CN106562988B - 一种代代花萼多糖在制备减肥药物中的应用 - Google Patents

一种代代花萼多糖在制备减肥药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药领域，公开了一种代代花萼多糖在制备减肥药物中的应用。所述代代花萼多糖在制备减肥药物中的应用，其中代代花萼多糖的制备步骤：(1)将代代花萼干燥，粉碎过筛，得代代花萼粗粉；(2)采用水加热回流提取代代花萼粗粉，将提取液离心，上清液浓缩，干燥至恒重，得到代代花萼水提物；(3)将代代花萼水提物用蒸馏水溶解，配成多糖溶液，将多糖溶液和经过预处理的大孔吸附树脂混合，脱色处理，过滤出多糖溶液，并用水反复洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖溶液合并，减压浓缩，得到浓缩糖液，在浓缩糖液中加入沉淀剂沉淀，离心，弃去上清液，收集沉淀物，干燥至恒重，得到代代花萼粗多糖。

Description

一种代代花萼多糖在制备减肥药物中的应用
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种代代花萼多糖在制备减肥药物中的应用。
背景技术
代谢综合征是多种代谢异常症候群的总称，包括肥胖、胰岛素抵抗，血脂异常，高胰岛素血症、高血压等。在这些代谢异常中，肥胖首当其冲，成为其他代谢异常的首要体现，已经在全球范围内危害着人类的健康。Ⅱ型糖尿病、高血压、心脑血管疾病、肿瘤等多种疾病的发生、发展都与肥胖有着密切的关系。目前肥胖已成为危害人类健康的全球性健康问题，它与Ⅱ型糖尿病、高血压、心脑血管疾病、肿瘤等多种疾病的发生、发展密切相关。
3T3-L1前脂肪细胞分离自小鼠胚胎(17～19d)的Swiss 3T3细胞，能特异性地被诱导分化成成熟的脂肪细胞。由于小鼠前体脂肪细胞的取材较为方便，并且关于小鼠前体脂肪细胞的培养研究技术较成熟，使得3T3-L1前脂肪细胞已成为国际上公认的研究脂肪代谢的细胞模型。越来越多的研究发现中药可通过抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖发挥预防或减肥的功效。比如于华强等利用MTT法以及油红O染色法研究不同浓度的芹菜素对前脂肪细胞增殖以及分化的影响，实验结果表明，芹菜素能够显著地抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖以及分化，并呈剂量依赖性，提示芹菜素可能具有预防或治疗肥胖的作用。
代代(Citrus aurantium L.var.amara Engl)是芸香科柑橘属植物酸橙的一个变种，代代花是其花蕾的干品，具有良好的药理作用，常用于治疗气郁不舒、脘腹胀痛、积食不化、恶心呕吐等。目前国内外对代代花的研究主要以其挥发油类化合物为主，而对代代花其它有效成分的研究报道几乎没有。代代花作为药食两用价值的天然保健品，其有效成分的提取纯化和药理活性等方面的研究还有待进一步深入探讨，全面加强代代花的生物利用，对于开发新药、指导临床用药具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种代代花萼多糖在制备减肥药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种代代花萼多糖在制备减肥药物中的应用。所述代代花萼多糖为代代花萼水提取物或/和代代花萼粗多糖，所述代代花萼粗多糖是将代代花萼水提取物进行纯化得到。所述纯化是指将代代花萼水提取物经过脱色处理、沉淀处理，再将沉淀物干燥。
所述的代代花萼多糖可作为新型的减肥药物，应用于肥胖症的治疗。
一种代代花萼多糖的制备方法，包含如下步骤：
(1)将代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)干燥，粉碎过筛，得代代花萼粗粉；
(2)采用水加热回流提取代代花萼粗粉，然后将提取液离心，并将上清液浓缩，干燥至恒重，得到代代花萼水提物(记为CAV-I)；
(3)将代代花萼水提物用蒸馏水溶解，配成代代花萼粗多糖溶液，将多糖溶液和经过预处理的大孔吸附树脂混合，脱色处理，过滤出多糖溶液，并用水反复洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖溶液合并，减压浓缩，得到浓缩糖液，在浓缩糖液中加入沉淀剂进行沉淀，然后离心，弃去上清液，收集沉淀物并干燥至恒重，得到代代花萼粗多糖(记为CAV-II)；所述代代花萼多糖为代代花萼水提物和/或代代花萼粗多糖。
