CN108785397B - 一种首乌藤萃取物及制法与在制备减肥药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药领域，公开了一种首乌藤萃取物及制法与在制备减肥药物中的应用。所述方法为采用乙醇溶液加热回流提取首乌藤粗粉，然后将提取液离心，并将上清液浓缩，干燥至恒重，得到首乌藤乙醇粗提物；然后将乙醇粗提物用水溶解，加入石油醚萃取，去除石油醚相；在去除石油醚相后的溶液中加入氯仿进行萃取，重复萃取数次，分别收集氯仿相和取出氯仿相后的溶液，将氯仿相浓缩蒸干，得到氯仿相萃取物；向取出氯仿相后的溶液中加入乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，浓缩蒸干，得到乙酸乙酯相萃取物即首乌藤萃取物。所述首乌藤萃取物具有显著的减肥活性，且使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。所述首乌藤萃取物用于制备减肥药物。

Description

一种首乌藤萃取物及制法与在制备减肥药物中的应用
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种首乌藤萃取物及其制备方法与在制备减肥药物中的应用。
背景技术
代谢综合征是多种代谢异常症候群的总称，包括肥胖、胰岛素抵抗，血脂异常，高胰岛素血症、高血压等。在这些代谢异常中，肥胖首当其冲，成为其他代谢异常的首要体现，已经在全球范围内危害着人类的健康。Ⅱ型糖尿病、高血压、心脑血管疾病、肿瘤等多种疾病的发生、发展都与肥胖有着密切的关系。目前肥胖已成为危害人类健康的全球性健康问题，它与Ⅱ型糖尿病、高血压、心脑血管疾病、肿瘤等多种疾病的发生、发展密切相关。
3T3-L1前脂肪细胞分离自小鼠胚胎(17～19d)的Swiss 3T3细胞，能特异性地被诱导分化成成熟的脂肪细胞。由于小鼠前体脂肪细胞的取材较为方便，并且关于小鼠前体脂肪细胞的培养研究技术较成熟，使得3T3-L1前脂肪细胞已成为国际上公认的研究脂肪代谢的细胞模型。越来越多的研究发现中药可通过抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖发挥预防或减肥的功效。
首乌藤(Caulis PolygoniMultiflori)，是蓼科植物何首乌(PolygonummultiflorumThunb.)的干燥藤茎，又名夜交藤。首乌藤呈长圆柱形，稍扭曲，具分枝，长短不一，直径4～7mm，无臭，味微苦涩。首乌藤具有改善睡眠障碍、减肥抑食、抗慢性炎症及抑菌作用。目前国内外对首乌藤的研究主要以其多糖为主，而对首乌藤其它有效成分的研究报道少有。首乌藤作为药食两用价值的天然保健品，其有效成分的提取纯化和药理活性等方面的研究还有待进一步深入探讨，全面加强首乌藤的生物利用，对于开发新药、指导临床用药具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种首乌藤萃取物及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述首乌藤萃取物在制备减肥药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种首乌藤萃取物的制备方法，包含如下步骤：
(1)将首乌藤(Caulis PolygoniMultiflori)干燥，粉碎过筛，得首乌藤粗粉；
(2)采用乙醇溶液加热回流提取首乌藤粗粉，然后将提取液离心，并将上清液浓缩，干燥至恒重，得到首乌藤乙醇粗提物；
(3)将首乌藤乙醇粗提物用水溶解，加入石油醚进行萃取，重复萃取数次，去除石油醚相；在去除石油醚相后的溶液中加入氯仿进行萃取，重复萃取数次，分别收集氯仿相和取出氯仿相后的溶液，将氯仿相浓缩蒸干，得到氯仿相萃取物；
(4)向取出氯仿相后的溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，重复萃取数次，合并乙酸乙酯相，浓缩蒸干，得到乙酸乙酯相萃取物即首乌藤萃取物；所述首乌藤有效成分为首乌藤乙酸乙酯相萃取物(PMC-Ⅰ)。
步骤(1)中所述干燥的温度为40～60℃；所述干燥时间为18～24h；所述粉碎过筛为40～60目筛。
步骤(2)中所述乙醇溶液的体积分数为70～90％。
步骤(2)中所述乙醇溶液与首乌藤粗粉的体积质量比为(10～30)mL:1g。
步骤(2)中所述加热回流提取的温度为80～100℃；所述加热回流提取次数为2～5次，每次提取的时间为1～3h。
步骤(2)中所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为8～12min；
步骤(2)中所述干燥的温度为40～60℃。
步骤(3)所述首乌藤乙醇粗提物与水的质量体积比为1g：(10～20)mL。
步骤(2)、(3)和(4)中所述的浓缩的方式为减压浓缩；
步骤(3)中所述萃取的时间都为30～60min；步骤(4)中所述萃取的时间为30～60min；
步骤(3)中所述萃取次数都为3～5次；步骤(4)中所述萃取次数都为3～5次。
