CN1329503C - 一种利用亮菌强体护肝保健品原液改进亮菌剂型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用亮菌强体护肝保健品原液改进亮菌剂型的方法。其工艺采用微生物液体深层发酵及现代中药制剂方法，该方法能提高亮菌产量和改进良菌剂型。所涉及的工艺流程除传统工艺流程外还包括：菌种斜面培养、液体种子培养和扩大发酵。制作方法为：菌种斜面培养，在液体种子培养基中接入斜面种子，在发酵培养基中接入液体种子发酵，通过收集发酵液及提取菌球中的有效成份，经脱色、浓缩加工为：1.冲剂；2.片剂；3.胶囊。本发明有效地提高了亮菌产量和改进了亮菌的剂型。
Description
技术领域
本发明涉及了一种利用亮菌强体护肝保健品原液改进亮菌剂型的方法，属于生物工程技术和制药工艺领域。
背景技术
随着工业的发展，人类所依赖生存的环境也遭到严重的污染，许多有机物质对人体各个器官都有严重的危害，例如多种人造板材、胶粘剂、墙纸等都含有甲醛，甲醛是世界上公认的潜在致癌物，它刺激眼睛和呼吸道黏膜等，最终造成免疫功能异常、肝损伤、肺损伤及神经中枢系统受到影响；另外，酒精性肝病近年来在我国也达到了不容忽视的程度。酒精对于脏器损害，以肝脏最为严重，我国的酒民三亿多人，其中酒精性肝病的发病率在百分之二十左右，如果因饮酒过度而使肝脏受到损伤，而不加以防治，其中很大部分会转变为酒精肝，并有癌变的可能。而亮菌保健品可以通过其独特的护肝作用对化学肝损伤患者，特别是酒精性肝病起到防护治疗的作用。强体护肝保健品的开发，可以减少肝病患者的数量，增强患者的体质，具有较大的社会效益。
经研究，亮菌具有多种医疗保健功能，不仅能提高人体免疫能力，而且对化学肝损伤也有较好的疗效。亮菌(假蜜环菌[Armillariella tabescens(Scop.ex Fr.)Sing])是为我国首次发现并拥有自主知识产权的一种真菌。《中药大词典》记载：亮菌为白蘑科真菌假蜜坏菌的菌丝体，具有治疗肝炎，胆囊炎，阑尾炎，中耳炎的主治功效。我国民间流传作为治疗急慢性肝炎及胆道疾病的中草药。主要原因是在其发酵提取物中含有多种生物有效及活性成份，如亮菌甲、乙、丙素，亮菌多糖、多肽及氨基酸、微量元素、天然甘露醇。亮菌中含有多种不同成分的多糖，能提高机体的免疫作用，还具有辐射防护和升白作用，这是因为亮菌多糖能加速造血组织细胞DNA的合成；亮菌甲素是一种香豆素衍生物，具有消炎、解痉、止痛的功能，用于急性胆囊炎、急慢性肝炎、胆石症和慢性浅表性、萎缩性胃炎；多肽和氨基酸提供了合理的能源底物维持氮平衡提高血浆中总蛋白、白蛋白的含量，使损伤的肝组织得以修复再生，另外氨基酸虽没有免疫原性，但可起半抗原的作用与大分子载体结合成复合物，即可获得免疫原性，刺激机体产生抗体或淋巴细胞，调整机体的免疫力。天然甘露醇能提高血浆渗透压，使组织间液水分向血浆转移而产生组织脱水作用，可使肝腹水病人迅速消除腹水。自其于二十世纪七十年代被发现以来，就一直用于治疗肝炎，胃病及胆囊炎，其疗效是相当肯定的。
现在市场已经有亮菌口服液出售，其产品主要采用价廉且易得的玉米粉、红薯粉等按一定比例混合配制固体培养基，灭菌接种，然后在室内避光培养两个月左右，取出后用热水煮提，离心除杂质，加入辅料后制成成品。
其生产工艺流程如下：培养基制备——亮菌接种发酵——沸水煮提——脱色除杂——加辅料分装——成品。
但是明显存在的问题是：1.通过固态发酵无法实现工业化大规模的生产。目前以固体培养基培养微生物一般只能在750毫升的菌种瓶中进行，培养时间较长，不易形成工业化规模的生产。2.在产品剂型上除亮菌口服液外还没有其它相关剂型产品的出现，但是口服液具有服用剂量大，保藏期短，运输不方便等缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点，提供一种利用亮菌强体护肝保健品原液改进亮菌剂型的方法。
本发明是这样实现的：
发明要解决的技术问题
