CN117296710A - 一种快速创制细胞质雄性不育系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物育种技术领域，公开了一种快速创制植物CMS系的方法，包括：S1.选择含有CMS细胞质的单倍体诱导系，诱导系具备父系单倍体诱导能力，选择待创制CMS系的保持系；以含有CMS细胞质的单倍体诱导系作为母本，保持系作为父本进行杂交，获得杂交种子；S2.从杂交种中筛选出细胞核遗传背景与父本一致，细胞质遗传背景与母本一致的CMS单倍体；S3.将CMS单倍体进行染色体加倍，获得CMS双单倍体；S4.以CMS双单倍体作为母本，保持系作为父本，进行杂交，获得的杂交种即为稳定的CMS系。本发明方法是利用体内单倍体诱导技术介导细胞质替换的全新的CMS系创制方法，对加快杂种优势利用具有极其重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物育种技术领域，具体涉及一种快速创制细胞质雄性不育系的方法。
背景技术
杂种优势利用是大幅提高作物单产、改良作物品质、提高作物抗逆性、增加作物适应性的重要途径。杂种优势利用通常是利用纯系进行杂交，获得杂交种。在规模化杂交制种，需要对母本进行花粉控制，常用的方法包括使用雄性不育（male sterility）系、自交不亲和系，或对母本进行去雄处理等。其中以雄性不育系为材料控制授粉，可大大节约成本，获得高质量杂交种。
在基于雄性不育的制种体系中经常用到三系：①保持系：也叫雄性不育保持系。指给不育系授粉后能使其后代仍保持雄性不育的父本品系（自交系），保持系的雌雄蕊均发育正常，自交结实。②不育系：也叫雄性不育系，其细胞核基因组背景需要与保持系一致。雄性不育系是一种雄性器官退化的品系，没有花粉或花粉发育不正常，不能起授粉作用；但它的雌性器官正常，只要给它授以正常花粉，就能授精结实，是制种及杂交育种的良好亲本。③恢复系（采收营养器官的作物可以不使用恢复系）：也叫雄性不育恢复系。指用它的花粉给不育系授粉，能使后代雄蕊发育恢复正常，恢复系雌雄蕊发育均正常，自交结实。
植物雄性不育是有性繁殖过程中雄蕊不能产生正常花粉，而雌蕊能正常发育和受精的现象。雄性不育分为细胞核雄性不育和细胞质雄性不育。细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)是广泛存在于高等植物中的一种自然现象，表现为母体遗传、花粉败育和雌蕊正常，可被显性核恢复基因恢复育性。其中，Ogura-CMS属核质互作雄性不育类型，Ogura不育源是日本科学家Ogura首次在萝卜中发现的天然雄性不育类型，雄性败育彻底，是迄今为止在十字花科植物中发现的不育性最为彻底的胞质不育源之一。
细胞核雄性不育在水稻中（主要为光温敏雄性不育）应用较多；而细胞质雄性不育在作物杂交制种中应用更为广泛；目前大部分十字花科作物（包括油菜、萝卜、甘蓝类蔬菜、白菜类蔬菜等）、胡萝卜、辣椒，部分玉米、水稻、大豆、向日葵等作物杂交制种均采用细胞质雄性不育。目前获得纯合细胞质雄性不育的方法为杂交和连续多代（6-8代）回交，需要耗费多年时间和大量人力物力，尚未见其他快速创制CMS系的方法。
双单倍体（DH，Doubled Haploid）育种技术是利用自然发生或人工诱导受体材料产生单倍体植株，再通过加倍获得二倍体纯合系的育种技术。相比于传统的通过连续自交/回交创制纯合育种材料的方法，双单倍体育种技术可在1-2代内获得100%纯合的材料，大大缩短育种年限。单倍体的获得包括体外（in vitro）诱导和体内（in vivo）诱导两类方法，体外单倍体诱导包括小孢子培养、大孢子培养等技术，体内单倍体诱导包括自发产生、单倍体诱导系诱导产生等方法，基于单倍体诱导系（包括父系单倍体诱导系和母系单倍体诱导系）的体外单倍体诱导技术是国际上新兴起的最前沿的育种技术，具有广阔的应用前景。
青花菜（学名：Brassica oleraceaL.var.italicaPlenck）是一种重要的十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）甘蓝种（Brassica oleracea）蔬菜，富含蛋白质、维生素C、矿物质等营养成分，以及萝卜硫素等抗癌和抗氧化功能成分。目前包括青花菜在内的众多作物，均通过连续多年杂交和回交的方法创制不育系，还未见采用体内单倍体诱导技术介导细胞质替换创制细胞质雄性不育系的报道。
