CN1895292B - 一种亮菌胶囊药物及其鉴别方法和质量标准检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种亮菌胶囊药物及其鉴别方法和质量标准检测方法，它的每克内容物中的多糖含量为以无水葡萄糖(C6H12O6)计≥6 0mg，多肽含量以牛血清白蛋白计≥60mg。标准质量检测方法则包括多糖及多肽两项内容，其主要步骤均为：对照品及供试药品的溶液制备，对照品溶液经过照分光光度法计算得出多糖或多肽含量与吸收度的的回归方程，再测出供试药品的吸收度得到供试品药品的多糖或多肽含量。该种亮菌胶囊药物的有效药物成分含量高，疗效好，保质期长，储藏运输及其服用均方便。而其质量标准检测方法精密度高，重现性好、稳定可靠，能够很好控制产品质量以保证工业化生产的产品质量和临床疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种亮菌胶囊药物及其鉴别方法和质量标准检测方法。
背景技术
亮菌〔Armillarella tabescens(Scop.exFr)Sing〕是一种能增强人体体质，提高免疫功能，并具有消炎、止痛、降酶、退黄及利胆作用的药用真菌，其制剂临床常用于治疗急、慢性肝炎、迁延性肝炎、慢性胆管炎和胆囊炎及慢性、浅表性、萎缩性胃炎、中耳炎及放疗化疗引起的白细胞减少症等。但现有制剂均为液体制剂，而无胶囊制剂，并且固体的亮菌提取物药物的鉴别与检测困难，重复性差，使得固体的亮菌胶囊药物无法工业化生产与临床应用。液体制剂的亮菌药物，其存在的问题是：有效药物成分含量低，疗效有待提高，且其保质期短，储藏运输及其服用均不方便，严重妨障了亮菌药物的临床使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种亮菌胶囊药物，该种亮菌胶囊药物的有效药物成分含量高，疗效好，保质期长，储藏运输及其服用均方便。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种亮菌胶囊药物，由亮菌发酵物制得，其特征在于：胶囊药物的每克内容物中的多糖含量为以无水葡萄糖(C6H12O6)计≥60mg，多肽含量以牛血清白蛋白计≥60mg。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：药物成分以固体方式存在于胶囊中，储存运输、携带及服用均很方便，且其药物有效药物成分含量高，不易变质，保质期长。
上述的药物的剂性为硬胶囊剂，内容物为浅棕黄色或浅黄色粉末，气清香。
本发明的另一目的是提供一种上述亮菌胶囊药物的质量标准检测方法，该种质量标准检测方法精密度高，重现性好、稳定可靠，能够很好控制产品质量以保证工业化生产的产品质量和临床疗效。
本发明提供的一种亮菌胶囊药物的质量标准检测方法，分为多糖含量和多肽含量的测定两项内容，其特点是，所述的多糖含量的测定步骤为：
A、对照品溶液的制备取经102℃-110℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品加水制成每1ml含无水葡萄糖0.08-0.12mg的溶液。
B、供试品溶液的制备a、取亮菌胶囊药物的内容物，研细、精密称定1g左右并记录称取量；置量瓶中，加水35-45ml，置75-85℃恒温水浴中加热25-35分钟，时时振摇，取出，冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀；b、用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取1ml滤液，置10ml离心管中，加无水乙醇6.5-7.5ml；c、在旋涡混悬器上混合25-35秒，以每分钟2500-3000转离心12-18分钟；d、取沉淀加无水乙醇5.5-6.5ml，重复c步的步骤，再取沉淀加无水乙醇5.5-6.5ml，重复c步的步骤；e、将d步得到的沉淀用水转至量瓶中，加水稀释至100ml摇匀，作为供试品溶液。
C、标准曲线的制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液0.8-1.3ml，摇匀，迅速加入硫酸4.0-5.0ml，摇匀，放冷至室温，以未量取对照品溶液的0管为空白，照分光光度法在490nm的波长处测定吸收度，计算出葡萄糖的量与对应的吸收度的回归方程。
