CN116640225A - 一种鲎凝血因子组合、反应体系、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种鲎凝血因子组合、反应体系、试剂盒及其应用，鲎凝血因子组合包括鲎凝血因子FGα＇，鲎凝血因子FGβ＇和鲎凝血因子PCE＇；鲎凝血因子FGα＇是对鲎凝血因子FGα删除如SEQ ID NO:1所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示锚定肽后，与分子伴侣素MA4386共表达获取到的；鲎凝血因子FGβ＇是对鲎凝血因子FGβ删除如SEQ ID NO:3所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:4所示锚定肽后，与分子伴侣素CpkA共表达获取到的；鲎凝血因子PCE＇是基于对鲎凝血因子PCE删除如SEQ ID NO:5所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示的锚定肽后，与分子伴侣素MA4386共表达获取到的。本公开通过分子生物学技术有效增加鲎凝血因子的原核可溶性表达，减少海洋中鲎的使用量。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术领域，且更具体地，涉及一种鲎凝血因子组合、反应体系、试剂盒及其应用。
背景技术
(1,3)-β-D-葡聚糖是真菌细胞壁的主要成分，具有极高的热稳定性，在高温高压条件下也无法使其灭活，(1,3)-β-D-葡聚糖可以导致实体器官移植、高强度免疫抑制等群体发生真菌性疾病死亡，因此对(1,3)-β-D-葡聚糖的检测具有重要意义。20世纪六十年代，人们发现一种古老的海洋生物，被称为“海洋活化石”的鲎，它的血液与(1,3)-β-D-葡聚糖接触后会发生特异性的凝集反应，这使得从鲎血细胞提取液获得的鲎凝血因子可以用于检测(1,3)-β-D-葡聚糖，然而，使用鲎血细胞提取液的方式获取鲎凝血因子使得海洋中鲎的数量逐渐减少。
发明内容
本公开提供了一种鲎凝血因子组合、反应体系、试剂盒及其应用，以解决现有技术中鲎试剂的获取方法会使得海洋中鲎的数量逐渐减少的技术问题。
根据本公开的第一方面，提供了一种鲎凝血因子组合，其特征在于，所述鲎凝血因子组合包括鲎凝血因子FGα＇，鲎凝血因子FGβ＇和鲎凝血因子PCE＇；
所述鲎凝血因子FGα＇是对鲎凝血因子FGα删除如SEQ ID NO:1所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示锚定肽后，与分子伴侣素MA4386共表达获取到的；
所述鲎凝血因子FGβ＇是对鲎凝血因子FGβ删除如SEQ ID NO:3所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:4所示锚定肽后，与分子伴侣素CpkA共表达获取到的；
所述鲎凝血因子PCE＇是基于对鲎凝血因子PCE删除如SEQ ID NO:5所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示的锚定肽后，与分子伴侣素MA4386共表达获取到的。
根据本公开的第二方面，提供了一种反应体系，所述反应体系包括上述鲎凝血因子组合和显色基质组成的酶混合液。
根据本公开的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的鲎凝血因子组合或上述的反应体系。
根据本公开的第四方面，提供了一种上述的鲎凝血因子组合、上述反应体系或上述的试剂盒在(1,3)-β-D-葡聚糖含量检测中的应用。
与现有技术相比，本公开提供的鲎凝血因子组合、反应体系、试剂盒及其应用，至少包括以下有益效果：
本公开的鲎凝血因子组合，包括鲎凝血因子FGα＇，鲎凝血因子FGβ＇和鲎凝血因子PCE＇。其中，鲎凝血因子FGα＇是对获取到的鲎凝血因子FGα删除如SEQ ID NO:1所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示锚定肽后，与分子伴侣素MA4386共表达获取到的。MA4386的羧基端带正电，而FGα＇带有一段带负电的锚定肽，通过静电相互作用，MA4386和FGα＇结合力增强，因此MA4386可以更有效地帮助FGα＇折叠成正确的构象，从而提高其可溶性表达。鲎凝血因子FGβ＇是对鲎凝血因子FGβ删除如SEQ ID NO:3所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:4所示锚定肽后，与分子伴侣素CpkA共表达获取到的；CpkA的羧基端带负电，而FGβ＇带有一段带正电的锚定肽，通过静电相互作用，CpkA和FGβ＇结合力增强，因此CpkA可以更有效地帮助FGβ＇折叠成正确的构象，从而提高其可溶性表达。鲎凝血因子PCE＇是基于对鲎凝血因子PCE删除如SEQ ID NO:5所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示的锚定肽后，与分子伴侣素MA4386共表达获取到的。MA4386的羧基端带正电，而PCE＇带有一段带负电的锚定肽，通过静电相互作用，MA4386和PCE＇结合力增强，因此MA4386可以更有效地帮助PCE＇折叠成正确的构象，提高其可溶性表达。在本公开提供的技术方案中，通过利用分子生物技术对鲎凝血因子进行基因编码，并利用分子伴侣素增加鲎凝血因子的可溶性表达，从而可以获取到更多的鲎凝血因子，有效减少海洋中鲎的使用数量，有利于海洋中鲎的保护，且该鲎凝血因子组合对(1,3)-β-D-葡聚糖具有更高的灵敏度，降低(1,3)-β-D-葡聚糖含量的检测下限，进而解决了现有市售的鲎试剂对(1,3)-β-D-葡聚糖的灵敏度较低的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本的技术方案，下面将对本公开的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本公开一示例性实施例提供的鲎凝血因子FGα＇和分子伴侣素MA4386共表达的流程示意图；
图2是本公开一示例性实施例提供的鲎凝血因子FGβ＇和分子伴侣素CpkA共表达的流程示意图；
图3是本公开一示例性实施例提供的鲎凝血因子PCE＇和分子伴侣素MA4386共表达的流程示意图；
图4是本公开一示例性实施例提供的鲎凝血因子FGα＇对应的SDS-PAGE蛋白质电泳图；