(1)采用液体深层发酵，优化培养条件，大大缩短发酵时间，在短时间内使菌丝得到充分的生长，提高了生产效率。
(2)筛选出独特的培养基配方，使亮菌经过代谢转化的有效成分对提高免疫力和防治化学肝损伤更加有效。
(3)通过有机溶剂沉淀、浓缩制备亮菌粉料，使其容易改造成不同剂型的保健品。
(4)改进亮菌剂型，克服以前亮菌口服液的种种弊端，例如：有效成分含量少，起效慢，不易运输，难储藏等。
所涉及的工艺流程包括：
亮菌——斜面培养——液体种子培养——发酵培养——收集(菌球并提炼和发酵液)——合并提取液和发酵液——脱色——成品(冲剂、片剂、胶囊)。所述工艺流程中的制作方法为：
1：亮菌各级菌种的制备
a、菌种斜面培养：将菌种无菌接于PDA斜面，放入28℃培养箱培养10-15天。
b、液体种子培养基为：土豆汁20％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、Vb1少量，PH6.0。按常规方法配置，分装转入三角瓶中，加塞密封，蒸汽加压至121℃灭菌，保压30min后冷却至25-28℃，接入斜面种子进行液体种子培养。
c、发酵培养基：葡萄糖3％、土豆汁14％、玉米粉5％、豆芽汁3％、氯化铵0.5％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.3％，PH 6.0。按常规方法配置，分装转入三角瓶中，加塞密封，蒸汽加压至121℃灭菌，保压30min后冷却至25-28℃，接入液体种子进行发酵。
2：接种方法和接种量的要求
a、试管斜面采用接种针挑取菌丝接种；液体种子摇瓶接种是将培养好的斜面菌种割取1cm2，然后接种于250ml或500ml装有液体培养基的三角瓶中；发酵培养接种采用直接取10％的摇瓶种子无菌操作转入的方法。
b、各级种子培养条件
各级种子培养制备的温度28℃，液体种子摇瓶和扩大发酵140rpm摇床中振荡避光培养6天。
3：亮菌保健品原液的制备
a、从发酵液中收集亮菌菌丝球，用沸水回流煮提两次，合并两次滤液。
b、将提取液和发酵液合并后离心除杂质。将上清液加热至50℃，加入脱色剂搅拌5h脱色后，离心去杂质得亮菌保健品原液。
4：保健品剂型的制备
a、亮菌冲剂的制备
在原液中加入淀粉30％、糊精20％、蔗糖粉10％等辅料，混匀后，将上述浆液进行喷雾干燥，喷雾干燥的进口温度为110-150℃，出口温度50-60℃。过筛40-60目，分装。
b、亮菌片剂的制备
将亮菌原液浓缩至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀过夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚连续洗涤，得干燥的粉末。按重量比亮菌粉末40、淀粉30、糊精20、蔗糖10混匀后以95％乙醇为湿润剂，过20目筛网制成湿颗粒，于60℃烘箱中干燥至水分含量为5％，整粒20目，加3％滑石粉压片。
c、亮菌胶囊的制备
将亮菌原液浓缩至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀过夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚连续洗涤，得干燥的粉末。按重量比亮菌粉末40、淀粉35、糊精25混匀后以95％乙醇为湿润剂，过40目筛网制成湿颗粒，于60℃烘箱中干燥至水分含量为5％，干燥的粉末过80-120目筛得胶囊内容物，填充胶囊即得亮菌胶囊。
本发明的有益效果在于：
1.生产工艺上采用液体深层发酵法，优点在于：培养基配方廉价，培养条件适宜亮菌的生长，大大缩短发酵时间，在短时间内使菌丝得到充分的生长，提高了生产效率。
2.独特的培养基配方，经亮菌转化后产生大量的生物活性物质，对提高免疫力和防治化学肝损伤更加有效。
3.首次发现并证明亮菌经发酵后的产物对化学肝损伤有预防和恢复的作用。
4.亮菌粉料的制备使制备剂型多，运输方便，保存期长，也便于患者服用。