步骤(1)中所述干燥温度为40～60℃；所述干燥时间为18～24h；所述粉碎过筛为40～60目筛。
步骤(2)中所述水与代代花萼粗粉的体积质量比(水料比)为(10～30)mL:1g；
步骤(2)中所述加热回流提取的次数为2～5次，每次提取的温度为80～100℃；每次提取的时间为1～3h；
步骤(2)中所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为8～12min。
步骤(2)中所述干燥的温度为40～60℃；
步骤(2)所述浓缩为减压浓缩；所述减压浓缩的温度为40～60℃。
步骤(3)所述大孔吸附树脂的预处理的方法为：将大孔吸附树脂先用蒸馏水浸泡12～24h，然后先用质量分数为3～5％的盐酸溶液浸泡0.5～3h，蒸馏水洗至中性，再用质量分数为3～5％的氢氧化钠溶液浸泡0.5～3h，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的大孔吸附树脂；
步骤(3)中所述大孔吸附树脂选用为D354FD树脂；
步骤(3)所述脱色处理的条件为于40～60℃水浴2～6h；
步骤(3)中所述沉淀剂为无水乙醇或体积分数为90～100％的乙醇溶液；
步骤(3)中所述沉淀的温度为0～4℃；所述沉淀的时间为8～24h。
步骤(3)中所述沉淀剂的加入量为浓缩糖液体积的3～5倍。
所述的代代花萼多糖(CAV-I、CAV-II)在制备减肥药物中的应用；
所述的代代花萼多糖(CAV-I、CAV-II)可作为新型的减肥药物，应用于肥胖症的治疗。
一种减肥药物，含有上述代代花萼多糖(CAV-I、CAV-II)中的至少一种。
本发明的原理：天然植物来源的有效成分能通过抑制前脂肪细胞的增殖发挥减肥的功效。本发明发现和确证天然植物有效成分具有显著的减肥活性，且使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次发现代代花萼多糖(CAV-I、CAV-II)在体外能显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖。
(2)本发明使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。
附图说明
图1是实施例4制备得到的代代花萼多糖CAV-II的红外光谱图；
图2是实施例1制备得到的代代花萼多糖CAV-I对3T3-L1前脂肪细胞增殖抑制作用图；
图3是实施例4制备得到的代代花萼多糖CAV-II对3T3-L1前脂肪细胞增殖抑制作用图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，小鼠3T3-L1前脂肪细胞购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；代代花萼购自广州清平药材市场。
实施例1从代代花萼中制备得到代代花萼多糖CAV-I
(1)将代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于电热鼓风干燥箱中60℃干燥24h，用粉碎机粉碎后，过50目筛，得代代花萼粗粉备用；
(2)称量代代花萼粗粉100g于锥形瓶中，加入3000mL的蒸馏水，充分震荡摇匀，水浴锅90℃加热回流提取3次，每次加热3h；加热结束后，合并提取液，4000r/min下离心10min，取上层澄清液，将上清液用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩，50℃下真空干燥箱干燥至恒重，即得代代花萼多糖CAV-I。
实施例2从代代花萼中制备得到代代花萼多糖CAV-I
(1)将代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于电热鼓风干燥箱中50℃干燥20h，用粉碎机粉碎后，过55目筛，得代代花萼粗粉备用；
(2)称量代代花萼粗粉100g于锥形瓶中，加入2000mL的蒸馏水，充分震荡摇匀，水浴锅80℃加热回流提取4次，每次加热2h；加热结束后，合并提取液，3000r/min下离心12min，取上层澄清液，将上清液用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩，50℃下真空干燥箱干燥至恒重，即得代代花萼多糖CAV-I。