D、测定精密量取供试品溶液1.0ml，再加3％苯酚溶液0.8-1.2ml，摇匀，迅速加入硫酸4.5ml，摇匀，放冷至室温，以C步中的0管为空白，照分光光度法在490nm的波长处测定吸收度，根据测得的吸收度，再由C步的回归方程计算出供试品的多糖含量；再根据B步记录的药物称取量，计算出每克胶囊内容物的多糖含量。
本发明的一种亮菌胶囊药物的质量标准检测方法，其中多肽含量的测定方法为：
A、对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml含0.25-0.35mg的溶液。
B、供试品溶液的制备取亮菌胶囊药物的内容物，研细、精密称定1g左右，并记录称取量；置于量瓶中，加水35-45ml，置75-85℃恒温水浴中加热25-35分钟，时时振摇，取出，冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀；用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取2ml滤液，置于量瓶中，加水稀释至100ml，摇匀。
C、福林酚试液的配制：
福林酚甲液的配制：a、取酒石酸钾钠0.4-0.6g，加水50ml溶解，b、取硫酸铜0.4-0.6g，加水60ml溶解，c、取氢氧化钠8-12g与碳酸钠45-55g，加水400ml溶解，临用前分别取a、b、c三种溶液按1∶1∶8混匀。
福林酚试液乙液的配制：将上述福林酚甲液加水稀释8倍。
D、标准曲线的制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加福林酚试液甲液1.0ml，摇匀，室温放置8-12分钟后，加入福林酚试液乙液4.0ml，摇匀，于50-60℃水浴中保温4-7分钟，取出，放冷至室温；以未量取对照品溶液的0管为空白，照分光光度法在650nm的波长处测定吸收度，并计算出牛血清白蛋白的量与对应的吸收度的回归方程。
E、测定精密量取供试品溶液1.0ml，再加福林酚试液甲液1.0ml，摇匀，室温放置8-12分钟后，加入福林酚试液乙液4.0ml，摇匀，于50-60℃水浴中保温4-7分钟，取出，放冷至室温；以D步中的0管为空白，照分光光度法在650nm的波长处测定吸收度，再由D步的回归方程计算出供试品溶液的多肽含量；再根据B步记录的药物称取量，计算出每克胶囊内容物的多肽含量。
以下的实验证明，本发明的上述质量标准检测方法，精密度符合要求，重现性好，样品在4小时内测定含量稳定。该质量标准检测方法，能够很好控制产品质量。
1、供试药物样品稳定性试验：采用本发明的质量标准检测方法对本发明的一批亮菌胶囊药物样品5份，制成多糖及多肽测定的供试品溶液，每间隔60分钟测定其多糖含量和多肽含量，结果如下表：
| 测定时间 | 0分钟 | 60分钟 | 120分钟 | 180分钟 | 240分钟 | RSD |
| 多糖含量 | 78.6 | 78.4 | 78.5 | 78.4 | 78.7 | 0.17％ |
| 多肽含量 | 72.3 | 72.4 | 72.1 | 72.2 | 72.1 | 0.18％ |
多糖RSD＝0.17％ 多肽RSD＝0.18％
表明供试品溶液在4小时内含量稳定。
2、精密度试验：取亮菌胶囊8份，每份5粒，分别测定其多糖和肽含量，结果如下表：
| 样品号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | RSD |
| 多糖含量 | 78.5 | 78.6 | 78.3 | 78.4 | 78.7 | 78.5 | 78.4 | 78.5 | 0.16％ |
| 多肽含量 | 72.1 | 72.4 | 72.3 | 72.2 | 72.1 | 72.3 | 72.2 | 72.3 | 0.92％ |
多糖RSD＝0.16％ (N＝8) 多肽RSD＝0.92％ (N＝8)
表明本发明的质量标准检测方法精密度符合要求。
3、重现性试验：取同一批药物样品6份，每份5粒，分别测定其多糖和肽含量，结果如下表：
