CN106635817B

CN106635817B - 一株高产红曲色素中间产物的红色红曲菌突变株及其用途

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Publication number: CN106635817B
Application number: CN201510738176.1A
Authority: CN
Inventors: 陈福生; 刘姣; 周有祥; 谢娜娜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-11-04
Filing date: 2015-11-04
Publication date: 2019-05-17
Anticipated expiration: 2035-11-04
Also published as: CN106635817A

Abstract

本发明公开一种高产红曲色素中间产物M7PKS‑1[2,4‑二羟基‑6‑(4‑羟基‑2‑氧代戊基)‑3‑甲基苯甲醛]的红色红曲菌突变株，该菌株命名为红色红曲菌ISM[Intermediate secreting mutant],菌种保藏名为Monascus ruber ISM，所述菌株已于2015年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2015074。所述菌株是以红色红曲菌M7(CCAM 070120)为出发菌株，通过基因敲除技术筛选得到的，以高产M7PKS‑1为特征。本发明公开了利用该菌株制备M7PKS‑1的固态发酵法，其固态发酵物中的含量的产量高达10mg/g(以干基计)。通过将所述菌株产物M7PKS‑1与红色红曲菌M7及其部分突变株共培养，可提高其色素产量，表明M7PKS‑1是红曲色素重要中间产物。M7PKS‑1最大紫外‑可见吸收波长为294nm，最大摩尔吸光系数为17640，具备近紫外吸收特性，既可用于研究红曲色素的合成途径，也适用于开发紫外吸收材料。

Description

一株高产红曲色素中间产物的红色红曲菌突变株及其用途

技术领域

本发明属于分子生物学与生物技术领域，涉及一株高产红曲色素中间产物的红色红曲菌(Monascus ruber)工程菌的筛选及其应用。

背景技术

红曲菌(Monascus spp.)又称为红曲霉，是我国及东南亚国家传统的食品发酵微生物，主要用于红曲的生产。红曲是红曲菌发酵米饭后的产物，根据用途不同，红曲可分为色曲、功能曲以及酿酒曲3类，其中色曲是GB2760中允许使用的微生物源天然食品添加剂。此外，红曲菌还可产生多种有益次级代谢产物，如降血脂药物莫纳可林K、降血压药物γ-氨基丁酸和食品着色剂红曲色素(Monascus pigments)等。

红曲色素是红曲菌分泌的次级代谢产物，属于嗜氮酮类化合物，主要包括红、橙和黄3类色素组分，目前至少已有鉴定出90多种红曲色素。红曲色素除具着色功能外，部分红曲色素还具有抗氧化、消炎和抗癌等生物活性，也有报道称红曲色素还可作为太阳能电池原料。红曲色素在食品、医药、工业等领域展现了良好应用前景，潜在经济价值巨大。

红曲色素由聚酮合成途径(polyketone synthesis)合成，但合成途径目前仍存争议。近年来，通过基因敲除技术构建突变株，分析红曲色素合成基因簇基因功能，不仅为解析红曲色素的合成途径提供了重要研究材料，也为获取高品质色素产物(包括中间产物)提供了技术保障。本发明以红色红曲菌M7(CCAM 070120)为出发菌株，利用农杆菌介导转化，通过基因敲除技术筛选得到一株可大量分泌M7PKS-1[2,4-二羟基-6-(4-羟基-2-氧代戊基)-3-甲基苯甲醛]的突变株。M7PKS-1属苯甲醛类衍生物，分子量为252，最大摩尔吸光系数为17640，具备近紫外吸收特性，仅存在于野生菌红色红曲菌M7生长早期(3-9天)，为红曲色素生物合成途径中的重要初始中间产物，该菌株高产M7PKS-1的特征，既可用于红曲色素的合成途径分析，也可用于生产高品质的红曲色素，还可用于开发防晒剂，具有良好的商业和科研价值。

发明内容

本发明目的在于采用农杆菌介导的基因敲除技术，筛选得到了一株高产M7PKS-1的基因缺失突变株；并建立了固体发酵法获取高产量M7PKS-1的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一株高产红曲色素中间产物的突变株，其特征在于，所述菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M2015074，菌株保藏名为Monascus ruber ISM，分类命名为红色红曲菌(M.ruber)ΔMpigJ-R。

本发明的红色红曲菌ΔMpigJ-R的形态学特征为：菌株ΔMpigJ-R在PDA培养基中28℃培养3天即可见清晰的直径约2cm白色菌落，菌落扁平开展，无褶皱，气生菌丝浓密，菌落生长至10天左右背面呈浅黄色。

