CN109613251B

CN109613251B - 大肠杆菌β半乳糖苷酶受体的用途

Info

Publication number: CN109613251B
Application number: CN201910039492.8A
Authority: CN
Inventors: 王贵利; 高秋峰; 龚俊; 刘希
Original assignee: Beijing Strong Biotechnologies Inc
Current assignee: Beijing Strong Biotechnologies Inc
Priority date: 2016-09-22
Filing date: 2016-09-22
Publication date: 2021-01-26
Anticipated expiration: 2036-09-22
Also published as: CN109609481A; CN109797143B; CN109609481B; CN109666619A; CN106399278B; CN109609535A; CN106399278A; CN109797143A; CN109609535B; CN109666619B; CN109613251A

Abstract

本申请涉及大肠杆菌β半乳糖苷酶受体的用途。本申请提供了一种SEQ ID NO：1所示的编码β半乳糖苷酶受体的核苷酸，以及SEQ ID NO：2所示的β半乳糖苷酶受体。根据大肠杆菌β半乳糖苷酶结构和功能，以及酶供体和酶受体的互补原理，设计了删除第13至33位氨基酸的酶受体；将酶受体的编码核苷酸与载体连接，并转化至大肠杆菌构建重组表达宿主细胞；通过发酵大量表达酶受体；通过亲和层析技术对酶受体纯化，脱盐后的酶受体纯度在90％以上。与常规酶受体相比，本申请的酶受体产量更高、互补活性更强，可应用于CEDIA生化诊断试剂的研制。

Description

大肠杆菌β半乳糖苷酶受体的用途

本申请是申请号为201610841474.8，申请日为2016年9月22日，发明名称为“一种大肠杆菌β半乳糖苷酶受体及其制备方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本申请涉及生物技术领域，更具体地涉及克隆酶供体免疫分析技术。本申请提供了一种大肠杆菌β半乳糖苷酶的酶受体，其编码核酸、表达载体、宿主细胞及制备方法。

背景技术

大肠杆菌β半乳糖苷酶(GenBank:EDU66561.1)可以通过溴化氢CNBr₂裂解或者基因重组技术得到两个肽段：缺失N端少量氨基酸的大片段，称为酶受体(Enzyme acceptor，EA)：缺失大部分C端氨基酸的小片段，称为酶供体(Enzyme donor，ED)。二者单独存在没有酶活性，同时存在时二者可以聚合，形成具有酶活性的全酶，这一现象被定义为α-互补。

大肠杆菌β半乳糖苷酶的这种特性已被应用于分子生物学和克隆酶供体免疫分析技术(Cloned Enzyme Donor Immunoassay，CEDIA)中。CEDIA技术在临床生化诊断中可以检测小分子化合物。

CEDIA是一种免疫检测技术，其结合了β半乳糖苷酶α互补原理和抗原抗体的特异性结合性质。将小分子抗原(Ag)与ED偶联，形成ED-Ag偶联物，此偶联物能与EA自发结合，形成有活性的β半乳糖苷酶。但是，如果在反应体系中加入针对该小分子抗原的抗体(Ab)，抗原抗体的特异性结合会形成ED-Ag-Ab复合物。此时，由于抗体空间位阻的影响，ED-Ag-Ab复合物不能再与EA结合形成具有活性的β半乳糖苷酶。如果样本中含有待检测的小分子抗原，此时反应体系中含有两种形式的抗原：一种是样本中的游离Ag；一种是试剂盒中的ED-Ag。这两种抗原都具有与抗体特异性结合的能力。显然，这两种形式的抗原会竞争性的结合反应体系中的Ab，样本中游离Ag越多，其结合的Ab就越多，从而导致有更多的剩余ED-Ag偶联物(未与抗体结合的部分)能与EA自发结合，形成具有活性的β半乳糖苷酶，且酶活性的高低与样本中游离抗原的含量成正比。

