CN106916845A - 一种红麻转基因创制细胞质雄性不育系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及育种方法，具体公开了一种红麻转基因创制细胞质雄性不育系的方法：以红麻中非全长Hcpdil5‑2a为目的基因，采用转基因方法获得细胞核雄性不育种质资源，继而与非转基因的野生型杂交形成F1代群体，建立不育株与可育株为1:1的永久分离群体；以该群体中的雄性不育株为母本，与非转基因的异源保持系或品种(系)进行核置换回交，即可选育出质核异源细胞质雄性不育系；又以质核异源雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，以非转基因的野生型(与转基因供试品种为同一品种来源)品种(系)为父本，进行核置换回交，即可选育出质核同源细胞质雄性不育系。

Description

一种红麻转基因创制细胞质雄性不育系的方法
技术领域
本发明涉及育种方法，具体地说，涉及一种红麻转基因创制细胞质雄性不育系的方法。
背景技术
红麻又称“洋麻”，是锦葵科木槿属一年生韧皮纤维作物。因其在长江流域及其以北地区不能自然留种，北方麻区每年要从华南地区引入大量种子。红麻表现出强大的杂种优势，其杂种优势率高达35％-40％。长期以来，红麻杂种优势利用是国内外红麻育种的主攻目标。
但在农业生产中，由单一细胞质雄性不育系组配的杂交种在生产中的大面积推广和长期利用可能成为某一病害生理小种的哺育品种，从而存在某一病害大流行的风险。解决这一问题的基本途径是获得多种细胞质来源的雄性不育系，而不同细胞质来源的雄性不育系的选育源于细胞质雄性不育种质的遗传多样性。但迄今为止，植物细胞质雄性不育种质一般源于自然突变或采用远缘杂交的方法获得，而自然突变几率很低，远缘杂交又难以成功，因此，许多作物因雄性不育种质的缺乏至今尚未选育出细胞质雄性不育系。若能采用转雄性不育相关基因的方法创造细胞质雄性不育种质将具有极重要的科学意义和广阔的利用前景。
申请人团队长期致力于植物雄性不育种质创新及其分子基础的研究工作。2008年，周瑞阳指导的博士研究生李刚采用同重标签相对定量与绝对定量(简称iTRAQ)技术分析了红麻雄性不育系和保持系花药线粒体蛋白质组差异，发现了一个差异表达的PDIL(protein disulfide isomerase-like，类蛋白质二硫键异构酶，缩写为“PDIL”)蛋白。该蛋白质部分氨基酸残基的同源比对表明，它与AtPDIL5-2、OsPDIL5-2和OsPDIL5-3直系同源。2010年，周瑞阳指导的另一位博士研究生金刚在此基础上，根据GenBank中公布的OsPDIL5-2、OsPDIL5-3、AtPDIL5-2及其他同源基因的cDNA序列，基于同源克隆和RACE技术，克隆了两个红麻PDIL同源基因，并通过全长cDNA的扩增加以验证。两个基因分别命名为Hcpdil5-2a和Hcpdil5-2b，在NCBI基因数据库中的登录号分别为HQ638208和HQ898859。同时，这两个基因在不育系开花期的不同组织器官的表达量存在差异，其中Hcpdil5-2a在各组织的表达均受到不育胞质的影响，而Hcpdil5-2b的表达仅在营养器官中受到不育胞质的影响。说明Hcpdil5-2a可能与雄性不育有关。但与雄性不育可能有关与细胞质雄性不育系的创制是两个完全不同的问题。
经过多年的探索性研究发现，采用花粉管通道法转红麻非全长Hcpdil5-2a基因，成功创造出了红麻细胞核雄性不育种质，继而转育成红麻细胞质雄性不育系。对此，国内外均未见报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种红麻转基因创制细胞质雄性不育系的方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
一种红麻转基因创制细胞质雄性不育系的方法，包括如下步骤：
S1、构建可超量表达目标基因的重组表达载体；目标基因如SEQ ID No.1所示；
S2、将上述重组表达载体采用花粉管通道法导入红麻中，收获T0代种子；
S3、播种上述T0代种子获得T1代植株，在T1代植株中筛选出花药不开裂的转基因雄性不育种质HMS株；
S4、将上述转基因雄性不育种质与非转基因的野生型杂交，获得F1代植株；
S5、将表现可育的F1代植株与稳定表现雄性不育的HMS株测交，建立雄性不育株与可育株长期保持1:1分离的永久分离群体；
所述稳定表现雄性不育的HMS株为S3中在海南和南宁种植均表现雄性不育的转基因雄性不育株；
S6、以上述转基因雄性不育种质HMS株或S5所述永久分离群体中的雄性不育株为母本，与异源保持系杂交，并进行核置换回交；即可获得质核异源细胞质雄性不育系；