发明内容
本发明的目的是针对目前CMS系创制方法存在的上述问题，提供一种全新的、快速创制CMS系的方法，其操作简单，选育周期短（1-2代），对提高育种效率、加快杂种优势利用具有极其重要的意义。本发明基于植物杂交过程中，细胞质遵循母系遗传的规则，开拓性的尝试以父系单倍体诱导系诱导其他自交系产生单倍体，同时进行细胞质替换的方法，实现一步法创制CMS系。基于此，本发明提供了如下技术方案：
一种快速创制植物细胞质雄性不育（CMS）系的方法，一步法创制胞质雄性不育系，包括如下步骤（技术流程如图8所示）：
S1.选择含有CMS细胞质的单倍体诱导系，所述诱导系具备父系单倍体诱导能力，选择待创制CMS系的保持系；以含有CMS细胞质的单倍体诱导系作为母本，保持系作为父本进行杂交，获得杂交种子；
S2.从杂交种中筛选出细胞核遗传背景与父本一致，细胞质遗传背景与母本一致的CMS单倍体；
S3.将步骤S2获得的CMS单倍体进行染色体加倍，获得CMS双单倍体；
S4.以步骤S3获得的CMS双单倍体作为母本，步骤S1中的保持系作为父本，进行杂交，获得的杂交种即为稳定的CMS系。
在上述方法技术方案中，步骤S3中所述染色体加倍的方法为人工诱导加倍或者自然加倍方法；优选所述人工诱导加倍方法为秋水仙素处理方法。
在上述方法技术方案中，步骤S1中所述保持系为任意遗传背景高度纯合且育性正常的材料，通常为自交系或者DH系（双单倍体系），需要注意的是虽然使用纯合度较低的材料也可以创制CMS系，但其遗传背景、性状等方面通常与保持系存在差异，不适合在育种上进行应用，本发明实施例中采用高代自交系22qB54进行实验验证，但实际应用时并不只局限于某一个具体的自交系或者DH系。
在上述方法技术方案中，步骤S1中的含有CMS细胞质的单倍体诱导系的创制方法包括如下步骤：
(1)选择自交系，通过基因编辑技术获得具备父系单倍体诱导能力的父系单倍体诱导系；
(2)以CMS不育系作为母本，步骤(1)获得的父系单倍体诱导系作为父本进行杂交，获得含CMS细胞质的F1代；
(3)以F1代植株作为母本，步骤(1)获得的父系单倍体诱导系作为父本进行回交，获得BC1代，从BC1代中筛选出具有CMS胞质的纯合突变单倍体诱导系，即得。
步骤S1中的含有CMS细胞质的单倍体诱导系的获得方法不限于上述方法，也可以通过直接编辑CMS系使其具备父系单倍体诱导能力获得。
在上述方法技术方案中，步骤(1)中父系单倍体诱导系的制备方法包括如下步骤：沉默或抑制目的植物基因组中CENH3基因的表达或敲除CENH3基因或采用基因编辑技术对目的植物基因组中的CENH3基因进行修饰，得到基因编辑植株，筛选出其中具备单倍体诱导能力的植株，即为父系单倍体诱导系；优选所述父系单倍体诱导系为CENH3基因结构修饰的突变体，而并非CENH3功能丧失的突变体。
其中，父系单倍体诱导系的制备方法也可以采用已有报道的其它基因工程方法获得，并不只局限于编辑CENH3基因获得。
从得到的基因编辑植株中筛选出具备单倍体诱导能力的植株的具体方法是：以基因编辑植株作为母本与其他植物材料杂交，得到杂交后代，通过单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定来鉴定杂交后代中是否有单倍体植株，如果杂交后代单株中鉴定到具有父本特异性分子标记且不具有母本特异性分子标记的单株，则该杂交后代单株为单倍体，表明该基因编辑植株具备单倍体诱导能力；
叶片倍性鉴定具体可为：采用流式细胞仪检测，如果杂交后代单株的叶片细胞核具有单倍体细胞核信号峰，该杂交后代单株为植物单倍体；
单倍体性状鉴定具体可为：如果杂交后代单株具有植株矮小、叶片狭长的表型，该杂交后代单株为植物单倍体；
优选所述分子标记为InDel标记。
在上述方法技术方案中，所述CENH3基因是如下任一所述的DNA分子：
(1)核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；
(3)来源于青花菜，核苷酸序列与(1)或(2)限定的DNA分子序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
