CN1066331C - 以亮菌为原料制备的液体口服药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种以亮菌为原料制备的液体口服药物。由亮菌菌种在碳/氮比为8/1～80/1的液体培养基中于22℃～28℃发酵培养8-11天后的培养物滤液，与对过滤所得的菌丝体蒸煮1-2小时后的蒸煮液合并的浓缩液构成，其pH4-6，相对密度≥1.15，总含氮量≥0.08%(重量/体积)，还可加入制药中允许的辅助添加成分，辅助添加成分的量为0～10%药物总重量。

Description

以亮菌为原料制备的液体口服药物

本发明涉及的是一种以亮菌为原料制备的液体口服药物。

亮菌，属于自蘑科环菌属假蜜环菌[Armillariella tabecens(scop.ex.Fr)sing]，是一种药用真菌。由于其含有多种氨基酸、多糖、多肽、维生素，以及目前已发现的亮菌甲素、亮菌乙素、亮菌丙素等成分，并具有消退黄胆、消炎、解痉和止痛等作用，现已有将其制成的药物在对急、慢性肝炎，迁延性肝炎、胆道疾病等多种疾病的治疗中被应用。如，早期有以亮菌为原料制备的注射型药物供使用。由于其使用上的不方便，公告号为CN 1031915C的中国专利文献公开了一种用以制备口服型药物“亮菌糖浆”的生产方法。但由于是以固体培养基培养的亮菌菌丝体为原料生产制备，明显存在的问题之一是无法实现工业化大规模生产。目前以固体培养基培养微生物一般最多只能在750毫升的菌种瓶中进行，且培养时间长，上述的亮菌培养通常需50-60天。此外，随固体培养方式带来的另一主要缺点是被污染机会多，且一旦菌种被污染则只能全部丢弃，浪费大。另一方面，该糖浆药物的成分均唯一来自亮菌的菌丝体，且处理的浸煮时间需长达40小时之久。除因成分来源的局限性而影响其糖浆药物的使用效果外，众所周知，对菌丝体的长时间浸煮显然会产生许多不利的反应和变化。大量的氨基酸被破坏，各种不利成分同时混入药物，是影响该糖浆药物的治疗效果及储放稳定性，甚至可能是导致其副作用产生的一个重要因素。

针对上述情况，本发明的目的是提供一种新形式的以亮菌为原料制备的液体口服药物，使其既能有利于大规模工业生产，减少浪费，又能提高使用效果及长期储放稳定性等方面的质量。

本发明所称的以亮菌为原料制备的液体口服药物，是由亮菌菌种在碳/氮比为8/1～80/1的液体培养基中于22℃-28℃发酵培养8-11天后的培养物滤液，与对过滤所得的菌丝体加水蒸煮1-2小时后的蒸煮液合并的浓缩液构成，其pH4-6，相对密度≥1.15，总含氮量≥0.08(重量/体积)。还可加入制药中允许的蔗糖、香精、医用苯甲酸钠等矫味剂、防腐剂等辅助添加成分，辅助添加成分的量为0～10％药物总重量。

为提高药物中各种有益成分和活性成分的含量及生产效率，并保证菌种培养发酵的正常进行，上述成分中所说的亮菌发酵培养物的滤液，以在菌丝体占培养物总重量8-10％时的过滤液为好。

上述亮菌在液体培养基中的发酵培养，可按液体培养真菌的一般方法进行。液体培养基的各种必须营养成分中，碳源可采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、玉米浆、马铃薯、甜菜糖蜜等常用原料或由其制备；氮源可采用氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵等无机氮源，或尿素、用酶水解的蛋白质、氨基酸、玉米浆、麸皮浸出液、酵母浸出液、蚕蛹粉、黄豆粉等常用原料或由其制备。此外，磷、钾、硫、镁、钙、铜、铁、锰、锌、钴等微量元素和无机盐，以及B族维生素等成分按常规也是不可缺少的，但并无其它特殊要求。其发酵培养时培养液通常可保持在其自然形成的pH4-6范围，如有超出，可用少量醋酸调整。培养过程中可按常规方式保持适当的通气量，以增加培养液中菌丝生长所需的氧的溶解量。

