CN106442974B - 一种用于检测人血清中AGEs含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测人血清中AGEs含量的方法——胶乳免疫比浊法,该方法中提供的试剂包括碳酸盐缓冲液、稳定剂、偶联剂、防腐剂、抗人AGEs抗体的胶乳微球。该检测方法拓宽了检测的线性范围,并且该方法稳定性和线性好,特异性强,分析灵敏度高,操作简便等优点,可用于临床中常用的全自动生化分析仪。
Description
技术领域
本发明属于疾病的诊断或检测技术领域,具体涉及一种胶乳免疫比浊法用来检测人血清中AGEs的含量。
背景技术
AGEs是外源性或内源性的蛋白质、脂肪及核酸的氨基和还原糖发生非酶催化反应产生稳定的、不可逆的化合物,同时它能够和人体的组织和细胞相结合并造成严重的破坏。由于它的积聚会引发糖尿病等各种并发症,如糖尿病肾病、阿尔兹海默症、动脉粥样硬化、白内障等症,影响全身各系统,因此对其进行快捷、简单并准确的检验在临床诊断中具有重要意义。目前它的检测方法有放射受体分析法、放射免疫法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法等,但是这些方法操作过程繁琐,误差大,消耗时间长,自动化程度低,线性范围窄,费用高,灵敏度低,对于临床非常不利,一般只用来定性检测。
流行病学和临床研究表明,AGEs与多种疾病的密切相关,现今对其治病机制研究已经取得了很大的进展,同时相关靶点的药物也在不断开发,所以对其进行精确的诊断和准确定量成为了关键解决的限速步骤。因此开发检测该物质的其他方法,在该临床诊断中是具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测AGEs含量的方法。采用胶乳免疫比浊法检测血清中AGEs的含量,包括游离态的AGEs和结合态的AGEs,线性范围宽好,灵敏度高,特异性好、操作简单、方便快速等优点。它能够作为一项新的临床指标,AGEs检测对阐明这些疾病的发病机制和判定治疗效果有一定价值。
本发明采用以下步骤:
一种AGEs检测试剂,包括试剂R1和试剂R2,所述试剂R1和试剂R2的组成如下:
试剂R1中含有
试剂R2中含有
本发明中抗人AGEs抗体的胶乳微球的制备步骤:
1、每ml反应混合物加入下列各物:
a.去离子水是最后容积为1.0mL;
b.0.1mL的5x的贮备缓冲溶液,其pH值为6.0-7.0(一般可用0.5M MES缓冲溶液);胶乳微球最终浓度为5%(W/V);
c.按照二者呈现的0.2∶1~0.5∶1的比例范围加入50mg/ml的NHS在去离子水中的溶液和19.2mg/mL的EDAC在去离子水中的溶液中;
2、在室温将此混合物反应18min,不断搅拌;
3、用上述的MES缓冲液,除去未反应的NHS和EDAC;
4、重新将胶乳微球在去离子水中悬浮,使其浓度为5%(w/v);
5、将结合的蛋白质溶于MES缓冲溶液中,浓度为1mg/mL;
6、立即加入蛋白质溶液;
7、将混合物反应至少2h,轻轻搅拌;
8、按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合,搅拌反应10分钟;
9、除去未结合的蛋白质和乙醇胺,贮于适宜的贮存缓冲溶液中。
本发明的优点:
1.采用的不同粒径的胶乳微球,提升了检测的线性范围和灵敏度。
2.采用的偶联剂NHS和EDAC的加入比例的多少,提升了抗体与微球的偶联效率。
3.试剂的线性范围宽,准确度高,使用方便,满足临床需要。
附图说明:
图1:实施例1与对比方法相关性图
图2:实施例2与对比方法相关性图
图3:实施例3与对比方法相关性图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明,但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
按照下面讲述的检测步骤,在550nm的波长下,试剂R1∶试剂R2=4∶1,偶联剂NHS和EDAC的加入比例0.5∶1,检测一批数量为40例血清样本。
