CN106309462B

CN106309462B - 一种治疗脑缺血性疾病的药物及组合物

Info

Publication number: CN106309462B
Application number: CN201510342089.4A
Authority: CN
Inventors: 樊向德; 陈鸣珍
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-06-18
Filing date: 2015-06-18
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2035-06-18
Also published as: CN106309462A

Abstract

本发明属于中药领域，具体涉及京尼平‑1‑β‑D‑龙胆双糖苷及其组合物的新用途。本发明京尼平‑1‑β‑D‑龙胆双糖苷及其组合物，对脑缺血再灌注损伤模型大鼠有明显治疗作用，可明显降低模型大鼠行为学评分、明显缩小模型大鼠脑切片梗死区域面积、降低模型大鼠血清中TNF‑α和I L‑6含量；对体外培养Bend.3细胞缺血损伤模型有明显治疗作用，可明显提高损伤细胞存活率，且细胞死亡保护率与给药浓度呈正相关；对体外培养Bend.3细胞缺氧复氧造模上清液中肿瘤坏死因子(TNF‑α)和白介素6(I L‑6)含量有明显降低作用。而且，小鼠急性毒性实验和大鼠长期毒性实验表明，未见京尼平‑1‑β‑D‑龙胆双糖苷及其组合物引起的毒副反应。

Description

一种治疗脑缺血性疾病的药物及组合物

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷及其组合物的新用途。

背景技术

脑缺血性疾病指脑组织血供障碍引起的相应区域的缺血、缺氧，引发脑组织的一系列的病理生理生化等变化，最终造成脑组织的损害及相应组织区域功能的缺失。脑缺血性疾病是神经系统的多发病、常见病，其发病率高、死亡率高、致残率高，严重影响着患者的生活质量，并给家庭和社会带来了沉重的经济及精神负担。

目前，脑缺血性疾病的治疗方法主要包括：脑缺血后血管再通治疗、脑缺血的药物治疗等。然而，由于脑缺血后血管再通治疗有一定的时间窗限制，而且管腔的再通非病因性治疗以及难以预防脑缺血再发，因此，临床中并非所有的患者都适合再通治疗。与再通治疗比较而言，药物治疗在临床应用中有一定的优势，药物治疗不仅没有时间的限制，而且可以针对缺血发生的病因及缺血后的级联反应等各个环节进行干预，从而达到治疗与预防的双重目的。治疗脑缺血性疾病药物主要包括抗血小板药、抗凝药、溶栓药、血管扩张药、脑保护药等。

中国专利文献CN104510747A公开了京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷及其组合物用于制备抗病毒、抗菌、退热、抗炎、抗氧化药物的新用途。中国专利文献CN102000102A公开了京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷在制备治疗心力衰竭疾病药物中的应用。关于京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷及其组合物在制备治疗脑缺血性疾病的药物中的用途未见报道。

因此，研究新型的治疗脑缺血性疾病的药物具有重要意义。

发明内容

为此，本发明提出京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷及其组合物的新用途。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷在制备治疗脑缺血性疾病的药物中的应用。

本发明还提供组合物A在制备治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，所述组合物A的原料药组成为：京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷1-8重量份，京尼平苷1-8重量份。

上述组合物A在制备治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，所述组合物A的原料药组成为：

京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷1重量份、京尼平苷1重量份；或

京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷3重量份、京尼平苷1重量份；或

京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷6重量份、京尼平苷1重量份；或

京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷1重量份、京尼平苷3重量份；或

京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷1重量份、京尼平苷6重量份。

本发明还提供组合物B在制备治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，所述组合物B的原料药组成为：京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷0.5-6重量份、京尼平苷0.5-4重量份、山栀苷甲酯0.2-4重量份。

上述组合物B在制备治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，所述组合物B的原料药组成为：京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷1重量份、京尼平苷1重量份、山栀苷甲酯0.5重量份。

本发明还提供栀子提取物C在制备治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，所述栀子提取物C通过以下方法制备：

取栀子1重量份，粉碎，用5-10体积份30-60％V/V的乙醇浸渍提取0.5-1小时，回流提取1-2小时，再以4-8体积份的30-60％V/V乙醇回流提取0.5-2小时，滤过，合并滤液，-9Pa、40-80℃减压回收乙醇，得提取液；将提取液于NKA-2大孔树脂上样，以1-4倍柱体积水洗脱，洗脱液于S-8大孔树脂上样，以1-4倍柱体积、浓度为20-50％V/V的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用无水乙醇处理，即得栀子提取物C；所述重量份与体积份的关系为g/mL。

