CN106389509A - 一种绞股蓝皂苷及制备方法与其在制备抗炎药物中的应用 - Google Patents

一种绞股蓝皂苷及制备方法与其在制备抗炎药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药领域，公开了一种绞股蓝皂苷及制备方法与其在制备抗炎药物中的应用。所述方法包含如下步骤：(1)将绞股蓝粉碎，过筛，得绞股蓝粗粉；(2)采用乙醇溶液加热回流提取绞股蓝粗粉，然后将提取液离心，并将上清液浓缩，得到浓缩的绞股蓝乙醇粗提物浸膏；(3)将绞股蓝乙醇粗提物浸膏用蒸馏水溶解，加入有机溶剂进行萃取，去除含有色素的有机层，然后向水层中加入氯仿或乙酸乙酯继续进行萃取，去除有机层，得到水溶液；加入正丁醇进行萃取，收集正丁醇相，浓缩蒸干，得到绞股蓝皂苷。所述绞股蓝皂苷具有显著的抗炎活性，且植物皂苷的使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。

Description

一种绞股蓝皂苷及制备方法与其在制备抗炎药物中的应用
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种绞股蓝皂苷及制备方法与在制备抗炎药物中的应用。
背景技术
皂苷(saponins)因其发泡性特点而得名，是一类具有重要医药价值的配糖体化合物，根据水解后生成皂苷元的结构，分为三萜皂苷和甾体皂苷两大类。皂苷广泛存在于自然界，如大豆、苦瓜、大枣等常见食物，另外，皂苷也是一些本草著作中记载的具有“久服轻身不老”的中药的主要有效成分，这些中药如人参、三七、知母、远志、甘草、薯蓣等因显著的保健作用而被古人推崇为“上品药”。
许多慢性疾病的发病机制都涉及炎症，例如冠心病、癌症、高血脂等。因此抑制前炎症因子的生成可以作为预防或者治疗一些慢性疾病的重要靶点。脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞是常见研究炎症反应的模型。巨噬细胞在脂多糖LPS刺激下，可促使炎症因子如一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌。
绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Makino)又名七叶胆、五叶参，是葫芦科绞股蓝属多年生草质藤木，在我国陕西、四川、湖南、广西、云南等省均有分布，有“南方人参”的美誉，在日本被誉为“福音草”。早在20世纪70年代后期，日本学者已从该植物中分离出80多种皂甙，发现有4种绞股蓝皂苷分别与人参皂苷Rb1、Rb3、Rd和F2的结构完全相同，并且绞股蓝总皂苷含量是人参的3倍。现代药理、毒理及临床实验证明：绞股蓝主要有效成分为绞股蓝皂苷，具有抗疲劳、抗衰老、抗诱变、提高机体免疫能力、调节心脑血管和改善神经系统等作用。绞股蓝皂苷因其独特的功效，可开发用于绞股蓝茶制品、功能性口服液、保健酒、抗衰老化妆品、饲料添加剂等。但目前，绞股蓝更多的是简单加工为绞股蓝茶，而对于其中有效成分绞股蓝皂苷的提取、纯化及加工利用程度还远远不够，因此绞股蓝皂苷的提取纯化和药理活性等方面的研究还有待进一步深入探讨，全面加强绞股蓝皂苷的生物利用，对于开发新药、指导临床用药具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种绞股蓝皂苷的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的绞股蓝皂苷。
本发明的再一目的在于提供上述绞股蓝皂苷在制备抗炎药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种绞股蓝皂苷的制备方法，包含如下步骤：
(1)将绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Makino)粉碎，过筛，得绞股蓝粗粉；
(2)采用乙醇溶液加热回流提取绞股蓝粗粉，然后将提取液离心，并将上清液浓缩，得到浓缩的绞股蓝乙醇粗提物浸膏；
(3)将绞股蓝乙醇粗提物浸膏用蒸馏水溶解，加入有机溶剂进行萃取，去除含有色素的有机层，然后向水层中加入氯仿或乙酸乙酯继续进行萃取，去除有机层，得到水溶液；加入正丁醇进行萃取，收集正丁醇相，浓缩蒸干，得到绞股蓝皂苷即绞股蓝总皂苷。
步骤(3)中所述有机溶剂为石油醚或乙醚中一种以上；优选为石油醚。
步骤(3)中所述加入有机溶剂进行萃取的次数为3～5次，每次萃取的时间为30～60min；所述加入氯仿或乙酸乙酯继续进行萃取的次数为3～5次，每次萃取的时间为30～60min；所述加入正丁醇进行萃取的次数为3～5次，每次萃取的时间为30～60min。
步骤(1)中所述粉碎过筛为50～60目筛；
步骤(2)中所述乙醇溶液的体积分数为70～85％；优选为75％。
步骤(2)中所述乙醇溶液与绞股蓝粗粉的体积质量比为(10～20)mL:1g。
步骤(2)中所述加热回流提取的温度为90～100℃；所述加热回流提取的次数为2～4次，每次加热回流提取的时间为2～4h。
步骤(2)中所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为8～12min。
步骤(2)和(3)中所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为40～60℃。