大肠杆菌β半乳糖苷酶EA可以应用于CEDIA技术临床生化诊断试剂的研制，是一种重要的原料酶，具有较大应用价值。

目前报道的经基因工程改造过的EA或者EA突变体有多种，例如在Langley KE和Zabin I发表的论文中(Biochemistry.1976Nov 2；15(22):4866-75)提到了一种β半乳糖苷酶，和野生型EA相比，其缺失第11至41位的氨基酸残基(被称为M15)。

再比如，缺失23至31位氨基酸的M112；缺失35至52位氨基酸的EA5；缺失30至37位氨基酸的EA14；缺失35至54位氨基酸的EA11；缺失21至53位氨基酸的EA17；缺失13至45位氨基酸的EA18；缺失26至45位氨基酸的EA20；缺失13至40位氨基酸的EA22；缺失16至35位氨基酸的EA23；缺失22至35位氨基酸的EA24(Daniel R.Henderson,Clinical Chemistry,Vol.32,No.9,1986,1637-1641)。国内还有学者报道同时缺失1至5和14至40位氨基酸的β-半乳糖苷酶EA(大肠杆菌β-半乳糖苷酶EA、ED融合蛋白的表达；中华微生物学和免疫学杂志，2003,23,No 2:113-114)。

表1.现已报道的EA突变体总结

然而，现有技术中的酶受体仍然存在检测本底较高的现象。鉴于此，本领域需要一种新型的β半乳糖苷酶，其具有更高的产量、更低的本底，并且酶受体和酶供体之间的互补活性更强。

发明内容

根据一些实施方式，提供了一种β半乳糖苷酶受体，其氨基酸序列是SEQ ID No.2。根据本申请的β半乳糖苷酶受体，和野生型相比，缺失第13至33位氨基酸残基。

本发明人根据大肠杆菌β半乳糖苷酶的生物学结构和功能，以及EA和ED的互补原理，定点删除了β半乳糖苷酶第13至33位氨基酸，得到本申请的β半乳糖苷酶受体。发明人出乎意料地发现，经过这种基因工程改造的重组β半乳糖苷酶受体，具有非常低的检测本底，同时有利于表达和互补活性的提高。

根据一些实施方式，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的β半乳糖苷酶受体。在一些实施方式中，多核苷酸是DNA；在另一些实施方式中，多核苷酸是RNA。在具体的实施方式中，多核苷酸是DNA。在具体的实施方式中，多核苷酸的核苷酸序列是SEQ ID No.1、SEQID No.1的互补序列。

根据一些实施方式，提供了一种表达载体，其表达本申请的β半乳糖苷酶受体。在一些实施方式中，本申请的表达载体包含上述多核苷酸。在一些实施方式中，本申请的表达载体包含SEQ ID No.1所示的多核苷酸。在具体的实施方式中，SEQ ID No.1所示的多核苷酸可操作地连接至表达载体中。在一些实施方式中，表达载体是原核表达载体。在一些实施方式中，表达载体选自pET41a、pET28a、pET20a及其组合。在具体的实施方式中，表达载体是pET41a。

根据一些实施方式，提供了一种宿主细胞，其包含本申请的表达载体。在一些实施方式中，本申请的宿主细胞是原核宿主细胞。在具体的实施方式中，所述原核宿主细胞是大肠杆菌。在具体的实施方式中，大肠杆菌选自Rosetta-gami2(DE3)pLysS、BL21、Rosetta及其组合。

技术人员知晓，除了采用宿主细胞来表达目标产物以外，还可以使用无细胞表达系统表达本申请的β半乳糖苷酶受体。

根据一些实施方式，提供了一种试剂，其包含本申请的β半乳糖苷酶受体。在一些实施方式中，所述试剂是克隆酶供体免疫分析试剂。在一些实施方式中，所述试剂包含一个、或两个、或三个、或以上的独立容器。在一些实施方式中，在一个容器中包含本申请的β半乳糖苷酶受体；在另一个容器中包含β半乳糖苷酶供体。在另一些实施方式中，β半乳糖苷酶供体可以是游离的；或者β半乳糖苷酶供体可以偶联有抗原，例如分子量较小的抗原、或者半抗原。在一些实施方式中，抗原选自：肽、多糖、脂质、核酸、药物。在一些实施方式中，本申请的β半乳糖苷酶受体和β半乳糖苷酶供体在不同的容器中。在一些实施方式中，β半乳糖苷酶供体可以是任何现有技术公知的或者未来的β半乳糖苷酶供体。