S7、以S6中质核异源雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，以非转基因的野生型品种/系为父本，进行核置换回交，即可选育出质核同源细胞质雄性不育系；
此后，还可以选育得到的质核异源细胞质雄性不育系或选育得到的质核同源细胞质雄性不育系为细胞质供体，与新的同源或异源保持系进行核置换回交，又可选育出新的质核同源细胞质雄性不育系或质核异源细胞质雄性不育系。
需要说明的是，同源保持系是指与转基因材料为同一来源的非转基因野生型保持系或品种(系)；异源保持系是指与转基因材料没有亲缘关系的雄性不育保持系或常规品种(系)。
作为优选，S2中，将重组表达载体采用花粉管通道法导入红麻保持系722B中。该红麻品种722B为广西大学周瑞阳选育的细胞质雄性不育保持系；原始品种来源见：桂科鉴字第[2007]177号。
作为优选，所述重组表达载体含有CaMV35S启动子，用于使所述基因序列超量表达。
作为优选，在回交的同时，与多个栽培品种测定配合力，每个世代选择配合力高、性状与父本相似，且花药不开裂的雄性不育株继续回交，同时父本套袋自交，回交不低于5～6代。
作为优选，所述异型保持系为722B以外的保持系或品种(系)，例如P3B、F3B、763B、K03B、L23B或917B等。
本发明涉及到的原料均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
更为具体地，本发明所述方法涉及步骤如下：
1、目标基因序列：
以红麻非全长Hcpdil5-2a基因为目标基因。Hcpdil5-2a基因ORF序列长度为1268bp(不包括终止密码子)，用于构建超量表达载体的ORF序列长度为960bp(不包括终止密码子)，二者相差308bp。故目标基因为非全长Hcpdil5-2a基因，其具体序列如SEQ IDNo.1所示。
2、目标基因的扩增：
提取红麻发育花药中总RNA，然后反转录获得cDNA第一链；然后根据cDNA序列设计带有酶切位点Xba I、Kpn I特异引物对Hcpdil5-2a-TY，通过RT-PCR方法扩增红麻非全长Hcpdil5-2a基因。
所述特异引物对Hcpdil5-2a-TY包括：
正向引物：5’-TCTAGAATGTTGCTGTTCTCGATCTTGA-3’；
反向引物：5’-GGTACCTCAATCTTCTTTCTTCTCAGGTCTA-3’。
其中，所述PCR的反应体系如下：
反应体系用双蒸水补足到总体积20μL。
其中，PCR反应条件为：94℃预变性3min，然后94℃30s，51.7℃30s，72℃1min30s，扩增30个循环，最后72℃终延伸10min。
利用天根凝胶回收试剂盒回收上述片段后，将其连入PMD-19T(simple)载体(从宝生物工程有限公司购得)中，构建成测序中间载体，称为非全长PHcpdil5-2a，然后用该载体进行基因扩增和酶切验证，最后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。
3、重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建：
将上述步骤2中获得的含有非全长Hcpdil5-2a基因编码区cDNA的PHcpdil5-2a中间测序载体经过Xba I和Kpn I双酶切后获得带有酶切粘性末端的非全长Hcpdil5-2a基因片段。PBI121-GFP载体也用同样的Xba I和Kpn I双酶切，回收带有CaMV35S启动子的载体片段。将非全长Hcpdil5-2a基因片段与载体片段用连接酶连接，得到以CaMV35S启动子驱动的红麻非全长Hcpdil5-2a基因的植物超量表达载体，称为PBI121-Hcpdil5-2a-GFP。
植物表达载体PBI121-GFP可以通过商业途径购买，也可以自行构建。
4、目标基因植物重组表达载体导入：
采用花粉管通道法进行。
其具体步骤是：
(1)选株：选取生长健壮、无病虫害的红麻植株，将次日要开放的花蕾，用嫁接用塑料夹子将花蕾顶部夹住或使用棉线等将花蕾顶部扎紧使其不能正常开放，以防外来花粉污染；
(2)自花授粉：花开之日早上6:00，取掉塑料夹子或松开棉线，用卫生纸蘸取花粉涂抹到柱头上使其自交，然后继续用塑料夹子夹住花瓣或用棉线等捆扎花瓣，继续防止外来花粉污染；
(3)微量注射重组表达载体：自花授粉3-5小时后即可形成花粉管通道，此时即可去掉塑料夹子或棉线等捆扎物，使花瓣张开，同时用经过严格消毒处理过的微量进样器吸取PBI121-Hcpdil5-2a-GFP植物表达载体质粒10μL，将针头沿着花粉管插入至子房中，并将质粒注入子房中即完成超表达载体的微量注射。
