CN106434635A - 一种提高琴叶风吹楠dna提取质量的方法 - Google Patents

一种提高琴叶风吹楠dna提取质量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法，涉及DNA的提取方法，属生物技术领域。具体为选择琴叶风吹楠硅胶干燥树皮材料及在QIAGENPlant Mini Kit试剂盒的Buffer AP1提取液中加入1％的PVP，水浴时间延长至20min进行琴叶风吹楠DNA提取。本发明通过选择硅胶干燥树皮为材料，解决野外采集琴叶风吹楠新鲜叶片困难、且用新鲜叶片和落叶提取的DNA得率低、质量差的难题；用QIAGEN试剂盒改良法替代了传统的CTAB提取DNA的方法，解决了琴叶风吹楠用CTAB法和QIAGEN试剂盒原来的方法提取不到满足于实验要求的DNA难题，通过在QIAGEN试剂盒Buffer AP1中加入1％的PVP作为多酚络合剂和抗氧化剂，使琴叶风吹楠中的多酚不被分离到提取液，延长水浴时间使细胞尽可能多的破壁，细胞内大部分核酸渗出。

Description

一种提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法，特别是适用于琴叶风吹楠DNA提取的方法。属生物技术领域。
背景技术
DNA的提取是满足分子生物学实验的最重要、最基本的操作，提取高质量的DNA对于分子生物学实验非常重要。目前，提取DNA的材料为植物各部分组织，但多用幼嫩组织(嫩叶、嫩茎等)，而对于一些高大树种，采集嫩叶相当困难；提取方法有CTAB法、SDS法、高盐低pH法以及试剂盒法等，不同物种根据实际情况(内含物、组织结构差异等)，在以上几种方法的基础上进行了改良，以便提取得到高质量的DNA[1-8]。
琴叶风吹楠(Horsfieldia pandurifolia)科属：肉豆蔻科风吹楠属，倒卵状长圆形至提琴形，长16一34厘米，宽6－9.5厘米，先端短渐尖至突尖，基部楔形至宽楔形，两面无毛，侧脉9一22对；叶柄粗壮，长2.2一3厘米。花单性，雌雄同株，圆锥花序腋生，分枝稀疏，长12一15(一30)厘米，花序轴紫红色；花小，直径约2毫米，花被裂片通常个雄蕊10，合生成球形。果序圆锥状，长10一18厘米，通常着果1一3；果卵状椭圆形，基部下延成柄，长3－4.5厘米，外面光滑，成熟时2瓣裂，假种皮鲜红色，先端微撕裂状；种子1，顶端具突尖，种皮硬壳质。产地：云南。通常为生长在热带雨林沟谷的上层树种，成年树株高可达20-30m，采集新鲜叶片非常困难。
至今，很少有琴叶风吹楠，甚至肉豆蔻科的关于分子生物学研究的报道，特别是提取琴叶风吹楠植物DNA方面更是没见报道，de Wilde[9]和吴裕[10]等人分别用分子证据发表了关于风吹楠属、琴叶风吹楠分类学问题的文章，但文中也没有提到关于肉豆蔻科及琴叶风吹楠DNA提取的方法。
参考文献：
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[9]de Wilde W J.Endocomia,a new genus of Myristicaceae[J].Blumea,1984，30：173-196.
[10]吴裕，毛常丽，张凤良，等.琴叶风吹楠(肉豆蔻科)分类学位置再研究[J]，植物研究，2015，35(5)：652-659.