根据一些实施方式，提供了选自以下的任一项或其组合在制备试剂中的用途：本申请的β半乳糖苷酶受体、本申请的多核苷酸、本申请的表达载体、本申请的宿主细胞。在一些实施方式中，所述试剂是克隆酶供体免疫分析试剂。

根据一些实施方式，提供了一种β半乳糖苷酶，其包含β半乳糖苷酶供体、以及本申请的β半乳糖苷酶受体。在一些实施方式中，β半乳糖苷酶供体和本申请的β半乳糖苷酶受体相互作用，形成有活性的β半乳糖苷酶。在一些实施方式中，β半乳糖苷酶供体和本申请的β半乳糖苷酶受体非共价结合。在一些实施方式中，β半乳糖苷酶供体还可以偶联有抗原，例如分子量较小的抗原、或者半抗原。在一些实施方式中，抗原选自：肽、多糖、脂质、核酸、药物。在一些实施方式中，β半乳糖苷酶供体可以是任何现有技术公知的或者未来的β半乳糖苷酶供体。

根据一些实施方式，提供了一种制备β半乳糖苷酶受体的方法，包括步骤：

1)在允许β半乳糖苷酶受体进行表达的条件下，培养本申请的宿主细胞；和

2)纯化并收集所述β半乳糖苷酶受体。

在一些实施方式中，所述培养是通过发酵进行的。在一些实施方式中，发酵按照选自以下的方式：分批发酵、连续发酵、补料分批发酵及其组合。在一些实施方式中，所述培养在容器中进行。在具体的实施方式中，所述容器选自：摇瓶、培养皿和发酵罐。

在一些实施方式中，在28至40℃、30至40℃、35至38℃，优选37℃的温度中进行培养。

在一些实施方式中，在需氧条件下，进行培养。在具体的实施方式中，在溶氧大于40％的条件下进行。

在一些实施方式中，在pH值在6.8至7.2的条件下培养。

在一些实施方式中，所述表达是组成型表达或者诱导型表达；这取决于表达载体的类型。

在一些实施方式中，在步骤1)和步骤2)之间还包括诱导的步骤。在具体的实施方式中，向步骤1)的培养物中加入诱导物从而诱导β半乳糖苷酶受体的表达。在具体的实施方式中，诱导物是IPTG。

在一些实施方式中，所述纯化是指亲和纯化。纯化的方法取决于表达载体的类型。例如，但不限于，当表达载体中包含His标签时，采用Ni-NTA亲和层析技术。

在具体的实施方式中，提供了一种制备β半乳糖苷酶受体的方法，包括步骤：

1)按1.5×10 ⁸/L的密度，在发酵罐中将本申请的宿主细胞接种于含抗生素的初始培养基中；

2)在37℃中培养宿主细胞，直至宿主细胞的OD₆₀₀达3至5；

3)将培养的温度降低至25℃，加入第一补料，之后加入IPTG至终浓度为1mM；

4)按10ml/h/L的速度加入第二补料培养8至12小时；

5)收集培养物；

6)通过Ni-NTA亲和层析纯化并收集β半乳糖苷酶受体；

7)任选地，对β半乳糖苷酶受体进行脱盐。

在具体的实施方式中，含抗生素的初始培养基包含：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、0.5至2g/L硫酸镁、7至10g/L磷酸氢二钾、3至6g/L磷酸二氢钠、10ml/L微量元素母液、50mg/L卡那霉素、20％至25％葡萄糖。

