CN106399278A - 一种大肠杆菌β半乳糖苷酶受体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种大肠杆菌β半乳糖苷酶受体及其制备方法。本申请提供了一种SEQ ID NO：1所示的编码β半乳糖苷酶受体的核苷酸，以及SEQ ID NO：2所示的β半乳糖苷酶受体。根据结构生物学结构和功能，以及大肠杆菌β半乳糖苷酶的酶供体和酶受体的互补原理，设计了删除第13至33位氨基酸的酶受体；将酶受体的编码核苷酸与载体连接，并转化至大肠杆菌构建重组表达宿主细胞；通过发酵大量表达酶受体；通过亲和层析技术对酶受体纯化，脱盐后得纯度在90％以上的酶受体。与常规酶受体相比，本申请的酶受体产量更高、互补活性更强，可应用于CEDIA生化诊断试剂的研制。

Description

一种大肠杆菌β半乳糖苷酶受体及其制备方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，更具体地涉及酶供体免疫分析技术。本申请提供了一种大肠杆菌β半乳糖苷酶的酶受体，其编码核酸、表达载体、宿主细胞及制备方法。
背景技术
大肠杆菌β半乳糖苷酶(GenBank:EDU66561.1)可以通过溴化氢CNBr2裂解或者基因重组技术得到两个肽段：缺失N端少量氨基酸的大片段，称为酶受体(Enzyme acceptor，EA)：缺失大部分C端氨基酸的小片段是酶供体(Enzyme donor，ED)。二者单独存在没有酶活性，同时存在时二者可以聚合，形成具有酶活性的全酶，这一现象被定义为α-互补。
大肠杆菌β半乳糖苷酶的这种特性已被应用于分子生物学和酶供体免疫分析技术(Enzyme Donor Immunoassay，CEDIA)中。CEDIA技术在临床生化诊断中可以检测小分子化合物。
CEDIA是一种免疫检测技术，其结合了β半乳糖苷酶α互补原理和抗原抗体的特异性结合性质。将小分子抗原(Ag)与ED偶联，形成ED-Ag偶联物，此偶联物能与EA自发结合形成有活性的β半乳糖苷酶。但是，如果在反应体系中加入针对该小分子抗原的抗体(Ab)，抗原抗体的特异性结合会形成ED-Ag-Ab复合物。此时，由于抗体空间位阻的影响，ED-Ag-Ab复合物不能再与EA结合形成具有活性的β半乳糖苷酶。如果样本中含有待检测的小分子抗原，此时反应体系中含有两种形式的抗原：一种是样本中的游离Ag；一种是试剂盒中ED-Ag。这两种抗原都具有与抗体特异性结合的能力。显然，这两种形式的抗原会竞争性的与反应体系中的Ab结合，样本中游离Ag越多，其结合的Ab就越多，从而导致有更多的剩余ED-Ag偶联物(未与抗体结合的部分)能与EA自发结合形成具有活性的β半乳糖苷酶，且酶活性的高低与样本中游离抗原的含量成正比。
大肠杆菌β半乳糖苷酶EA可以应用于CEDIA技术临床生化诊断试剂的研制，是一种重要的原料酶，具有较大应用价值。
目前报道的经工程改造过的EA或者EA突变体有多种，例如在Langley KE和ZabinI发表的论文中(Biochemistry.1976，Vol 2；15:4866-75)提到了一种β半乳糖苷酶，和野生型EA相比，其缺失第11至41位的氨基酸残基(被称为M15)。
再比如，缺失23至31位氨基酸的M112；缺失35至52位氨基酸的EA5；缺失30至37位氨基酸的EA14；缺失35至54位氨基酸的EA11；缺失21至53位氨基酸的EA17；缺失13至45位氨基酸的EA18；缺失26至45位氨基酸的EA20；缺失13至40位氨基酸的EA22；缺失16至35位氨基酸的EA23；缺失22至35位氨基酸的EA24(Method for protein binding enzymecomplementation assays；美国专利US4708929A)。国内还有学者报道同时缺失1至5和14至40位氨基酸的β-半乳糖苷酶EA(大肠杆菌β-半乳糖苷酶EA、ED融合蛋白的表达；中华微生物学和免疫学杂志，2003,23,No 2:113-114)。
表1.现已报道的EA突变体总结
然而，现有技术中的酶仍然会存在检测本底较高的现象。鉴于此，本领域需要一种新型的β半乳糖苷酶，其具有更高的产量、更低的本底，并且酶受体和酶供体之间的互补活性更强。
发明内容
根据一些实施方式，提供了一种β半乳糖苷酶受体，其氨基酸序列是SEQ ID No.2。根据本申请的β半乳糖苷酶受体，和野生型相比，缺失第13至33位氨基酸残基。