一种首乌藤萃取物为有效成分PMC-Ⅰ，通过上述制备方法制备得到；本发明提取的有效成分PMC-I含有二苯乙烯苷、芹菜素、大黄素和大黄素甲醚，其中二苯乙烯苷的含量最高。
所述的首乌藤有效成分PMC-Ⅰ在制备减肥药物中的应用。
所述的首乌藤有效成分PMC-Ⅰ在实验浓度范围内能够抑制3T3-L1前脂肪细胞的增值和分化，且对正常肝细胞LO2细胞的毒副作用较低。
本发明的原理：天然植物来源的有效成分能通过抑制前脂肪细胞的增殖发挥减肥的功效。本发明发现和确证天然植物有效成分具有显著的减肥活性，且使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的首乌藤有效成分PMC-Ⅰ在体外能显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖。
(2)本发明的首乌藤有效成分PMC-Ⅰ在体外能显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化。
附图说明
图1是实施例1制备得到PMC-Ⅰ对LO2细胞存活率的作用图；
图2是实施例1制备得到PMC-Ⅰ对3T3-L1前脂肪细胞增殖抑制作用图；
图3是实施例1制备得到的PMC-Ⅰ对3T3-L1前脂肪细胞分化全过程的细胞作用图，其中control组是指未经任何处理的正常3T3-L1前脂肪细胞，model组指的是经鸡尾酒法诱导分化后成熟的脂肪细胞；
图4A是实施例7中所用标品二苯乙烯苷的色谱图；
图4B是实施例7中所用标品芹菜素的色谱图；
图4C是实施例7中所用标品大黄素的色谱图；
图4D是实施例7中所用标品大黄素甲醚的色谱图；
图4E是实施例1中制备得到的PMC-Ⅰ的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，小鼠3T3-L1前脂肪细胞购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；首乌藤购自广州清平药材市场。
实施例1从首乌藤中制备得到PMC-Ⅰ
(1)将首乌藤(Caulis PolygoniMultiflori)置于电热鼓风干燥箱中50℃干燥24h，用粉碎机粉碎后，过60目筛，得首乌藤粗粉；称取首乌藤粗粉100g于锥形瓶中，加入3000mL的体积分数为75％乙醇溶液，充分震荡摇匀，水浴锅90℃加热回流提取3次，每次加热3h；加热结束后，合并提取液，4000r/min下离心10min，取上层澄清液，将上清液用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩，真空干燥箱50℃干燥至恒重，得首乌藤乙醇粗提物；
(2)将制备得到的首乌藤乙醇粗提物用蒸馏水溶解(首乌藤乙醇粗提物质量(g)与蒸馏水体积(mL)的质量体积比为1:10)，加入与蒸馏水等体积的石油醚溶剂，充分震荡混匀，静置40min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的石油醚相，重复萃取三次，弃去石油醚层，得到水相溶液；
(3)在石油醚萃取后的水相溶液中加入与水相溶液等体积的氯仿溶剂，充分震荡混匀，静置40min，待两相溶剂完全分层后，收集氯仿相和取出氯仿相后的溶液，重复萃取三次，分别合并氯仿相和取出氯仿相后的溶液；
(4)在去除氯仿相后的水溶液中加入等体积的乙酸乙酯溶剂，充分震荡混匀，静置40min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的乙酸乙酯相，重复萃取三次，合并所得乙酸乙酯相萃取液，60℃减压浓缩，真空干燥至恒重，得到乙酸乙酯相萃取物记为PMC-Ⅰ。
实施例2从首乌藤中制备得到PMC-Ⅰ
(1)将首乌藤(Caulis PolygoniMultiflori)置于电热鼓风干燥箱中50℃干燥24h，用粉碎机粉碎后，过60目筛，得首乌藤粗粉；称取首乌藤粗粉100g于锥形瓶中，加入3000mL的体积分数为75％乙醇溶液，充分震荡摇匀，水浴锅90℃加热回流提取3次，每次加热3h；加热结束后，合并提取液，4000r/min下离心10min，取上层澄清液，将上清液用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩，真空干燥箱50℃干燥至恒重，得首乌藤乙醇粗提物；
(2)将制备得到的首乌藤乙醇粗提物用蒸馏水溶解(首乌藤乙醇粗提物质量(g)与蒸馏水体积(mL)的质量体积比为1:15)，加入2倍于蒸馏水体积的石油醚溶剂，充分震荡混匀，静置30min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的石油醚相，重复萃取四次，弃去石油醚层，得到水相溶液；
(3)在石油醚萃取后的水相溶液中加入2倍于蒸馏水体积的氯仿溶剂，充分震荡混匀，静置30min，待两相溶剂完全分层后，收集氯仿相和取出氯仿相后的溶液，重复萃取四次，分别合并氯仿相和取出氯仿相后的溶液；