在具体的实施方式中，第一补料包含100±20g/L胰蛋白胨、250±50g/L酵母提取物、10±2g/L乳糖。

在具体的实施方式中，第二补料包含400±50g/L甘油。

附图说明

图1：β半乳糖苷酶受体的表达。左道：蛋白分子量Marker；右道：大肠杆菌β半乳糖苷酶受体的条带。

具体实施方式

实施例1.大肠杆菌β半乳糖苷酶EA的表达载体的构建

根据NCBI网站公布的大肠杆菌β半乳糖苷酶核苷酸序列，确定野生型EA基因序列；删除第13至33位氨基酸残基而得到SEQ ID No.2所示序列；委托北京三博远志生物技术公司进行全基因合成，并且在序列两端分别加上两个酶切位点(例如Nco I、Xho I)，将合成的基因序列插在质粒上；

将上述质粒进行双酶切，电泳回收大肠杆菌β半乳糖苷酶EA基因片段；载体质粒pET41a同样进行双酶切处理，电泳纯化酶切后的质粒；

酶切后的pET41a质粒与大肠杆菌β半乳糖苷酶EA基因，在16℃条件下连接后得到表达质粒，转化至大肠杆菌DH5α，涂布Kan抗性的培养基平板进行筛选；筛选得到的阳性克隆提取表达质粒后测序确认。

实施例2.表达宿主细胞的获得

将实施例1所得的表达质粒转化入宿主细胞大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)pLysS，得到表达宿主细胞。

实施例3.制备β半乳糖苷酶EA

将实施例2所得的表达宿主细胞接种于种子培养基(称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl溶于900ml去离子水中，10M NaOH调节pH至7.0，补加去离子水定容至1L，121℃高压灭菌20min，冷却后室温保存，使用时加入卡那霉素至其终浓度为50mg/L)，37℃培养至OD₆₀₀达到3至5；

按1.5×10 ⁸/L的密度将宿主细胞接种于发酵初始培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、硫酸镁0.5至2g、磷酸氢二钾7至10g、磷酸二氢钠3至6g、10ml微量元素母液(10gFeSO₄·7H₂O、0.1g NH₄6Mo₇O₂₄、0.5g MnSO₄·5H₂O、2.25g ZnSO₄·7H₂O、0.23g Na₂B₄O₇·10H₂O、1g CuSO₄·7H₂O、2g CaCl₂溶于5M盐酸中)，加入900ml去离子水溶解后，调pH至6.8至7.2，补加去离子水定容至1L后，高压灭菌20min，冷却后使用。使用时加入卡那霉素至终浓度为50mg/L，加入灭菌的葡萄糖至终浓度为20％至25％)，调节通气量，在溶氧大于40％的条件下使其生长，并通过滴加酸或碱来调节培养基的pH值在6.8至7.2；

待初始培养基中的成分逐渐耗尽，培养基的溶氧值降至40％时，将培养温度降至25℃，同时以100ml/L的比例补加补料1(100±20g/L胰蛋白胨、250±50g/L酵母提取物、10±2g/L乳糖，121℃高温灭菌20min后室温保存)。补料1补加完成后，加入IPTG至终浓度为1mM开始诱导；

并按10ml/h/L的速度添加补料2(400±50g/L甘油，121℃高温灭菌20min后室温保存)，同时用氨水或硫酸调节培养基的pH值在6.8至7.2；25℃低温条件下诱导约10h后，发酵培养结束；