| 样品号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD |
| 多糖含量 | 78.6 | 78.5 | 78.4 | 78.7 | 78.3 | 78.5 | 0.18％ |
| 多肽含量 | 72.3 | 72.2 | 72.4 | 72.1 | 72.3 | 72.2 | 0.15％ |
多糖RSD＝0.18％ (N＝6) 多肽RSD＝0.15％ (N＝6)
表明本发明的质量标准检测方法重现性好。
4、中试生产三批次产品质量情况的实际检验
按照本发明的质量标准检测方法对本发明的的亮菌胶囊药物，取中试生产的三个批次产品进行了检验，结果均符合规定要求，见下表。
可见，通过上述的质量标准检测方法，可以确保工业化生产出的本发明的亮菌胶囊药物的多糖和多肽两种有效药物成分的含量达到规定标准，保证胶囊药物成分含量一致性，从而确保药物的疗效，以利其大规模临床使用。
本发明的第三个目的是提供上述的亮菌胶囊药物的鉴别方法：以方便在不需要定量分析的情况下，对该药物进行简单的鉴别和判定，尤其适合基层医院使用。
上述的亮菌胶囊药物的第一种鉴别方法为：取胶囊内容物1g，加蒸馏水40-60ml加热溶解，脱脂棉过滤；取滤液1.8-2.3ml，加茚三酮试液0.5ml，加热后，呈蓝紫色则判定内容物含有亮菌药物。
上述的亮菌胶囊药物的第二种鉴别方法的步骤为：
A、取胶囊内容物研细、称取0.9-1.1g，置量瓶中，加水35ml-45ml，置75℃-85℃恒温水浴中加热25-35分钟，时时振摇，取出，放冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀。
B、将A步的溶液用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取1ml滤液，置10ml离心管中，加无水乙醇6.5-7.5ml，在旋涡混悬器上混合25-35秒，以每分钟2500-3000转离心12-18分钟。
C、取B步的沉淀加水2ml使溶解，移至试管中，加15％甲萘酚乙醇溶液1-3滴，试管壁加0.7-1.5ml浓硫酸，两液接界处若成紫红色环，则判定内容物含有亮菌药物。
上述的亮菌胶囊药物的第三种鉴别方法的步骤为：
A、取胶囊内容物1.5g，加水40-60ml，煮沸12-18分钟，趁热用脱脂棉滤过，滤液放冷，加乙醚18-23ml振摇提取，分取乙醚液，用脱脂棉滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇0.5ml溶解，作为供试品溶液。
B、另取亮菌甲素对照品，加无水乙醇制成每1ml含8-12ug的溶液，作为对照品溶液。
C、按照照薄层色谱法试验，吸取上述A、B步的两种溶液各8-12ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以配比为8∶2∶0.5∶10的正丁醇-甲醇-浓氨试液-水的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱图相应的位置上，呈相同颜色的荧光斑点，则判定供试胶囊内容物中含有亮菌药物。
以上三种鉴别方法均能在不需要复杂的仪器的情况下，即可对本发明的胶囊药物进行鉴别，判定胶囊内容物是否含有亮菌药物，从而方便对本发明的药物进行简单的鉴别，条件较差的基层医院及药店也能据以进行鉴别。从而更加有利于本发明的药物的临床推广使用。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例一
一种亮菌胶囊药物，由亮菌经发酵后得到的发酵物，通过现有的药物提取工艺提取及胶囊制剂工艺即制成该药物。通过检验：胶囊药物的每克内容物中的多糖含量为以无水葡萄糖(C6H12O6)计≥60mg，多肽含量以牛血清白蛋白计≥60mg，即为合格产品。剂型一般采用硬胶囊剂，其内容物为浅棕黄色或浅黄色粉末，气清香。当然剂型也可以选用软胶囊。
本例的胶囊药物的质量标准检验方法，分为多糖含量和多肽含量的测定两项内容。
其中多糖含量的测定步骤为：
A、对照品溶液的制备取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品加水制成每1ml含无水葡萄糖0.1mg的溶液。