实施例
实例1
亮菌原液的制备
1.菌种采用北京微生物菌种保藏中心的菌种[Armillariella tabescens(Scop.ex Fr.)Sing]
2.菌种斜面培养：将购的菌种无菌接于PDA斜面，放入28℃培养箱培养10-15天。
3.制备摇瓶液体种子：割取培养好的斜面菌种接于250ml或500ml装有液体培养基的三角瓶中，置28℃、140rpm摇床中振荡避光培养7天。上述液体种子培养基为：土豆汁20％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、Vb1少量，PH6.0。
4.亮菌发酵：将液体种子按发酵培养基的10％接种量接种，置24℃、140rpm摇床振荡培养6d。发酵培养基为：葡萄糖3％、土豆汁14％、玉米粉5％、豆芽汁3％、氯化铵0.5％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙03％、PH6.0。
5.从发酵液中收集亮菌菌丝球，用沸水回流煮提两次，合并两次滤液。
6.将提取液和发酵液合并后离心除杂质。将上清液加热至50℃，加入脱色剂搅拌5h脱色后，离心去杂质得亮菌保健品原液。
实例2
亮菌冲剂的制备
在原液中加入淀粉20％、糊精20％、蔗糖粉10％等辅料，混匀后，将上述浆液进行喷雾干燥，喷雾干燥的进口温度为110-150℃，出口温度50-60℃。过筛40-60目，分装。主要技术指标如下：
有效多糖22.1％，蛋白质15.6％，多肽11.3％，水分4.3％。
实例3
亮菌片剂的制备
将亮菌原液浓缩至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀过夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚连续洗涤，得干燥的粉末。按重量比亮菌粉末40、淀粉30、糊精20、蔗糖10混匀后以95％乙醇为湿润剂，过20目筛网制成湿颗粒，于60℃烘箱中干燥至水分含量为5％，整粒20目，加3％滑石粉压片。每片重量0.4g。产品主要技术指标如下：
有效多糖26.5％，蛋白质17.8％，多肽12.1％，水分4.1％。
实例4
亮菌胶囊的制备，
将亮菌原液浓缩至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀过夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚连续洗涤，得干燥的粉末。按重量比亮菌粉末40、淀粉30、糊精20、蔗糖10混匀后以95％乙醇为湿润剂，过40目筛网制成湿颗粒，于60℃烘箱中干燥至水分含量为5％，干燥的粉末过80-120目筛得胶囊内容物，填充胶囊即得亮菌胶囊。主要技术指标如下：
有效多糖28.6％，蛋白质16.7％，多肽11.8％，水分4.5％。
本发明的动物实验
一、动物免疫实验
实验材料
1、菌种：假蜜环菌[Armillariella tabescens(Scop.ex Fr.)Sing]购自北京中科院微生物研究所。
2、动物：小鼠、豚鼠由四川省中药研究所动物实验中心提供。
实验方法
吞噬功能实验
体液免疫功能的检测(溶血素含量的测定)
实验结果
对小鼠RES吞噬功能的影响
从表3-1中可见，亮菌多糖高剂量组与正常组相比小鼠的吞噬系数有显著差异(P＜0.01)，吞噬系数明显增高，但对吞噬指数和免疫器官却没有明显影响。说明一定剂量的亮菌多糖可增强小鼠RES吞噬功能，但不是促进吞噬细胞的增殖。
表3-1亮菌多糖及亮菌口服液对小鼠RES吞噬功能的影响
| 药物 | 剂量(mg/10g·d) | 动物数(只) | 吞噬指数K | 吞噬系数a |
| 对照组 | - | 9 | 0.0539±0.0161 | 6.13±0.75 |
| 亮菌多糖 | 1.8 | 11 | 0.0692±0.0232 | 7.18±0.74** |
*P≤0.05 **P≤0.01