所述植物为如下任一所述的植物：
(1)双子叶植物或单子叶植物；(2)甘蓝种植物；或(3)青花菜。
在上述方法技术方案中，其中所述沉默或抑制目的植物基因组中CENH3基因的表达是指使目的植物基因组中CENH3基因表达量降低；所述敲除CENH3基因是指使目的植物基因组中CENH3基因发生修饰，但并非功能完全丧失；
所述采用基因编辑技术对目的植物基因组中的CENH3基因进行修饰得到基因编辑植株BoCENH3deta3，其基因组中CENH3基因的CDS序列自5’端的第407-409位碱基发生框内缺失突变，CENH3基因的CDS序列如SEQ ID No.4所示。
具备单倍体诱导能力的基因编辑植株并不仅仅局限于BoCENH3deta3，已有报道的采用其它方法获得的具备单倍体诱导能力的植株都可以作为父本，与作为母本的CMS不育系杂交获得含CMS细胞质的F1代，以F1代植株作为母本、具备单倍体诱导能力的基因编辑植株作为父本进行回交，在BC1代中筛选出具有CMS胞质的纯合突变单倍体诱导系。
优选地，所述父系单倍体诱导系的制备方法的具体步骤为：
①将基因编辑载体导入植物宿主细胞，所述基因编辑载体为对植物的CENH3基因进行CRISPR-Cas9基因编辑的载体，CRISPR/Cas9的靶序列如SEQIDNo.6所示；
②以①所得的细胞培育转化植株；
③检测转化株中CENH3基因突变的阳性株，获得基因编辑植株，即为父系单倍体诱导系BoCENH3deta3。
本发明最后提供了上述任一项所述的方法或者其制备得到的细胞质雄性不育系在植物育种中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)在植物杂交过程中，细胞质遵循母系遗传的规则，本发明通过利用父系单倍体诱导系可诱导其他正常系产生单倍体，又具有保留父系单倍体诱导系自身细胞质的特点，实现了细胞质的替换，可将保持系快速转换为细胞质不育系。发明了一种利用体内单倍体诱导技术介导细胞质替换，快速创制细胞质雄性不育系的全新的方法，该方法对加快杂种优势利用具有极其重要的意义。
(2) 本发明的实施例中以青花菜为例，采用本发明方法获得了青花菜保持系22qB54的CMS系CMS22qB54，CMS22qB54表型与保持系高度一致，在花期表现为100%雄性不育，与保持系杂交结实正常，可用于配制杂种优势组合，为该方法在其他作物中的应用提供了借鉴。
附图说明
图1为氨基酸系统发育树图。
图2为青花菜不同部位的BoCENH3基因表达量分析结果。
图3为pCas9-BoCENH3载体结构示意图。
图4为青花菜BoCENH3突变植株测序部分结果图。
图5为分子鉴定结果。
图6为叶片倍性鉴定（流式细胞仪分析）结果。
图7为表型鉴定结果：左侧为二倍体亲本，右侧为单倍体。
图8为本发明的快速创制细胞质雄性不育系的方法的技术流程图。
图9为22qB54和CMS22qB54二倍体植株的田间形态。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明，需要说明的是，实施例仅用于解释本发明而不代表限制本发明的范围。本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可商购获得，或采用本领域常规方法配制而得；未特别说明的实验条件，均为本领域常规实验条件，可参考分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:alaboratory manual，2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例所涉植物材料如下：
以下实施例所使用的青花菜材料为B53、CX33、22qB54，均为本实验室培育和保存的自交系，CMS219为本实验室培育和保存的青花菜雄性不育系（含Ogura CMS胞质），可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验。
实施例1. 青花菜BoCENH3基因的克隆
一、BoCENH3基因的鉴定
着丝粒特异组蛋白H3(centromere specific histone H3,CENH3)广泛分布于真核生物的功能着丝粒区域，在着丝粒染色质的识别和保持中起着关键作用。