步骤(2)和(3)中所述减压浓缩的温度优选为50℃。
步骤(3)所述绞股蓝乙醇粗提物浸膏中绞股蓝粗粉与蒸馏水质量体积比为为200g：(1～3)L。
步骤(3)中萃取所用的有机溶剂、氯仿或乙酸乙酯以及正丁醇总的体积用量与溶解浸膏的蒸馏水的体积用量比为(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)。
一种绞股蓝皂苷(GPMS)，通过上述制备方法制备得到。
所述绞股蓝皂苷(GPMS)在制备抗炎药物中的应用。
所述的绞股蓝皂苷(GPMS)可作为新型的抗炎药物，应用于炎症的治疗。
一种抗炎药物，含有绞股蓝皂苷(GPMS)；
本发明的原理：植物来源的皂苷能通过调节巨噬细胞的免疫功能体现出各种有益的药理作用。本发明发现和确证植物皂苷具有显著的抗炎活性，且植物皂苷的使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次发现绞股蓝皂苷(GPMS)在体外能显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO的释放。
(2)本发明首次发现绞股蓝皂苷(GPMS)在体外能显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOS、IL-6、TNF-α、IL-1β、和COX-2mRNA的表达。
(3)本发明首次发现绞股蓝皂苷(GPMS)在体外能显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞p-JNK、p-p38、p-p65和COX-2蛋白的表达。
(4)绞股蓝皂苷(GPMS)的用药剂量比较低，而且在有效用药剂量范围内毒性较低。
附图说明
图1是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对RAW264.7巨噬细胞的毒性作用图；
图2是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放NO的影响图；
图3是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞形态的影响图；
图4是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOSmRNA表达的影响图，其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01；
图5是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6mRNA表达的影响图，其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01；
图6是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TNF-αmRNA表达的影响图，其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01；
图7是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-1βmRNA表达的影响图，其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01；
图8是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞COX-2mRNA表达的影响图，其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01；
图9是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞磷酸化JNK(p-JNK)蛋白水平影响的结果分析图，其中图A为p-JNK蛋白表达曝光图，图B为p-JNK蛋白相对表达量；其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01；
图10是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞磷酸化P38(p-P38)蛋白水平影响的结果分析图，其中图A为p-P38蛋白表达曝光图，图B为p-P38蛋白相对表达量；其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01；
图11是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞磷酸化P65(p-P65)蛋白水平影响的结果分析图，其中图A为p-P65蛋白表达曝光图，图B为p-P65蛋白相对表达量；其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01；
图12是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞COX-2蛋白水平影响的结果分析图，其中图A为COX-2蛋白表达曝光图，图B为COX-2蛋白相对表达量；其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，小鼠巨噬细胞RAW 264.7购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；代代花萼购自广州清平药材市场。