B、供试品溶液的制备a、取亮菌胶囊药物的内容物，研细、精密称定1g左右并记录称取量；置量瓶中，加水40ml，置80℃恒温水浴中加热30分钟，时时振摇，取出，冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀；b、用脱脂棉滤过，弃去初始滤液(由于初始滤液中可能带有脱脂棉上的污物，因此弃去不用)，精密量取1ml滤液，置10ml离心管中，加无水乙醇7ml；c、在旋涡混悬器上混合30秒，以每分钟3000转离心15分钟；d、取沉淀加无水乙醇6ml，重复c步的步骤，再取沉淀加无水乙醇6ml，重复c步的步骤；e、将d步得到的沉淀用水转至量瓶中，加水稀释至100ml摇匀，作为供试品溶液。
C、标准曲线的制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液1.0ml，摇匀，迅速加入硫酸4.5ml，摇匀，放冷至室温，以未量取对照品溶液的0管为空白，以中国药典2000年版二部附录IVB记载的照分光光度法，在490nm的波长处测定吸收度，计算出葡萄糖的量与对应的吸收度的回归方程。
D、测定精密量取供试品溶液1.0ml，再加3％苯酚溶液1.0ml，摇匀，迅速加入硫酸4.5ml，摇匀，放冷至室温，以C步中的0管为空白，照分光光度法在490nm的波长处测定吸收度，根据测得的吸收度，再由C步的回归方程计算出供试品的多糖含量；再根据B步记录的药物称取量，计算出每克胶囊内容物的多糖含量。
亮菌胶囊药物的质量标准检测方法中的多肽含量的测定方法为：
A、对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml含0.3mg的溶液。
B、供试品溶液的制备取亮菌胶囊药物的内容物，研细、精密称定1g左右，并记录称取量；置于量瓶中，加水40ml，置80℃恒温水浴中加热30分钟，时时振摇，取出，冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀；用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取2ml滤液，置于量瓶中，加水稀释至100ml，摇匀。
C、福林酚试液的配制：
福林酚甲液的配制：a、取酒石酸钾钠0.5g，加水50ml溶解，b、取硫酸铜0.5g，加水60ml溶解，c、取氢氧化钠10g与碳酸钠50g，加水400ml溶解，临用前分别取a、b、c三种溶液按1∶1∶8混匀。
福林酚试液乙液的配制：将上述福林酚甲液加水稀释8倍。
D、标准曲线的制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加福林酚试液甲液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林酚试液乙液4.0ml，摇匀，于55℃水浴中保温5分钟，取出，放冷至室温；以未量取对照品溶液的0管为空白，照分光光度法在650nm的波长处测定吸收度，并计算出牛血清白蛋白的量与对应的吸收度的回归方程。
E、测定精密量取供试品溶液1.0ml，再加福林酚试液甲液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林酚试液乙液4.0ml，摇匀，于55℃水浴中保温5分钟，取出，放冷至室温；以D步中的0管为空白，以中国药典2000年版二部附录IVB记载的照分光光度法在650nm的波长处测定吸收度，再由D步的回归方程计算出供试品溶液的多肽含量；再根据B步记录的药物称取量，计算出每克胶囊内容物的多肽含量。
本例的亮菌胶囊药物的鉴别方法一为：取胶囊内容物1g，加蒸馏水50ml加热溶解，脱脂棉过滤；取滤液2ml，加茚三酮试液0.5ml，加热后，呈蓝紫色则判定内容物含有亮菌药物。
本例的亮菌胶囊药物的鉴别方法二为：
A、取胶囊内容物研细、称取1g，置50ml量瓶中，加水40ml，置80℃恒温水浴中加热30分钟，时时振摇，取出，放冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀。
