CN106434784B - 一种离子液体为反应介质的酶法制备脂溶性茶多酚的方法 - Google Patents

一种离子液体为反应介质的酶法制备脂溶性茶多酚的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种离子液体为反应介质的酶法制备脂溶性茶多酚的方法，属于食品添加剂生物合成领域。本发明方法采用离子液体作为反应介质，将茶多酚与脂肪酸乙烯酯在脂肪酶催化作用下60‑70℃反应12‑18小时，反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性茶多酚产品，该产物在食用油中溶解性良好，具有较强的抗氧化性能。相对于化学合成，本发明具有条件温和、反应后催化剂和离子液体与产物容易分离，可实现循环使用。

Description

一种离子液体为反应介质的酶法制备脂溶性茶多酚的方法
技术领域
本发明涉及一种离子液体为反应介质的酶法制备脂溶性茶多酚的方法，属于食品添加剂生物合成领域。
背景技术
茶多酚作为一种天然食品添加剂，具有使用安全性高，抗氧化能力强，基本无副作用等特点，该类化合物具有高效的抗癌、抗衰老、抗辐射、清除人体自由基、降血糖、降血脂等一系列药理功能，在油脂、食品、医药等领域得到了愈来愈多的应用，其经济效益和应用前景十分乐观。我国具有丰富的茶叶资源，从茶叶中提取茶多酚的工艺成熟，因此，茶多酚作为天然抗氧化剂对食品工业的发展和保护人体健康具有非常重要意义。
受自身分子结构限制，茶多酚易溶于水，难溶于油。对油脂性体系，茶多酚的溶解度很小，如果作为精炼食用油或含油食品的抗氧化剂，只能少量溶入，难以加至有效的抗氧化浓度阈值，其优异的抗氧化活性难以发挥作用。
为了解决茶多酚在油脂体系中不能均匀分散的问题，常用一些改性方法增加其脂溶性，这些方法包括溶剂法、乳化法、分子修饰法等。前两种方法得到的产品脂溶性不稳定，一般放置6个月以上会有茶多酚析出。
分子修饰法是将茶多酚中几种儿茶素分子结构的某些部位酰化或酯化，使得新生成的分子由原先的水溶性改性为脂溶性。目前分子修饰法主要有化学法和酶法。化学修饰是是利用有机试剂作为反应的催化剂和酰基供体，整个反应过程受试剂种类、浓度及反应温度等因素的影响。儿茶素的化学分子修饰主要是在儿茶素的酚羟基上引入酰基，形成酯键。目前常用的酰基供体为酰氯、酸酐、羧酸等，短链(C2-C4)一般选择相应的酸酐，而C6以上则使用酰氯。化学法分子修饰存在其自身固有的缺陷，如酚羟基损失较大，导致其生物活性降低；区域选择性差，易产生大量的副产物，目标产物分离难度大；采用基团保护等措施，反应步骤多，反应温度高，反应耗时长；多用碱性催化剂，产生大量含碱废液，造成环境污染等。
相对于化学法，酶法分子修饰具有反应条件温和，区域选择性高，副反应少，反应步骤少、简单可控、环境友好等优点。然而，目前酶法修饰茶多酚制备脂溶性产品的相关报道较少。如何以简单温和、低毒的方法制备脂溶性茶多酚并保证较高的得率，是目前亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种离子液体为反应介质的酶法制备脂溶性茶多酚的方法。本发明的方法是将茶多酚与脂肪酸乙烯酯在离子液体体系中经脂肪酶促催化反应，合成改性脂溶性茶多酚。本发明将离子液体用于酶法分子修饰的反应介质，与传统的有机溶剂相比，离子液体在脂肪酶催化酯类合成过程中具有提高脂肪酶的催化性能、热稳定性及区域选择性等优越的介质特性，且后处理简单，可重复利用。
本发明的第一个目的是提供一种脂溶性茶多酚的制备方法，所述方法是采用离子液体作为反应介质，将茶多酚与脂肪酸乙烯酯在脂肪酶催化作用下催化反应，反应结束后，经萃取、浓缩、真空干燥后得到脂溶性茶多酚。
在本发明的一种实施方式中，离子液体为酸性离子液体。
在本发明的一种实施方式中，所述酸性离子液体为以下任意一种或者多种的混合：
[Bmim]HSO4、[Bmim]H2PO4、[Bmim]FeCl3Br(其中Bmim：1-丁基-3-甲基咪唑)。
在本发明的一种实施方式中，所述萃取、浓缩，是在体系中加入乙酸乙酯萃取，取有机相进行浓缩。
在本发明的一种实施方式中，茶多酚(原料)为多酚含量95％以上，其中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)含量45％以上的茶多酚产品。
在本发明的一种实施方式中，脂肪酸乙烯酯为以下任意一种或者多种：乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、戊酸乙烯酯、己酸乙烯酯、新壬酸乙烯酯、新癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕榈酸乙烯酯。