所述菌株ΔMpigJ-R是以红色红曲菌M7为出发菌株，通过基因敲除技术筛选得到的。

具体方法如下：通过Double-joint PCR方法得到的MpigJ基因序列同源臂和筛选标记hph(潮霉素B抗性基因)的重组片段，其中MpigJ基因序列的同源臂位于筛选标记hph两侧，即为MpigJ敲除盒重组片段；然后通过根瘤农杆菌介导，将MpigJ敲除盒重组片段转入到红色红曲菌M7的孢子中，MpigJ敲除盒两段同源臂与基因组上目的基因MpigJ相对应的同源序列发生双交换重组，使抗性基因hph置换原有的基因编码区，在筛选敲除子过程中，筛选到一株形态特征变化明显的突变株，即本发明所述菌株，并经验证ΔMpigJ-R菌株的基因型为ΔMpigJ-hph-ΔMpigK-ΔMpigL-ΔMpigM-ΔMpigN-ΔMpigP-ΔMpigQ-ΔMpigR，所用引物见表1，验证步骤如下：

1)DNA水平的验证。分别取红色红曲菌M7及ΔMpigJ-R 100μL红曲菌孢子悬浮液(10⁵cfu/mL)接种到铺有玻璃纸的PDA平板上，28℃培养3-5天，收集菌丝，CTAB法抽提红色红曲菌M7及ΔMpigJ-R基因组DNA。以基因组DNA为模板PCR验证ΔMpigJ-R菌株基因背景。

2)RNA水平的验证。分别取红色红曲菌M7及ΔMpigJ-R 100μL红曲菌孢子悬浮液(10⁵cfu/mL)接种到铺有玻璃纸的PDA平板上，28℃培养3-5天，收集菌丝，Trozlo法抽提红色红曲菌M7及ΔMpigJ-R基因组RNA。将所抽提RNA反转为cDNA，以cDNA为模板PCR分析ΔMpigJ-R菌株的基因表达水平。

表1ΔMpigJ-R菌株基因背景的验证所用引物

本发明所述红色红曲菌ΔMpigJ-R产物M7PKS-1的分析

1)菌株选择：红色红曲菌ΔMpigJ-R(CCTCC M2015074)。

2)菌株活化：将上述菌株接种于含有质量百分比为1.5％的琼脂固体PDA斜面上，28℃下静置培养10天。

3)固态发酵：将步骤2)中培养的菌株，在无菌条件下以5mL无菌水洗涤孢子，置于28℃摇床以150转/min振荡30min-1h，将孢子打散。按1％的接种量接种ΔMpigJ-R孢子液(10⁵cfu/mL)于50g米饭培养基中，28℃静置培养7-15天。

4)M7PKS-1的提取纯化：发酵结束后，将样品于40℃烘干至恒重后磨碎，以80％乙醇，1：5料液比，超声提取30min。提取液于12000转/min离心10min，收集上清液，通过反相高效液相色谱的外标定量法，分析固体发酵样品中的M7PKS-1产量可达10mg/g。

5)步骤4)所述的反相高效液相色谱条件为，流动相为乙腈:水＝1:1，流速为0.8mL/min，柱温为30℃，M7PKS-1的保留时间为5.3min，检测波长为294nm。

本发明利用分子生物学技术获得并公开了工程菌株红色红曲菌ΔMpigJ-R，该菌株红曲色素基因簇中的基因型为ΔMpigJ-∷hph-ΔMpigK-ΔMpigL-ΔMpigM-ΔMpigN-ΔMpigP-ΔMpigQ-ΔMpigR，菌株保藏号为CCTCC M2015074，该菌株的产物M7PKS-1在发酵红曲米中的产量可达10mg/g。该产物也存在于野生菌红色红曲菌M7的生长早期(3-9天)，是红曲色素合成途径中的重要初始产物，可用于红曲色素的合成途径分析。此外，该产物最大紫外-可见吸收波长为294nm，其最大摩尔吸光系数为17640，具备近紫外吸收特性，还可用于开发紫外吸收剂，具有良好的商业和科研价值。

附图说明

图1以基因组DNA为模板，红色红曲菌M7及ΔMpigJ-R色素合成基因簇相关基因的扩增结果。单数条带(即条带1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37)均为以M7基因组为模板扩增产物，偶数条带(即条带2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38)均为以ΔMpigJ-R基因组为模板扩增产物。