本发明还提供栀子提取物D在制备治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，所述栀子提取物D通过以下方法制备：

取栀子1重量份，粉碎，用5-10体积份30-60％V/V的乙醇浸渍提取0.5-1小时，回流提取1-2小时，再以4-8体积份的30-60％V/V乙醇回流提取0.5-2小时，滤过，合并滤液，-9Pa、40-80℃减压回收乙醇，得提取液；将提取液于ADS-17大孔树脂上样，以1-4倍柱体积水洗脱，洗脱液于LSA308大孔树脂上样，以1-4倍柱体积、浓度为20-50％V/V的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用无水乙醇处理，即得栀子提取物D；或者

取栀子1重量份，粉碎，用7-11体积份的水室温浸渍提取1-5小时，再用5-10体积份室温水提取1-3小时，滤过，合并滤液，得提取液；将提取液于ADS-17大孔树脂上样，以1-4倍柱体积水洗脱，洗脱液于NKA-2大孔树脂上样，以1-4倍柱体积、浓度为20-50％V/V的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇后再于NKA-2大孔树脂上样，继续以1-4倍柱体积、浓度为30-70％V/V的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用无水乙醇处理，即得栀子提取物D；或者

取栀子1重量份，粉碎，用7-11体积份的水室温浸渍提取0.5-1小时，煎煮提取1-3小时，再用5-10体积份水煎煮0.5-2小时，滤过，合并滤液，得提取液；将提取液于LSA308大孔树脂上样，以1-3倍柱体积水洗脱，洗脱液于S-8大孔树脂上样，以1-4倍柱体积、浓度为20-50％V/V的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇后再于NKA-2大孔树脂上样，继续以1-4倍柱体积、浓度为30-70％V/V的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用丙酮处理，即得栀子提取物D；

所述重量份与体积份的关系为g/mL。

本发明上述应用，京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、所述组合物A、所述组合物B、所述栀子提取物C、所述栀子提取物D，按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、贴膏剂、栓剂、气雾剂、软膏剂或注射剂。

所述药学上可接受的辅料为：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000、PEG4000、虫蜡等。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷及其组合物，对脑缺血再灌注损伤模型大鼠有明显治疗作用，可明显降低模型大鼠行为学评分、明显缩小模型大鼠脑切片梗死区域面积、降低模型大鼠血清中TNF-α和IL-6含量；对体外培养Bend.3细胞缺血损伤模型有明显治疗作用，可明显提高损伤细胞存活率，且细胞死亡保护率与给药浓度呈正相关；对体外培养Bend.3细胞缺氧复氧造模上清液中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)含量有明显降低作用。而且，小鼠急性毒性实验和大鼠长期毒性实验表明，未见京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷及其组合物引起的毒副反应。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1是本发明实验例1中正常组的大鼠脑切片染色结果；

图2是本发明实验例1中模型组的大鼠脑切片染色结果；

图3是本发明实验例1中舒血宁组的大鼠脑切片染色结果；

图4是本发明实验例1中供试药1的大鼠脑切片染色结果；

图5是本发明实验例1中供试药2的大鼠脑切片染色结果；

图6是本发明实验例1中供试药7的大鼠脑切片染色结果；

图7是本发明实验例1中供试药8的大鼠脑切片染色结果；

图8是本发明实验例1中供试药9的大鼠脑切片染色结果。

具体实施方式

实施例1

取栀子500g，粉碎，用4L 30％(V/V)乙醇浸渍1小时，回流提取2小时，再以3L相同浓度乙醇回流提取1小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇(-9Pa，60℃)，得提取液；将提取液于AB-8大孔树脂上样，以2倍柱体积水洗脱，洗脱液于ADS-7大孔树脂上样，以2倍柱体积、浓度为30％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇后再于ADS-7大孔树脂上样，继续以3倍柱体积、浓度为50％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用无水乙醇处理，得单体成分京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷。

实施例2

取栀子1000g，粉碎，用8L 70％(V/V)乙醇浸渍1小时，回流提取2小时，再以7L相同浓度乙醇提取1小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇(-9Pa，60℃)，得提取液；将提取液于D101大孔树脂上样，以3倍柱体积水洗脱，洗脱液于S-8大孔树脂上样，以3倍柱体积、浓度为20％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇后再于S-8大孔树脂上样，继续以2倍柱体积、浓度为40％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用无水乙醇处理，得单体成分京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷。