经试验，为有利于本发明药物中有益成分和活性成分的增加，提高使用效果，所用液体培养基中的碳源以使用玉米浆、甜菜糖蜜或蔗糖中的至少一种为好；氮源以使用玉米浆、麸皮浸出液、蚕蛹粉或黄豆粉中的至少一种为好，并使其中碳源的糖分(以葡萄糖计)占培养液重量的2％-6％。亮菌菌种于22℃-28℃，在碳/氮比为8/1～80/1的液体培养基中，可采取经两级深层发酵的方式培养。两级培养的接种量均分别为培养液重量的10％，第一级培养5-7天，第二级培养3-4天。

经检测发现，在其液体发酵培养物的培养液中存在有大量的亮菌甲素，亮菌乙素，亮菌丙素，多糖，甘露醇，及精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸丝氨酸等十三种氨基酸，其中含有八种人体必须但自身不能合成的氨基酸，及其它多种有益成分。其有益成分和活性成分的种类及含量均多于菌丝体中的存在量。为最大限度地回收菌丝体中的有益成分和活性成分，只需对过滤所得的菌丝体再进行1-2小时的蒸煮，将蒸煮液与培养物滤液合并浓缩后，根据需要按药典规定加入所说的添加成分，进行必要的灭菌处理后，即是本发明所说的亮菌液体口服药物。

由于液体发酵培养可大规模进行，目前已可在5吨容积的大发酵罐中进行，且培养时间短，仅需8-11天，对菌丝体的蒸煮时间也只有1-2小时，因此生产规模和生产效率均远远大于上述亮菌糖浆以50-60天为一周期的固体培养生产方式。培养发酵过程中被污染的机会也大为减少，对粮食原料的消耗及浪费可比上述亮菌糖浆降低80％以上。试验还表明，本发明的亮菌液体口服药物的稳定性大为提高，存放有效期可达1.5年以上，可比上述亮菌糖浆的存放时间延长50％以上。对用于肝胆疾病治疗使用的观察表明，本发明的亮菌液体口服药物由于不含糖，适用的患者对象可不受限制，使用时的用量也可比上述亮菌糖浆减少～70％，且尚未发现有明显的副作用；对747例病患者使用治愈后的观察也未见有反弹现象发生。而上述亮菌糖浆除因含糖量高达40～80％，明确无法用于糖尿病及禁糖的病患者外，实际使用结果还显示出，胆道梗阻患者必须在手术治疗后才能使用该糖浆，否则会使患者发生呕吐和上腹部阵痛，梗阻加重并加剧疼痛等现象。

以下用具体实例对本发明的上述药物作进一步的说明。但本发明上述主题的范围并非仅限于下述实例。

用于亮菌发酵培养的液体培养基可选用下列各组中的任一组，其中各原料成分的用量均为培养基总重量的百分比例：

培养基1：葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.15，蚕蛹粉0.5，硫酸镁0.075，

         麸皮(煮半小时后除渣)5，其余为无污染的自来水或地下水。

         培养基的碳/氮约为35/1。

培养基2：蔗糖3，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁0.1，玉米浆0.3，

         麸皮(煮半小时后除渣)5，其余为无污染的自来水或地下水。

         培养基的碳/氮约为50/1。

将上述任一种培养基置500毫升三角瓶中，常规方法接种亮菌菌种，于22℃～28℃，置旋转式摇床上以转速220转/分作常规的原种培养。将此亮菌原种按10％的比例接种于种子罐中，在罐压0.5-0.8千克/平方厘米，按每分钟通入培养液体积量30-50％的通风量和22℃～28℃条件下，进行第一级培养5-7天。然后在500升的大罐中，按10％的接种量接种后，在同样罐压、温度及pH4-6等条件，保持20％的通风量，培养3-4天，完成第二级的发酵培养。当第二级培养中的菌丝体离心沉淀量约为培养物总重量的8％～10％，且镜检正常，无杂菌时，放出发酵培养物并过滤。滤得的菌丝体加水常规蒸煮1-2小时，一般可为1.5小时后，将蒸煮液与上述培养物滤液合并，浓缩至相对密度≥1.15，总含氮量≥0.08％(重量/体积)时，按药典常规标准加入蔗糖、香精、医用苯甲酸钠等矫味剂、防腐剂成分，灭菌后即为本发明所称的亮菌液体口服药物。