在本发明的一种实施方式中，茶多酚与脂肪酸乙烯酯的摩尔比为1:1-3:1。
在本发明的一种实施方式中，脂肪酶的添加量为0.4-1.2％(w/w底物)(底物即茶多酚)。
在本发明的一种实施方式中，所述催化反应，是在60-70℃反应12-18小时。
本发明的第二个目的是提供按照所述方法得到的脂溶性茶多酚的应用。
所述应用，是应用于食品领域、生物领域或者制备药物。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，是用作食品添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，是用作精炼食用油或含油食品的抗氧化剂。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，是将本发明的脂溶性茶多酚添加到食用油中。
在本发明的一种实施方式中，所述添加的添加量为50-200mg/Kg。
本发明的有益效果：
(1)本发明与传统的化学合成法相比具有反应条件温和，反应步骤少，简单可控，环境友好，产品分离相对简单等优点，是一种高效、快速、符合绿色化学和环境友好发展方向的茶多酚改性方法。同时酶法分子修饰具有高度选择性，能更好保持或提高茶多酚的生物活性；本发明方法得率高。
(2)本发明采用离子液体作为反应介质，具有不挥发性、不易燃性、热稳定性、低毒等优点，离子液体中的生物催化过程表现出明显高于有机溶剂内所能达到的反应速率、区域选择性和转化产量。
(3)本发明制备的脂溶性茶多酚产物在油脂中溶解性良好，透光率为82％以上，明显高于未改性茶多酚(透光率21％)。在食用大豆油中，当添加量同为200mg/Kg时，油脂的过氧化值试验结果表明，本发明的脂溶性茶多酚的抗氧化性显著高于迷迭香提取物、BHT和未改性茶多酚。
(4)本发明的脂溶性茶多酚，脂溶性稳定，放置12个月都不会有茶多酚析出。
附图说明：
图1：不同抗氧化剂脂溶性能比较；
图2：脂溶茶多酚与几种抗氧化剂的抗氧化效果比较；其中BHA丁化羟基茴香醚，BHT2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，TBHQ特丁基对苯二酚，POV过氧化值。
具体实施方案
以下给出实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1
将100mg含EGCG 55.4％的茶多酚与乙酸乙烯酯按质量比2:1置于100mL具塞反应瓶中，再加入40mL[Bmim]HSO4离子液体，上述反应体系移入集热式磁力加热搅拌器中，待反应体系温度升至60℃时，加入0.5％(w/w底物)Novo Nordisk公司生产的脂肪酶LIPOZYMETL IM开始反应16h，反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性茶多酚产品94.7mg，得率为94.7％。
实施例2
将50mg含EGCG 46.8％的茶多酚与丙酸乙烯酯按质量比1:1置于100mL具塞反应瓶中，再加入20mL[Bmim]HSO4离子液体，上述反应体系移入集热式磁力加热搅拌器中，待反应体系温度升至70℃时，加入0.7％(w/w底物)Novo Nordisk公司生产的脂肪酶LIPOZYME RMIM开始反应12h，反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性茶多酚产品48.2mg，得率为96.4％。
实施例3
将300mg含EGCG 56.7％的茶多酚与戊酸乙烯酯按质量比2:1置于250mL具塞反应瓶中，再加入60mL[Bmim]FeCl3Br离子液体，上述反应体系移入集热式磁力加热搅拌器中，待反应体系温度升至70℃时，加入0.5％(w/w底物)Amano Pharmarceutial公司生产的脂肪酶LipaseAYS“Amano”开始反应18h，反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性茶多酚产品304.8mg，得率为101.6％。
实施例4
将200mg含EGCG 56.8％的茶多酚与乙酸乙烯酯按质量比2:1置于250mL具塞反应瓶中，再加入60mL[Bmim]H2PO4离子液体，上述反应体系移入集热式磁力加热搅拌器中，待反应体系温度升至70℃时，加入0.5％(w/w底物)Amano Pharmarceutial公司生产的脂肪酶LipaseAYS“Amano”开始反应18h，反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性茶多酚产品171.9mg。