将所得的细胞以管式离心机离心收集，高压均质机预冷至温度4℃以下；

重悬细胞，以高压均质机850bar高压均质3次，使细胞破碎，释放大肠杆菌β半乳糖苷酶EA；

将细胞裂解液于4℃18000rpm离心30min，所得上清用0.22μm滤膜过滤；

将过滤后的上清加载至Ni亲和柱；除去未与柱结合或结合力较低的杂质；洗脱目的蛋白大肠杆菌β-半乳糖苷酶EA，同时收集蛋白峰；

加载至脱盐柱进行脱盐，收集蛋白峰。

测试例

测试例1.蛋白纯度和产量的测定

将实施例3所得蛋白以SDS-PAGE凝胶电泳鉴定蛋白纯度(图1)，并以BCA法测定蛋白浓度，计算出EA产量。本申请制得的EA纯度为90％。

表2.产量

测试例2.活性检测

将实施例3所得的大肠杆菌β半乳糖苷酶EA进行活性检测。

大肠杆菌β半乳糖苷酶EA能够和ED互补，形成β半乳糖苷酶。β半乳糖苷酶能够将邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)水解，生成半乳糖和黄色的邻硝基苯酚(ONP)。测定ONP的量可以确定半乳糖苷酶的酶活，从而确定EA的互补活性。

(1)EA用PB缓冲液(100mM PB、150mM NaCl、0.1％NaN3、pH 7.3)稀释至0.2mg/ml，ED以PB缓冲液稀释至1μg/ml。以西门子生化分析仪1800测定互补活性：

100μl EA溶液作为R1；

100μl ONPG底物溶液(5mg/ml ONPG、100mM PB、150mM NaCl、10mM MgCl2、0.1％NaN3，pH7.3)作为R2；

10μl酶供体溶液作为样本S，用于测定EA的互补活性。

10μl PB缓冲液作为空白对照样本，用于测定EA的本底活性；

运行EA-ED程序，确定反应速率，

(2)以M15为对照，平行进行上述操作。

(3)结果：

本申请的EA互补活性比M15高11.2％，而本底活性低21％。

表3.互补活性

EA	OD<sub>571</sub>	％
			M15	0.21874	100
本申请的EA	0.24332	111.2％

表4.本底活性

EA	OD<sub>571</sub>	％
			M15	0.00167	100
本申请的EA	0.00132	79

序列表

<110> 北京九强生物技术股份有限公司

<120> 大肠杆菌β半乳糖苷酶受体的用途

<130> 390005CG-360019

<150> 201610841474.8

<151> 2016-09-22

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3006

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

accatgatta cggattcact ggccgtcgtt ttacaagcca gctggcgtaa tagcgaagag 60

gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgctttgcc 120

tggtttccgg caccagaagc ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc 180

gatactgtcg tcgtcccctc aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc 240

aacgtgacct atcccattac ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt 300

tgttactcgc tcacatttaa tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt 360