图5是本公开一示例性实施例提供的鲎凝血因子FGβ＇对应的SDS-PAGE蛋白质电泳图；
图6是本公开一示例性实施例提供的鲎凝血因子PCE＇对应的SDS-PAGE蛋白质电泳图；
图7是本公开一示例性实施例提供的鲎凝血因子PCE包涵体尿素复性、分子伴侣素CpkB辅助的PCE包涵体尿素复性和鲎凝血因子PCE＇包涵体尿素复性对应的SDS-PAGE蛋白质电泳图；
图8是本公开一示例性实施例提供的市售鲎试剂在(1,3)-β-D-葡聚糖检测过程中的标准曲线，以及鲎凝血因子组合在(1,3)-β-D-葡聚糖含量检测过程中的标准曲线图一；
图9是本公开一示例性实施例提供的鲎凝血因子组合的特异性检测结果；
图10是本公开一示例性实施例提供的鲎凝血因子组合在(1,3)-β-D-葡聚糖含量检测过程中的标准曲线图二。
具体实施方式
下面将结合本中的附图，对本公开中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本公开一部分实施例，而不是全部实施例。基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实施例保护的范围。
在本公开一示例性实施例中提供了鲎凝血因子组合，所述鲎凝血因子组合包括鲎凝血因子FGα＇，鲎凝血因子FGβ＇和鲎凝血因子PCE＇。
所述鲎凝血因子FGα＇是对鲎凝血因子FGα删除如SEQ ID NO:1所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示锚定肽后，与分子伴侣素MA4386共表达获取到的。
所述鲎凝血因子FGβ＇是对鲎凝血因子FGβ删除如SEQ ID NO:3所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:4所示锚定肽后，与分子伴侣素CpkA共表达获取到的；
所述鲎凝血因子PCE＇是基于对鲎凝血因子PCE删除如SEQ ID NO:5所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示的锚定肽后，与分子伴侣素MA4386共表达获取到的。
具体地，鲎凝血因子FGα的前导肽如SEQ ID NO:1所示，SEQ ID NO:1:TTGGTGTTGCTGTGTTGTGTTGTTTTGCATGTTGGTGTTGCAAGAATTTGCTGT。带负电荷的锚定肽如SEQ ID NO:2所示，SEQ ID NO:2：GGTGATGGTGATGAT。锚定肽的氨基酸序列为GDGDD。分子伴侣素MA4386带正电荷，通过静电相互作用，MA4386和FGα＇结合力增强，因此MA4386可以更有效地帮助FGα＇折叠成正确的构象，从而提高其可溶性表达。
进一步地，鲎凝血因子FGβ的前导肽如SEQ ID NO:3所示，SEQ ID NO:3:ATGGATATCAGTTTCCTGGTTTTTATCACACTGTCTATGGCTCTCTTCTCGAGCAACGTGACAGGAACGTCAGTAACATCAAGGGTACGACGT。带正电荷的锚定肽如SEQ ID NO:4所示，SEQ ID NO:4：CGTGGTCGTCGTGGTGGT。
CpkA是由548个氨基酸组成的分子伴侣素，适应低温，分子伴侣素是一大类能够识别并结合到不完整折叠或装配的多肽或蛋白质，并帮助其折叠成正确的空间结构的蛋白。分子伴侣素CpkA是从嗜热菌Thermococcus kodakarensis中提取发现的冷诱导型CpkA。CpkA的羧基端带负电，而鲎凝血因子FGβ＇相应地带有一段带正电的锚定肽，通过静电相互作用，CpkA和鲎凝血因子FGβ＇结合力增强，因此CpkA可以更有效地帮助鲎凝血因子FGβ＇折叠成正确的构象，从而提高其可溶性表达。
进一步地，鲎凝血因子PCE的前导肽如SEQ ID NO:5所示，SEQ ID NO:5:TTGGTGAATAACGTGTTTTCACTACTGTGTTTCCCACTCTTGATGTCTGTGGTTAGATGCAGTACTCTCAGCAGACAGCGTAGA。分子伴侣素MA4386带正电荷，通过静电相互作用，MA4386和PCE＇结合力增强，因此MA4386可以更有效地帮助PCE＇折叠成正确的构象，从而提高其可溶性表达。
在本公开一示例性实施例中，对鲎凝血因子FGα删除如SEQ ID NO:1所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示锚定肽后，得到鲎凝血因子FGα＇，将到鲎凝血因子FGα＇连接到第一表达载体中，得到第一重组表达载体；将分子伴侣素MA4386连接到第二表达载体中，得到第二重组表达载体；将第一重组表达载体和第二重组表达载体共转化到工程菌中，使得工程菌中共表达鲎凝血因子FGα＇和MA4386。
在一种可能的实现方式中，查询FGα基因序列，将编码天然鲎凝血因子FGα基因中负责编码前导肽的基因部分删除，并根据大肠杆菌密码子偏好性对FGα基因序列进行优化后合成重组质粒，利用质粒提取方法提取出重组质粒。以重组质粒为模板，进行PCR反应，将编码带负电荷的锚定肽添加在FGα基因序列的5＇端，得到FGα＇的重组质粒即第一重组表达载体。
具体地，如图1所示，将编码天然鲎凝血因子FGα的基因中负责编码前导肽(Leadsequence)的基因部分删除，并用一段锚定肽(Anchor-tag)取代，改造好的鲎凝血因子FGα被命名为鲎凝血因子FGα＇，得到第一重组表达载体pET 17b-FGα＇。将pET 17b-FGα＇和第二重组表达载体pACYC-MA共转化至工程菌Escherichia Coli BL21(DE3)中，鲎凝血因子FGα＇与MA4386在大肠杆菌中共表达后，MA4386的羧基端带正电，而鲎凝血因子FGα＇相应地带有一段带负电的锚定肽。
在本公开一示例性实施例中，对鲎凝血因子FGβ删除如SEQ ID NO:3所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:4所示锚定肽后，得到鲎凝血因子FGβ＇，将鲎凝血因子FGβ＇连接到第三表达载体中，得到第三重组表达载体；将分子伴侣素CpkA连接到第四表达载体中，得到第四重组表达载体；将第三重组表达载体和第四重组表达载体共转化到工程菌中，使得工程菌中共表达鲎凝血因子FGβ＇和CpkA。
在一种可能的实现方式中，查询FGβ基因序列，将编码天然鲎凝血因子FGβ基因中负责编码前导肽的基因部分删除，并根据大肠杆菌密码子偏好性对FGβ基因序列进行优化后合成重组质粒，利用质粒提取方法提取出重组质粒。以重组质粒为模板，进行PCR反应，将编码带负电荷的锚定肽添加在FGβ基因序列的5＇端，得到FGβ＇的重组质粒即第三重组表达载体。