实施例1从绞股蓝中制备得到绞股蓝皂苷(GPMS)
(1)将绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Makino)用粉碎机粉碎后，过60目筛，得绞股蓝粗粉备用；
(2)称取绞股蓝粗粉200g，于5000mL圆底烧瓶中，加入2000mL的体积分数为75％乙醇溶液，充分摇匀后，100℃保持微沸提取3h，停止加热，过滤，加热回流提取3次，合并滤液，采用离心机4000rpm，离心10min，将所得上清液用旋转蒸发仪在50℃的条件下减压浓缩，得到乙醇粗提物浸膏；
(3)将绞股蓝乙醇粗提物浸膏用1.5L蒸馏水溶解，加入0.5L的石油醚溶剂，充分震荡混匀，静置40min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的石油醚相，重复萃取四次(0.5L×3次)，弃去石油醚层，除去一些色素；在石油醚萃取后的溶液中即去除石油醚层的溶液中加入0.5L的乙酸乙酯溶剂，充分震荡混匀，静置40min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的乙酸乙酯相，重复萃取四次(0.5L×3次)，弃去乙酸乙酯层，除去黄酮、香豆素等中等极性的物质；在乙酸乙酯萃取后的溶液中加入0.5L的正丁醇溶剂，充分震荡混匀，静置40min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的正丁醇相，重复萃取四次(0.5L×3次)，合并所得正丁醇相萃取液，50℃减压浓缩蒸干，得到绞股蓝总皂苷即绞股蓝皂苷(GPMS)，回收正丁醇溶液。
实施例2从绞股蓝中制备得到绞股蓝皂苷(GPMS)
(1)将绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Makino)用粉碎机粉碎后，过60目筛，得绞股蓝粗粉备用；
(2)称取绞股蓝粗粉200g，于5000mL圆底烧瓶中，加入2000mL的体积分数为70％乙醇溶液，充分摇匀后，100℃保持微沸提取2h，停止加热，过滤，加热回流提取3次，合并滤液，采用离心机3000rpm，离心8min，将所得上清液用旋转蒸发仪在55℃的条件下减压浓缩，得到乙醇粗提物浸膏；
(3)将绞股蓝乙醇粗提物浸膏用1.8L蒸馏水溶解，加入0.6L的石油醚溶剂，充分震荡混匀，静置30min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的石油醚相，重复萃取三次(0.6L×3次)，弃去石油醚层，除去一些色素；在石油醚萃取后的溶液中加入0.6L的乙酸乙酯溶剂，充分震荡混匀，静置30min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的乙酸乙酯相，重复萃取三次(0.6L×3次)，弃去乙酸乙酯层，除去黄酮、香豆素等中等极性的物质；在乙酸乙酯萃取后的溶液中加入0.6L的正丁醇溶剂，充分震荡混匀，静置30min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的正丁醇相，重复萃取三次(0.6L×3次)，合并所得正丁醇相萃取液，55℃减压浓缩蒸干得到绞股蓝总皂苷即绞股蓝皂苷(GPMS)，回收正丁醇溶液。
实施例3从绞股蓝中制备得到绞股蓝皂苷(GPMS)
(1)将绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Makino)用粉碎机粉碎后，过60目筛，得绞股蓝粗粉备用；
(2)称取绞股蓝粗粉200g，于5000mL圆底烧瓶中，加入3000mL的体积分数为80％乙醇溶液，充分摇匀后，95℃保持微沸提取4h，停止加热，过滤，加热回流提取2次，合并滤液，采用离心机5000rpm，离心10min，将所得上清液用旋转蒸发仪在60℃的条件下减压浓缩，得到乙醇粗提物浸膏；
(3)将绞股蓝乙醇粗提物浸膏用3L蒸馏水溶解，加入1L的石油醚溶剂，充分震荡混匀，静置60min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的石油醚相，重复萃取三次(1L×3次)，弃去石油醚层，除去一些色素。在石油醚萃取后的溶液中加入1L的乙酸乙酯溶剂，充分震荡混匀，静置60min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的乙酸乙酯相，重复萃取三次(1L×3次)，弃去乙酸乙酯层，除去黄酮、香豆素等中等极性的物质。在乙酸乙酯萃取后的溶液中加入1L的正丁醇溶剂，充分震荡混匀，静置60min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的正丁醇相，重复萃取三次(1L×3次)，合并所得正丁醇相萃取液，60℃减压浓缩蒸干得到绞股蓝总皂即绞股蓝皂苷(GPMS)苷，回收正丁醇溶液。
实施例4MTT法检测绞股蓝皂苷(GPMS)对RAW264.7细胞毒性的影响