以本发明上述亮菌口服液药物对有关肝胆疾病和胃病进行的部分临床使用效果观察的试验如下：

1．治疗急性病毒性肝炎的疗效观察试验

四川省彭州市人民医院将急性病毒性肝炎60例分为试验组与对照组，每组各30例。试验组中急性甲型肝炎18例，急性乙型肝炎12例；对照组中急性甲型肝炎22例，急性乙型肝炎8例。各病例均具有黄疸、腹胀纳差、倦怠无力、右上腹疼痛、肝区叩击痛或肝脏肿大等典型症状体征；肝功能试验异常或HAV-IgM阳性，HBV标志阳性。试验组只使用本发明的口服液药物，每次30毫升，每日三次，十天为一疗程。对照组全部按中医辩证施治原则用中药治疗，每日一剂，十日为一疗程。以症状体征消失，肝功能检验及HBV标志正常，肝脏回缩正常为“显效”；以症状体征减轻，体征好转，肝功能检验改善为“有效”；以症状体征无改善或继续进展，肝功能检查无变化为“无效”。试验结果如表1和表2所示。此结果显示，试验组的显效率为86.66％，高于对照组的56.66％，而且有73.33％的病例在用药2-3天后即开始见效，饮食增加，精神好转，右上腹疼痛消失，明显优于对照组。

表1对急性病毒性肝炎治疗的疗效结果

	显效(例)	有效(例)	合计(例)	显效率(％)
试验组	26	4	30	86.66
对照组	17	13	30	56.66

表2急性病毒性肝炎治疗中用药后的有效时间对比

用药后时间(天)	试验组有效数(例)	对照组有效数(例)
			2	10	/
3	12	/
			4	2	1
5	3	3
			6	2	2
7	1	9
			8	/	2
10	/	2
			＞11	/	11

中山医科大学附属第三医院传染病科用本发明的亮菌口服液药物，对急性甲型肝炎1例，急性戊型肝炎6例，慢性乙型肝炎重叠性戊型肝炎4例，慢性病毒性肝炎乙型28例(轻度3例，中度23例，重度2例)和活动性肝硬化4例等各型病毒性肝炎43例进行的治疗观察试验，结果表明临床的显效率为41.8％，总有效率为88.3％。试验中显示，约90％的病人自觉症状明显改善，其中58％在用药后一周症状改善，用药第二周消失，其余病例在用药后第三、四周症状消失，急性肝炎患者症状均消失。并且还有降酶及退黄的作用。同时还表明，本发明的药物对改善慢性肝炎患者的蛋白代谢无明显影响，也未发现有明显不良反应。结论为本发明的亮菌液体口服药物是一种安全、愈小的药物。

与前述的“亮菌糖浆”进行对急性病毒性肝炎的对比治疗也显示，本发明药物的疗效为93.3％，“亮菌糖浆”的疗效为70.2％。

2．治疗胆囊疾病的疗效观察试验

四川省人民医院将慢性胆囊炎病例60例分为试验组和对照组，每组各30例，试验组以每日三次，每次30毫升给予本发明的上述亮菌口服液药物，对照组按每日三次，每次二片，绐予市售的“胆舒胶囊”。均连服四周为一疗程。试验结果，试验组总有效率为83.3％，对照组总有效率为80.0％。经统计学处理二者间无显著差异，但在显效率方面，试验组为41.7％，明显高于对照组的30.0％。此外，在对症状或体征的分项疗效观察中，对恶心的缓解率试验组为80％，对照组为60.0％；对黄疸的消退率试验组为86.7％，对照组为60.0％，试验组均大大高于对照组。

另外，中国人民解放军总医院以本发明上述口服液药物对因高位胆管癌、壶腹周围癌、肝癌、胆石症、胆管炎引起括约肌痉挛等多种原因所致的梗阻性黄疸病人32例进行了临床治疗试验观察，于手术后5～7天开始按每日三次，每次10～20毫升给药，10～15天为一疗程。结果显示，服药后恶心腹胀减轻率为94％，进食改善率为78％，腹痛缓解率93％。胆红质化验检查中，原属重、中、轻度的病例在服药一周内下降一度的显效率为87％，SGPT升高的病例在服药一周内降为正常的占64％。试验表明本发明的上述药物对外科梗阻性黄疸病人在手术后有良好的消炎、消疸、和降低转氨酶的作用。试验中均未发现有明显不良反应，且病员反映药物口感好，易于服用。