B、将A步的溶液用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取1ml滤液，置10ml离心管中，加无水乙醇7ml，在旋涡混悬器上混合30秒，以每分钟3000转离心15分钟。
C、取B步的沉淀加水2ml使溶解，移至试管中，加15％甲萘酚乙醇溶液2滴，试管壁加1.0ml浓硫酸，两液接界处若成紫红色环，则判定内容物含有亮菌药物。
本例的亮菌胶囊药物的鉴别方法三为：
A、取胶囊内容物1.5g，加水50ml，煮沸15分钟，趁热用脱脂棉滤过，滤液放冷，加乙醚20ml振摇提取，分取乙醚液，用脱脂棉滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇0.5ml溶解，作为供试品溶液。
B、另取亮菌甲素对照品，加无水乙醇制成每1ml含10u g的溶液，作为对照品溶液。
C、按照照薄层色谱法试验，吸取上述A、B步的两种溶液各10u l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以配比为8∶2∶0.5∶10的正丁醇-甲醇-浓氨试液-水的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱图相应的位置上，呈相同颜色的荧光斑点，则判定供试胶囊内容物中含有亮菌药物。
实施例二
本例的亮菌胶囊药物与实施例一相同。亮菌胶囊药物的质量标准检测方法和鉴别方法，与实施例一略有不同：
质量标准检验方法，分为多糖含量和多肽含量的测定两项内容。
其中多糖含量的测定步骤为：
A、对照品溶液的制备取经102℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品加水制成每1ml含无水葡萄糖0.08mg的溶液。
B、供试品溶液的制备a、取亮菌胶囊药物的内容物，研细、精密称定1g左右并记录称取量；置量瓶中，加水35ml，置75℃恒温水浴中加热25分钟，时时振摇，取出，冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀；b、用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取1ml滤液，置10ml离心管中，加无水乙醇6.5ml；c、在旋涡混悬器上混合35秒，以每分钟2500转离心12分钟；d、取沉淀加无水乙醇5.5ml，重复c步的步骤，再取沉淀加无水乙醇5.5ml，重复c步的步骤；e、将d步得到的沉淀用水转至量瓶中，加水稀释至100ml摇匀，作为供试品溶液。
C、标准曲线的制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液0.8ml，摇匀，迅速加入硫酸4ml，摇匀，放冷至室温，以未量取对照品溶液的0管为空白，照分光光度法在490nm的波长处测定吸收度，计算出葡萄糖的量与对应的吸收度的回归方程。
D、测定精密量取供试品溶液1.0ml，再加3％苯酚溶液0.8ml，摇匀，迅速加入硫酸4.5ml，摇匀，放冷至室温，以C步中的0管为空白，照分光光度法在490nm的波长处测定吸收度，根据测得的吸收度，再由C步的回归方程计算出供试品的多糖含量；再根据B步记录的药物称取量，计算出每克胶囊内容物的多糖含量。
亮菌胶囊药物的质量标准检测方法中的多肽含量的测定方法为：
A、对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml含0.25mg的溶液。
B、供试品溶液的制备取亮菌胶囊药物的内容物，研细、精密称定1g左右，并记录称取量；置于量瓶中，加水35ml，置75℃恒温水浴中加热25分钟，时时振摇，取出，冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀；用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取2ml滤液，置于量瓶中，加水稀释至100ml，摇匀。
C、福林酚试液的配制：
福林酚甲液的配制：a、取酒石酸钾钠0.4g，加水50ml溶解，b、取硫酸铜0.6g，加水60ml溶解，c、取氢氧化钠12g与碳酸钠45g，加水400ml溶解，临用前分别取a、b、c三种溶液按1∶1∶8混匀。
福林酚试液乙液的配制：将上述福林酚甲液按体积加水稀释8倍。