表3-2亮菌多糖及亮菌口服液对小鼠免疫器官的影响
| 药物 | 剂量(mg/10g) | 肝/体重 | 脾/体重 |
| 对照组 | - | 0.05405±0.0056 | 0.006833±0.001861 |
| 亮菌多糖组 | 1.80 | 0.05059±0.0062 | 0.006318±0.002129 |
*P≤0.05 **P≤0.01
对小鼠溶血素抗体生成的影响
与环磷酰胺组比较，亮菌多糖对于环磷酰胺所致的免疫低下的小鼠有显著的增强免疫的作用；与正常对照组比较，亮菌多糖对正常小鼠的吞噬功能没有显著增强趋势(表3-3)。
表3-3亮菌多糖及亮菌口服液对小鼠溶血素形成的影响
| 组别 | 剂量(mg/10g·d) | 动物数(只) | 溶血素形成(0.D值) |
| 环磷酰胺+亮菌多糖 | 1.8 | 9 | 0.3387±0.1563* |
| 环磷酰胺组 | - | 9 | 0.1649±0.1257 |
| 亮菌多糖组 | 1.8 | 10 | 0.2301±0.1317 |
| 正常对照组 | - | 9 | 0.1948±0.0987 |
*P≤0.05
讨论
本实验选用亮菌多糖作为研究对象，测定了亮菌多糖对小鼠体液免疫和细胞免疫功能的影响。通过对小鼠RES吞噬活性、血清溶血素值测定，结果表明亮菌多糖体内给药能显著提高小鼠的吞噬系数，激活小鼠网状内皮系统，增强其吞噬功能；能显著增强环磷酰胺所致的免疫低下小鼠的体液免疫功能。
二、动物保肝实验
实验材料
动物小鼠由四川省中药研究所动物实验中心提供
药品和试剂亮菌多糖溶液(低剂量0.1g/kg；中剂量0.2g/kg；高剂量0.4g/kg)；0.1％四氯化碳(用油配)；ACP试剂盒(批号1003041)
实验方法
(1)小鼠分组：50只小鼠随机分成5组(雌雄各半)，第一组为正常对照组；第二组为模型组；第三、四、五组为喂药组(固体)，分为低剂量0.2g/kg、中剂量0.4g/kg、高剂量组0.8g/kg，每天以0.1ml/10g灌胃一次，连续喂药7天；第六、七、八组为给药组(液体)，分为低剂量0.2g/kg、中剂量0.4g/kg、高剂量组0.8g/kg，每天以0.1ml/10g灌胃一次，连续喂药7天；
(2)造型：第7天灌胃半小时后，剂量组与模型组腹腔注射0.1％四氯化碳(0.1mg/10g)。
(3)造型后的第二天眼眶取血1-2ml，2400rpm离心15min，取血清。
(4)检测指标：血清谷丙转氨酶(ALT)。
实验结果
| 药物 | 剂量(mg/10g·d) | 动物数(只) | 血清谷丙转氨酶(ALT)(KarU) |
| 对照组 | - | 10 | 61.5318±23.4273 |
| 模型组 | - | 10 | 181.6650±57.6920 |
| 液体发酵亮菌多糖低剂量组 | 20 | 10 | 120.3698±54.0843* |
| 液体发酵亮菌多糖中剂量组 | 40 | 10 | 108.4475±38.1581** |
| 液体发酵亮菌多糖高剂量组 | 80 | 7 | 102.5838±38.2817** |
*P≤0.05 **P≤0.01
结果分析
通过给小鼠注射四氯化碳造肝损伤模型，最后取血检测ALT，亮菌多糖组与模型组进行比较结果表明：液体发酵亮菌多糖低剂量组对化学肝损伤的预防起到了显著效果；液体发酵亮菌多糖中剂量组和高剂量组对化学肝损伤的预防效果比低剂量组更好。
亮菌保健品的用途和使用效果
亮菌作为一种药用真菌。它可以为人们提供多种营养物质，在其液体发酵培养物的培养液中存在大量的多糖和蛋白质，除此之外还存有大量亮菌甲素，亮菌乙素，亮菌丙素，甘露醇，及精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、丝氨酸等十三种氨基酸，其中含有八种人体必须但是不能自身合成的氨基酸，及其它多种有益成分，可对造成人类健康威胁的许多疾病起着预防和治疗的作用。归纳起来看，亮菌保健品对人体的保健功能主要有下列一些：