实施例3

取栀子600g，粉碎，用5.4L的室温水浸渍提取6小时，再以4.2L水浸渍提取4小时，浸渍过程需搅拌，滤过，合并滤液，得提取液，将提取液于AB-8大孔树脂上样，以2倍柱体积水洗脱，洗脱液于S-8大孔树脂上样，以2倍柱体积、浓度为20％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇后再于S-8大孔树脂上样，继续以2倍柱体积、浓度为40％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用无水乙醇处理，得单体成分京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷。

实施例4

取栀子800g，粉碎，用7.2L的50℃水浸渍，50℃保温水浸渍提取5小时，再以5.6L50℃水提取3小时，浸渍过程需搅拌，滤过，合并滤液，得提取液，将提取液于AB-8大孔树脂上样，以2倍柱体积水洗脱，洗脱液于AB-8大孔树脂上样，以2倍柱体积、浓度为30％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇后再于NKA-2大孔树脂上样，继续以3倍柱体积、浓度为50％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用丙酮处理，得单体成分京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷。

实施例5

取栀子1000g，粉碎，用9L水室温浸渍0.5小时，煎煮(100℃)提取1.5小时，再以7L水煎煮提取1小时，滤过，滤液合并，得提取液，将提取液于LSA308大孔树脂上样，以2倍柱体积水洗脱，洗脱液于ADS-7大孔树脂上样，以2倍柱体积、浓度为30％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇后再于ADS-7大孔树脂上样，继续以3倍柱体积、浓度为50％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用丙酮处理，得单体成分京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷。

实施例6

取栀子500g，粉碎，用3.5L的50％(V/V)乙醇浸渍1小时，回流提取2小时，再以3L相同浓度乙醇回流提取1小时，滤过，滤液合并，减压回收乙醇(-9Pa，60℃)，得提取液，将提取液于AB-8大孔树脂上样，以3倍柱体积水洗脱，洗脱液于S-8大孔树脂上样，以2倍柱体积、浓度为30％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇后再于LSA308大孔树脂上样，继续以3倍柱体积、浓度为60％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用甲醇处理，得单体成分京尼平苷。

实施例7

取栀子800g，粉碎，用8.8L的50％(V/V)乙醇浸渍1小时，回流提取2小时，再以4.8L相同浓度乙醇回流提取1小时，滤过，滤液合并，减压回收乙醇(-9Pa，60℃)，得提取液，将提取液于ADS-17大孔树脂上样，以2倍柱体积水洗脱，洗脱液于NKA-2大孔树脂上样，以2倍柱体积、浓度为30％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇后再于NKA-2大孔树脂上样，继续以3倍柱体积、浓度为50％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用乙酸乙酯处理，得单体成分山栀苷甲酯。

实施例8

取栀子600g，粉碎，用5.4L的50％(V/V)乙醇浸渍1小时，回流提取2小时，再以3.6L相同浓度乙醇回流提取1小时，滤过，滤液合并，减压回收乙醇(-9Pa，60℃)，得提取液，将提取液于NKA-2大孔树脂上样，以2倍柱体积水洗脱，洗脱液于S-8大孔树脂上样，以2倍柱体积、浓度为30％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用无水乙醇处理，得含有京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、京尼平苷两种成分为主的药效部位。

实施例9

取栀子1000g，粉碎，用10L的50％(V/V)乙醇浸渍1小时，回流提取2小时，再以6L相同浓度乙醇回流提取1小时，滤过，滤液合并，减压回收乙醇(-9Pa，60℃)，得提取液，将提取液于ADS-17大孔树脂上样，以2倍柱体积水洗脱，洗脱液于LSA308大孔树脂上样，以2倍柱体积、浓度为30％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用无水乙醇处理，得含有京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的药效部位。

实施例10

取栀子600g，粉碎，用4.2L的室温水浸渍提取6小时，再以4.2L室温水浸渍提取4小时，浸渍过程需搅拌，滤过，滤液合并，得提取液，将提取液于ADS-17大孔树脂上样，以3倍柱体积水洗脱，洗脱液于NKA-2大孔树脂上样，以2倍柱体积、浓度为20％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇后再于NKA-2大孔树脂上样，继续以3倍柱体积、浓度为40％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用无水乙醇处理，得含有京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的药效部位。