分别取生长对数期的小鼠巨噬细胞RAW264.7，1000rpm离心5min，弃去上清液，用含质量分数为10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞数为3×105/mL，100μL接种于96孔培养板中，置于5％CO2培养箱中，37℃培养24h后，弃去上清液，各组分别加入含有GPMS(实施例1制得)的DMEM培养基(GPMS的终浓度分别为31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL和500μg/mL)。在37℃、5％CO2培养箱中培养24h，弃去上清液，PBS清洗两次，每孔加入200μL不含血清的DMEM基础培养基和20μL噻唑蓝(MTT)，放入培养箱中继续孵育4h，弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，避光放置于微量振荡器均匀震荡10min，用酶标仪测量在490nm波长下的OD值，计算细胞增殖抑制率。图1是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对RAW264.7巨噬细胞的毒性作用图。
在GPMS浓度为31.25～500μg/mL范围内，绞股蓝皂苷(GPMS)作用于RAW264.7细胞24h，对RAW264.7细胞的生长均没有毒性作用(图1)。因此后续的实验中，绞股蓝皂苷(GPMS)的浓度设定为500、250、125、62.5、31.25、16.13μg/mL。
实施例5Griess法检测绞股蓝皂苷(GPMS)对RAW264.7细胞释放NO的影响
常规培养细胞，取对数生长期的RAW264.7细胞，吹打细胞成单细胞悬液，显微镜下用血细胞计数板计数后，1000rpm，离心5min去上清，培养基重悬并调整细胞浓度，按20万个/孔的细胞密度接种于24孔培养板，置于37℃，5％CO2培养箱培养，贴壁24h，吸弃上清，按如下分组要求给药，每组设3个复孔：Control组，脂多糖(LPS，终浓度为1μg/mL)组，LPS(终浓度为1μg/mL)+地塞米松(DXM，终浓度为50μg/mL)组，LPS(终浓度为1μg/mL)+GPMS(实施例1制备得到的绞股蓝皂苷，终浓度为16.13、31.25、62.5、125、250和500μg/mL)组，对照组添加同体积的培养基。给药后，置于37℃，5％CO2培养箱，继续培养24h。分别取各孔细胞上清100μL，相应加入另一新的96孔板中。每孔加50μL Griess试剂A，置于37℃培养箱中反应10min，每孔再加50μL Griess试剂B，置于37℃培养箱中反应10min，立即置板于多标记微孔板检测仪上，在550nm波长下检测各孔吸光度值。图2是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放NO的影响图。
GPMS能够抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO的释放，并呈现浓度依赖性(图2)。当GPMS的浓度为500μg/mL时，抑制效果优于50μg/mL的地塞米松(P<0.01)。
实施例6绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7细胞影响的电子显微镜观察
常规培养细胞，取对数生长期的RAW264.7细胞，吹打细胞成单细胞悬液，显微镜下用血细胞计数板计数后，1000rpm，离心5min去上清，培养基重悬并调整细胞浓度，按20万个/孔的细胞密度接种于24孔培养板，置于37℃，5％CO2培养箱培养，贴壁24h，吸弃上清，按如下分组要求给药，每组设3个复孔：Control组，脂多糖(LPS，终浓度为1μg/mL)组，LPS(终浓度为1μg/mL)+地塞米松(DXM，终浓度为50μg/mL)组，LPS(终浓度为1μg/mL)+GPMS(实施例1制备得到的绞股蓝皂苷，终浓度为62.5、125、250和500μg/mL)组，对照组添加同体积的DMEM基础培养基。给药后，置于37℃，5％CO2培养箱，继续培养24h。然后取出细胞在电子显微镜下拍照。图3是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞形态的影响图。
RAW264.7细胞经LPS诱导后，随着作用时间的改变，细胞形态发生改变，control组细胞呈圆形，边界清晰，贴壁良好，给予LPS诱导后，随着时间的延长，RAW264.7细胞形态学的改变逐渐明显，出现体积变大，呈不规则圆形、椭圆形、伸出伪足，边界不规则，部分细胞内呈明显泡沫化(图3)。经不同浓度的绞股蓝皂苷GPMS治疗后，细胞形态改变缓慢，趋于正常(图3)。
实施例7绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS、IL-6、TNF-α、IL-1β和COX-2mRNA表达的影响