图2以cDNA为模板，红色红曲菌M7及ΔMpigJ-R色素合成基因簇相关基因的扩增结果。左侧条带均为以M7基因组为模板扩增产物，右侧条带均为以ΔMpigJ-R基因组为模板扩增产物。

图3本发明所述一株高产红曲色素中间产物突变株ΔMpigJ-R的产物M7PKS-1的的质谱图。

图4本发明所述一株高产红曲色素中间产物突变株ΔMpigJ-R的产物M7PKS-1的化学结构式。

图5在PDB液态发酵培养条件下的芳香醇脱氢酶缺失突变株ΔMpigE中添加M7PKS-1可显著增加黄色素FK17-P2b2的产量。

图6在PDB液态发酵培养条件下的芳香醇脱氢酶缺失突变株ΔMpigE中添加M7PKS-1可显著增加黄色素monasfluore A的产量。

图7所述红色红曲菌ΔMpigJ-R与出发菌株红色红曲菌M7(CCAM 070120)在PDB液态发酵培养条件下胞内M7PKS-1的含量差异。

图8所述红色红曲菌ΔMpigJ-R与出发菌株红色红曲菌M7(CCAM 070120)在PDB液态发酵培养条件下胞外M7PKS-1的含量差异。

具体实施方式

微生物来源

实施例中的出发菌株红色红曲菌(Monascus ruber)M7已于2005年保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCAM 070120。

所述转化培养基包括以下组份。

1)10×常量元素溶液(1L)：NH₄NO₃，5g，NaCl，3g，CaCl₂·2H₂O，0.1g，MgSO₄·7H₂O，6g，KH₂PO₄，1.36g。4℃保存。

2)200×微量元素溶液(100mL)：CuSO₄·5H₂O，10mg，ZnSO₄·7H₂O，10mg，H₃BO₃，10mg，Na₂MoO₄·2H₂O，10mg。4℃保存。

3)1000×铁盐溶液(100mL)：Na₂-EDTA·2H₂O，0.130g，FeSO₄·7H₂O，0.100g。4℃保存。

4)1mol/L 2-N-吗啉基乙磺酸(MES)溶液：MES 9.8g，用去离子水溶解，以2mol/LNaOH调pH至5.5，定容至50mL，过滤除菌，分装至无菌离心管，-20℃保存。

5)0.1mol/L乙酰丁香酮(AS)全称溶液：AS 0.196g，用10mL二甲基亚砜溶解，分装至无菌离心管，-20℃保存。

6)20％葡萄糖溶液：2g葡萄糖溶于去离子水中，定容至10mL，115℃灭菌备用。

所述诱导培养基(Induction medium，IM)(100mL)：10×IM大量元素溶液，10mL，200×微量元素溶液，0.5mL，1000×铁盐溶液，0.1mL，50％甘油，1mL，121℃灭菌20min。使用前补加如下试剂：1mol/L MES，1mL，20％葡萄糖，1ml，0.1mol/L AS，0.2mL。

所述共培养培养基Cocultivation medium(Co-IM)(100mL)：10×IM常量元素溶液，10mL，200×微量元素溶液，0.5mL，1000×铁盐溶液，0.1mL，50％甘油，1mL，琼脂粉，2g，121℃灭菌20min。使用前补加如下试剂：1mol/L MES，1mL，20％葡萄糖，0.5mL，0.1mol/LAS，0.4mL。

所述抗性筛选培养基：

100g/L头孢霉素(Cefalothin Sodium，CS)：2.5g CS溶于25mL去离子水中，过滤除菌，分装至无菌离心管，现配现用。

土豆固体(PDA)培养基(1L)：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，121℃灭菌20min。使用前加入潮霉素B溶液和头孢霉素溶液，使其终浓度分别为30mg/L和0.5g/L。

所述发酵培养基：

1)土豆液体(PDB)培养基(1L)：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，121℃灭菌20min。

2)米饭培养基：称取优质大米200g，以1L去离子水浸泡2h，沥干水分，分装至250mL三角瓶中，每瓶50g，121℃灭菌20min，趁热将米粒打散备用。

红色红曲菌基因组DNA的提取：

1)取1-2g培养3-4天的菌丝，放入-80℃预冷研钵中加液氮迅速研磨成粉末，在粉末融化前按0.2g/mL的比例加入65℃预热的5％CTAB提取缓冲液，继续研磨至完全融化，转入已灭菌的离心管，65℃水浴30min，其间每10min取出摇匀一次。