具体地，如图2所示，将编码天然鲎凝血因子FGβ的基因中负责编码前导肽(Leadsequence)的基因部分删除，并用一段锚定肽(Anchor-tag)取代，改造好的鲎凝血因子FGβ被命名为鲎凝血因子FGβ＇，得到第三重组表达载体pET 17b-FGβ＇。将pET 17b-FGβ＇和第四重组表达载体pACYC-CpkA共转化至工程菌Escherichia Coli BL21(DE3)中，鲎凝血因子FGβ＇与CpkA在大肠杆菌中共表达后，CpkA的羧基端带负电，而鲎凝血因子FGβ＇相应地带有一段带正电的锚定肽。
在本公开一示例性实施例中，对鲎凝血因子PCE删除如SEQ ID NO:5所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示锚定肽后，得到鲎凝血因子PCE＇，将到鲎凝血因子PCE＇连接到第五表达载体中，得到第五重组表达载体；将分子伴侣素MA4386连接到第六表达载体中，得到第六重组表达载体；将第五重组表达载体和第六重组表达载体共转化到工程菌中，使得工程菌中共表达鲎凝血因子PCE＇和MA4386。
在一种可能的实现方式中，查询PCE基因序列，将编码天然鲎凝血因子PCE基因中负责编码前导肽(Lead sequence)的基因部分删除，并根据大肠杆菌密码子偏好性对PCE基因序列进行优化后合成重组质粒，利用质粒提取方法提取出重组质粒。以重组质粒为模板，进行PCR反应，将编码带负电荷的锚定肽添加在PCE基因序列的5＇端，得到PCE＇的重组质粒即第五重组表达载体。
具体地，如图3所示，将编码天然鲎凝血因子PCE的基因中负责编码前导肽(Leadsequence)的基因部分删除，并用一段锚定肽(Anchor-tag)取代，改造好的鲎凝血因子PCE被命名为鲎凝血因子PCE＇，得到第五重组表达载体pET 17b-PCE＇。将pET 17b-PCE＇和第六重组表达载体pACYC-MA共转化至工程菌Escherichia Coli BL21(DE3)中，鲎凝血因子PCE＇与MA4386在大肠杆菌中共表达后，MA4386的羧基端带正电，而鲎凝血因子PCE＇相应地带有一段带负电的锚定肽。通过静电相互作用，MA4386和鲎凝血因子PCE＇结合力增强，因此MA4386可以更有效地帮助鲎凝血因子PCE＇折叠成正确的构象，从而提高其可溶性表达。
在本公开一示例性实施例中，所述鲎凝血因子PCE＇是对鲎凝血因子PCE删除如SEQID NO:5所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示的锚定肽后，与分子伴侣素MA4386共表达，且利用分子伴侣素CpkB辅助体外复性获取到的。具体地，pET 17b-PCE＇和第六重组表达载体pACYC-MA共转化至工程菌Escherichia Coli BL21(DE3)中，鲎凝血因子PCE＇与MA4386在大肠杆菌中共表达后，取鲎凝血因子PCE＇包涵体，将鲎凝血因子PCE＇包涵体用尿素溶解，并加入分子伴侣素CpkB，在Tris-HCl的缓冲溶液中搅拌复性，鲎凝血因子PCE＇包涵体可溶性蛋白得率较高。
在本公开一示例性实施例中，第一重组表达载体为pET 17b-FGα＇，pET 17b-FGα＇的基因序列如SEQ ID NO:6所示，SEQ ID NO:6：
其中，带框且加下划线的基因序列为添加的锚定肽；斜体加粗为核糖体结合位点(ribosomebinding site,RBS)；斜体加双下滑线的为限制性内切酶HindIII酶切位点；加粗加框的为限制性内切酶BamHI酶切位点；带单下划线的基因序列为删除信号肽，添加锚定肽后的鲎凝血因子FGα＇编码基因序列。
在本公开一示例性实施例中，第三重组表达载体为pET17b-FGβ＇，所述pET17b-FGβ＇的基因序列如SEQ ID NO:7所示，SEQ ID NO:7：
其中，带框的基因序列为添加的锚定肽；斜体加粗为核糖体结合位点(ribosomebinding site,RBS)；斜体加双下滑线的为限制性内切酶HindIII酶切位点；加粗加框的为限制性内切酶BamHI酶切位点；带单下划线的基因序列为删除信号肽后的鲎凝血因子FGβ编码基因序列。需要说明的是，锚定肽与鲎凝血因子FGβ之间的基因序列为大肠杆菌表达质粒的基因片段。
在本公开一示例性实施例中，第五重组表达载体为pET17b-PCE＇，所述pET17b-PCE＇的基因序列如SEQ ID NO:8所示，SEQ ID NO:8：
其中，带框且加下划线的的基因序列为添加的锚定肽；斜体加粗为核糖体结合位点(ribosomebinding site,RBS)；斜体加双下滑线的为限制性内切酶HindIII酶切位点；加粗加框的为限制性内切酶BamHI酶切位点；带单下划线的基因序列：为删除信号肽，添加锚定肽后的鲎凝血因子PCE＇编码基因序列。
在本公开一示例性实施例中，提供了一种反应体系，所述反应体系包括上述鲎凝血因子组合和显色基质组成的酶混合液。其中，显色基质可以为Boc-Leu-Gly-Arg-pNA(鲎三肽)。鲎凝血因子FGα＇，鲎凝血因子FGβ＇和鲎凝血因子PCE＇对(1,3)-β-D-葡聚糖具有更高的灵敏度，有利于对(1,3)-β-D-葡聚糖的检测。
进一步地，所述鲎凝血因子FGα＇、鲎凝血因子FGβ＇、鲎凝血因子PCE＇的摩尔比为6:3:1～1:8:2。具体地，鲎凝血因子FGα＇：鲎凝血因子FGβ＇：鲎凝血因子PCE＇可以为6:3:1，4:3:1，3:3:1，1:8:2等。
进一步地，所述鲎凝血因子FGα＇、鲎凝血因子FGβ＇、鲎凝血因子PCE＇的摩尔比为4:2:1～1:8:2。具体地，鲎凝血因子FGα＇：鲎凝血因子FGβ＇：鲎凝血因子PCE＇可以为4:2:1，2:4:1，1:4:1，1:8:2等。
进一步地，所述鲎凝血因子FGα＇的摩尔浓度为20nM～100nM。具体地，鲎凝血因子FGα＇的摩尔浓度可以为20nM～25nM、25nM～30nM、30nM～40nM、40nM～50nM、50nM～60nM、60nM～70nM、70nM～80nM、80nM～90nM、90nM～100nM。
进一步地，所述鲎凝血因子FGβ＇的摩尔浓度为200nM～160nM。具体地，鲎凝血因子FGβ＇的摩尔浓度可以为200nM～195nM、195nM～190nM、190nM～185nM、185nM～180nM、180nM～175nM、175nM～170nM、170nM～165nM、165nM～160nM。