常规培养细胞，取对生长数期的RAW264.7细胞，按100万/孔细胞数接种于6孔板，孵育24h后，吸弃上清，按如下分组要求给药，每组设3个复孔。Control组，脂多糖(LPS，终浓度为1μg/mL)组，LPS(终浓度为1μg/mL)+地塞米松(DXM，终浓度为50μg/mL)组，LPS(终浓度为1μg/mL)+GPMS(实施例1制备得到的绞股蓝皂苷，终浓度为62.5、125、250和500μg/mL)，对照组添加同体积的培养基。给药后，置于37℃，5％CO2培养箱，继续培养12h。作用12h后，吸弃细胞上清，PBS洗2次。每孔加入Trizol 1mL，静置5min，吸管吹打至液体无粘稠物，吸取细胞裂解液转入EP管，每管加入0.2mL氯仿，盖上EP管盖，手持用力上下震荡10s，室温静置5min，4℃以12,000rpm离心15min，离心后转移上层水相至另一EP管中，加入0.5mL异丙醇，室温静置10min，4℃离心机以12,000rpm离心10min，小心吸弃去上清，用冷体积分数75％的乙醇1mL清洗2次，分别4℃条件下以7,500rpm离心5min，小心吸弃上清，空气吹干，约15min，加入0～50μL RNase-free纯水，60℃加热10min溶解沉淀。测定mRNA的纯度和浓度。并用RevertAid First Strand cnthesis Kit(Thermo公司)反转录试剂盒，20μL反应体系，对RNA进行逆转录。采用DyNAmo Flash SYRB Green qPCR Kit(Thermo公司)试剂盒，ABI实时荧光定量PCR仪(Rrism 7500，Applied Biosystems，Foster City，CA,USA)对mRNA进行扩增，扩增后用ABI PRISM 7500SDS软件中Relative Quantification(ddCt)Study法进行自动分析以获得目的基因的相对表达量。相关基因mRNA引物序列为iNOS(forward,5’-CGGCAA ACA TGA CTT CAG GC-3’,reverse,5’-GCA CAT CAA AGC GGC CAT AG-3’)，IL-6(forward,5’-GTA CTC CAG AAG ACC AGA GG-3’,reverse,5’-TGC TGG TGA CAA CCA CGGCC-3’)，TNF-α(forward,5’-GGG GAT TAT GGC TCA GGG TC-3’,reverse,5’-CGA GGC TCCAGT GAA TTC GG-3’)，IL-1β(forward,5’-CCA TGG AAT CCG TGT CTT CCT-3’,reverse,5’-GTC TTG GCC GAG GAC TAA GG-3’)，COX-2(forward,5’-CAG CAA ATC CTT GCT GTTCC-3’,reverse,5’-TGG GCA AAG AAT GCA AAC ATC-3’)和GAPDH(forward,5’-CAC TCACGG CAA ATT CAA CGG CAC-3’,reverse,5’-GAC TCC ACG ACA TAC TCA GCA-3’)。
图4是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOSmRNA表达的影响图，其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01。图5是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6mRNA表达的影响图，其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01。图6是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TNF-αmRNA表达的影响图，其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01。图7是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-1βmRNA表达的影响图，其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01。图8是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞COX-2mRNA表达的影响图，其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01。
与control组相比，LPS组分泌的iNOS、IL-6、IL-1β和COX-2显著增加(P＜0.01)，表明LPS诱导RAW264.7巨噬细胞释放NO的炎症模型成立。绞股蓝皂苷(GPMS)可以显著抑制iNOS mRNA(图4)、IL-6mRNA(图5)和COX-2mRNA(图8)的分泌(P＜0.05)，且呈浓度依赖性。同时绞股蓝皂苷(GPMS)也对IL-1βmRNA有一定的抑制作用(图7)，但对TNF-αmRNA的分泌并无明显的抑制效果(图6)。
实施例8绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7细胞相关蛋白水平的影响