本实施例根据已知的甘蓝种CENH3基因序列设计青花菜CENH3基因扩增特异引物对：正向引物（BoCENH3-F，SEQ ID No.1）和反向引物（BoCENH3-R，SEQ ID No.2）。以青花菜幼嫩叶片为材料，采用改良CTAB法提取基因组DNA（Han et al., 2015），以该基因组DNA为模板，采用前述特异引物对进行PCR扩增，扩增产物送测序公司进行测序，测序得到BoCENH3基因的DNA序列SEQ ID No.3所示，全长1305bp，包含9个外显子和8个内含子。
PCR扩增用的正向引物和反向引物序列为：
BoCENH3-F（SEQ ID No.1）：5’-ATGGCGAGAACCAAACATTTC-3’；
BoCENH3-R（SEQ ID No.2）：5’-TCACAATGGTCTGCCTTTTCCT-3’。
将SEQ ID No.3所示的测序结果通过手工校对，序列拼接，并与已公布的拟南芥蛋白进行Protein Blast相似性比对，发现比对结果显示扩增得到的基因与拟南芥CENH3基因同源性最高，序列相似度达66%。通过氨基酸系统发育树的构建，如图1所示，系统发育树分析表明，青花菜BoCENH3基因与芸薹属其他种的CENH3基因相聚集，说明青花菜的BoCENH3基因与芸薹属其他种的CENH3基因高度同源，本实施例PCR扩增得到的片段为青花菜BoCENH3基因。
二、青花菜不同部位的BoCENH3基因表达量分析
提取青花菜根、茎、叶、花、雌蕊、雄蕊等各部分mRNA，逆转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR分析，结果如图2所示，发现BoCENH3基因在授粉后的雌蕊中表达量最高，在根、茎、叶中表达量低。
取大约1g的青花菜叶片样品，放入无RNA酶的研钵中，加入液氮研磨，使用TIANGEN公司植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取植物总mRNA，以此mRNA为模板，使用Vazyme公司转录试剂盒合成cDNA第一条链。随后以该cDNA第一条链为模板，采用前述的正向引物（BoCENH3-F）和反向引物（BoCENH3-R）进行PCR扩增，获得1个青花菜BoCENH3基因的CDS序列，克隆到pGEM-T载体（TA 克隆载体）。克隆的青花菜BoCENH3基因的CDS序列如SEQ IDNo.4所示，共558bp，其基因编码一个185个氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID No.5所示。
实施例2. 青花菜BoCENH3基因编辑载体pCas9-BoCENH3的构建
针对青花菜BoCENH3基因使用在线网站（http://crispor.tefor.net/）进行CRSPR-Cas9靶点预测，选取特异性位点SEQ ID No.6 (GGACTGCTGAAGCTCTTATGG)设计sgRNA，通过将设计的如SEQ ID No.6所示的序列的gRNA靶点序列制备成Oligo二聚体gRNA；将所述Oligo二聚体构建至pBK2-Cas9-U6载体骨架即得到pCas9-BoCENH3载体，所述pBK2-Cas9-U6载体骨架购自武汉伯远生物科技有限公司（货号#REC44-I）；至此，通过PCR扩增、酶切后和连接将目标sgRNA连接到载体上。连接产物转化大肠杆菌感受态，筛选阳性克隆，构建得到青花菜BoCENH3编辑载体pCas9- BoCENH3，载体结构示意图如图3所示。
实施例3. 农杆菌介导法转化青花菜
在本实施例，以青花菜自交系CX33作为受体材料，通过农杆菌介导法转化青花菜下胚轴的的方法，得到含有pCas9-BoCENH3表达的转基因外植体，进而从中筛选出青花菜BoCENH3基因发生突变的植株。
（1）青花菜外植体的获得
选取成熟、饱满、无病斑的青花菜种子，使用75%酒精消毒3分钟，7%次氯酸钠溶液消毒10分钟，然后用灭菌水洗2-3次，灭菌后的种子在超净工作台中吸干多余的水，播种在萌发培养基上。在16h光照/8h黑暗条件下培养5-7天，将青花菜下胚轴切成约0.8cm长，作为农杆菌介导转化的受体。
（2）青花菜的遗传转化