本发明人根据大肠杆菌β半乳糖苷酶的生物学结构和功能，以及EA和ED的互补原理，定点删除了β半乳糖苷酶第13至33位氨基酸，得到本申请的β半乳糖苷酶受体。发明人出乎意料地发现，经过这种工程改造的重组β半乳糖苷酶受体具有非常低的检测本底，同时有利于表达和互补活性的提高。
根据一些实施方式，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的β半乳糖苷酶受体。在一些实施方式中，多核苷酸是DNA；在另一些实施方式中，多核苷酸是RNA。在具体的实施方式中，多核苷酸是DNA。在具体的实施方式中，多核苷酸的核苷酸序列是SEQ ID No.1、SEQID No.1的互补序列。
根据一些实施方式，提供了一种表达载体，其表达本申请的β半乳糖苷酶受体。在一些实施方式中，本申请的表达载体包含上述多核苷酸。在一些实施方式中，本申请的表达载体包含SEQ ID No.1所示的多核苷酸。在具体的实施方式中，SEQ ID No.1所示的多核苷酸可操作地连接至表达载体中。在一些实施方式中，表达载体是原核表达载体。在一些实施方式中，表达载体选自pET41a、pET28a、pET20a及其组合。在具体的实施方式中，表达载体是pET41a。
根据一些实施方式，提供了一种宿主细胞，其包含本申请的表达载体。在一些实施方式中，本申请的宿主细胞是原核宿主细胞。在具体的实施方式中，所述原核宿主细胞是大肠杆菌。在具体的实施方式中，大肠杆菌选自Rosetta-gami2(DE3)pLysS、BL21、Rosetta及其组合。
技术人员知晓，除了采用宿主细胞来表达目标产物以外，还可以使用无细胞表达系统表达本申请的β半乳糖苷酶受体。
根据一些实施方式，提供了一种试剂，其包含本申请的β半乳糖苷酶受体。在一些实施方式中，所述试剂是酶供体免疫分析试剂。在一些实施方式中，所述试剂包含一个、或两个、或三个、或以上的独立容器。在一些实施方式中，在一个容器中包含本申请的β半乳糖苷酶受体；在另一个容器中包含β半乳糖苷酶供体。在另一些实施方式中，β半乳糖苷酶供体可以是游离的；或者β半乳糖苷酶供体可以偶联有抗原，例如分子量较小的抗原、或者半抗原。在一些实施方式中，抗原选自：肽、多糖、脂质、核酸、药物。在一些实施方式中，本申请的β半乳糖苷酶受体和β半乳糖苷酶供体在不同的容器中。在一些实施方式中，β半乳糖苷酶供体可以是任何现有技术公知的或者未来的β半乳糖苷酶供体。
根据一些实施方式，提供了选自以下的任一项或其组合在制备试剂中的用途：本申请的β半乳糖苷酶受体、本申请的多核苷酸、本申请的表达载体、本申请的宿主细胞。在一些实施方式中，所述试剂是酶供体免疫分析试剂。
根据一些实施方式，提供了一种β半乳糖苷酶，其包含β半乳糖苷酶供体、以及本申请的β半乳糖苷酶受体。在一些实施方式中，β半乳糖苷酶供体和本申请的β半乳糖苷酶受体相互作用，形成有活性的β半乳糖苷酶。在一些实施方式中，β半乳糖苷酶供体和本申请的β半乳糖苷酶受体非共价结合。在一些实施方式中，β半乳糖苷酶供体还可以偶联有抗原，例如分子量较小的抗原、或者半抗原。在一些实施方式中，抗原选自：肽、多糖、脂质、核酸、药物。在一些实施方式中，β半乳糖苷酶供体可以是任何现有技术公知的或者未来的β半乳糖苷酶供体。
根据一些实施方式，提供了一种制备β半乳糖苷酶受体的方法，包括步骤：
1)在允许β半乳糖苷酶受体进行表达的条件下，培养本申请的宿主细胞；和
2)纯化并收集所述β半乳糖苷酶受体。
在一些实施方式中，所述培养是通过发酵进行的。在一些实施方式中，发酵按照选自以下的方式：分批发酵、连续发酵、补料分批发酵及其组合。在一些实施方式中，所述培养在容器中进行。在具体的实施方式中，所述容器选自：摇瓶、培养皿和发酵罐。
在一些实施方式中，在28至40℃、30至40℃、35至38℃，优选37℃的温度中进行培养。
在一些实施方式中，在需氧条件下，进行培养。在具体的实施方式中，在溶氧大于40％的条件下进行。
在一些实施方式中，在pH值在6.8至7.2的条件下培养。
在一些实施方式中，所述表达是组成型表达或者诱导型表达；这取决于表达载体的类型。
在一些实施方式中，在步骤1)和步骤2)之间还包括诱导的步骤。在具体的实施方式中，向步骤1)的培养物中加入诱导物从而诱导β半乳糖苷酶受体的表达。在具体的实施方式中，诱导物是IPTG。