实施例11

取栀子800g，粉碎，用8.8L水室温浸渍0.5小时，煎煮(100℃)提取1.5小时，再以5.6L水煎煮提取1小时，滤过，滤液合并，得提取液，将提取液于LSA308大孔树脂上样，以2倍柱体积水洗脱，洗脱液于S-8大孔树脂上样，以3倍柱体积、浓度为20％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇后再于NKA-2大孔树脂上样，继续以3倍柱体积、浓度为40％(V/V)的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，继续减压浓缩，浓缩液用丙酮处理，得含有京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的药效部位。

实施例12

取京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷50g(购于成都曼斯特生物科技有限公司)，粉碎，过120目筛，与干燥的淀粉约250g混合均匀，过120目筛，充分混匀，分装填入空胶囊中，共制成1000粒。所述胶囊的用药方式为口服。

实施例13

取京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷25g(采用实施例1方法制得的单体成分)，乳糖120g，淀粉95g，用5％乙基纤维素乙醇液制成适宜湿颗粒，过80目筛，60℃通风干燥，用20目筛整粒，加入滑石粉约6g，硬脂酸镁约1g，混合均匀，压片，制成1000片。所述片剂的用药方式为口服。

实施例14

取京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷50g(采用实施例3方法制得的单体成分)，加入糊精950g，用24目筛湿法制粒，70℃通风干燥，制成1000g颗粒剂。所述颗粒剂的用药方式为温开水冲服。

实施例15

取京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷50g与京尼平苷50g(两种单体均购于成都曼斯特生物科技有限公司)，混合并粉碎，过120目筛，与干燥的淀粉约200g混合均匀，过120目筛，充分混匀，分装填入空胶囊中，共制成1000粒。所述胶囊的用药方式为口服。

实施例16

分别取京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷48g、京尼平苷48g以及山栀苷甲酯24g(三种单体均购于成都曼斯特生物科技有限公司)，粉碎，过120目筛，与干燥的淀粉约180g混合均匀，过120目筛，充分混匀，分装填入空胶囊中，共制成1000粒。所述胶囊的用药方式为口服。

实施例17

取京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷与京尼平苷组合(两种单体均购于成都曼斯特生物科技有限公司，重量比为1:3)5g，甘露醇0.6g，在无菌环境下加无菌注射用水约900mL，搅拌使充分溶解，加无菌注射用水至1000mL，加0.2g活性炭，搅拌约15分钟，用经灭菌的G6垂熔漏斗过滤，分装于安瓿中，冷冻干燥后无菌熔封，即得冻干粉针剂。所述冻干粉针剂的用药方式为①用无菌注射用水溶解后肌肉注射；②与0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液混合后按常规静脉滴注。

实施例18

取京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷8g(购于成都曼斯特生物科技有限公司)，甘露醇1g，在无菌环境下加无菌注射用水约900mL，搅拌使充分溶解，加无菌注射用水至1000mL，用经灭菌的G6垂熔漏斗过滤，分装于安瓿中，冷冻干燥后无菌熔封，即得冻干粉针剂。所述冻干粉针剂的用药方式为①用无菌注射用水溶解后肌肉注射；②与0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液混合后按常规静脉滴注。

实施例19

取京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷20g(采用实施例4方法制得的单体成分)，乳糖155g，糖粉65g，混合，用15％淀粉浆适量，湿法制粒(14目筛)，60℃通风干燥，与约0.6g硬脂酸镁混合，压片制成1000片，即得舌下片剂。所述舌下片剂的用药方式为舌下含服。

实施例20

取95g半合脂肪酸酯，在水浴上加热熔化，加入8g京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷(购于成都曼斯特生物科技有限公司)，搅拌均匀，注入涂有润滑剂的栓模中，室温冷却后启模，制成100粒肛门栓剂。所述肛门栓剂的用药方式为按常规肛门给药。

实施例21

取京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、京尼平苷、山栀苷甲酯三种成分组合(三种单体分别采用实施例1、6和7方法制得，重量比为0.5:2:0.2)8g，注射用氯化钠7g，加入注射用水约800mL，搅拌使充分溶解，加注射用水至1000mL，加0.2g活性炭，搅拌约15分钟，过滤，灌入中性安瓿，100℃加热灭菌30分钟，即得水针剂。所述水针剂的用药方式为①肌肉注射；②与0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液混合后按常规静脉滴注。