实施例3从代代花萼中制备得到代代花萼多糖CAV-I
(1)将代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于电热鼓风干燥箱中45℃干燥18h，用粉碎机粉碎后，过60目筛，得代代花萼粗粉备用；
(2)称量代代花萼粗粉100g于锥形瓶中，加入1500mL的蒸馏水，充分震荡摇匀，水浴锅100℃加热回流提取3次，每次加热2h；加热结束后，合并提取液，5000r/min下离心8min，取上层澄清液，将上清液用旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩，60℃下真空干燥箱干燥至恒重，即得代代花萼多糖CAV-I。
实施例4从代代花萼中制备得到代代花萼多糖CAV-II
(1)将D354FD树脂先用蒸馏水浸泡12h，然后依次用质量分数为5％的盐酸溶液、质量分数为5％的氢氧化钠溶液各自浸泡0.5h，200目纱布过滤，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的D354FD树脂；
(2)将实施例2中制备得到的代代花萼水粗提物(CAV-I)用200mL蒸馏水溶解，配成多糖溶液，与经过预处理的D354FD树脂混合，置于50℃恒温水浴锅中恒温水浴3h进行脱色，间隔搅拌，然后用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复清洗5次洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；
(3)在步骤(2)制备得到的浓缩糖液中加入4倍体积的无水乙醇，边加边磁力搅拌，于4℃条件下醇沉12h，然后4000rpm下离心分离15min，弃去上清液，取出沉淀物于45℃烘干至恒重，得到代代花萼多糖CAV-II。
实施例5从代代花萼中制备得到代代花萼多糖CAV-II
(1)将D354FD树脂先用蒸馏水浸泡18h，然后依次用质量分数为3％的盐酸溶液、质量分数为3％的氢氧化钠溶液各自浸泡1h，200目纱布过滤，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的D354FD树脂；
(2)将实施例2中制备得到的代代花萼水粗提物(CAV-I)用200mL蒸馏水溶解，配成多糖溶液，与经过预处理的D354FD树脂混合，置于55℃恒温水浴锅中恒温水浴4h进行脱色，间隔搅拌，然后用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复清洗4次洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；
(3)在步骤(2)制备得到的浓缩糖液中加入5倍体积的无水乙醇，边加边磁力搅拌，于4℃条件下醇沉18h，然后3000rpm下离心分离12min，弃去上清液，取出沉淀物于50℃烘干至恒重，得到代代花萼多糖CAV-II。
实施例6从代代花萼中制备得到代代花萼多糖CAV-II
(1)将D354FD树脂先用蒸馏水浸泡24h，然后依次用质量分数为4％的盐酸溶液、质量分数为4％的氢氧化钠溶液各自浸泡1.5h，200目纱布过滤，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的D354FD树脂；
(2)将实施例2中制备得到的代代花萼水粗提物(CAV-I)用200mL蒸馏水溶解，配成多糖溶液，与经过预处理的D354FD树脂混合，置于60℃恒温水浴锅中恒温水浴5h进行脱色，间隔搅拌，然后用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复清洗3次洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖液合并，用旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩至200mL，得到浓缩糖液；
(3)在步骤(2)制备得到的浓缩糖液中加入6倍体积的无水乙醇，边加边磁力搅拌，于4℃条件下醇沉24h，然后5000rpm下离心分离8min，弃去上清液，取出沉淀物于55℃烘干至恒重，得到代代花萼多糖CAV-II。