D、标准曲线的制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加福林酚试液甲液1.0ml，摇匀，室温放置8分钟后，加入福林酚试液乙液4.0ml，摇匀，于50℃水浴中保温4分钟，取出，放冷至室温；以未量取对照品溶液的0管为空白，照分光光度法在650nm的波长处测定吸收度，并计算出牛血清白蛋白的量与对应的吸收度的回归方程。
E、测定精密量取供试品溶液1.0ml，再加福林酚试液甲液1.0ml，摇匀，室温放置8分钟后，加入福林酚试液乙液4.0ml，摇匀，于50℃水浴中保温4分钟，取出，放冷至室温；以D步中的0管为空白，照分光光度法在650nm的波长处测定吸收度，再由D步的回归方程计算出供试品溶液的多肽含量；再根据B步记录的药物称取量，计算出每克胶囊内容物的多肽含量。
本例的亮菌胶囊药物的鉴别方法一为：取胶囊内容物1g，加蒸馏水40ml加热溶解，脱脂棉过滤；取滤液2.3ml，加茚三酮试液0.5ml，加热后，呈蓝紫色则判定内容物含有亮菌药物。
本例的亮菌胶囊药物的鉴别方法二为：
A、取胶囊内容物研细、称取0.9g，置50ml量瓶中，加水35ml，置75℃恒温水浴中加热25分钟，时时振摇，取出，放冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀。
B、将A步的溶液用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取1ml滤液，置10ml离心管中，加无水乙醇6.5ml，在旋涡混悬器上混合25秒，以每分钟2500转离心12分钟。
C、取B步的沉淀加水2ml使溶解，移至试管中，加15％甲萘酚乙醇溶液1滴，试管壁加1.5ml浓硫酸，两液接界处若成紫红色环，则判定内容物含有亮菌药物。
本例的亮菌胶囊药物的鉴别方法三为：A、取胶囊内容物1.5g，加水40ml，煮沸12分钟，趁热用脱脂棉滤过，滤液放冷，加乙醚18ml振摇提取，分取乙醚液，用脱脂棉滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇0.5ml溶解，作为供试品溶液。
B、另取亮菌甲素对照品，加无水乙醇制成每1ml含8ug的溶液，作为对照品溶液。
C、按照照薄层色谱法试验，吸取上述A、B步的两种溶液各12ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以配比为8∶2∶0.5∶10的正丁醇-甲醇-浓氨试液-水的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱图相应的位置上，呈相同颜色的荧光斑点，则判定供试胶囊内容物中含有亮菌药物。
实施例三
本例的亮菌胶囊药物与实施例一相同。亮菌胶囊药物的质量标准检测方法和鉴别方法，与实施例一略有不同：
质量标准检验方法，分为多糖含量和多肽含量的测定两项内容。
其中多糖含量的测定步骤为：
A、对照品溶液的制备取经110℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品加水制成每1ml含无水葡萄糖0.12mg的溶液。
B、供试品溶液的制备a、取亮菌胶囊药物的内容物，研细、精密称定1g左右并记录称取量；置量瓶中，加水45ml，置85℃恒温水浴中加热35分钟，时时振摇，取出，冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀；b、用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取1ml滤液，置10ml离心管中，加无水乙醇7.5ml；c、在旋涡混悬器上混合25秒，以每分钟3000转离心18分钟；d、取沉淀加无水乙醇6.5ml，重复c步的步骤，再取沉淀加无水乙醇6.5ml，重复c步的步骤；e、将d步得到的沉淀用水转至量瓶中，加水稀释至100ml摇匀，作为供试品溶液。
C、标准曲线的制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液1.3ml，摇匀，迅速加入硫酸5ml，摇匀，放冷至室温，以未量取对照品溶液的0管为空白，照分光光度法在490nm的波长处测定吸收度，计算出葡萄糖的量与对应的吸收度的回归方程。