将含有pCas9- BoCENH3质粒的农杆菌培养至OD600=0.4左右，用液体MS培养基重悬作为侵染液。将青花菜外植体侵染10分钟，置于共培养培养基中25℃暗培养36-48小时；随后将外植体转移到含10 mg/L Basta浓度的选择培养基上，在16h光照/8h黑暗条件下，每14天更换一次选择培养基。待抗性芽长到约2-3cm长度，切下抗性芽转到长苗培养基中，在16h光照/8h黑暗条件下培养20-30天，放入生根培养基中培养20天。根部生长发达的植株转入营养土中栽培。经Bar和Cas9基因PCR检测，共获得5个转基因植株。
Bar引物序列如下：
BarH-F(SEQ ID No.7): 5’-ATGAGCCCAGAACGACGCCCG-3’；
BarH-R(SEQ ID No.8): 5’-TCAAATCTCGGTGACGGGCAGG-3’；
Cas9引物序列如下：
Cas-F(SEQ ID No.9): 5’-GACAAGAAGTACTCGATCGGC-3’；
Cas-R(SEQ ID No.10): 5’-GTCAGATCCTGATGGTGCTC-3’。
（3）青花菜BoCENH3基因编辑植株的获得
提取已获得的5个转基因植株的基因组DNA，使用前述的如SEQ ID No.1、2所示的引物扩增青花菜BoCENH3基因并进行一代测序，检测在目标靶点存在突变的植株，共检测到4个BoCENH3基因的编辑植株为突变植株，将BoCENH3基因扩增产物连T载体（北京全式金生物技术股份有限公司，货号CT501-01）进行克隆测序，选取至少10个克隆进行一代测序。测序结果表明4个T0代基因编辑植株中（图4为青花菜BoCENH3突变植株测序部分结果图），有两个杂合体和两个嵌合体，如表1中所示，表1列出了每个突变相较于如SEQ ID No.4所示的CDS序列的突变位置。其中基因编辑植株#1、#3、#4均含有移码突变，植株均表现为叶面皱缩、植株偏小，#2基因编辑植株为框内缺失突变，植株生长正常，表型与野生型一致。
表1
移栽后3个月BoCENH3基因编辑植株开花，自交授粉后2个月后收获种子；对四个系的T1代植株进行筛选，结果如表2中所示，发现基因编辑植株#1、#3、#4的后代均为野生型或杂合突变类型，无法获得BoCENH3纯合移码突变的植株，说明BoCENH3功能完全丧失，可能会导致胚胎或植株致死。从#2的T1的植株中，可筛选出纯合的框内缺失突变（3bp），将该株系命名为BoCENH3deta3；该纯合突变体生长正常。
表2
实施例4.青花菜BoCENH3基因编辑植株单倍体诱导能力的鉴定
1.田间授粉，播种鉴定
以实施例3中得到的T1突变体分别作为母本，与青花菜材料B53杂交，获得杂交后代。T1突变体即青花菜BoCENH3deta3（#2-T1植株）纯合框内缺失突变体，#1-T1，#3-T1，#4-T1杂合移码突变体。将上述授粉组合所得后代，播种于穴盘。
2.分子标记鉴定
利用两个亲本（CX33与B53）之间的特异InDel标记（如表3）进行杂交后代的基因型鉴定。将杂交所得后代，播种于穴盘，取叶片提取DNA进行PCR扩增，并电泳检测扩增产物，所有#1-T1、#3-T1、#4-T1与B53杂交后代中，均未检测到与B53基因型一致植株；而在BoCENH3deta3与B53杂交后代中，604棵单株中，共有3株与B53基因型相同，初步判定为单倍体，结果如图5所示：图中泳道1-8分别是DNA marker；BoCENH3deta3；B53；BoCENH3deta3× B53真杂种；BoCENH3deta3× B53真杂种；B53单倍体；B53单倍体；B53单倍体。
所述InDel标记的引物序列如表3中所示：
表3
| InDel标记名称 | 正向引物 (5′-3′) | 反向引物 (5′-3′) |
| ZC1-3 | SEQ ID No.11：ATGGGAGCCTCTTGTTCCTC | SEQ ID No.12：ACCAGAGGAAGTGAAGGCAA |
| ZC2-24 | SEQ ID No.13：CGTACGCGGGAGAAAATCTT | SEQ ID No.14：ACACCAAGACCACTCTCTCC |
| BAC3-9 | SEQ ID No.15：CCGGAGAAGAAGAGGACGAG | SEQ ID No.16：TCCCTCGGCTCAGCATTAAT |