(4)在去除氯仿相后的溶液中加入2倍体积的乙酸乙酯溶剂，充分震荡混匀，静置30min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的乙酸乙酯相，重复萃取四次，合并所得乙酸乙酯相萃取液，50℃减压浓缩，于50℃真空干燥至恒重，得到乙酸乙酯相萃取物记为PMC-Ⅰ。
实施例3从首乌藤中制备得到PMC-Ⅰ
(1)将首乌藤(Caulis PolygoniMultiflori)置于电热鼓风干燥箱中50℃干燥24h，用粉碎机粉碎后，过60目筛，得首乌藤粗粉；称取首乌藤粗粉100g于锥形瓶中，加入3000mL的体积分数为75％乙醇溶液，充分震荡摇匀，水浴锅90℃加热回流提取3次，每次加热3h；加热结束后，合并提取液，4000r/min下离心10min，取上层澄清液，将上清液用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩，真空干燥箱50℃干燥至恒重，得首乌藤乙醇粗提物；
(2)将制备得到的首乌藤乙醇粗提物用蒸馏水溶解(首乌藤乙醇粗提物质量(g)与蒸馏水体积(mL)的质量体积比为1:20)，加入3倍于蒸馏水体积的石油醚溶剂，充分震荡混匀，静置60min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的石油醚相，重复萃取五次，弃去石油醚层，得到水相溶液；
(2)在石油醚萃取后的水相溶液中加入3倍于蒸馏水体积的氯仿溶剂，充分震荡混匀，静置60min，待两相溶剂完全分层后，收集氯仿相和取出氯仿相后的溶液，重复萃取5次，分别合并氯仿相和取出氯仿相后的溶液；
(3)在去除氯仿相后的溶液中加入3倍体积的乙酸乙酯溶剂，充分震荡混匀，静置60min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的乙酸乙酯相，重复萃取五次，合并所得乙酸乙酯相萃取液，55℃减压浓缩，真空干燥至恒重，得到乙酸乙酯相萃取物记为PMC-Ⅰ。
实施例4MTT法检测PMC-Ⅰ对人正常肝细胞LO2细胞增值的影响
分别取生长对数期的人正常肝细胞LO2细胞，1000rpm离心5min，弃去上清液，用含质量分数为10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞数为5×104/mL，100μL接种于96孔培养板中，置于5％CO2培养箱中，37℃培养24h后，弃去上清液，各组分别加入含有PMC-Ⅰ(实施例1制得)的DMEM培养基(PMC-Ⅰ的终浓度分别为12.5、25、50、100、200和400μg/mL)。在37℃、5％CO2培养箱中培养24h，弃去上清液，PBS清洗两次，每孔加入180μL不含血清的DMEM基础培养基和20μL噻唑蓝(MTT)，放入培养箱中继续孵育4h，弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，避光放置于微量振荡器均匀震荡10min，用酶标仪测量在490nm波长下的OD值，计算细胞增殖抑制率。
测试结果如图1所示。图1是实施例1制备得到PMC-Ⅰ对LO2细胞存活率的作用图。在最高浓度400μg/mL时LO2细胞的存活率为83.78％，在浓度12.5～200μg/mL时LO2细胞的存活率均在90％以上，说明PMC-Ⅰ对LO2细胞的毒副作用低。
实施例5MTT法检测PMC-Ⅰ对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响
分别取生长对数期的小鼠3T3-L1前脂肪细胞，1000rpm离心5min，弃去上清液，用含质量分数为10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞数为5×104/mL，100μL接种于96孔培养板中，置于5％CO2培养箱中，37℃培养24h后，弃去上清液，各组分别加入含有PMC-Ⅰ(实施例1制得)的DMEM培养基(PMC-Ⅰ的终浓度分别为12.5、25、50、100、200和400μg/mL)。在37℃、5％CO2培养箱中培养24h，弃去上清液，PBS清洗两次，每孔加入180μL不含血清的DMEM基础培养基和20μL噻唑蓝(MTT)，放入培养箱中继续孵育4h，弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，避光放置于微量振荡器均匀震荡10min，用酶标仪测量在490nm波长下的OD值，计算细胞增殖抑制率。
测试结果如图2所示。图2是实施例1制备得到PMC-Ⅰ对3T3-L1前脂肪细胞增殖抑制作用图。PMC-Ⅰ在12.5～400μg/mL范围内对小鼠3T3-L1前脂肪细胞均表现出显著的增殖抑制作用。说明首乌藤经过分级筛选，具有减肥功效的活性成分得到富集。
实施例6油红O染色法检测PMC-Ⅰ对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响