进一步地，所述鲎凝血因子PCE＇的摩尔浓度为100nM～40nM。具体地，鲎凝血因子PCE＇的摩尔浓度可以为100nM～95nM、95nM～90nM、90nM～85nM、85nM～80nM、80nM～75nM、75nM～70nM、70nM～65nM、65nM～60nM、60nM～55nM、55nM～50nM、50nM～45nM、45nM～40nM。
在一种可能的实现方式中，将20nM的重组鲎凝血因子FGα＇、160nM的重组鲎凝血因子FGβ＇和40nM的重组鲎凝血因子PCE＇以摩尔比为1:8:2混合，加入显色基质Boc-Leu-Gly-Arg-pNA，组成酶混合物。在获取到酶混合物后，配置(1,3)-β-D-葡聚糖标准溶液，向微孔版中分别加入(1,3)-β-D-葡聚糖标准溶液和酶混合物，放入酶标仪进行检测，结束后，得到吸光度变化的平均速率。根据吸光度变化的平均速率绘制标准曲线，计算斜率。
具体地，配制浓度为100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ml、3.08pg/ml、0.5pg/ml的(1,3)-β-D-葡聚糖标准溶液。向96孔板中分别加入50μl标准溶液和100μl酶混合物后，放入酶标仪，将仪器设定为动力学检测，孔板震动5秒，恒温37℃，405nm波长，每30秒检测一次，检测40分钟，反应结束后得出吸光度变化的平均速率，根据该吸光度变化的平均速率绘制标准曲线，计算斜率。根据结果可知鲎凝血因子FGα＇，鲎凝血因子FGβ＇和鲎凝血因子PCE＇在(1,3)-β-D-葡聚糖为50pg、25pg、12.5pg、6.25pg、3.13pg、0.5pg浓度区间有较好的线性，曲线R2为0.997，也就是说本实施例中鲎凝血因子组合在进行(1,3)-β-D-葡聚糖检测时，浓度下限降至0.5pg，具有较高的灵敏度。
在本公开一示例性实施例中，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的鲎凝血因子组合或上述的反应体系。
具体地，在该试剂盒包括鲎凝血因子FGα＇，鲎凝血因子FGβ＇和鲎凝血因子PCE＇时，该试剂盒还包括显色基质，该鲎凝血因子FGα＇，鲎凝血因子FGβ＇、鲎凝血因子PCE＇和显色基质以冻干粉的形式存在在试剂盒内，为反应主剂。在该试剂盒包括鲎凝血因子组合和显色基质组成的酶混合液时，该鲎凝血因子FGα＇，鲎凝血因子FGβ＇、鲎凝血因子PCE＇和显色基质以冻干粉的形式存在在试剂盒内，为反应主剂。
进一步地，该试剂盒还包括主剂复溶液，该主剂复溶液可以为Tris-HCI缓存液，例如0.9M，pH7.2的Tris-HCI缓存液。该试剂盒还包括处理液A，处理液A可以为KOH溶液，例如0.4M的KOH溶液。该试剂盒还包括处理液B，处理液B可以为KCI溶液，例如2M的KCI溶液。该试剂盒还包括溶解液纯化水。该试剂盒还包括微孔板，例如96孔聚苯乙烯板。该试剂盒还包括校准品，例如(1,3)-β-D-葡聚糖冻干粉。该试剂盒还包括质控品，例如含有(1,3)-β-D-葡聚糖工作校准品的5％牛血清的冻干粉。
在本公开一示例性实施例中，提供了上述的鲎凝血因子组合、上述的反应体系、上述的试剂盒在(1,3)-β-D-葡聚糖含量检测中的应用。
其中，上述鲎凝血因子组合和上述反应体系可以用于制备试剂盒。在获取到试剂盒后，利用该试剂盒进行(1,3)-β-D-葡聚糖含量检测。
具体地，第一步，获取血清样本；第二步，制作(1,3)-β-D-葡聚糖标准曲线；第三步，配制质控溶液，如将2mL溶液解加入到质控品试剂瓶中，涡旋震荡不少于30秒。第四步，血清样本处理，将处理液A和处理液B等体积混匀得到样本处理液，向微孔板样本孔中加入血清样本(或质控品)和样本处理液，孔板震动5秒混匀，然后37℃孵育10分钟。第五步，添加反应主剂，取主剂复溶液和溶解液溶解反应主剂，混匀。向加有(1,3)-β-D-葡聚糖标准溶液和样本(或质控品)的微孔板中加入反应主剂溶液。第六步，检测，将添加反应主剂后的微孔板加入仪器，孔板震动5秒。将仪器设定为动力学检测，恒温37℃，405nm波长，每30秒检测一次，检测40分钟，反应结束后得出吸光度变化的平均速率。第七步，结果计算，反应完成后，根据标准曲线计算样本(或质控品)中(1,3)-β-D-葡聚糖含量。
具体实施例
步骤1，获取鲎凝血因子FGα＇。
步骤11，获取pET 17b-FGα＇。
步骤111，pET 17b-FGα＇的构建。
在NCBI网站中的Gene Bank数据库中查询鲎凝血因子FGα基因序列，将鲎凝血因子FGα基因中负责编码前导肽的基因部分删除，并根据大肠杆菌密码子偏好性对FGα基因序列进行优化后合成重组质粒pET 17b-FGα。
利用软件Oligo7.0对鲎凝血因子FGα的基因序列进行分析并设计引物，将一段带负电荷的锚定肽(GDGDD)添加到鲎凝血因子FGα的N端，改造好的鲎凝血因子FGα被命名为鲎凝血因子FGα＇。所设计的引物由库美公司合成，引物序列如表1所示：
表1 FGα＇的全质粒PCR引物序列
pET 17b-FGα质粒提取：使用接菌环挑取少量含有pET 17b-FGα质粒的E.coliTop10菌液，在含有Amp抗性的LB液体培养基中过夜培养，采用生工公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提，参照说明书上的具体操作步骤来提取pET 17b-FGα质粒。
全质粒PCR反应体系和反应条件：以pET 17b-FGα质粒为模板，根据表2中的全质粒PCR反应体系和反应条件进行PCR，将编码带净负电荷的锚定肽(GDGDD)的基因序列GGTGATGGTGATGAT添加到FGα基因序列的5＇端，得到pET 17b-FGα＇质粒。将得到的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳验证。
表2全质粒PCR反应体系
PCR反应条件如下：
步骤112，DpnI酶去除模板DNA
按照表3中的DpnI酶反应体系，将各组分加入EP管中混合均匀，在37℃恒温金属浴上反应15min后，在80℃恒温金属浴中加热5min使酶失活，最后使用12000rpm的高速冷冻离心机离心1min收集上清，并在-20℃条件下保存。
表3 DpnI酶反应体系
步骤113，感受态的制备和转化
将PCR产物经DpnI酶处理后转化到E.coli DH5α感受态细胞中，通过含有Amp抗性的LB固体培养基筛选出转化成功的菌株。其中E.coli DH5α感受态制备方法如下：