D、测定精密量取供试品溶液1.0ml，再加3％苯酚溶液1.2ml，摇匀，迅速加入硫酸4.5ml，摇匀，放冷至室温，以C步中的0管为空白，照分光光度法在490nm的波长处测定吸收度，根据测得的吸收度，再由C步的回归方程计算出供试品的多糖含量；再根据B步记录的药物称取量，计算出每克胶囊内容物的多肽含量。
亮菌胶囊药物的质量标准检测方法中的多肽含量的测定方法为：
A、对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml含0.35mg的溶液。
B、供试品溶液的制备取亮菌胶囊药物的内容物，研细、精密称定1g左右，并记录称取量；置于量瓶中，加水45ml，置85℃恒温水浴中加热35分钟，时时振摇，取出，冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀；用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取2ml滤液，置于量瓶中，加水稀释至100ml，摇匀。
C、福林酚试液的配制：
福林酚甲液的配制：a、取酒石酸钾钠0.6g，加水50ml溶解，b、取硫酸铜0.4g，加水60ml溶解，c、取氢氧化钠8g与碳酸钠55g，加水400ml溶解，临用前分别取a、b、c三种溶液按1∶1∶8混匀。
福林酚试液乙液的配制：将上述福林酚甲液加水稀释8倍。
D、标准曲线的制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加福林酚试液甲液1.0ml，摇匀，室温放置12分钟后，加入福林酚试液乙液4.0ml，摇匀，于60℃水浴中保温7分钟，取出，放冷至室温；以未量取对照品溶液的0管为空白，照分光光度法在650nm的波长处测定吸收度，并计算出牛血清白蛋白的量与对应的吸收度的回归方程。
E、测定精密量取供试品溶液1.0ml，再加福林酚试液甲液1.0ml，摇匀，室温放置12分钟后，加入福林酚试液乙液4.0ml，摇匀，60℃水浴中保温7分钟，取出，放冷至室温；以D步中的0管为空白，照分光光度法在650nm的波长处测定吸收度，再由D步的回归方程计算出供试品溶液的多肽含量；再根据B步记录的药物称取量，计算出每克胶囊内容物的多肽含量。
本例的亮菌胶囊药物的鉴别方法一为：取胶囊内容物1g，加蒸馏水60ml加热溶解，脱脂棉过滤；取滤液1.8ml，加茚三酮试液0.5ml，加热后，呈蓝紫色则判定内容物含有亮菌药物。
本例的亮菌胶囊药物的鉴别方法二为：
A、取胶囊内容物研细、称取1.1g，置量瓶中，加水45ml，置85℃恒温水浴中加热35分钟，时时振摇，取出，放冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀。
B、将A步的溶液用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取1ml滤液，置10ml离心管中，加无水乙醇7.5ml，在旋涡混悬器上混合35秒，以每分钟3000转离心18分钟。
C、取B步的沉淀加水2ml使溶解，移至试管中，加15％甲萘酚乙醇溶液3滴，试管壁加0.7ml浓硫酸，两液接界处若成紫红色环，则判定内容物含有亮菌药物。
本例的亮菌胶囊药物的鉴别方法三为：
A、取胶囊内容物1.5g，加水60ml，煮沸18分钟，趁热用脱脂棉滤过，滤液放冷，加乙醚23ml振摇提取，分取乙醚液，用脱脂棉滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇0.5ml溶解，作为供试品溶液。
B、另取亮菌甲素对照品，加无水乙醇制成每1ml含12ug的溶液，作为对照品溶液。
C、按照中国药典2000年版二部附录VB记载的照薄层色谱法试验，吸取上述A、B步的两种溶液各8ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以配比为8∶2∶0.5∶10的正丁醇-甲醇-浓氨试液-水的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱图相应的位置上，呈相同颜色的荧光斑点，则判定供试胶囊内容物中含有亮菌药物。