| ZC4-14 | SEQ ID No.17：ATCACACTGTAAACGGGCCT | SEQ ID No.18：TCAGGTGGTGTTGAGATGGT |
| ZC5-7 | SEQ ID No.19：AGACATGATGACTCCACCGC | SEQ ID No.20：AAACTCTCTTTTGCCCGCC |
| ZC6-2 | SEQ ID No.21：AGATCGAGCTCCACCATTAATTG | SEQ ID No.22：GGAGGTCATGATACTTGGGC |
| ZC7-2 | SEQ ID No.23：ACATTGTGAGGCTTGTCGTG | SEQ ID No.24：GGAGGTCATGATACTTGGGC |
| ZC8-28 | SEQ ID No.25：GGTCATCTCAGCGAGTGGAT | SEQ ID No.26：AACGCATTTGGTCTTAGGCC |
| ZC9-3 | SEQ ID No.27：TGTTGGGTCCTACAGTCACC | SEQ ID No.28：GGAGTGGAGAACATCGAGCT |
3.流式细胞仪鉴定倍性
将上述步骤2中鉴定初步获得的可能的单倍体植株进行流式细胞检测；方法如下：
取青花菜靠近生长点的幼嫩叶片0.5g，提取其细胞核，以二倍体青花菜叶片作为对照；再用流式细胞仪检测细胞核的荧光强度，首先检测二倍体对照，并将二倍体细胞核信号峰位设为200(由于在有丝分裂G1期，二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位理论上在100附近出现)；若待测植株的细胞核信号峰出现在200附近，则认为其是二倍体。若待测植株细胞核信号峰出现在100附近，则认为该待测植株为单倍体植株(图6)。
将经步骤3检测过的二倍体和单倍体移栽至花盆，观察表型。与二倍体相比，单倍体具有植株矮小，叶片狭长较窄等特征，二倍体叶片植株高大，叶片椭圆（图7）。
经过上述的分子标记鉴定、叶片倍性鉴定、单倍体性状鉴定，最终确认在BoCENH3deta3与B53杂交后代中，604棵单株中，共有3株B53单倍体，计算单倍体诱导率为0.5%，单倍体诱导率（%）=（实际单倍体株数/总株数）×100%。
综上所述，将青花菜基因组中的BoCENH3基因突变后获得的BoCENH3突变植株BoCENH3deta3可作为青花菜单倍体诱导系，该青花菜单倍体诱导系与其他青花菜材料杂交，可在后代中获得青花菜单倍体。
实施例5. 制备具有CMS胞质的单倍体诱导系CMS-BoCENH3deta3
1.与Ogura CMS不育系杂交
播种和培养青花菜单倍体诱导系BoCENH3deta3，青花菜Ogura CMS不育系CMS219，在开花期，以CMS219作为母本，单倍体诱导系BoCENH3deta3作为父本进行杂交，获得F1代植株，F1代植株BoCENH3基因处于杂合状态（BoCENH3/BoCENH3deta3）。另外由于细胞质遵循母系遗传的规律，F1代植株含Ogura CMS细胞质。
2.回交和筛选
播种和培养步骤1获得的F1代植株，在开花期，以F1代植株作为母本，单倍体诱导系BoCENH3deta3作为父本进行回交，获得BC1植株，由于细胞质遵循母系遗传的规律，BC1代植株均含Ogura CMS细胞质。使用前述的如SEQ ID No.1、2所示的引物扩增BC1代（10株）BoCENH3基因并进行一代测序，检测BoCENH3突变情况，杂合BoCENH3deta3在目标靶标处出现测序双峰，纯合BoCENH3deta3在目标靶标处无测序双峰，但与野生型相比缺失3 bp，筛选出纯合BoCENH3deta3单株，即为具有CMS胞质的单倍体诱导系CMS- BoCENH3deta3。
实施例6. 利用父系单倍体诱导系创制青花菜Ogura CMS单倍体
（1）青花菜植株培养和杂交授粉
将青花菜父系单倍体诱导系CMS- BoCENH3deta3，自交系22qB54种植于温室中，常规田间管理。在开花期（通常为3-4月份），以CMS-BoCENH3deta3作为母本，22qB54作为父本进行人工杂交授粉，取自交系22qB54花粉，授于CMS-BoCENH3deta3植株的柱头上，套硫酸纸袋进行隔离。
（2）青花菜22qB54 Ogura CMS单倍体的获得