1.提高人体免疫力
2.对化学肝损伤有一定疗效
3.防辐射作用
4.治疗肝炎、胃炎、胆囊炎
虽然亮菌已进入真菌药物的市场，但是由于其制备工艺及产品剂型等原因，还未形成较大的市场，因此亮菌保健品的开发必将具有美好的前程。
Claims (4)
1、一种利用亮菌强体护肝保健品原液改进亮菌剂型的方法，所涉及的工艺流程包括：
其特征在于：
a、菌种斜面培养：将菌种无菌接于PDA斜面，放入28℃培养箱培养10-15天；
b、液体种子培养基为：土豆汁20％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、Vb1少量，PH6.0，按常规方法配置，分装转入三角瓶中，加塞密封，蒸汽加压至121℃灭菌，保压30min后冷却至25-28℃，接入斜面种子；
c、发酵培养基：葡萄糖3％、土豆汁14％、玉米粉5％、豆芽汁3％、氯化铵0.5％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.3％，PH6.0，按常规方法配置，分装转入三角瓶中，加塞密封，蒸汽加压至121℃灭菌，保压30min后冷却至25-28℃，接入液体种子进行发酵；
d、将亮菌原液浓缩至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀过夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚连续洗涤，得干燥的粉末。
2、根据权利要求1所述的一种利用亮菌强体护肝保健品原液改进亮菌剂型的方法，其特征在于：接种方法和接种量的要求
a、试管斜面采用接种针挑取菌丝接种，液体种子摇瓶接种是将培养好的斜面菌种割取1cm2，然后接种于250ml或500ml装有液体培养基的三角瓶中，发酵培养接种采用直接取10％的摇瓶种子无菌操作转入的方法；
b、各级种子培养条件
各级种子培养制备的温度28℃，液体种子摇瓶和扩大发酵140rpm摇床中振荡避光培养6天。
3、根据权利要求1所述的一种利用亮菌强体护肝保健品原液改进亮菌剂型的方法，其特征在于：亮菌保健品原液的制备
a、从发酵液中收集亮菌菌丝球，用沸水回流煮提两次，合并两次滤液；
b、将提取液和发酵液合并后离心除杂质，将上清液加热至50℃，加入脱色剂搅拌5h脱色后，离心去杂质得亮菌保健品原液。
4、根据权利要求1所述的一种利用亮菌强体护肝保健品原液改进亮菌剂型的方法，其特征在于：保健品剂型的制备
a、亮菌冲剂的制备
在原液中加入淀粉30％、糊精20％、蔗糖粉10％等辅料，混匀后，将上述浆液进行喷雾干燥，喷雾干燥的进口温度为110-150℃，出口温度50-60℃，过筛40-60目，分装；
b、亮菌片剂的制备
将亮菌原液浓缩至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀过夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚连续洗涤，得干燥的粉末，按重量比亮菌粉末40、淀粉30、糊精20、蔗糖10混匀后以95％乙醇为湿润剂，过20目筛网制成湿颗粒，于60℃烘箱中干燥至水分含量为5％，整粒20目，加3％滑石粉压片；
c、亮菌胶囊的制备
将亮菌原液浓缩至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀过夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚连续洗涤，得干燥的粉末，按重量比亮菌粉末40、淀粉35、糊精25混匀后以95％乙醇为湿润剂，过40目筛网制成湿颗粒，于60℃烘箱中干燥至水分含量为5％，干燥的粉末过80-120目筛得胶囊内容物，填充胶囊即得亮菌胶囊。
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