常规培养细胞，取对生长数期的RAW264.7细胞，按100万/孔细胞数接种于6孔板，孵育24h后，吸弃上清，按如下分组要求给药，每组设3个复孔。Control组，脂多糖(LPS，终浓度为1μg/mL)组，LPS(终浓度为1μg/mL)+地塞米松(DXM，终浓度为50μg/mL)组，LPS(终浓度为1μg/mL)+GPMS(实施例1制备得到的绞股蓝皂苷，终浓度为125、250和500μg/mL)组，对照组添加同体积的培养基。其中，LPS+GPMS组采用GPMS预先刺激2h后，再加脂多糖(LPS+地塞米松组同样处理)，置于37℃，5％CO2培养箱，继续培养12h。作用12h后，吸弃细胞上清，并且用预冷的PBS清洗两次，收集细胞至1.5mL离心管中，加入60μL的PIPA裂解液(含磷酸酶抑制剂(PhosSTOP，Roche)和蛋白酶抑制剂(cOmplete ULTRA Tablets，Mini，EDTA-free，EASYpack，Roche))，用1mL的注射器吸取裂解液反复吹打细胞至充分混匀，于冰上放置30min，每隔10min于涡旋振荡器上振荡30s。以12000rpm离心15min，将上清转移至新的1.5mLEP管，置于冰上待测定蛋白浓度。采用BCA法检测蛋白浓度(按照BCA Protein AssayKit说明书进行)：先将浓度为2mg/mL的BSA溶液予超纯去离子水稀释为系列质量浓度(0μg/mL、25μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL)的标准品溶液，再根据需要配置一定量的工作液(BCA Solution:4％(体积分数)Cupric Sulfate＝200:4)。取一块无底物的96孔板，每孔分别加入已稀释好的系列标准品溶液25μL，以及需要检测的蛋白溶液25μL(已稀释5倍)，每组均设置复孔。同时加入200μL/孔工作液，轻轻震荡混匀，置于37℃孵育30min后，取出，于多标记微孔板检测仪570nm处检测OD值。根据标准品蛋白溶液所测OD值绘制标准曲线，计算出待测蛋白溶液浓度。根据BCA法测得的蛋白浓度，计算出40μg总蛋白所需蛋白体积，同时加5μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液，再补充相应体积的超纯去离子水至总体积为25μL，混匀，充分离心，使液体聚集在底部，100℃加热变性10min，离心，置于冰上备用。选择10％(体积分数)分离胶和5％(体积分数)浓缩胶，将已变性好的蛋白样品依次加入各泳道，样品两侧的泳道分别加入5μL Marker。电泳槽中加入足够量的TGS缓冲液，电泳条件为：100V，约150min，直至溴酚蓝指示剂跑至距胶下缘约0.5cm时，停止电泳。然后在冰浴中以100V的电压转膜100min。用含5％(质量分数)脱脂奶粉的TBST封闭，缓慢摇荡1h。一抗抗体分别为：GAPDH(14c10)Rabbit mAb、p-JNK、p-P38、p-P65和COX-2(均购自CST公司)，二抗抗体为山羊抗兔(HRP标记)，购自聚研生物科技有限公司。按照说明书推荐的稀释比例(1:1000)，配制一抗，室温下轻摇孵育4h或4℃静置过夜。一抗孵育结束后，更换二抗，HRP标记的二抗按相应比例稀释(1:2000)，室温轻摇1h。二抗结束后，加入发光液(购自BioFuture公司)并利用凝胶成像仪蛋白条带显影。
图9是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞磷酸化JNK(p-JNK)蛋白水平影响的结果分析图，其中图A为p-JNK蛋白表达曝光图，图B为p-JNK蛋白相对表达量；其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01。图10是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞磷酸化P38(p-P38)蛋白水平影响的结果分析图，其中图A为p-P38蛋白表达曝光图，图B为p-P38蛋白相对表达量；其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01。图11是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞磷酸化P65(p-P65)蛋白水平影响的结果分析图，其中图A为p-P65蛋白表达曝光图，图B为p-P65蛋白相对表达量；其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01。图12是实施例1制备得到的绞股蓝皂苷(GPMS)对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞COX-2蛋白水平影响的结果分析图，其中图A为COX-2蛋白表达曝光图，图B为COX-2蛋白相对表达量；其中，##：与control组比较，P<0.01，**：与LPS组比较，P<0.01。
正常组RAW264.7巨噬细胞内磷酸化的JNK、P38、P65和COX-2蛋白表达较低，当1μg/mL的LPS作用细胞12h，细胞内磷酸化的JNK、P38、P65和COX-2蛋白表达显著上调(P＜0.01)，从而激活MAPK和NF-κB信号通路(图9～12)。绞股蓝皂苷GPMS可以浓度依赖性的显著下调p-P38(图10)、p-P65(图11)和COX-2(图12)蛋白表达，同时绞股蓝皂苷GPMS也可显著降低p-JNK(图9)蛋白表达。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南理工大学
<120> 一种绞股蓝皂苷及制备方法与其在制备抗炎药物中的应用
<130> 1
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS的forward
<400> 1
cggcaaacat gacttcaggc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS的 reverse
<400> 2