(1)取10μL在-80℃冻存的E.coli DH5α菌液于含有5ml LB液体培养基的试管中，在37℃、180rpm恒温培养箱中培养过夜。
(2)取培养好的菌液250μL于含有5ml LB液体培养基的试管中，在37℃、180rpm恒温培养箱中培养至OD600为0.35-0.4时停止培养。
(3)菌液每1ml分装到1.5ml EP管中并冰浴15min，用高速冷冻离心机4000rpm、4℃、10min离心收集菌体。
(4)菌体中加入200μL 0.1M CaCl2溶液吹打混匀并冰浴30min后使用高速冷冻离心机4000rpm、4℃、10min离心收集菌体。
(5)菌体中加入100μL 0.1M CaCl2溶液混匀后即为E.coli DH5α感受态细胞。
转化步骤如下：
(1)将2μL pET 17b-FGα＇质粒与新制备的E.coli DH5α感受态混匀，冰浴30min后金属浴42℃热处理90s，迅速转移到冰上3min，加入600μL预热的含有Amp抗性的LB液体培养基，在37℃、110rpm恒温培养箱中培养1h。
(2)培养好的菌液在4000rpm、4℃高速冷冻离心机中离心10min，弃上清500μL，余下菌体与培养基吹打混匀。
(3)分别取10μL和90μL菌液在含有Amp抗性的平板上均匀涂板，在37℃恒温培养箱过夜培养至有单菌落长出。
步骤114，鲎凝血因子FGα＇的PCR验证和测序验证
(1)将步骤113中筛选出的菌株在含有Amp抗性的LB液体培养基中培养过夜，过夜培养的菌液按照步骤111的pET 17b-FGα质粒提取方法提取pET 17b-FGα＇质粒。
(2)利用软件Oligo7.0设计鲎凝血因子FGα＇的PCR验证引物，由库美公司合成，引物序列如表4所示：
表4鲎凝血因子FGα＇的PCR验证引物序列
(3)按照表5中的PCR反应体系和反应条件进行鲎凝血因子FGα＇的PCR验证，将得到的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。
表5鲎凝血因子FGα＇的PCR验证反应体系
PCR反应条件如下：
(4)测序验证
将经过PCR验证后的pET 17b-FGα＇质粒送去库美公司测序，利用NCBI网站中的BLAST功能比较pET 17b-FGα＇质粒测序结果与目的基因序列，确定pET 17b-FGα＇质粒构建成功。
步骤12，获取pACYC-MA。
通过检索NCBI网站的Gene Bank数据库得到MA4386的全长序列，利用NEBcutterV2.0对pACYCDuet-1的质粒图谱和MA4386的序列进行比对，最终确定酶切位点BamH I(GGATCC)和XhoI(CTCGAG)。pACYC-MA4386质粒构建流程如下：首先分别提取pACYCDuet-1和pET22b-MA4386质粒；随后用BamH1和XhoI分别对上述两质粒做双酶切处理(双酶切体系如表6所示)，获得相同的粘性末端；将切下的MA4386片段电泳后通过凝胶回收试剂盒获得该基因的纯化片段；将切好的pACYCDuet-1去磷酸化(去磷化反应体系如表7所示)后，通过乙醇沉淀获得该质粒的纯化片段；随后用T4 DNA连接酶连接上述处理好的MA4386和pACYCDuet-1(连接酶反应体系如表8所示)；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，培养过夜后挑取阳性克隆，保存测序验证序列无误的阳性克隆为pACYC-MA4386。
表6双酶切体系
表7去磷酸化反应体系
表8连接体系
步骤13，鲎凝血因子FGα＇与分子伴侣素MA4386共表达
将测序验证正确的重组质粒pET 17b-FGα＇与质粒pACYC-MA共转化到E.coli BL21(DE3)中，利用含有Amp和Cm的双抗性LB固体培养基筛选出转化成功的菌株。
加入IPTG进行诱导表达。即将筛选出的菌株在含有Amp和Cm的双抗性2YT液体培养基中培养至OD600为0.75左右时加入终浓度为0.8mM的IPTG，在16℃、110rpm、12h的条件下诱导鲎凝血因子FGα＇表达。使用高速冷冻离心机在4℃、9000rpm、10min条件下收集诱导后菌体，并用超声波细胞粉碎机破碎菌体后分离上清和沉淀。通过12％的SDS-PAGE检测诱导前、诱导后、总破碎液、上清和沉淀中的鲎凝血因子FGα＇，并用Image J分析电泳蛋白条带灰度。
图4示出了SDS-PAGE蛋白质电泳图，其中图4中1是诱导前蛋白；2是诱导后蛋白；3是总破碎液；4是破碎液上清；5是破碎液沉淀；M是蛋白质分子量标记。
结果表明：pET 17b-FGα＇成功转化至大肠杆菌中，并在上清中有大量FGα＇表达，约占整个上清蛋白的50％以上，具有较高的可溶性。
步骤2，获取鲎凝血因子FGβ＇。
步骤21，获取pET 17b-FGβ＇。
步骤211，pET 17b-FGβ＇的构建。
在NCBI网站中的Gene Bank数据库中查询鲎凝血因子FGβ基因序列，将鲎凝血因子FGβ基因中负责编码前导肽的基因部分删除，并根据大肠杆菌密码子偏好性对FGβ基因序列进行优化后合成重组质粒pET 17b-FGβ。
利用软件Oligo7.0对鲎凝血因子FGβ的基因序列进行分析并设计引物，将一段带净正电荷的锚定肽(RGRRGG)添加到鲎凝血因子FGβ的N端，改造好的鲎凝血因子FGβ被命名为鲎凝血因子FGβ＇。所设计的引物由库美公司合成，引物序列如表9所示：
表9 FGβ＇的全质粒PCR引物序列
pET 17b-FGβ质粒提取：使用接菌环挑取少量含有pET 17b-FGβ质粒的E.coliTop10菌液，在含有Amp抗性的LB液体培养基中过夜培养，采用生工公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提，参照说明书上的具体操作步骤来提取pET 17b-FGβ质粒。
全质粒PCR反应体系和反应条件：以pET 17b-FGβ质粒为模板，根据表10中的全质粒PCR反应体系和反应条件进行PCR，将编码带净正电荷的锚定肽(RGRRGG)的基因序列CGTGGTCGTCGTGGTGGT添加到FGβ基因序列的5＇端，得到pET 17b-FGβ＇质粒。将得到的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳验证。
表10全质粒PCR反应体系
PCR反应条件如下：
步骤212，DpnI酶去除模板DNA
按照表11中的DpnI酶反应体系，将各组分加入EP管中混合均匀，在37℃恒温金属浴上反应15min后，在80℃恒温金属浴中加热5min使酶失活，最后使用12000rpm的高速冷冻离心机离心1min收集上清，并在-20℃条件下保存。