(4)收获：待上述注射PBI121-Hcpdil5-2a-GFP植物表达载体质粒的果实自然成熟后，单株上的同类种子合并编号，即获得T0代种子。
5、转基因红麻细胞核雄性不育种质的获得：
播种上述T0代种子即获得T1代植株，于开花期调查T1代植株育性，如花药不能开裂即为雄性不育株，计算雄性不育株与总植株数的比率，并检测目标基因是否导入雄性不育株中，对于已经导入目标基因的雄性不育株，命名为HMS株。而对于未检测到目标基因的雄性不育株，可能是其它原因导致的雄性不育，不作进一步的分析。
6、红麻转基因细胞质雄性不育系的选育
(1)转基因细胞核雄性不育系的选育：HMS植株与非转基因的野生型杂交F1代在南宁春播或者夏播，在秋季开花，表现正常可育，说明目标基因所致的雄性不育性在南宁表现隐性性状；但HMS株是在海南冬繁的T1代发现的，说明目标基因在海南冬季短日和相对低温(相对于南宁秋季的气温较低)条件下表现显性性状，目标基因的雄性不育性对温度或日长敏感。但在海南冬繁条件下，HMS株的表现有3种类型：(1)稳定型HMS株：稳定表现雄性不育，环剥不能恢复其育性；(2)环剥恢复型HMS株：在海南表现雄性不育，但环剥可使其育性恢复，可实现自交纯合；(3)自然恢复型HMS株：海南开花前期表现雄性不育，但随着海南气温的升高，开花后期自然恢复可育。由此表明HMS的光温敏感性由多个基因控制，选择海南和南宁均表现雄性不育的HMS株是完全可能的。根据这一特性，将上述南宁表现可育的(HMS株与非转基因的野生型杂交)F1代与稳定表现雄性不育的HMS株测交，其后代表现可育株与不育株1:1分离；将该世代中可育株(基因型为杂合体)与不育株杂交，其后代仍然表现可育株与不育株为1:1分离。此后，将这种1:1分离世代在隔离区自由授粉，从不育株上收获种子播种，即可建立雄性不育株与可育株长期保持1:1的永久分离群体。
(2)转基因质核异源细胞质雄性不育系的选育：将上述永久分离群体中的不育株与异型保持系(与转基因材料没有亲缘关系的雄性不育保持系)杂交，并与异型保持系核置换回交，即可获得具有HMS株细胞质、异型保持系细胞核的雄性不育系，异型保持系即为该不育系的保持系。由于该类型不育系的细胞质源于转基因创造的雄性不育细胞质，细胞核源于转基因供体材料以外的异型保持系，其质核来源不同，故称为质核异源细胞质雄性不育系。
(3)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法：以上述永久分离群体中的不育株与同型保持系杂交或任一回交后代中的雄性不育株为母本，与转基因雄性不育株为同一品种来源的品种/系为父本，进行饱和回交。其回交父本即为雄性不育保持系。由此选育的细胞质雄性不育系，因其细胞质和细胞核均源于同一品种，故为质核同源细胞质雄性不育系。
本发明过了长达7年的探索性研究，付出了巨大的创新性劳动。其创造性在于，采用转基因方法细胞核雄性不育种质，继而与异性保持系进行核置换回交，选育出质核异源细胞质雄性不育系；在此基础上又与同源保持系进行核置换回交，选育出质核同源细胞质雄性不育系。
本发明的有益效果在于：
本发明所得雄性不育系的细胞核源于非转基因的保持系或品种(系)，因而不含转基因质粒载体，与非转基因植物无异，不存在安全风险和市场风险；所得雄性不育系的细胞质源于栽培品种(系)，有利于组配出强优势杂交组合；由此可创造出多种细胞质雄性不育种质，从而避免了农业生产上由于单一细胞质杂交种的大面积推广和长期利用可能导致的某一病害大流行的潜在风险，具有极为广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明超量表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建过程。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1超量表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建
1、目标基因序列：
以红麻非全长Hcpdil5-2a基因为目标基因。Hcpdil5-2a基因ORF序列长度为1268bp(不包括终止密码子)，用于构建超量表达载体ORF序列长度为960bp(不包括终止密码子)，二者相差380bp。故目标基因为非全长Hcpdil5-2a基因，其具体序列如SEQ ID No.1所示。
2、目标基因的扩增：
提取红麻发育花药中总RNA，然后反转录获得cDNA第一链；然后根据cDNA序列设计带有酶切位点Xba I、Kpn I特异引物对Hcpdil5-2a-TY，通过RT-PCR方法扩增红麻非全长Hcpdil5-2a基因。
所述特异引物对Hcpdil5-2a-TY包括：
正向引物：5’-TCTAGAATGTTGCTGTTCTCGATCTTGA-3’；