实施例5
将200mg含EGCG 56.8％的茶多酚与乙酸乙烯酯按质量比2:1置于250mL具塞反应瓶中，再加入60mL[Bmim]FeCl3Br离子液体，上述反应体系移入集热式磁力加热搅拌器中，待反应体系温度升至70℃时，加入0.5％(w/w底物)Amano Pharmarceutial公司生产的脂肪酶LipaseAYS“Amano”开始反应18h，反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性茶多酚产品199.9mg。
实施例6
将200mg含EGCG 55％的茶多酚与乙酸乙烯酯按质量比3:1置于250mL具塞反应瓶中，再加入60mL[Bmim]FeCl3Br离子液体，上述反应体系移入集热式磁力加热搅拌器中，待反应体系温度升至68℃时，加入0.4％(w/w底物)Amano Pharmarceutial公司生产的脂肪酶Lipase AYS“Amano”开始反应16h，反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性茶多酚产品201.8mg。
实施例7
将300mg含EGCG 55％的茶多酚与乙酸乙烯酯按质量比2:1置于250mL具塞反应瓶中，再加入60mL[Bmim]FeCl3Br离子液体，上述反应体系移入集热式磁力加热搅拌器中，待反应体系温度升至64℃时，加入1.2％(w/w底物)Amano Pharmarceutial公司生产的脂肪酶Lipase AYS“Amano”开始反应12h，反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性茶多酚产品300.7mg。
实施例8：脂溶性茶多酚的性能及应用
如图1所示，为实施例1-7制备得到的脂溶性茶多酚与其他不同抗氧化剂的脂溶性能比较。分别称取10mg茶多酚、脂溶性茶多酚、BHT、BHA、TBHQ和迷迭香提取物，分别溶于10mL氯仿中，超声10min使其溶解，采用紫外可见分光光度计测定所得溶液或悬浊液在800nm下的透光率。
图1结果表明，本发明制备的脂溶性茶多酚产物在油脂中溶解性良好，透光率为82％以上，明显高于未改性茶多酚(透光率21％)。
将实施例1-7制备得到的脂溶性茶多酚进行应用。选择的油脂为国内常用的大豆油，其他抗氧化剂为BHT、TBHQ、茶多酚和迷迭香提取物，当添加量同为200mg/kg时，按照《GB/T 5538-2005动植物油脂过氧化值测定》测定POV值。油脂的过氧化值试验结果(如图2)表明，本发明的脂溶性茶多酚的抗氧化性显著高于迷迭香提取物、BHT和未改性茶多酚。
实施例9
将实施例1中的离子液体分别替换成酸性离子液体[Bmim]H2PO4、碱性离子液体[Bmim]OH、中性离子液体[Bmim]BF4，其他步骤和参数与此实施例一致。
结果显示，茶多酚在酸性离子液体[Bmim]H2PO4、碱性离子液体[Bmim]OH、中性离子液体[Bmim]BF4反应16h后，他们的转化率分别为85.5％，34.8％和52.7％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种脂溶性茶多酚的制备方法，其特征在于，所述方法是采用离子液体作为反应介质，将茶多酚与脂肪酸乙烯酯在脂肪酶催化作用下催化反应，反应结束后，经萃取、浓缩、真空干燥后得到脂溶性茶多酚；所述离子液体为酸性离子液体；所述催化反应，是在60-70℃反应12-18小时；所述茶多酚与脂肪酸乙烯酯的摩尔比为1:1-3:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子液体为以下任意一种或者多种的混合：[Bmim]HSO4、[Bmim]H2PO4、[Bmim]FeCl3Br。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶的添加量为底物重量的0.4-1.2％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述茶多酚为多酚含量95％以上、其中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)含量45％以上的茶多酚产品。
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