2)取出样品后，冷却至室温，加入等体积的苯酚/氯仿(1:1)，充分混匀，12000转/min离心10min。

3)转移上清于新的1.5mL离心管中，加入等体积氯仿，充分混匀，12000转/min离心10min。

4)转移上清于新的1.5mL离心管中，加入1/10体积3mol/L的醋酸钠和0.6倍体积的异丙醇，充分混匀后，-20℃沉淀30min以上，12000转/min离心10min。

5)弃上清，沉淀用500μL 75％乙醇洗涤，12000转/min离心5min，弃上清。重复洗涤一次。

6)沉淀晾干后加入50μL TE溶解，加5μL RNase(10mg/mL)37℃处理2h。凝胶电泳检测其质量，4℃短期保存，或-20℃长期保存。

5％CTAB提取缓冲液(100mL)：CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)5g，PVP(polyvinylpyrrolidone)40，2g，NaCl，8.2g，0.5mol/L EDTA(pH8.0)，4mL，1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mL。

红色红曲菌总RNA的提取：

1)液氮预冷研钵，取0.1g菌丝体放入研钵中，液氮研磨成粉末，转入灭过菌的1.5mL离心管内。

2)加入1mL的Trizol Reagent，使其覆盖粉末，剧烈震荡使其混匀，静置5min。

3)加入250μL三氯甲烷，颠倒离心管，充分混匀，静置5min，4℃，12000转/min离心15min。

4)将上清转移到新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置15min，4℃，12000转/min离心10min，弃上清，管底的白色沉淀即为RNA。

5)加入75％(v/v)乙醇500μL洗涤沉淀，4℃，7500转/min离心5min。重复一次。

6)将管底液体吸除干净，将离心管置于超净台上自然挥干5min，加入20μL DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶解RNA。凝胶电泳及紫外分光光度计分析RNA的含量及纯度。

红色红曲菌RNA反转录：

1)模板RNA混合液(6μL)：取一PCR管，加入含1μg RNA的溶液，50μmol/L oligo(dT)1μL，DEPC水补足至6μL。

2)70℃保温10min后迅速冰上急冷2min以上，离心数秒使其聚集于管底部。

3)反转录反应液(10μL)：模板RNA混合液6μL，5×M-MLV buffer 2μL，10μmol/LdNTP0.5μL，40U/mL Rnase inhibitor 0.25μL，RTase M-MLV(Rnase H-)0.25μL，DEPC水补足至10μL。

4)42℃保温1h，70℃保温15min后迅速冰上冷却，得到的cDNA溶液-70℃保存。

高产红曲色素中间产物M7PKS-1的菌株ΔMpigJ-R的筛选及验证：以潮霉素B(hph)为筛选标记，包括敲除盒的构建、敲除载体的构建、农杆菌介导的红曲转化三个步骤。

敲除盒的构建：

采用Double-joint PCR技术，将MpigJ的ORF区域的5’-同源臂(5’-UTR)和3’-同源臂(3’-UTR)分别连接在hph基因的两端。

从红色红曲菌M7基因组中克隆MpigJ基因的5’-同源臂和3’-同源臂，从质粒pSKH中克隆hph，采用Double-joint PCR融合3个片段，获得MpigJ敲除盒，融合体系是：2.5μL 10×Easy Taq BufferⅠ，1μL 10mmol/L dNTPs，0.2μL 5U/μL Easy Taq DNA Polymerase，5’-同源臂、hph、3’-同源臂纯化产物共600ng，按1:2:1(摩尔比)的比例加入融合体系，补水至25μL。Double-joint PCR程序是：94℃4min；(94℃30s，58℃4min，72℃4min)×15cycles；72℃7min。以融合PCR产物(敲除盒)为模板，敲除盒两端的引物5F/3R进行敲除盒的富集。PCR程序是：94℃4min；(94℃30s，55℃30s，72℃4min)×30cycles；72℃7min。0.8％(g/v)琼脂糖凝胶分离PCR产物，切胶回收敲除盒。引物序列表2所示：

表2构建ΔMpigJ敲除盒所用引物

实施例中的出发菌株红色红曲菌(Monascus ruber)M7已于2005年保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCAM 070120。本发明公开的工程菌红色红曲菌ΔMpigJ-R已于2015年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M2015074，菌株保藏名为Monascus ruber ISM。