发明内容
本发明目的在于为了克服以上困难，本发明提供了一种适用于琴叶风吹楠采样及DNA的提取方法，其目的在于解决琴叶风吹楠采样困难，CTAB法、QIAGEN试剂盒法提取不到满足于分子实验所需的DNA等问题。
本发明提供一种适用于琴叶风吹楠DNA提取的方法，包括选择的样品为琴叶风吹楠树皮，提取的方法为QIAGEN试剂盒改良法，即在QIAGEN试剂盒Buffer AP1提取液中加入1％的PVP(以下简称1％PVP-AP1提取液)，在试剂盒提取步骤中的水浴时间由10min延长至20min。
所述的树皮样品为嫩枝树皮，如果树太高不能采到嫩枝，则用刀将主干树皮外层干枯木栓层刮除，取新鲜木栓层进行硅胶干燥；
所述的1％PVP-AP1提取液配方为：在100ml Buffer AP1提取液中加入1gPVP；
所述的水浴时间为液氮研磨后加入1％PVP-AP1提取液后，65℃水浴20min；
在以上所述中，优选的，如果能采到嫩枝，则要嫩树皮；
本发明野外采样时，带上变色硅胶用于干燥样品。采样时能采到嫩枝则将嫩树皮剥离进行硅胶干燥，如果树太高不能采到嫩枝，则用刀将主干树皮外层干枯木栓层刮除，取新鲜木栓层进行硅胶干燥。干燥好的样品用于后续DNA的提取。
本发明琴叶风吹楠DNA提取的方法具体步骤如下：
1)准备1％PVP-AP1提取液；
2)将50-70mg硅胶干燥样品进行液氮研磨后，加入400μl 1％PVP-AP1提取液和4μlRNase A，涡旋后65℃水浴20min，中间颠倒混匀2-3次；
3)水浴结束后加入130μl Buffer P3，混匀后，冰浴5min；
4)14000rpm，离心5min；
5)转移溶液至QIAshredder收集管，14000rpm，离心2min；
6)将收集管中的液体转入一新的离心管，加入1.5倍体积的AW1，枪打匀；
7)转移6中的液体650μl至2ml收集柱，大于8000rpm，离心1min，(如果6中样品还有剩余，可重复此步骤)
8)将收集柱转入一新的2ml收集管，加入500μl AW2，大于8000rpm，离心1min，弃收集管中的液体；
9)加入500μl AW2，大于12000rpm，离心2min；
10)将吸附柱放入一新的1.5ml离心管；
11)加入100μl Buffer AE，室温放置5min-10min，大于8000rpm，离心1min；
12)将吸附柱重新放入一新的1.5ml离心管，重复步骤11。
本发明还提供1％PVP-AP1提取液的配制方法，为：在100ml Buffer AP1提取液中加入1gPVP。
本发明通过选择硅胶干燥树皮为材料，解决野外采集琴叶风吹楠新鲜叶片困难、且用新鲜叶片和落叶提取的DNA得率低、质量差的难题；用QIAGEN试剂盒改良法替代了传统的CTAB提取DNA的方法，解决了琴叶风吹楠用CTAB法和QIAGEN试剂盒原来的方法提取不到满足于实验要求的DNA难题，通过在QIAGEN试剂盒Buffer AP1中加入1％的PVP作为多酚络合剂和抗氧化剂，使琴叶风吹楠中的多酚不被分离到提取液，延长水浴时间使细胞尽可能多的破壁，细胞内大部分核酸渗出。通过材料选择和提取方法改良可以提高所得DNA的质量。
本发明有益效果：可操作的采样方式简便、快速和高质量提取琴叶风吹楠DNA的方法，对于需要进行琴叶风吹楠分子生物学研究的研究者而言，显得非常重要。
附图说明
图1为本发明实施例1、实施例2和实施例3提取琴叶风吹楠叶片、树皮的DNA琼脂糖凝胶电泳检测图。
图2为实施例4的电泳图谱。
图3为实施例4的峰图。
图4为实施例4的原始数据。
图5为实施例4的0/1数据。
具体实施方法
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明将琴叶风吹楠的叶片材料换为琴叶风吹楠的树皮材料进行DNA提取，提取方法为QIAGEN试剂盒改良法，即在AP1中加入1％PVP(以下称1％PVP-AP1)，水浴时间由10min延长至20min，所述琴叶风吹楠的树皮材料为野外采样时能采到嫩枝，则将嫩树皮剥离进行硅胶干燥。如果琴叶风吹楠树太高不能采到嫩枝，则可用刀将琴叶风吹楠主干树皮外层干枯木栓层刮除，取新鲜木栓层进行硅胶干燥；所述的AP1中加入1％PVP为：100ml AP1中加入1gPVP。
发明人曾分别采用CTAB法、QIAGEN试剂盒法提取琴叶风吹楠老树皮、嫩树皮、老叶、嫩叶的DNA进行比对实验，但由于得到的琴叶风吹楠DNA得率低、质量差，不能满足实验需要。为了将琴叶风吹楠的分子生物学研究继续进行，首先需要解决的问题是如何得到高质量的DNA，这也是本发明产生原因。
实施例1 QIAGEN试剂盒改良法提取琴叶风吹楠嫩叶、嫩树皮、老叶、老树皮DNA