与前述的“亮菌糖浆”进行对胆囊炎的对比治疗显示，本发明药物的疗效为86.1％，“亮菌糖浆”的疗效为82.4％。

3．治疗慢性胃炎的疗效观察试验

四川省彭州市人民医院对经纤维胃镜检查证实为慢性胃炎的患者30例，年龄自19岁至80岁，以本发明上述口服液药物进行了治疗试验，按每日三次，每次30毫升给药，4～6周为一疗程。治疗期间不再使用其它药物，以观察疗效。临床症状变化和胃镜观察的结果分别如表3和表4所示。此结果清楚显示出，本发明的亮菌口服液药物在临床上能迅速缓解慢性胃炎的症状，胃镜下的改变也较明显，用药后的病变可明显减轻，甚至消失，并被认为是目前治疗慢性胃炎较为理想的药物。

表3治疗慢性胃炎的临床症状变化情况

临床症状	用药前有症状(例)	用药后仍有症状(例)
					用药后1天	用药后2天	用药后3天
		上腹痛	26	20				10	0
上腹不适	4				3	1	0
		纳差	21	18				11	0
呕吐	11				9	6	0
		胃酸	6	4				3	0
呃气	9				7	2	0

表4治疗慢性胃炎的胃镜观察的变化情况

观察现象	用药前(例)	用药4周后(例)
胃底充血水肿	1	0
胃体充血水肿	10	0
胃体充血出血	7	0
胃窦红白相同	30	24
幽门水肿	5	0
十二指肠球部充血水肿	1	0

四川省人民医院对30例慢性胃炎病例以本发明上述口服液药物进行治疗的试验结果显示，能明显缓解慢性胃炎患者的多种症状体征，治疗总有效率为86.7％，胃镜及病理检查发现炎症明显减轻，好转率77.8％，HP好转率50％，也表明了本发明的上述口服液药物能有效治疗慢性胃炎。

而上述的“亮菌糖浆”目前尚未见有用于治疗慢性胃炎的疗效报导。

以上的试验结果都已清楚说明本发明的亮菌口服液药物在用于对肝炎、胆囊和胆道疾病，以及慢性胃炎等胃部疾病的治疗上都有着显著的效果，为这些疾病的治疗提供了一种具有积极意义，且安全的生物生物制剂药物。

Claims (5)

1．一种以亮菌为原料制备的液体口服药物，其特征在于由亮菌菌种在碳/氮比为8/1～80/1的液体培养基中于22℃-28℃发酵培养8-11天后的培养物滤液，与对过滤所得的菌丝体加水蒸煮1-2小时后的蒸煮液合并的浓缩液构成，其pH4-6，相对密度≥1.15，总含氮量≥0.08％(重量/体积)，加入制药中允许的辅助添加成分，辅助添加成分的量为0～10％药物总重量。

2．如权利要求1所述的液体口服药物，其特征在于所说成分中的亮菌培养物滤液为发酵培养物中的菌丝体占总重量8％-10％时的滤液。

3．如权利要求1所述的液体口服药物，其特征在于所说成分中的亮菌发酵培养物为以亮菌菌种在碳/氮比为8/1～80/1的液体培养基中，于22℃-28℃经两级发酵培养8-11天后的培养物，培养基中碳源的糖分(以葡萄糖计)占培养液重量的2％-6％，第一级培养的接种量为培养液(重量)的10％，培养5-7天，第二级培养的接种量为培养液(重量)的10％，培养3-4天。

4．如权利要求1至3之一所述的以亮菌为原料制备的液体口服药物，其特征在于所说成分中的亮菌发酵培养物中所用培养基的碳源为玉米浆、甜菜糖蜜或蔗糖中的至少一种。

5．如权利要求1至3之一所述的以亮菌为原料制备的液体口服药物，其特征在于所说成分中的亮菌发酵培养物中所用培养基的氮源为玉米浆、麸皮浸出液、蚕蛹粉或黄豆粉中的至少一种。