大约2个月后，收获杂交种子，播种于穴盘中，待长到1-3片真叶时期进行鉴定，采用实施例4中的播种田间表型鉴定、分子鉴定和流式细胞仪鉴定倍性方法，选择其中1-3种方法鉴定。单倍体（n=9）通常表现为植株矮小，叶片狭窄。
（3）青花菜22qB54 Ogura CMS单倍体细胞质的分子鉴定
由于细胞质遵循母系遗传的规律，所获得的单倍体应含有Ogura CMS胞质，为确保获得的植株含Ogura CMS胞质，使用orf138（造成Ogura CMS的线粒体基因）特异分子标记进行鉴定，采用引物对BnRFO-AS2F/BnRFO-NEW-R进行PCR扩增，扩增有预期条带的为含CMS胞质的单株。orf138标记和具体鉴定方法参考下述文献：Yu H, Fang Z, Liu Y, et al.Development of a novel allele-specific Rfo marker and creation of Ogura CMSfertility-restored interspecific hybrids in Brassica oleracea. Theoreticaland Applied Genetics, 2016, 129: 1625-1637.
鉴定结果显示：在CMS- BoCENH3deta3与22qB54的杂交种中，在382个后代中，鉴定到2个单倍体，且该植株的细胞质为Ogura CMS胞质，从形态上看，单倍体植株与22qB54十分接近，但植株矮小，叶片狭窄，将鉴定为含Ogura CMS胞质的单倍体杂交种材料命名为青花菜CMS22qB54单倍体，用于实施例7。
实施例7. 青花菜Ogura CMS单倍体的染色体加倍和二倍体植株扩繁
（1）青花菜CMS22qB54单倍体的染色体加倍
待青花菜CMS22qB54单倍体生长至4-5真叶时期，将其移出，用水清洗干净根部，随后在200 mg/l浓度的秋水仙素溶液中浸泡12个小时以上，再次用水清洗干净根部，移栽到正常苗碗中；待其成活后移栽到温室中。通过表型鉴定、倍性鉴定等方法确定其加倍成功（2n=18），将获得的二倍体植株命名为CMS22qB54二倍体。二倍体使用实施例4所述的分子标记进行鉴定，标记ZC1-3、ZC2-24、BAC3-9、ZC4-14、ZC5-7、ZC6-2、ZC7-2、ZC8-28、ZC9-3分别位于青花菜C1-C9 9条染色体，CMS-BoCENH3deta3基因型鉴定结果记为A，22qB54基因型鉴定结果记为B，杂合基因型记为A/B，CMS-BoCENH3deta3和22qB54杂交后代植株基因型鉴定结果根据此规则进行记录，鉴定结果如表4所示，显示获得2个CMS22qB54二倍体植株，遗传背景与22qB54完全一致。
表4
此CMS22qB54二倍体植株细胞核遗传背景与22qB54一致，含Ogura CMS细胞质，从形态上看，加倍后获得的二倍体植株与22qB54完全一致（图9A），在开花期，CMS22qB54二倍体表现出典型的Ogura CMS雄性不育（花朵偏小，雄蕊退化，不能产生花粉，图9B），此CMS22qB54二倍体植株即为22qB54自交系（保持系）对应的不育系。
（2）青花菜CMS22qB54 二倍体植株的扩繁
将青花菜自交系（保持系）22qB54和不育系CMS22qB54二倍体种植于温室中，常规田间管理。在开花期（通常为3-4月份），进行杂交授粉，取自交系22qB54花粉，授于CMS22qB54柱头上，套硫酸纸袋进行隔离，大约2个月后，即可收获大量种子，扩繁获得的CMS系可直接用于杂交制种。
Claims (10)
1.一种快速创制植物细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，一步法创制胞质雄性不育系，包括如下步骤：
S1.选择含有CMS细胞质的单倍体诱导系，所述诱导系具备父系单倍体诱导能力，选择待创制CMS系的保持系；以含有CMS细胞质的单倍体诱导系作为母本，保持系作为父本进行杂交，获得杂交种子；
S2.从杂交种中筛选出细胞核遗传背景与父本一致，细胞质遗传背景与母本一致的CMS单倍体；
S3.将步骤S2获得的CMS单倍体进行染色体加倍，获得CMS双单倍体；
S4.以步骤S3获得的CMS双单倍体作为母本，步骤S1中的保持系作为父本，进行杂交，获得的杂交种即为稳定的CMS系。