改良方法为：在QIANGEN试剂盒的Buffer AP1提取液中加入1gPVP。水浴时间延长至20min。具体步骤如下：
1)准备1％PVP-AP1提取液；
2)将50-70mg硅胶干燥样品进行液氮研磨后，加入400μl 1％PVP-AP1提取液和4μlRNase A，涡旋后65℃水浴20min，中间颠倒混匀2-3次；
3)水浴结束后加入130μl Buffer P3，混匀后，冰浴5min；
4)14000rpm，离心5min；
5)转移溶液至QIAshredder收集管，14000rpm，离心2min；
6)将收集管中的液体转入一根新离心管，加入1.5倍体积的AW1，枪打匀；
7)转移步骤6中的液体650μl至2ml收集柱，大于8000rpm，离心1min，(如果步骤6中样品还有剩余，可重复此步骤)
8)将收集柱转入一根新的2ml收集管，加入500μl AW2，大于8000rpm，离心1min，弃收集管中的液体；
9)加入500μl AW2，大于12000rpm，离心2min；
10)将吸附柱放入一根新的1.5ml离心管；
11)再加入100μl Buffer AE，室温放置5min-10min，大于8000rpm，离心1min；
12)将吸附柱重新放入一根新的1.5ml离心管，重复步骤11。
本发明通过选择琴叶风吹楠树皮为材料，解决野外采集嫩叶困难及用老树叶提取不到适用于实验要求的DNA的难题，用QIAGEN试剂盒替代了传统的CTAB提取DNA的方法，解决了琴叶风吹楠用CTAB法提取不到满足于实验要求的DNA难题，通过在QIAGEN试剂盒Buffer AP1中加入1％的PVP作为多酚络合剂和抗氧化剂，使琴叶风吹楠中的多酚不被分离到提取液提取琴叶风吹楠DNA改变步骤及药品，延长水浴时间使细胞尽可能多的破壁，细胞内大部分核酸渗出。
实施例2 QIAGEN试剂盒提取琴叶风吹楠嫩叶、嫩树皮、老叶、老树皮DNA
2)将50-70mg硅胶干燥样品进行液氮研磨后，加入400μl Buffer AP1提取液和4μlRNase A，涡旋后65℃水浴10min，中间颠倒混匀2-3次；
3)水浴结束后加入130μl Buffer P3，混匀后，冰浴5min；
4)14000rpm，离心5min；
5)转移溶液至QIAshredder收集管，14000rpm，离心2min；
6)将收集管中的液体转入一根新的离心管，加入1.5倍体积的AW1，枪打匀；
7)转移步骤6中的液体650μl至2ml收集柱，大于8000rpm，离心1min，(如果步骤6中样品还有剩余，可重复此步骤)
8)将收集柱转入一根新的2ml收集管，加入500μl AW2，大于8000rpm，离心1min，弃收集管中的液体；
9)加入500μl AW2，大于12000rpm，离心2min；
10)将吸附柱放入一根新的1.5ml离心管；
11)加入100μl Buffer AE，室温放置5min-10min，大于8000rpm，离心1min；
12)将吸附柱重新放入一根新的1.5ml离心管，重复步骤11。
实施例3 CTAB法提取琴叶风吹楠嫩叶、嫩树皮、老叶、老树皮DNA
1)将水浴锅调至65℃；
2)用1.5ml的离心管编号后加入1ml的(2×CTAB+β-巯基乙醇)于65℃的水浴锅中预热；
3)取研钵，取适量的嫩叶、嫩树皮、老叶、老树皮分别加入液氮研磨，将研磨后的粉末转入事先预热好的装有CTAB提取液的离心管中，于65℃水浴中温浴2h左右，期间隔段时间上下颠倒摇动；
4)10000r/min离心10min；
5)取上清液于一根干净的离心管，加入等体积的24：1的氯仿：异戊醇，摇匀，10000r/min离心10min；
6)重复步骤5三次，直至中间析出的杂质层很薄；
7)取上清液加入300μl的5M的Nacl与600μl预冷的异丙醇，摇匀后置于4℃冰箱静置过夜(此步应先加入Nacl后加入异丙醇)；
8)10000r/min离心10min，弃上清液，沉淀即为DNA；
9)加76％乙醇200μl轻摇，使沉淀脱离管壁，静置5min后，8000r/min离心5min；
10)重复步骤9一次；
11)弃上清液，加入无水乙醇200μl，8000r/min离心5min；
12)弃乙醇，晾干后加入TE溶解DNA。
实施例4 应用本发明实施例1的方法，以琴叶风吹楠硅胶干燥嫩树皮、老树皮为材料，用QIAGEN试剂盒改良法提取琴叶风吹楠DNA，用于AFLP分析，AFLP分析在北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行，具体步骤如下：
1)QIAGEN试剂盒改良法提取琴叶风吹楠DNA；