gcacatcaaa gcggccatag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6的forward
<400> 3
gtactccaga agaccagagg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6的reverse
<400> 4
tgctggtgac aaccacggcc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-α的forward
<400> 5
ggggattatg gctcagggtc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-α的reverse
<400> 6
cgaggctcca gtgaattcgg 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-1β的forward
<400> 7
ccatggaatc cgtgtcttcc t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-1β的reverse
<400> 8
gtcttggccg aggactaagg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2的forward
<400> 9
cagcaaatcc ttgctgttcc 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2的reverse
<400> 10
tgggcaaaga atgcaaacat c 21
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH的forward
<400> 11
cactcacggc aaattcaacg gcac 24
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH的reverse
<400> 12
gactccacga catactcagc a 21

Claims (10)

1.一种绞股蓝皂苷的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：
(1)将绞股蓝粉碎，过筛，得绞股蓝粗粉；
(2)采用乙醇溶液加热回流提取绞股蓝粗粉，然后将提取液离心，并将上清液浓缩，得到浓缩的绞股蓝乙醇粗提物浸膏；
(3)将绞股蓝乙醇粗提物浸膏用蒸馏水溶解，加入有机溶剂进行萃取，去除含有色素的有机层，然后向水层中加入氯仿或乙酸乙酯继续进行萃取，去除有机层，得到水溶液；加入正丁醇进行萃取，收集正丁醇相，浓缩蒸干，得到绞股蓝皂苷即绞股蓝总皂苷。
2.根据权利要求1所述绞股蓝皂苷的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述有机溶剂为石油醚或乙醚中一种以上；步骤(2)中所述乙醇溶液的体积分数为70～85％。
3.根据权利要求2所述绞股蓝皂苷的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述有机溶剂为石油醚；步骤(2)中所述乙醇溶液的体积分数为75％。
4.根据权利要求1所述绞股蓝皂苷的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述加热回流提取的温度为90～100℃；所述加热回流每次提取的时间为2～4h；
步骤(2)中所述加热回流提取的次数为2～4次。
5.根据权利要求1所述绞股蓝皂苷的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述加入有机溶剂进行萃取的次数为3～5次，每次萃取的时间为30～60min；所述加入氯仿或乙酸乙酯继续进行萃取的次数为3～5次，每次萃取的时间为30～60min；所述加入正丁醇进行萃取的次数为3～5次，每次萃取的时间为30～60min。
6.根据权利要求1所述绞股蓝皂苷的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述乙醇溶液与绞股蓝粗粉的体积质量比为(10～20)mL:1g；
步骤(3)所述绞股蓝乙醇粗提物浸膏中绞股蓝粗粉与蒸馏水质量体积比为为200g：(1～3)L。
7.根据权利要求1所述绞股蓝皂苷的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为8～12min；步骤(2)和(3)中所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为40～60℃。
8.根据权利要求1所述绞股蓝皂苷的制备方法，其特征在于：步骤(3)中萃取所用的有机溶剂、氯仿或乙酸乙酯以及正丁醇总的体积用量与溶解浸膏的蒸馏水的体积用量比为(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)；
步骤(1)中所述粉碎过筛为50～60目筛。
9.一种由权利要求1～8任一项所述的制备方法得到的绞股蓝皂苷。
10.根据权利要求9所述绞股蓝皂苷的应用，其特征在于：所述绞股蓝皂苷在制备抗炎药物中的应用。
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