在一些实施方式中，所述纯化是指亲和纯化。纯化的方法取决于表达载体的类型。例如，但不限于，当表达载体中包含His标签时，采用Ni-NTA亲和层析技术。
在具体的实施方式中，提供了一种制备β半乳糖苷酶受体的方法，包括步骤：
1)按1.5×108/L的密度，在发酵罐中将本申请的宿主细胞接种于含抗生素的初始培养基中；
2)在37℃中培养宿主细胞，直至宿主细胞的OD600达3至5；
3)将培养的温度降低至25℃，加入第一补料，之后加入IPTG至终浓度为1mM；
4)按10ml/h/L的速度加入第二补料培养8至12小时；
5)收集培养物；
6)通过Ni-NTA亲和层析纯化并收集β半乳糖苷酶受体；
7)任选地，对β半乳糖苷酶受体进行脱盐。
在具体的实施方式中，含抗生素的初始培养基包含：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、0.5至2g/L硫酸镁、7至10g/L磷酸氢二钾、3至6g/L磷酸二氢钠、10ml/L微量元素母液、50mg/L卡那霉素、20％至25％葡萄糖。
在具体的实施方式中，第一补料包含100±20g/L胰蛋白胨、250±50g/L酵母提取物、10±2g/L乳糖。
在具体的实施方式中，第二补料包含400±50g/L甘油。
附图说明
图1：β半乳糖苷酶受体的表达。左道：蛋白分子量Marker；右道：大肠杆菌β半乳糖苷酶受体的条带。
具体实施方式
实施例1.大肠杆菌β半乳糖苷酶EA的表达载体的构建
根据NCBI网站公布的大肠杆菌β半乳糖苷酶核苷酸序列，确定野生型EA基因序列；删除第13至33位氨基酸残基而得到SEQ ID No.2所示序列；委托北京三博远志生物技术公司进行全基因合成，并且在序列两端分别加上两个酶切位点(例如Nco I、Xho I)，将合成的基因序列插在质粒上；
将上述质粒进行双酶切，电泳回收大肠杆菌β半乳糖苷酶EA基因片段；载体质粒pET41a同样进行双酶切处理，电泳纯化酶切后的质粒；
酶切后的pET41a质粒与大肠杆菌β半乳糖苷酶EA基因在16℃条件下连接后得到表达质粒，转化大肠杆菌DH5α，涂布Kan抗性的培养基平板进行筛选；筛选得到的阳性克隆提取表达质粒后测序确认。
实施例2.表达宿主细胞的获得
将实施例1所得的表达质粒转化入宿主细胞大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)pLysS，得到表达宿主细胞。
实施例3.制备β半乳糖苷酶EA
将实施例2所得的表达宿主细胞接种于种子培养基(称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl溶于900ml去离子水中，10M NaOH调节pH至7.0，补加去离子水定容至1L，121℃高压灭菌20min，冷却后室温保存，使用时加入卡那霉素至其终浓度为50mg/L)，37℃培养至OD600达到3至5；
按1.5×10 8/L的密度将宿主细胞接种于发酵初始培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、硫酸镁0.5至2g、磷酸氢二钾7至10g、磷酸二氢钠3至6g、10ml微量元素母液(10gFeSO4·7H2O、0.1g NH46Mo7O24、0.5g MnSO4·5H2O、2.25g ZnSO4·7H2O、0.23g Na2B4O7·10H2O、1g CuSO4·7H2O、2g CaCl2溶于5M盐酸中)，加入900ml去离子水溶解后，调pH至6.8至7.2，补加去离子水定容至1L后，高压灭菌20min，冷却后使用。使用时加入卡那霉素至终浓度为50mg/L，加入灭菌的葡萄糖至终浓度为20％至25％)，调节通气量，在溶氧大于40％的条件下使其生长，并通过滴加酸或碱来调节培养基的pH值在6.8至7.2；
待初始培养基中的成分逐渐耗尽，培养基的溶氧值将至40％时，将培养温度降至25℃，同时以100ml/L的比例补加补料1(100±20g/L胰蛋白胨、250±50g/L酵母提取物、10±2g/L乳糖，121℃高温灭菌20min后室温保存)。补料1补加完成后，加入IPTG至终浓度为1mM开始诱导；
并按10ml/h/L的速度添加补料2(400±50g/L甘油，121℃高温灭菌20min后室温保存)，同时用氨水或硫酸调节培养基的pH值在6.8至7.2；25℃低温条件下诱导约10h后，发酵培养结束；