反向引物：5’-GGTACCTCAATCTTCTTTCTTCTCAGGTCTA-3’。
其中，所述PCR的反应体系如下：
反应体系用双蒸水补足到总体积20μL。
其中，PCR反应条件为：94℃预变性3min，然后94℃30s，51.7℃30s，72℃1min30s，扩增30个循环，最后72℃终延伸10min。
利用天根凝胶回收试剂盒回收上述片段后，将其连入PMD-19T(simple)载体(从宝生物工程有限公司购得)中，构建成测序中间载体，称为非全长PHcpdil5-2a，然后用该载体进行基因扩增和酶切验证，最后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。
3、超量表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建：
由步骤1所述红麻非全长Hcpdil5-2a基因的开放阅读框序列与植物表达载体PBI121构建而成。其具体方法是：
上述步骤2中获得的含有非全长Hcpdil5-2a编码区cDNA的PHcpdil5-2a中间测序载体经过Xba I和Kpn I双酶切后获得带有酶切粘性末端的非全长Hcpdil5-2a基因片段。PBI121-GFP载体也用同样的Xba I和Kpn I双酶切，回收带有CaMV35S启动子的载体片段。将非全长Hcpdil5-2a基因片段与载体片段用连接酶连接，得到以CaMV35S启动子驱动的红麻非全长Hcpdil5-2a的植物超量表达载体，称为PBI121-Hcpdil5-2a-GFP。
实施例2红麻转基因雄性不育种质资源的获得
2010年10月，以红麻品种722B(广西大学周瑞阳选育的细胞质雄性不育保持系；原始品种来源见：桂科鉴字第[2007]177号)为材料，按照本发明的方法，于开花期用微量注射器将实施例1制备的超量表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP注入供试材料子房中。2011年4月，在海南冬繁的T1代群体中发现12株花药不开裂，即为雄性不育株。分子检测发现，其中2株已导入目标基因，命名为HMS1、HMS2，即为转基因红麻雄性不育种质。
实施例3红麻转基因细胞核雄性不育系的构建
以上述HMS1、HMS2为母本与非转基因的722杂交，形成HMS1/722F0:1和HMS2/722F0:1种子。然后，根据HMS株的育性表现特征，采用海南环剥的方法恢复HMS育性，实现了HMS株的育性分离和自交纯合，选育出了海南和南宁稳定表现雄性不育的HMS株。此后，将(HMS1/非转基因野生型722B)和(HMS2/非转基因野生型722B)杂交F1代与稳定性HMS株测交，按照本发明步骤6中的方法分别建立HMS1和HMS2雄性不育株/雄性可育株为1:1永久分离群体。分子鉴定表明，HMS1和HMS2植株及其后代永久分离群体中的雄性不育株，均已导入目标基因，表现为雄性不育性与目标基因共分离。
实施例4红麻转基因质核异源细胞质雄性不育系的创制
2012年10月，分别以上述HMS1和HMS2永久分离群体中的不育株为母本，以异源保持系P3B、F3B、763B、K03B、L23B、917B(均为广西大学周瑞阳选育的细胞质雄性不育保持系；原始品种来源见：桂科鉴字第[2007]177号)为父本杂交，其杂交F1代所有植株均表现为雄性不育，表明其为细胞质遗传的雄性不育；此后，按照本发明步骤6中的方法(2)进行核置换回交，在回交世代中，与恢复系福红992(引自福建农林大学)测定配合力，并选育性状与父本相似、花药不开裂且配合力高的株系继续与父本回交，于2015年10月选育出了具有HMS1和HMS2细胞质，具有P3B、F3B、763B、K03B、L23B、917B细胞核的质核异源细胞质雄性不育系，其相应的轮回亲本即为该不育系的保持系。
实施例5红麻转基因质核同源细胞质雄性不育系的创制
2013年10月，以实施例4中所述HMS1、HMS2永久分离群体中不育株与异源保持系杂交F1代表现细胞质雄性不育的植株为母本，以非转基因的野生型722B为父本，其杂交后代所有植株均表现为雄性不育，表明其细胞核遗传的雄性不育性经过与异源保持系杂交之后已转换为细胞质雄性不育；此后，以此类雄性不育株为母本，继续与非转基因的野生型722B进行核置换回交，在回交世代中，与恢复系福红992(引自福建农林大学)测定配合力，并选育性状与父本相似、花药不开裂且配合力高的株系继续与父本回交，于2016年10月选育出了具有HMS1和HMS2细胞质、722B细胞核的质核同源细胞质雄性不育系。
此后，还可以实施例4中选育的质核异源细胞质雄性不育系或实施例5中选育的质核同源细胞质雄性不育系为细胞质供体，与新的同源或异源保持系进行核置换回交，又可选育出新的质核同源细胞质雄性不育系或质核异源细胞质雄性不育系。