Claims (2)
1.一种亮菌胶囊药物的质量标准检测方法，所述亮菌胶囊药物由亮菌发酵物制得，胶囊药物的每克内容物中的多糖含量为以无水葡萄糖(C6H12O6)计≥60mg，多肽含量以牛血清白蛋白计≥60mg；所述的质量标准检测方法分为多糖含量和多肽含量的测定两项内容，其特征在于，所述的多糖含量的测定步骤为：
A、对照品溶液的制备取经102℃-110℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品加水制成每1ml含无水葡萄糖0.08-0.12mg的溶液；
B、供试品溶液的制备a、取亮菌胶囊药物的内容物，研细、精密称定1g左右并记录称取量；置量瓶中，加水35-45ml，置75-85℃恒温水浴中加热25-35分钟，时时振摇，取出，冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀；b、用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取1ml滤液，置10ml离心管中，加无水乙醇6.5-7.5ml；c、在旋涡混悬器上混合25-35秒，以每分钟2500-3000转离心12-18分钟；d、取沉淀加无水乙醇5.5-6.5ml，重复c步的步骤，再取沉淀加无水乙醇5.5-6.5ml，重复c步的步骤；e、将d步得到的沉淀用水转至量瓶中，加水稀释至100ml摇匀，作为供试品溶液；
C、标准曲线的制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液0.8-1.3ml，摇匀，迅速加入硫酸4.0-5.0ml，摇匀，放冷至室温，以未量取对照品溶液的0管为空白，照分光光度法在490nm的波长处测定吸收度，计算出葡萄糖的量与对应的吸收度的回归方程；
D、测定精密量取供试品溶液1.0ml，再加3％苯酚溶液0.8-1.2ml，摇匀，迅速加入硫酸4.5ml，摇匀，放冷至室温，以C步中的0管为空白，照分光光度法在490nm的波长处测定吸收度，根据测得的吸收度，再由C步的回归方程计算出供试品的多糖含量；再根据B步记录的药物称取量，计算出每克胶囊内容物的多糖含量。
2.如权利要求1所述的的一种亮菌胶囊药物的质量标准检测方法，其特征在于，所述的多肽含量的测定方法为：
A、对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml含0.25-0.35mg的溶液；
B、供试品溶液的制备取亮菌胶囊药物的内容物，研细、精密称定1g左右，并记录称取量；置于量瓶中，加水35-45ml，置75-85℃恒温水浴中加热25-35分钟，时时振摇，取出，冷至室温，加水稀释至50ml，摇匀；用脱脂棉滤过，弃去初始滤液，精密量取2ml滤液，置于量瓶中，加水稀释至100ml，摇匀；
C、福林酚试液的配制：
福林酚甲液的配制：a、取酒石酸钾钠0.4-0.6g，加水50ml溶解，b、取硫酸铜0.4-0.6g，加水60ml溶解，c、取氢氧化钠8-12g与碳酸钠45-55g，加水400ml溶解，临用前分别取a、b、c三种溶液按1∶1∶8混匀；
福林酚试液乙液的配制：将上述福林酚甲液加水稀释8倍；
D、标准曲线的制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加福林酚试液甲液1.0ml，摇匀，室温放置8-12分钟后，加入福林酚试液乙液4.0ml，摇匀，于50-60℃水浴中保温4-7分钟，取出，放冷至室温；以未量取对照品溶液的0管为空白，照分光光度法在650nm的波长处测定吸收度，并计算出牛血清白蛋白的量与对应的吸收度的回归方程；
E、测定精密量取供试品溶液1.0ml，再加福林酚试液甲液1.0ml，摇匀，室温放置8-12分钟后，加入福林酚试液乙液4.0ml，摇匀，于50-60℃水浴中保温4-7分钟，取出，放冷至室温；以D步中的0管为空白，照分光光度法在650nm的波长处测定吸收度，再由D步的回归方程计算出供试品溶液的多肽含量；再根据B步记录的药物称取量，计算出每克胶囊内容物的多肽含量。
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