所述红色红曲菌ΔMpigJ-R所产红曲色素中间产物M7PKS-1的制备：

样品粗提取：称取固态发酵样品1g(干重)，粉碎，加入10mL 80％乙醇超声提取30min，5000转/min离心5min，将上清转移至旋转蒸发瓶中，旋蒸直至将溶剂完全蒸干。加入5mL50％乙腈溶解旋蒸瓶中固体残留物，分装于2mL离心管中，12000转/min离心，上清液即为样品提取液。

固相萃取分离纯化：1)先后以1mL甲醇和1mL去离子水活化C₁₈固相萃取小柱；2)取上述样品粗提取液500μL转入活化后的固相萃取小柱，加压使样品进入吸附剂；3)加入4mL去离子水洗涤弱保留干扰化合物；4)加入4mL40％甲醇水溶液洗脱，将洗脱液转移至旋转蒸发瓶中，旋蒸直至将溶剂完全蒸干，所得粉末称重后分装至1.5mL离心管中，-20℃保存，用于制备M7PKS-1。

半制备型HPLC色谱条件：Inertsil ODS-3色谱柱(4.6mm×250mm，10μm)；柱温：30℃；流动相：酸水(去离子水中含5‰的H₃PO₄)/乙腈/水＝5:50:45(v/v)；流速：3.0mL/min；PDA检测器；检测波长：294nm。

HPLC分析条件:Inertsil ODS-3C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈/水＝50:50(V/V)；流速0.8mL/min；柱温25℃；检测波长294nm。

所述红色红曲菌ΔMpigJ-R所产红曲色素中间产物M7PKS-1的结构鉴定。

采用质谱和核磁共振法鉴定了M7PKS-1的结构，质谱图谱见图3，¹H谱、¹³C谱数据见表3。结果显示，M7PKS-1的相对分子质量为252，化学结构式如图4所示。

表3M7PKS-1的¹H谱和¹³C谱数据

所述红色红曲菌ΔMpigJ-R所产红曲色素中间产物M7PKS-1对红曲色素合成的影响：

接种30μL新鲜红色红曲菌ΔMpigE孢子液及1mL 0.1g/mL M7PKS-1溶液至30mLPDB培养基中，28℃，120转/min振荡培养15天。HPLC检测M7PKS-1对ΔMpigE菌株(芳香醇脱氢酶缺失突变株)产色素能力的影响。ΔMpigE菌株为红色红曲菌M7芳香醇脱氢酶缺失突变株，该突变株只能产生五种黄色素，有利于M7PKS-1的功能分析。图5和图6说明在发酵的过程中添加少量的M7PKS-1，即可显著增加不同种类红曲黄色素的产量。

所述红色红曲菌ΔMpigJ-R(CCTCC M2015074)与出发菌株红色红曲菌M7(CCAM070120)在PDB液态发酵培养条件下，色素中间产物M7PKS-1的含量差异。图7，图8分别分析了红色红曲菌M7和ΔMpigJ-R胞内、胞外M7PKS-1的含量，结果说明在出发菌株红色红曲菌M7中M7PKS-1仅存在于发酵初期，而在所述菌株ΔMpigJ-R中大量积累，其最高含量是出发菌株最高含量的4倍，通过固态发酵，HPLC测定该产物的含量可达10mg/g。

本发明利用生物工程技术获得并公开了红色红曲菌工程菌株(ΔMpigJ-∷hph-ΔMpigK-ΔMpigLΔ-MpigM-ΔMpigN-ΔMpigP-ΔMpigQ-ΔMpigR，CCTCC M 2015074)，与初始菌株红色红曲菌M7(CCAM 070120)相比，该突变株可以大量分泌红曲色素中间产物M7PKS-1[2,4-二羟基-6-(4-羟基-2-氧代戊基)-3-甲基苯甲醛]，其固体发酵产量可达10mg/g。M7PKS-1为苯甲醛类衍生物，是红曲色素合成途径中的重要初始产物，其最大紫外-可见吸收波长为294nm，最大摩尔吸光系数为17640，具备近紫外吸收特性，适用于开发紫外吸收剂。该菌株高产M7PKS-1的特征，既可用于红曲色素的合成途径研究，也可用于高品质红曲色素的生产，还可用于开发紫外吸收剂产品，具有良好的商业和科研价值。

Claims

1.一株高产红曲色素中间产物的红色红曲菌菌株，其特征在于：该菌株命名为红色红曲菌(Monascus ruber)ISM(Intermediate secreting mutant)，所述菌株已于2015年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M2015074，菌株保藏名为Monascus ruber ISM。