实施例7红外光谱扫描
分别取实施例4～6中制备得到的代代花萼多糖(CAV-II)2mg，与KBr混合研细成均匀薄层状，在4000～400cm-1波数范围内进行红外扫描。
红外光谱分析结果：
实施例4制备的代代花萼粗多糖的红外谱图如图1所示。如图1所示，代代花萼粗多糖CAV-II在波数3399cm-1处的强吸收峰是糖类分子间或分子内的O-H伸缩振动峰。在波数2927cm-1处的吸收峰是次甲基或甲基的C-H振动吸收峰，在1417cm-1吸收峰可能是糖类分子C-H变角振动引起的。由以上三组糖类的特征峰可初步判断CAV-II为多糖。CAV-II在1647～1620cm-1处有较强的吸收峰，表明CAV-II中均含有-COO基团。同时该种多糖在1200-1000cm-1处的吸收峰表示CAV-II中的糖环构型为吡喃型(呋喃型糖环在此区间上只有两个强吸收峰)，因CAV-II是吡喃环结构。实施例5和实施例6的检测结果同实施例4。
实施例8 MTT法检测代代花萼多糖CAV-I、CAV-II对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响
分别取生长对数期的小鼠3T3-L1前脂肪细胞，1000rpm离心5min，弃去上清液，用含质量分数为10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞数为5×104/mL，100μL接种于96孔培养板中，置于5％CO2培养箱中，37℃培养24h后，弃去上清液，各组分别加入含有CAV-I(实施例1制得)、CAV-II(实施例4制得)的DMEM培养基(CAV-I和CAV-II的终浓度分别为50μg/mL、100、200、400和800μg/mL)。在37℃、5％CO2培养箱中培养24h，弃去上清液，PBS清洗两次，每孔加入200μL不含血清的DMEM基础培养基和20μL噻唑蓝(MTT)，放入培养箱中继续孵育4h，弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，避光放置于微量振荡器均匀震荡10min，用酶标仪测量在490nm波长下的OD值，计算细胞增殖抑制率；测试结果如图2～3所示。图2是实施例1制备得到的代代花萼多糖CAV-I对3T3-L1前脂肪细胞增殖抑制作用图；图3是实施例4制备得到的代代花萼多糖CAV-II对3T3-L1前脂肪细胞增殖抑制作用图。
CAV-I(图2)和CAV-II(图3)在50～800μg/mL范围内对小鼠3T3-L1前脂肪细胞表现出增殖抑制作用，且CAV-II的抑制作用更显著。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种代代花萼多糖在制备减肥药物中的应用，其特征在于：所述代代花萼多糖通过以下方法制备得到：
（1）将代代花萼在50℃干燥20h，粉碎过55目筛，得代代花萼粗粉；
（2）采用水加热回流提取代代花萼粗粉，然后将提取液离心，并将上清液浓缩，在50℃干燥至恒重，得到代代花萼水提物；
（3）将代代花萼水提物用蒸馏水溶解，配成代代花萼粗多糖溶液，将多糖溶液和经过预处理的D354FD树脂混合，然后在50℃水浴3h进行脱色处理，用200目的滤布过滤出多糖溶液，并用水反复洗出树脂中吸附的多糖，将脱色后的多糖溶液合并，减压浓缩，得到浓缩糖液，在浓缩糖液中加入无水乙醇在4℃沉淀12h，然后在4000rpm下离心分离15min；弃去上清液，收集沉淀物并干燥至恒重，得到代代花萼粗多糖；所述代代花萼多糖即为代代花萼粗多糖；
步骤（2）所述水与代代花萼粗粉的体积质量比为20 mL：1 g；步骤（2）中所述加热回流提取的次数为4次，每次提取的温度为80℃；每次提取的时间为2 h；步骤（2）中所述离心的转速为3000r/min；所述离心的时间为12 min；步骤（2）所述浓缩为减压浓缩，所述减压浓缩的温度为50℃；
步骤（3）中所述沉淀剂的加入量为浓缩糖液体积的4倍；
步骤（3）所述大孔吸附树脂的预处理的方法为：将大孔吸附树脂先用蒸馏水浸泡12h，然后先用质量分数为5%的盐酸溶液浸泡0.5h，蒸馏水洗至中性，再用质量分数为5%的氢氧化钠溶液浸泡0.5h，蒸馏水洗至中性，得到经过预处理的大孔吸附树脂。
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