将所得的细胞以管式离心机离心收集，高压均质机预冷至温度4℃以下；
重悬细胞，以高压均质机850bar高压均质3次，使细胞破碎，释放大肠杆菌β半乳糖苷酶EA；
将细胞裂解液于4℃18000rpm离心30min，所得上清用0.22μm滤膜过滤；
将过滤后的上清加载至Ni亲和柱；除去未与柱结合或结合力较低的杂质；洗脱目的蛋白大肠杆菌β-半乳糖苷酶EA，同时收集蛋白峰；
加载至脱盐柱进行脱盐，收集蛋白峰。
测试例
测试例1.蛋白纯度和产量的测定
将实施例3所得蛋白以SDS-PAGE凝胶电泳鉴定蛋白纯度(图1)，并以BCA法测定蛋白浓度，计算出EA产量。本申请制得的EA纯度为90％。
表2.产量
测试例2.活性检测
将实施例3所得的大肠杆菌β半乳糖苷酶EA进行活性检测。
大肠杆菌β半乳糖苷酶EA能够和ED互补，形成β半乳糖苷酶。β半乳糖苷酶能够将邻硝基苯βD-半乳吡喃糖苷(ONPG)水解，生成半乳糖和黄色的邻硝基苯酚(ONP)。测定ONP的量可以确定半乳糖苷酶的酶活，从而确定EA的互补活性。
(1)EA用PB缓冲液(100mM PBS、150mM NaCl、0.1％NaN3、pH 7.3)稀释至0.2mg/ml，ED以PB缓冲液稀释至1μg/ml。以西门子生化分析仪1800测定互补活性：
100μl EA溶液作为R1；
100μl ONPG底物溶液(5mg/ml ONPG、100mM PBS、150mM NaCl、10mM MgCl2、0.1％NaN3，pH7.3)作为R2；
10μl酶供体溶液作为样本S，用于测定EA的互补活性。
10μl PB缓冲液作为空白对照样本，用于测定EA的本底活性；
运行EA-ED程序，确定反应速率，
(2)以M15为对照，平行进行上述操作。
(3)结果：
本申请的EA互补活性比M15高11.2％，而本底活性低21％。
表3.互补活性
EA OD571 ％
M15 0.21874 100
本申请的EA 0.24332 111.2％
表4.本底活性
EA OD571 ％
M15 0.00167 100
本申请的EA 0.00132 79

Claims (10)

1.一种β半乳糖苷酶受体，其氨基酸序列是SEQ ID No.2。
2.根据权利要求1所述的β半乳糖苷酶受体，其偶联有抗原，所述抗原选自：肽、多糖、脂质、核酸、药物、及其组合。
3.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的β半乳糖苷酶受体；
所述多核苷酸是DNA或RNA；
优选地，所述多核苷酸的序列是SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的互补序列。
4.一种原核表达载体，其包含权利要求3所述的多核苷酸；
优选地，所述原核表达载体选自：pET41a、pET28a、pET20a及其组合。
5.一种原核宿主细胞，其包含权利要求4所述的原核表达载体；
优选地，所述原核宿主细胞是大肠杆菌；
更优选地，所述大肠杆菌选自：Rosetta-gami2(DE3)pLysS、BL21、Rosetta及其组合。
6.一种试剂，其包含权利要求1所述的β半乳糖苷酶受体；
优选地，所述试剂是酶供体免疫分析试剂；
任选地，所述试剂还包含β半乳糖苷酶供体；
优选地，所述β半乳糖苷酶受体和所述β半乳糖苷酶供体在不同的容器中。
7.选自以下的任一项或其组合在制备试剂中的用途：
权利要求1所述的β半乳糖苷酶受体、权利要求3所述的多核苷酸、权利要求4所述的原核表达载体、和权利要求5所述的原核宿主细胞；
优选地，所述试剂是酶供体免疫分析试剂。
8.一种β半乳糖苷酶，其包含：
权利要求1所述的β半乳糖苷酶受体；以及
β半乳糖苷酶供体。
9.一种制备β半乳糖苷酶受体的方法，包括步骤：
在允许权利要求1所述β半乳糖苷酶受体进行表达的条件下，培养权利要求5所述的原核宿主细胞；和
纯化并收集所述β半乳糖苷酶受体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中：
所述培养在28至40℃，优选30至40℃、更优选35至38℃，最优选37℃的温度中进行；
所述培养在需氧条件下进行，优选在溶氧大于40％的条件下进行；
所述培养在pH值6.8至7.2的条件下进行。
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