分子鉴定表明，由此选育的细胞质雄性不育系不存在载体质粒序列，这是因为轮回亲本为非转基因保持系，原有HMS1和HMS2的细胞核已被轮回亲本置换所致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种红麻转基因创制细胞质雄性不育系的方法
<130> KHP161119323.4
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 960
<212> DNA
<213> Hcpdil5-2a
<400> 1
atgcatggag tttctatgga gtattctgga cctaggaaag cagacttact tgttcaatat 60
ctgaagaaat tcgttgctcc tgatgtgtct attcttagtt cagactctgc catcaatgat 120
tttgttgaag cagccgggac tttctttcct atatacatag gttttggctt gaatgagaca 180
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ttctcagatg atgccatggt gttgtatgac tttgacaaag ttccttcttt ggtagcactt 300
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Claims (6)

1.一种红麻转基因创制细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、构建可超量表达目标基因的重组表达载体；目标基因如SEQ ID No.1所示；
S2、将上述重组表达载体采用花粉管通道法导入红麻中，收获T0代种子；
S3、播种上述T0代种子获得T1代植株，在T1代植株中筛选出花药不开裂的转基因雄性不育种质HMS株；
S4、将上述转基因雄性不育种质与非转基因的野生型杂交，获得F1代植株；
S5、将表现可育的F1代植株与稳定表现雄性不育的HMS株测交，建立雄性不育株与可育株长期保持1:1分离的永久分离群体；
所述稳定表现雄性不育的HMS株为S3中在海南和南宁种植均表现雄性不育的转基因雄性不育株；
S6、以上述转基因雄性不育种质HMS株或S5所述永久分离群体中的雄性不育株为母本，与异源保持系杂交，并进行和置换回交，即可获得质核异源细胞质雄性不育系；
S7、以S6中质核异源雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，以非转基因的野生型品种/系为父本，进行核置换回交，即可选育出质核同源细胞质雄性不育系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中，将重组表达载体采用花粉管通道法导入红麻保持系722B中。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体含有CaMV35S启动子。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在回交的同时，与多个栽培品种测定配合力，每个世代选择配合力高、性状与父本相似，且花药不开裂的雄性不育株继续回交，同时父本套袋自交，回交不低于5～6代。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述异源保持系是除722B以外的保持系或品种(系)。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，以S6选育的质核异源细胞质雄性不育系或S7选育的质核同源细胞质雄性不育系为母本，与新的同源或异源保持系(品种/系)杂交，并进行核置换回交，又可转育出新的质核同源细胞质雄性不育系或质核异源细胞质雄性不育系；如此循环往复，可不断转育出新的质核同源和质核异源细胞质雄性不育系。
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIN G等: "登录号：HQ638208.1", 《GENBANK》 *
刘冬梅等: "陆地棉蛋白质二硫键异构酶(GhPDIL5-2a)的克隆及其在花药中的表达分析", 《中国农业大学学报》 *
金刚等: "基于简并引物同步克隆两个红麻PDIL同源基因cDNA 5"-末端序列", 《生物技术通报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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