(1)分别取生长对数期的小鼠3T3-L1前脂肪细胞，1000rpm离心5min，弃去上清液，用含质量分数为10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞数为5×104/mL，100μL接种于96孔培养板中，置于5％CO2培养箱中，先用含10％FBS的完全培养液培养2d，待细胞长满后继续用完全培养液培养2d，使细胞达到接触抑制，实验组分别加入含10μg/mL胰岛素、0.05mmol/LIBMX和1μmol/L的完全培养液，加入PMC-Ⅰ(实施例1所得)(终浓度分别为12.5、25和50μg/mL)，同时设置对照组，每种处理设5个重复。培养2d后，换含有10μg/mL胰岛素的完全培养液，加入PMC-Ⅰ(终浓度分别为12.5、25和50μg/mL)，培养2～4d，换用含有PMC-Ⅰ(终浓度分别为12.5、25和50μg/mL)的完全培养液培养4d，直到分化结束，80％左右的细胞已经分化为成熟的脂肪细胞；
(2)将诱导分化成熟后的细胞用PBS小心洗涤3次，用100μL的4％多聚甲酵溶液固定30min，然后弃去多聚甲醛溶液，用PBS缓冲液洗涤3次，室温下晾干后每孔加入100μL油红O工作液室温下染色30min，染色30min后去除染液，再加70％乙醇迅速清洗细胞次达到脱色的目的，加PBS清洗细胞3次，然后加入200μL异丙醇，于显微镜下观察细胞形态；
测试结果如图3所示，图3是实施例1制备得到的PMC-Ⅰ对3T3-L1前脂肪细胞分化全过程的细胞作用图，control组是指未经任何处理的正常3T3-L1前脂肪细胞，model组指的是经鸡尾酒法诱导分化后成熟的脂肪细胞。实验组可显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化，细胞中的脂肪积累逐渐减少，脂肪滴变小。
实施例7高效液相色谱法(HPLC)检测PMC-Ⅰ有效成分
将PMC-Ⅰ(实施例1所得)用75％甲醇(色谱级)配置成浓度为0.5mg/mL的溶液。色谱条件为YMC C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱；乙腈(B)和0.5％甲酸水(C)为流动相(B：C体积比为95:5)；1.00mL/min流速；柱温30℃；检测波长290nm。通过对比样品与标准品的保留时间，从PMC-Ⅰ中鉴定出二苯乙烯苷、芹菜素、大黄素及大黄素甲醚四种成分，其中二苯乙烯苷的含量最高。
测试结果如图4A、4B、4C、4D和4E所示。图4A是实施例7中所用标品二苯乙烯苷的色谱图；图4B是实施例7中所用标品芹菜素的色谱图；图4C是实施例7中所用标品大黄素的色谱图；图4D是实施例7中所用标品大黄素甲醚的色谱图；图4E是实施例1中制备得到的PMC-Ⅰ的色谱图。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种首乌藤萃取物在制备减肥药物中的应用，其特征在于：所述首乌藤萃取物的制备方法，包含如下步骤：
（1）将首乌藤干燥，粉碎过筛，得首乌藤粗粉；
（2）采用乙醇溶液加热回流提取首乌藤粗粉，然后将提取液离心，并将上清液浓缩，干燥至恒重，得到首乌藤乙醇粗提物；
（3）将首乌藤乙醇粗提物用水溶解，加入石油醚进行萃取，重复萃取数次，去除石油醚相；在去除石油醚相后的溶液中加入氯仿进行萃取，重复萃取数次，分别收集氯仿相和取出氯仿相后的溶液；
（4）向取出氯仿相后的溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，重复萃取数次，合并乙酸乙酯相，浓缩蒸干，得到乙酸乙酯相萃取物即首乌藤萃取物；
步骤（2）中所述乙醇溶液的体积分数为70～90%；
所述首乌藤萃取物，包含二苯乙烯苷、芹菜素、大黄素和大黄素甲醚。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所述加热回流提取的温度为80～100℃；所述加热回流提取次数为2~5次，每次提取的时间为1～3 h。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所述乙醇溶液与首乌藤粗粉的体积质量比为（10～30）mL:1g；
步骤（3）所述首乌藤乙醇粗提物与水的质量体积比为1g：（10～20） mL。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为8～12 min；
步骤（3）中所述萃取的时间都为30～60 min；步骤（4）中所述萃取的时间为30～60min。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（2）、（3）和（4）中所述的浓缩的方式为减压浓缩，所述浓缩的温度为40～60℃；
步骤（3）中所述萃取次数都为3～5 次；步骤（4）中所述萃取次数都为3～5 次。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所述干燥的温度为40～60℃；步骤（1）中所述干燥的温度为40～60℃；所述干燥时间为18～24h；所述粉碎过筛为40～60目筛。
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