2.根据权利要求1所述的快速创制植物细胞质雄性不育系的方法，其特征在于：步骤S3中所述染色体加倍的方法为人工诱导加倍或者自然加倍方法。
3.根据权利要求1所述的快速创制植物细胞质雄性不育系的方法，其特征在于：步骤S1中所述保持系为自交系或者DH系。
4.根据权利要求1所述的快速创制植物细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，步骤S1中所述含有CMS细胞质的单倍体诱导系的创制方法包括如下步骤：
(1)选择自交系，通过基因编辑技术获得具备父系单倍体诱导能力的父系单倍体诱导系；
(2)以CMS不育系作为母本，步骤(1)获得的父系单倍体诱导系作为父本进行杂交，获得含CMS细胞质的F1代；
(3)以F1代植株作为母本，步骤(1)获得的父系单倍体诱导系作为父本进行回交，获得BC1代，从BC1代中筛选出具有CMS胞质的纯合突变单倍体诱导系，即得。
5.根据权利要求4所述的快速创制植物细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，步骤(1)中父系单倍体诱导系的制备方法包括如下步骤：沉默或抑制目的植物基因组中CENH3基因的表达或敲除CENH3基因或采用基因编辑技术对目的植物基因组中的CENH3基因进行修饰，得到基因编辑植株，筛选出其中具备单倍体诱导能力的植株，即为父系单倍体诱导系。
6.根据权利要求5所述的快速创制植物细胞质雄性不育系的方法，其特征在于：从得到的基因编辑植株中筛选出具备单倍体诱导能力的植株的具体方法是：以基因编辑植株作为母本与其他植物材料杂交，得到杂交后代，通过单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定来鉴定杂交后代中是否有单倍体植株，如果杂交后代单株中鉴定到具有父本特异性分子标记且不具有母本特异性分子标记的单株，则该杂交后代单株为单倍体，表明该基因编辑植株具备单倍体诱导能力；
叶片倍性鉴定具体为：采用流式细胞仪检测，如果杂交后代单株的叶片细胞核具有单倍体细胞核信号峰，该杂交后代单株为植物单倍体；
单倍体性状鉴定具体为：如果杂交后代单株具有植株矮小、叶片狭长的表型，该杂交后代单株为植物单倍体。
7.根据权利要求5所述的快速创制植物细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，
所述CENH3基因是如下任一所述的DNA分子：
(1)核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；
(3)来源于青花菜，核苷酸序列与(1)或(2)限定的DNA分子序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
所述植物为如下任一所述的植物：
(1)双子叶植物或单子叶植物；(2)甘蓝种植物；或(3)青花菜。
8.根据权利要求5所述的快速创制植物细胞质雄性不育系的方法，其特征在于：其中所述沉默或抑制目的植物基因组中CENH3基因的表达是指使目的植物基因组中CENH3基因表达量降低；所述敲除CENH3基因是指使目的植物基因组中CENH3基因发生修饰，但并非功能完全丧失；
所述采用基因编辑技术对目的植物基因组中的CENH3基因进行修饰得到基因编辑植株BoCENH3deta3，其基因组中CENH3基因的CDS序列自5’端的第407-409位碱基发生框内缺失突变，CENH3基因的CDS序列如SEQ ID No.4所示。
9.根据权利要求8所述的快速创制植物细胞质雄性不育系的方法，其特征在于：所述父系单倍体诱导系的制备方法的具体步骤为：
①将基因编辑载体导入植物宿主细胞，所述基因编辑载体为对植物的CENH3基因进行CRISPR-Cas9基因编辑的载体，CRISPR/Cas9的靶序列如SEQIDNo.6所示；
②以①所得的细胞培育转化植株；
③检测转化株中CENH3基因突变的阳性株，获得基因编辑植株，即为父系单倍体诱导系BoCENH3deta3。
10.权利要求1至9任一项所述的方法或者其制备得到的细胞质雄性不育系在植物育种中的应用。
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