表11 DpnI酶反应体系
步骤213，感受态的制备和转化
将PCR产物经DpnI酶处理后转化到E.coli DH5α感受态细胞中，通过含有Amp抗性的LB固体培养基筛选出转化成功的菌株。其中E.coli DH5α感受态制备方法参加步骤113，转化步骤如下：
(1)将2μL pET 17b-FGβ＇质粒与新制备的E.coli DH5α感受态混匀，冰浴30min后金属浴42℃热处理90s，迅速转移到冰上3min，加入600μL预热的含有Amp抗性的LB液体培养基，在37℃、110rpm恒温培养箱中培养1h。
(2)培养好的菌液在4000rpm、4℃高速冷冻离心机中离心10min，弃上清500μL，余下菌体与培养基吹打混匀。
(3)分别取10μL和90μL菌液在含有Amp抗性的平板上均匀涂板，在37℃恒温培养箱过夜培养至有单菌落长出。
步骤214，鲎凝血因子FGβ＇的PCR验证和测序验证
(1)将步骤213中筛选出的菌株在含有Amp抗性的LB液体培养基中培养过夜，过夜培养的菌液按照步骤211的pET 17b-FGβ质粒提取方法，提取pET 17b-FGβ＇质粒。
(2)利用软件Oligo7.0设计鲎凝血因子FGβ＇的PCR验证引物，由库美公司合成，引物序列如表12所示：
表12鲎凝血因子FGβ＇的PCR验证引物序列
(3)按照表13中的PCR反应体系和反应条件进行鲎凝血因子FGβ＇的PCR验证，将得到的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。
表13鲎凝血因子FGβ＇的PCR验证反应体系
PCR反应条件如下：
(4)测序验证
将经过PCR验证后的pET 17b-FGβ＇质粒送去库美公司测序，利用NCBI网站中的BLAST功能比较pET 17b-FGβ＇质粒测序结果与目的基因序列，确定pET 17b-FGβ＇质粒构建成功。
步骤22，获取pACYC-CpkA。
以pACYCDuet-1作为分子伴侣素CpkA的载体，利用NEBcutter V2.0对CpkA碱基序列进行分析，与pACYCDuet-1质粒图谱进行比对确定酶切位点，利用Oligo 7设计引物分别在5’和3’端分别加上酶切位点Nde I(CATATG)和EcoR V(GATATC)，送由库美公司进行合成，CpkA的PCR引物如表14所示：
表14 CpkA的PCR引物序列
CpkA的PCR体系如表15所示：
表15 CpkA的PCR反应体系
PCR反应条件如下：
质粒pACYCDuet-1和CpkA的PCR产物双酶切，将双酶切电泳胶通过胶回收的方式获得所需的基因片段，具体步骤依照天根柱式胶回收试剂盒提供的说明书进行胶回收操作。为了防止载体发生自身连接和环化的情况，需要将双酶切过的载体经去磷酸化酶(rSAP)处理，去除其5＇末端的磷酸基团，其中去磷酸化反应体系如表16所示。
表16去磷酸化反应体系
将各组分混匀后，在37℃下温浴60min使其反应完全，然后将体系在65℃温浴5min，以失活去磷酸化酶rSAP。将EP管12000rpm离心2min，取上清利用乙醇沉淀法进一步纯化载体。向上一步得到的载体中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)混匀，再加入1mL 95％乙醇(冰)，混匀各组分，将EP管置于-20℃静置1h。12000rpm下离心10min，弃上清，加入500μL70％乙醇清洗两次，离心弃上清，将EP管开口置于通风处至乙醇完全挥发，加入20μL无菌水溶解核酸。把经过乙醇沉淀获得的载体和经过胶回收得到的目的片段进行电泳，利用ImageJ比较两者浓度，调节浓度比载体:目的基因≥1:10，利用T4连接酶进行连接操作。将产物转化入DH5α中，将含有Cm抗性的固体培养基在37℃下过夜培养至有单菌落长出，将提取的质粒进行双酶切验证和测序验证，获取pACYC-CpkA。
步骤23，鲎凝血因子FGβ＇与分子伴侣素CpkA共表达
将测序验证正确的重组质粒pET 17b-FGβ＇与质粒pACYC-CpkA共转化到E.coliBL21(DE3)中，利用含有Amp和Cm的双抗性LB固体培养基筛选出转化成功的菌株。
加入IPTG进行诱导表达。即将筛选出的菌株在含有Amp和Cm的双抗性2YT液体培养基中培养至OD600为0.60左右时加入终浓度为1.2mM的IPTG，在16℃、110rpm、12h的条件下诱导鲎凝血因子FGβ＇表达。使用高速冷冻离心机在4℃、9000rpm、10min条件下收集诱导后菌体，并用超声波细胞粉碎机破碎菌体后分离上清和沉淀。通过12％的SDS-PAGE检测诱导前、诱导后、总破碎液、上清和沉淀中的鲎凝血因子FGβ＇，并用Image J分析电泳蛋白条带灰度。
PD-10脱盐柱纯化
使用PD-10脱盐柱处理上清中的鲎凝血因子FGβ＇蛋白，将经过PD-10脱盐柱处理后的FGβ＇蛋白于冰盒中保存，便于后续实验。通过12％的SDS-PAGE检测脱盐前和脱盐后的FGβ＇蛋白，并用Image J分析电泳蛋白条带灰度。
图5示出了SDS-PAGE蛋白质电泳图，其中图5中1是蛋白质分子量标记；2是破碎液上清；3是总破碎液；4是破碎液沉淀；5是用PD-10脱盐柱处理后的破碎液上清；6是PD-10脱盐柱流出液；7-9分别是将破碎液上清稀释1/2、1/5、1/10。
结果表明：pET 17b-FGβ＇成功转化至大肠杆菌中，并在上清中有大量FGβ＇表达，约占整个上清蛋白的15％以上，具有较高的可溶性。
步骤3，获取鲎凝血因子PCE＇。
步骤31，获取pET 17b-PCE＇。
步骤311，pET 17b-PCE＇的构建。
在NCBI网站中的Gene Bank数据库中查询鲎凝血因子PCE基因序列，将鲎凝血因子PCE基因中负责编码前导肽的基因部分删除，并根据大肠杆菌密码子偏好性对PCE基因序列进行优化后合成重组质粒pET 17b-PCE。
利用软件Oligo7.0对鲎凝血因子PCE的基因序列进行分析并设计引物，将一段带负电荷的锚定肽(GDGDD)添加到鲎凝血因子PCE的N端，改造好的鲎凝血因子PCE被命名为鲎凝血因子PCE＇。所设计的引物由库美公司合成，引物序列如表17所示：
表17 PCE＇的全质粒PCR引物序列
pET 17b-PCE质粒提取：使用接菌环挑取少量含有pET 17b-PCE质粒的E.coliTop10菌液，在含有Amp抗性的LB液体培养基中过夜培养，采用生工公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提，参照说明书上的具体操作步骤来提取pET 17b-PCE质粒。