atttttgatg gcgttaactc ggcgtttcat ctgtggtgca acgggcgctg ggtcggttac 420

ggccaggaca gtcgtttgcc gtctgaattt gacctgagcg catttttacg cgccggagaa 480

aaccgcctcg cggtgatggt gctgcgctgg agtgacggca gttatctgga agatcaggat 540

atgtggcgga tgagcggcat tttccgtgac gtctcgttgc tgcataaacc gactacacaa 600

atcagcgatt tccatgttgc cactcgcttt aatgatgatt tcagccgcgc tgtactggag 660

gctgaagttc agatgtgcgg cgagttgcgt gactacctac gggtaacagt ttctttatgg 720

cagggtgaaa cgcaggtcgc cagcggcacc gcgcctttcg gcggtgaaat tatcgatgag 780

cgtggtggtt atgccgatcg cgtcacacta cgtctgaacg tcgaaaaccc gaaactgtgg 840

agcgccgaaa tcccgaatct ctatcgtgcg gtggttgaac tgcacaccgc cgacggcacg 900

ctgattgaag cagaagcctg cgatgtcggt ttccgcgagg tgcggattga aaatggtctg 960

ctgctgctga acggcaagcc gttgctgatt cgaggcgtta accgtcacga gcatcatcct 1020

ctgcatggtc aggtcatgga tgagcagacg atggtgcagg atatcctgct gatgaagcag 1080

aacaacttta acgccgtgcg ctgttcgcat tatccgaacc atccgctgtg gtacacgctg 1140

tgcgaccgct acggcctgta tgtggtggat gaagccaata ttgaaaccca cggcatggtg 1200

ccaatgaatc gtctgaccga tgatccgcgc tggctaccgg cgatgagcga acgcgtaacg 1260

cgaatggtgc agcgcgatcg taatcacccg agtgtgatca tctggtcgct ggggaatgaa 1320

tcaggccacg gcgctaatca cgacgcgctg tatcgctgga tcaaatctgt cgatccttcc 1380

cgcccggtgc agtatgaagg cggcggagcc gacaccacgg ccaccgatat tatttgcccg 1440

atgtacgcgc gcgtggatga agaccagccc ttcccggctg tgccgaaatg gtccatcaaa 1500

aaatggcttt cgctacctgg agagacgcgc ccgctgatcc tttgcgaata cgcccacgcg 1560

atgggtaaca gtcttggcgg tttcgctaaa tactggcagg cgtttcgtca gtatccccgt 1620

ttacagggcg gcttcgtctg ggactgggtg gatcagtcgc tgattaaata tgatgaaaac 1680

ggcaacccgt ggtcggctta cggcggtgat tttggcgata cgccgaacga tcgccagttc 1740

tgtatgaacg gtctggtctt tgccgaccgc acgccgcatc cagcgctgac ggaagcaaaa 1800

caccagcagc agtttttcca gttccgttta tccgggcaaa ccatcgaagt gaccagcgaa 1860

tacctgttcc gtcatagcga taacgagctc ctgcactgga tggtggcgct ggatggtaag 1920

ccgctggcaa gcggtgaagt gcctctggat gtcgctccac aaggtaaaca gttgattgaa 1980

ctgcctgaac taccgcagcc ggagagcgcc gggcaactct ggctcacagt acgcgtagtg 2040

caaccgaacg cgaccgcatg gtcagaagcc ggacacatca gcgcctggca gcagtggcgt 2100

ctggctgaaa acctcagcgt gacactcccc gccgcgtccc acgccatccc gcatctgacc 2160

accagcgaaa tggatttttg catcgagctg ggtaataagc gttggcaatt taaccgccag 2220

tcaggctttc tttcacagat gtggattggc gataaaaaac aactgctgac gccgctgcgc 2280

gatcagttca cccgtgcacc gctggataac gacattggcg taagtgaagc gacccgcatt 2340

gaccctaacg cctgggtcga acgctggaag gcggcgggcc attaccaggc cgaagcagcg 2400

ttgttgcagt gcacggcaga tacacttgct gatgcggtgc tgattacgac cgctcacgcg 2460

tggcagcatc aggggaaaac cttatttatc agccggaaaa cctaccggat tgatggtagt 2520

ggtcaaatgg cgattaccgt tgatgttgaa gtggcgagcg atacaccgca tccggcgcgg 2580

attggcctga actgccagct ggcgcaggta gcagagcggg taaactggct cggattaggg 2640

ccgcaagaaa actatcccga ccgccttact gccgcctgtt ttgaccgctg ggatctgcca 2700

ttgtcagaca tgtatacccc gtacgtcttc ccgagcgaaa acggtctgcg ctgcgggacg 2760

cgcgaattga attatggccc acaccagtgg cgcggcgact tccagttcaa catcagccgc 2820

tacagtcaac agcaactgat ggaaaccagc catcgccatc tgctgcacgc ggaagaaggc 2880

acatggctga atatcgacgg tttccatatg gggattggtg gcgacgactc ctggagcccg 2940

tcagtatcgg cggaattcca gctgagcgcc ggtcgctacc attaccagtt ggtctggtgt 3000

caaaaa 3006

<210> 2

<211> 1002

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2

Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Ala Ser Trp Arg

1 5 10 15

Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser

20 25 30

Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val

35 40 45

Pro Glu Ser Trp Leu Glu Cys Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val