2)限制性酶切及连接反应，反应体系如下：
将以上体系混匀离心数秒37℃保温5h,8℃保温4h，4℃过夜。
3)预扩增，体系如下：
离心数秒，按下列参数进行PCR扩增
4)选择性扩增
预扩产物1:20稀释后作为选扩模板。
按以下体系混匀后，离心数秒。
按下列参数设置PCR循环
第一轮扩增参数：94℃30S，65℃30S，72℃80S
以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12循环。
接着按下列参数进行扩增
5)选择性扩增实验结果，如下图2、图3、图4和图5：
6)从原始数据(图4)到0/1数据(图5)的统计
鼎国公司提供了ABI377测序仪电泳检测后的片段大小，即原始数据。数据是通过GENESCAN软件进分析，软件每2个碱基读一次数，Marker片段范围为70-500bp，这样在70-500bp之间一共读取216个数，由于不可避免的误差，在所设置的片段Bin Range范围内的片段，认为是同一条带，例如：在71.5-73.5之间，c1、c2扩增条带大小分别为73.00835和71.9044，这样的误差范围在我们的误差允许范围认为是同一条带。
在原始数据的基础上，有带的地方替换为1，无带的地方替换为0，这样构成了01数据。
以上实验结果表明，选择琴叶风吹楠硅胶干燥嫩树皮、老树皮用QIAGEN试剂盒改良法提取的琴叶风吹楠DNA完全可以用于分子生物学实验。

Claims (6)

1.一种提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法，其特征在于，选取的样品为硅胶干燥树皮，选择的提取方法是QIAGEN试剂盒改良法(在QIAGEN试剂盒Buffer AP1提取液中加入1％的PVP，水浴时间延长至20min)进行琴叶风吹楠DNA的提取。
2.根据权利要求1所述的提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法，其特征在于，具体步骤如下：
野外采样时，带上变色硅胶用于干燥样品。采样时能采到嫩枝则将嫩树皮剥离进行硅胶干燥，如果树太高不能采到嫩枝，则用刀将主干树皮外层干枯木栓层刮除，取新鲜木栓层进行硅胶干燥。干燥好的样品用于后续DNA的提取。
3.根据权利要求1或2所述的提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)准备1％PVP-AP1提取液；
2)将50-70mg硅胶干燥样品进行液氮研磨后，加入400μl 1％PVP-AP1提取液和4μlRNase A，涡旋后65℃水浴20min，中间颠倒混匀2-3次；
3)水浴结束后加入130μl Buffer P3，混匀后，冰浴5min；
4)14000rpm，离心5min；
5)转移溶液至QIAshredder收集管，14000rpm，离心2min；
6)将收集管中的液体转入一新的离心管，加入1.5倍体积的AW1，枪打匀；
7)转移6中的液体650μl至2ml收集柱，大于8000rpm，离心1min，(如果6中样品还有剩余，可重复此步骤)
8)将收集柱转入一新的2ml收集管，加入500μl AW2，大于8000rpm，离心1min，弃收集管中的液体；
9)加入500μl AW2，大于12000rpm，离心2min；
10)将吸附柱放入一新的1.5ml离心管；
11)加入100μl Buffer AE，室温放置5min-10min，大于8000rpm，离心1min；
12)将吸附柱重新放入一新的1.5ml离心管，重复步骤11。
4.根据权利要求3所述的提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法，其特征在于，叶片材料换为树皮材料进行DNA提取，提取的方法为QIAGEN试剂盒改良法，即在AP1中加入1％PVP(以下称1％PVP-AP1)，水浴时间由10min延长至20min，所述的树皮材料为野外采样时能采到嫩枝则将嫩树皮剥离进行硅胶干燥，如果树太高不能采到嫩枝，则用刀将主干树皮外层干枯木栓层刮除，取新鲜木栓层进行硅胶干燥；所述的AP1中加入1％PVP为：100mlAP1中加入1gPVP。
5.权利要求1-4项任一项所述提高琴叶风吹楠DNA提取质量的方法在提取琴叶风吹楠DNA中的应用。
6.权利要求1-5所述的树皮样品、QIAGEN试剂盒改良法(1％PVP-AP1提取液、20min水浴时间)在提取琴叶风吹楠DNA中的应用。
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