全质粒PCR反应体系和反应条件：以pET 17b-PCE质粒为模板，根据表18中的全质粒PCR反应体系和反应条件进行PCR，将编码带净负电荷的锚定肽(GDGDD)的基因序列GGTGATGGTGATGAT添加到PCE基因序列的5＇端，得到pET 17b-PCE＇质粒。将得到的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳验证。
表18全质粒PCR反应体系
PCR反应条件如下：
步骤312，DpnI酶去除模板DNA
按照表19中的DpnI酶反应体系，将各组分加入EP管中混合均匀，在37℃恒温金属浴上反应15min后，在80℃恒温金属浴中加热5min使酶失活，最后使用12000rpm的高速冷冻离心机离心1min收集上清，并在-20℃条件下保存。
表19 DpnI酶反应体系
步骤313，感受态的制备和转化
将PCR产物经DpnI酶处理后转化到E.coli DH5α感受态细胞中，通过含有Amp抗性的LB固体培养基筛选出转化成功的菌株。其中E.coli DH5α感受态制备方法参加步骤113，转化步骤如下：
(1)将2μL pET 17b-PCE＇质粒与新制备的E.coli DH5α感受态混匀，冰浴30min后金属浴42℃热处理90s，迅速转移到冰上3min，加入600μL预热的含有Amp抗性的LB液体培养基，在37℃、110rpm恒温培养箱中培养1h。
(2)培养好的菌液在4000rpm、4℃高速冷冻离心机中离心10min，弃上清500μL，余下菌体与培养基吹打混匀。
(3)分别取10μL和90μL菌液在含有Amp抗性的平板上均匀涂板，在37℃恒温培养箱过夜培养至有单菌落长出。
步骤314，鲎凝血因子PCE＇的PCR验证和测序验证
(1)将步骤313中筛选出的菌株在含有Amp抗性的LB液体培养基中培养过夜，过夜培养的菌液按照步骤311的pET 17b-PCE质粒提取方法，提取pET 17b-PCE＇质粒。
(2)利用软件Oligo7.0设计鲎凝血因子PCE＇的PCR验证引物，由库美公司合成，引物序列如表20所示：
表20鲎凝血因子PCE＇的PCR验证引物序列
(3)按照表21中的PCR反应体系和反应条件进行鲎凝血因子PCE＇的PCR验证，将得到的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。
表21鲎凝血因子PCE＇的PCR验证反应体系
PCR反应条件如下：
(4)测序验证
将经过PCR验证后的pET 17b-PCE＇质粒送去库美公司测序，利用NCBI网站中的BLAST功能比较pET 17b-PCE＇质粒测序结果与目的基因序列，确定pET 17b-PCE＇质粒构建成功。
步骤32，获取pACYC-MA，请参见步骤12。
步骤33，鲎凝血因子PCE＇与分子伴侣素MA4386共表达
将测序验证正确的重组质粒pET 17b-PCE＇与质粒pACYC-MA共转化到E.coli BL21(DE3)中，利用含有Amp和Cm的双抗性LB固体培养基筛选出转化成功的菌株。
加入IPTG进行诱导表达。即将筛选出的菌株在含有Amp和Cm的双抗性2YT液体培养基中培养至OD600为0.60左右时加入终浓度为1.2mM的IPTG，在16℃、110rpm、12h的条件下诱导鲎凝血因子PCE＇表达。
使用高速冷冻离心机在4℃、9000rpm、10min条件下收集诱导后菌体，并用超声波细胞粉碎机破碎菌体后分离上清和沉淀。通过12％的SDS-PAGE检测诱导前、诱导后、总破碎液、上清和沉淀中的鲎凝血因子PCE＇，并用Image J分析电泳蛋白条带灰度。
图6示出了SDS-PAGE蛋白质电泳图，其中图6中1是诱导前蛋白；2是诱导后蛋白；3是总破碎液；4是破碎液上清；5是破碎液沉淀；M是蛋白质分子量标记。
结果表明：pET 17b-PCE＇成功转化至大肠杆菌中，PCE＇主要以包涵体的形式表达。
步骤34，鲎凝血因子PCE＇体外复性。
将鲎凝血因子PCE＇包涵体用8M尿素溶解后，依次在含有6M、4M、2M、1M尿素和200mMTris-HCl(pH 8.0)的缓冲溶液中搅拌复性。使用12％SDS-PAGE检测所有复性后的蛋白样品，用Image J分析蛋白条带灰度，计算出鲎凝血因子PCE＇的包涵体可溶性蛋白得率。
图7中C图示出了PCE＇包涵体尿素复性电泳图：1-6分别是PCE＇包涵体经8M、6M、4M、2M、1M尿素和200mM Tris-HCl复性后的蛋白样品，M是蛋白质分子量标记。结果表明：PCE＇包涵体可溶性蛋白得率为81％。
需要说明的是，图7中A图示出了PCE包涵体尿素复性电泳图：1-6分别是PCE包涵体经8M、6M、4M、2M、1M尿素和200mM Tris-HCl复性后的蛋白样品，M是蛋白质分子量标记。PCE包涵体经尿素复性后可溶性蛋白得率为69％，也就是说PCE＇包涵体比PCE包涵体复性所得蛋白多，通过尿素复性后获得了高浓度、并且有活性的PCE酶液，经过适当稀释后可直接应用于葡聚糖检测反应中，无需进一步纯化。图7中B图示出了分子伴侣素CpkB辅助的PCE体外复性电泳图：1-4分别是分子伴侣素CpkB辅助的PCE包涵体经1M、2M、4M、6M尿素复性后的蛋白样品，M是蛋白质分子量标记。通过比较PCE和CpkB辅助的PCE在体外复性后的肽酶活性，发现加入分子伴侣素CpkB后的PCE经复性后活性最高，CpkB在体外复性过程中帮助PCE折叠，提高了PCE的肽酶活性。因此在一种可能的实现方式中，也可以利用CpkB辅助的PCE＇包涵体在体外复性。
步骤4，利用步骤1获取的鲎凝血因子FGα＇、步骤2获取的鲎凝血因子FGβ＇和步骤3获取的鲎凝血因子PCE＇进行(1,3)-β-D-葡聚糖检测。
步骤41，将20nM的鲎凝血因子FGα＇、160nM的鲎凝血因子FGβ＇和40nM的鲎凝血因子PCE＇以摩尔比为1:8:2混合，加入显色基质Boc-Leu-Gly-Arg-pNA至终浓度为0.6mg/ml，组成酶混合物。
步骤42，配制浓度为100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ml、3.08pg/ml、0.5pg/ml的(1,3)-β-D-葡聚糖标准溶液。
步骤43，向96孔板中分别加入50μl标准溶液和100μl酶混合物后，放入酶标仪。将仪器设定为动力学检测，孔板震动5秒，恒温37℃，405nm波长，每30秒检测一次，检测40分钟，反应结束后得出吸光度变化的平均速率。