本实施例描述的AGEs检测方法,使用双试剂全自动生化分析仪,例如贝克曼DXC800、日立7600等全自动分析仪,选用终点法进行测定。将R1和R2放置所设置好的位置上,在样本盘中对应位置放好蒸馏水、标准品和待测样本,操作如下:
表1操作程序
结果计算:以测定管ΔA,根据校准曲线可求得AGEs含量。
实施例2
按照下面讲述的检测步骤,在600nm的波长下,试剂R1∶试剂R2=5∶1,偶联剂NHS和EDAC的加入比例0.2∶1,检测同实施例1相同的40例血清样本。
本实施例描述的AGEs检测方法,使用双试剂全自动生化分析仪,例如贝克曼DXC800、日立7600等全自动分析仪,选用终点法进行测定。将R1和R2放置所设置好的位置上,在样本盘中对应位置放好蒸馏水、标准品和待测样本,操作如下:
表2操作程序
结果计算:以测定管ΔA,根据校准曲线可求得AGEs含量。
实施例3
按照下面讲述的检测步骤,按照上述的检测步骤,在580nm的波长下,试剂R1∶试剂R2=6∶1,偶联剂NHS和EDAC的加入比例0.4∶1,检测同实施例1和实施例2相同的40例血清例样本。
本实施例描述的AGEs检测方法,使用双试剂全自动生化分析仪,例如贝克曼DXC800、日立7600等全自动分析仪,选用终点法进行测定。将R1和R2放置所设置好的位置上,在样本盘中对应位置放好蒸馏水、标准品和待测样本,操作如下:
表3操作程序
结果计算:以测定管ΔA,根据校准曲线可求得AGEs含量。
实施例4
将上述实施例1~3的相同血清样本进行荧光光谱法检测(对比方法),实施例1~3的结果与对比方法比较。
表4所有实施例检测结果汇总(ng/mL)
综合上述结果实施例1~3中的结果采用BS-420全自动生化分析仪,对40个血清样本进行测定,并对测定值进行相关分析并与对比方法检测结果比较,其中实施例1的相关系数:r2=0.997,线性方程为:y=0.999x+0.067。其中实施例2的相关系数:r2=0.982,线性方程为:y=1.003x+0.124。其中实施例3的相关系数:r2=0.964,线性方程为:y=0.960x+0.469;结果表明实施例1中的试剂的检测与对比方法的相关性较好。
Claims (1)
1.一种检测AGEs含量方法所用的检测试剂,其特征包括试剂R1和试剂R2,试剂R1和试剂R2的体积比例为6∶1~4∶1,所述试剂R1和试剂R2的组成如下:
试剂R1中含有
试剂R2中含有
抗人AGEs抗体的胶乳微球的制备步骤:
(1)、每ml反应混合物加入下列各物:
a.去离子水是最后容积为1.0mL;
b.0.1mL的5x的贮备缓冲溶液,其pH值为6.0-7.0,所述5x的贮备缓冲溶液采用0.5MMES缓冲溶液;胶乳微球最终浓度为5%(W/V);
c.按照二者呈现的0.2∶1~0.5∶1的比例范围加入50mg/ml的NHS去离子水溶液和19.2mg/mL的EDAC去离子水溶液;
(2)、在室温将此混合物反应18min,不断搅拌;
(3)、用上述的MES缓冲液,除去未反应的NHS和EDAC;
(4)、重新将胶乳微球在去离子水中悬浮,使其浓度为5%(w/v);
(5)、将结合的蛋白质溶于MES缓冲溶液中,浓度为1mg/mL;
(6)、立即加入蛋白质溶液;
(7)、将混合物反应至少2h,轻轻搅拌;
(8)、按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合,搅拌反应10分钟;
(9)、除去未结合的蛋白质和乙醇胺,贮于适宜的贮存缓冲溶液中。
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CN101046473A (zh) * | 2006-03-31 | 2007-10-03 | 上海复星医药(集团)股份有限公司 | 改进胶乳结合的抗原或抗体粒子稳定性的方法 |
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