50 55 60

Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr

65 70 75 80

Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu

85 90 95

Asn Pro Thr Gly Cys Tyr Ser Leu Thr Phe Asn Val Asp Glu Ser Trp

100 105 110

Leu Gln Glu Gly Gln Thr Arg Ile Ile Phe Asp Gly Val Asn Ser Ala

115 120 125

Phe His Leu Trp Cys Asn Gly Arg Trp Val Gly Tyr Gly Gln Asp Ser

130 135 140

Arg Leu Pro Ser Glu Phe Asp Leu Ser Ala Phe Leu Arg Ala Gly Glu

145 150 155 160

Asn Arg Leu Ala Val Met Val Leu Arg Trp Ser Asp Gly Ser Tyr Leu

165 170 175

Glu Asp Gln Asp Met Trp Arg Met Ser Gly Ile Phe Arg Asp Val Ser

180 185 190

Leu Leu His Lys Pro Thr Thr Gln Ile Ser Asp Phe His Val Ala Thr

195 200 205

Arg Phe Asn Asp Asp Phe Ser Arg Ala Val Leu Glu Ala Glu Val Gln

210 215 220

Met Cys Gly Glu Leu Arg Asp Tyr Leu Arg Val Thr Val Ser Leu Trp

225 230 235 240

Gln Gly Glu Thr Gln Val Ala Ser Gly Thr Ala Pro Phe Gly Gly Glu

245 250 255

Ile Ile Asp Glu Arg Gly Gly Tyr Ala Asp Arg Val Thr Leu Arg Leu

260 265 270

Asn Val Glu Asn Pro Lys Leu Trp Ser Ala Glu Ile Pro Asn Leu Tyr

275 280 285

Arg Ala Val Val Glu Leu His Thr Ala Asp Gly Thr Leu Ile Glu Ala

290 295 300

Glu Ala Cys Asp Val Gly Phe Arg Glu Val Arg Ile Glu Asn Gly Leu

305 310 315 320

Leu Leu Leu Asn Gly Lys Pro Leu Leu Ile Arg Gly Val Asn Arg His

325 330 335

Glu His His Pro Leu His Gly Gln Val Met Asp Glu Gln Thr Met Val

340 345 350

Gln Asp Ile Leu Leu Met Lys Gln Asn Asn Phe Asn Ala Val Arg Cys

355 360 365

Ser His Tyr Pro Asn His Pro Leu Trp Tyr Thr Leu Cys Asp Arg Tyr

370 375 380

Gly Leu Tyr Val Val Asp Glu Ala Asn Ile Glu Thr His Gly Met Val

385 390 395 400

Pro Met Asn Arg Leu Thr Asp Asp Pro Arg Trp Leu Pro Ala Met Ser

405 410 415

Glu Arg Val Thr Arg Met Val Gln Arg Asp Arg Asn His Pro Ser Val

420 425 430

Ile Ile Trp Ser Leu Gly Asn Glu Ser Gly His Gly Ala Asn His Asp

435 440 445

Ala Leu Tyr Arg Trp Ile Lys Ser Val Asp Pro Ser Arg Pro Val Gln

450 455 460

Tyr Glu Gly Gly Gly Ala Asp Thr Thr Ala Thr Asp Ile Ile Cys Pro

465 470 475 480

Met Tyr Ala Arg Val Asp Glu Asp Gln Pro Phe Pro Ala Val Pro Lys

485 490 495

Trp Ser Ile Lys Lys Trp Leu Ser Leu Pro Gly Glu Thr Arg Pro Leu

500 505 510

Ile Leu Cys Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Leu Gly Gly Phe

515 520 525

Ala Lys Tyr Trp Gln Ala Phe Arg Gln Tyr Pro Arg Leu Gln Gly Gly

530 535 540

Phe Val Trp Asp Trp Val Asp Gln Ser Leu Ile Lys Tyr Asp Glu Asn

545 550 555 560

Gly Asn Pro Trp Ser Ala Tyr Gly Gly Asp Phe Gly Asp Thr Pro Asn

565 570 575

Asp Arg Gln Phe Cys Met Asn Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr Pro