步骤44，根据反应后吸光度变化的平均速率绘制标准曲线，计算斜率。利用该标准曲线可以计算后续检测的样品中的(1,3)-β-D-葡聚糖的含量。
步骤45，利用构建的酶反应体系分别检测浓度为25pg/ml的(1,3)-β-D-葡聚糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖，验证反应体系是否能特异性检测(1,3)-β-D-葡聚糖。
图8中A图示出了市售鲎试剂对应的标准曲线，该市售鲎试剂为真菌(1,3)-β-D葡聚糖测定试剂盒(显色法)(科赫生物技术有限公司)，按照说明书绘制标准曲线，由图8中A图可知市售鲎试剂在(1,3)-β-D-葡聚糖为100pg、50pg、25pg、12.5pg浓度区间有较好的线性(四点曲线R2为0.99)。图8中B图示出了本实施例提供的鲎凝血因子FGα＇、鲎凝血因子FGβ＇和鲎凝血因子PCE＇组成的鲎试剂对应的标准曲线，由图8中B图可知在(1,3)-β-D-葡聚糖为50pg、25pg、12.5pg、6.25pg、3.13pg、0.5pg浓度区间有较好的线性(六点曲线R2为0.9969)，也就是说本实施例中提供的鲎凝血因子FGα＇、鲎凝血因子FGβ＇和鲎凝血因子PCE＇组成的鲎试剂可将(1,3)-β-D-葡聚糖浓度下限降至0.5pg。图9示出了鲎凝血因子FGα＇、鲎凝血因子FGβ＇和鲎凝血因子PCE＇组成的鲎试剂对乳糖、麦芽糖、蔗糖没有活性，(1,3)-β-D-葡聚糖能够激活酶反应体系产生活性，因此可以特异性检测(1,3)-β-D-葡聚糖。
进一步地，在步骤41中也可以采用其他的比例获取酶混合物。例如，将20nM的鲎凝血因子FGα＇、160nM的鲎凝血因子FGβ＇和40nM的鲎凝血因子PCE＇以摩尔比为6:3:1混合，加入显色基质Boc-Leu-Gly-Arg-pNA至终浓度为0.6mg/ml，组成酶混合物。并根据步骤42、步骤43和步骤44制作对应的标准曲线，结果如图10中A图所示，该标准曲线的线性较好。或将20nM的鲎凝血因子FGα＇、160nM的鲎凝血因子FGβ＇和40nM的鲎凝血因子PCE＇以摩尔比为4:2:1混合，加入显色基质Boc-Leu-Gly-Arg-pNA至终浓度为0.6mg/ml，组成酶混合物。并根据步骤42、步骤43和步骤44制作对应的标准曲线，结果如图10中B图所示。
提供所发明的方面的以上描述以使本领域的任何技术人员能够做出或者使用本公开。对这些方面的各种修改对于本领域技术人员而言是非常显而易见的，并且在此定义的一般原理可以应用于其他方面而不脱离本公开的范围。因此，本公开不意图被限制到在此示出的方面，而是按照与在此发明的原理和新颖的特征一致的最宽范围。
为了例示和描述的目的已经给出了以上描述。此外，此描述不意图将本公开的实施例限制到在此发明的形式。尽管以上已经讨论了多个示例方面和实施例，但是本领域技术人员将认识到其某些变型、修改、改变、添加和子组合。
Claims (10)
1.一种鲎凝血因子组合，其特征在于，所述鲎凝血因子组合包括鲎凝血因子FGα＇，鲎凝血因子FGβ＇和鲎凝血因子PCE＇；
所述鲎凝血因子FGα＇是对鲎凝血因子FGα删除如SEQ ID NO:1所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示锚定肽后，与分子伴侣素MA4386共表达获取到的；
所述鲎凝血因子FGβ＇是对鲎凝血因子FGβ删除如SEQ ID NO:3所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:4所示锚定肽后，与分子伴侣素CpkA共表达获取到的；
所述鲎凝血因子PCE＇是基于对鲎凝血因子PCE删除如SEQ ID NO:5所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示的锚定肽后，与分子伴侣素MA4386共表达获取到的。
2.根据权利要求1所述的鲎凝血因子组合，其特征在于，所述鲎凝血因子PCE＇是对鲎凝血因子PCE删除如SEQ ID NO:5所示的前导肽，并添加如SEQ ID NO:2所示的锚定肽后，与分子伴侣素MA4386共表达，且利用分子伴侣素CpkB辅助体外复性获取到的。
3.一种反应体系，其特征在于，所述反应体系包括权利要求1或2所述鲎凝血因子组合和显色基质组成的酶混合液。
4.根据权利要求3所述的反应体系，其特征在于，所述鲎凝血因子FGα＇、鲎凝血因子FGβ＇、鲎凝血因子PCE＇的摩尔比为6:3:1～1:8:2。
5.根据权利要求3所述的反应体系，其特征在于，所述鲎凝血因子FGα＇、鲎凝血因子FGβ＇、鲎凝血因子PCE＇的摩尔比为4:2:1～1:8:2。
6.根据权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述鲎凝血因子FGα＇的摩尔浓度为20nM～100nM。
7.根据权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述鲎凝血因子FGβ＇的摩尔浓度为200nM～160nM。
8.根据权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述鲎凝血因子PCE＇的摩尔浓度为100nM～40nM。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的鲎凝血因子组合或权利要求3至8中任一项所述的反应体系。
10.权利要求1或2所述的鲎凝血因子组合、权利要求3至8中任一项所述的反应体系、权利要求9所述的试剂盒在(1,3)-β-D-葡聚糖含量检测中的应用。
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| CN106290890A (zh) * | 2016-07-15 | 2017-01-04 | 科赫生物科技（北京）有限公司 | 一种改良的人体液显色法真菌1,3‑β‑D‑葡聚糖检测试剂盒及其应用方法 |
| CN108588084A (zh) * | 2018-04-23 | 2018-09-28 | 广东医科大学 | 一种基因工程鲎血g因子及其制备方法和应用 |
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2022
- 2022-10-08 CN CN202211223154.8A patent/CN116640225B/zh active Active
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