580 585 590

His Pro Ala Leu Thr Glu Ala Lys His Gln Gln Gln Phe Phe Gln Phe

595 600 605

Arg Leu Ser Gly Gln Thr Ile Glu Val Thr Ser Glu Tyr Leu Phe Arg

610 615 620

His Ser Asp Asn Glu Leu Leu His Trp Met Val Ala Leu Asp Gly Lys

625 630 635 640

Pro Leu Ala Ser Gly Glu Val Pro Leu Asp Val Ala Pro Gln Gly Lys

645 650 655

Gln Leu Ile Glu Leu Pro Glu Leu Pro Gln Pro Glu Ser Ala Gly Gln

660 665 670

Leu Trp Leu Thr Val Arg Val Val Gln Pro Asn Ala Thr Ala Trp Ser

675 680 685

Glu Ala Gly His Ile Ser Ala Trp Gln Gln Trp Arg Leu Ala Glu Asn

690 695 700

Leu Ser Val Thr Leu Pro Ala Ala Ser His Ala Ile Pro His Leu Thr

705 710 715 720

Thr Ser Glu Met Asp Phe Cys Ile Glu Leu Gly Asn Lys Arg Trp Gln

725 730 735

Phe Asn Arg Gln Ser Gly Phe Leu Ser Gln Met Trp Ile Gly Asp Lys

740 745 750

Lys Gln Leu Leu Thr Pro Leu Arg Asp Gln Phe Thr Arg Ala Pro Leu

755 760 765

Asp Asn Asp Ile Gly Val Ser Glu Ala Thr Arg Ile Asp Pro Asn Ala

770 775 780

Trp Val Glu Arg Trp Lys Ala Ala Gly His Tyr Gln Ala Glu Ala Ala

785 790 795 800

Leu Leu Gln Cys Thr Ala Asp Thr Leu Ala Asp Ala Val Leu Ile Thr

805 810 815

Thr Ala His Ala Trp Gln His Gln Gly Lys Thr Leu Phe Ile Ser Arg

820 825 830

Lys Thr Tyr Arg Ile Asp Gly Ser Gly Gln Met Ala Ile Thr Val Asp

835 840 845

Val Glu Val Ala Ser Asp Thr Pro His Pro Ala Arg Ile Gly Leu Asn

850 855 860

Cys Gln Leu Ala Gln Val Ala Glu Arg Val Asn Trp Leu Gly Leu Gly

865 870 875 880

Pro Gln Glu Asn Tyr Pro Asp Arg Leu Thr Ala Ala Cys Phe Asp Arg

885 890 895

Trp Asp Leu Pro Leu Ser Asp Met Tyr Thr Pro Tyr Val Phe Pro Ser

900 905 910

Glu Asn Gly Leu Arg Cys Gly Thr Arg Glu Leu Asn Tyr Gly Pro His

915 920 925

Gln Trp Arg Gly Asp Phe Gln Phe Asn Ile Ser Arg Tyr Ser Gln Gln

930 935 940

Gln Leu Met Glu Thr Ser His Arg His Leu Leu His Ala Glu Glu Gly

945 950 955 960

Thr Trp Leu Asn Ile Asp Gly Phe His Met Gly Ile Gly Gly Asp Asp

965 970 975

Ser Trp Ser Pro Ser Val Ser Ala Glu Phe Gln Leu Ser Ala Gly Arg

980 985 990

Tyr His Tyr Gln Leu Val Trp Cys Gln Lys

995 1000

Claims

1.SEQ ID No.2所示的β半乳糖苷酶受体在制备酶供体免疫分析试剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，所述酶供体免疫分析试剂还包含β半乳糖苷酶供体。

3.根据权利要求2所述的用途，所述β半乳糖苷酶供体是游离的β半乳糖苷酶供体、或者所述β半乳糖苷酶供体偶联有抗原。

4.根据权利要求3所述的用途，所述抗原是肽。

5.根据权利要求3所述的用途，所述抗原是多糖。

6.根据权利要求3所述的用途，所述抗原是脂质。

7.根据权利要求3所述的用途，所述抗原是核酸。

8.根据权利要求3所述的用途，所述抗原是药物。