实施例22

取京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷，京尼平苷，山栀苷甲酯三种成分组合(三种单体均购于成都曼斯特生物科技有限公司，重量比为1:1:0.5)12g，甘露醇1.2g，在无菌环境下加无菌注射用水约900mL，搅拌使充分溶解，加无菌注射用水至1000mL，加0.2g活性炭，搅拌约15分钟，用经灭菌的G6垂熔漏斗过滤，分装于安瓿中，冷冻干燥后无菌熔封，即得冻干粉针剂。所述冻干粉针剂的用药方式为①用无菌注射用水溶解后肌肉注射；②与0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液混合后按常规静脉滴注。

实施例23

取本说明书实施例8所提取的含有京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷和京尼平苷两种成分为主的药效部位200g，与约100g淀粉混合均匀，70℃通风干燥，粉碎，过80目筛，装填至空胶囊，制成1000粒。所述胶囊的用药方式为口服。

实施例24

取本说明书实施例9所提取的含有京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的药效部位250g，与约50g淀粉混合均匀，70℃通风干燥，粉碎，过80目筛，装填至空胶囊，制成1000粒。所述胶囊的用药方式为口服。

实施例25

取本说明书实施例9所提取的含有京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的药效部位45g，乳糖118g，淀粉90g，用15％乙基纤维素乙醇液制成适宜颗粒，过80目筛，60℃通风干燥，用20目筛整粒，加入滑石粉约6g，硬脂酸镁约0.8g，混合均匀，压片，制成1000片。所述片剂的用药方式为口服。

实施例26

取本说明书实施例9所提取的含有京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的药效部位18g，甘露醇1.4g，在无菌环境下加无菌注射用水约900mL，搅拌使充分溶解，加无菌注射用水至1000mL，加0.3g活性炭，搅拌约15分钟，用经灭菌的G6垂熔漏斗过滤，分装于安瓿中，冷冻干燥后无菌熔封，即得冻干粉针剂。所述冻干粉针剂的用药方式为①用无菌注射用水溶解后肌肉注射；②与0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液混合后按常规静脉滴注。

实验例

下述各实验例证明本发明所述的技术效果。

下述实验例中所涉及的供试药物1-9分别按照如下配方进行实验：

供试药1：京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷；

供试药2：京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷与京尼平苷以重量比1:1混合；

供试药3：京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷与京尼平苷以重量比3:1混合；

供试药4：京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷与京尼平苷以重量比6:1混合；

供试药5：京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷与京尼平苷以重量比1:3混合；

供试药6：京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷与京尼平苷以重量比1:6混合；

供试药7：京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、京尼平苷以及山栀苷甲酯以重量比1:1:0.5混合；

供试药8：实施例8中提取得到的含有京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷和京尼平苷的栀子提取物；

供试药9：实施例9中提取得到的含有京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷和京尼平苷和山栀苷甲酯的栀子提取物。

实验例1对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的治疗作用

SD大鼠，雄性，饲养在室温环境中，自由摄取饲料及水。禁食12小时后，采用经典线栓法，制备大鼠脑缺血后再灌注损伤模型。实验随机分为8组：正常组、模型组、舒血宁组、供试药物1、2、7、8、9组，每组大鼠9只。正常组和模型组腹腔注射等量生理盐水。各治疗组分别于术后1h，4h腹腔注射药物(1mL/100g)各一次，再灌注20h后，进行动物行为学评分；TTC染色法测量大鼠脑梗面积；并用酶联免疫标记法检测血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)的含量，结果见表1、表2和表3。

1.对大鼠行为学评分的影响

表1供试药对模型大鼠行为学评分的影响

与正常组比较##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01

2.对大鼠脑组织形态的影响

正常组、模型组、舒血宁组、供试药1、供试药2、供试药7、供试药8和供试药9的大鼠脑切片染色结果分别见图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8。

3.对大鼠脑梗死面积率的影响

表2对模型大鼠脑梗死面积率的影响

与正常组比较##P<0.01，与模型组比较**P<0.01。

4.对血清中TNF-α、IL-6含量的影响

表3大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量(n＝9)

与正常组比较，##P<0.01，与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

结果表明，给供试药物1、2、7、8、9组动物行为学评分均明显降低，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05)；各给药组大鼠脑切片梗死区域面积均明显缩小，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01)；大鼠脑缺血再灌注24h后，模型组动物血清中TNF-α和IL-6含量均明显升高，与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)，各给药组动物血清中TNF-α和IL-6含量明显降低，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01、P<0.05)。

实验例2对体外培养小鼠脑微血管内皮细胞(Bend.3细胞)毒性实验

将起始浓度为5mg/mL的供试药物1、2、7、8、9以DMEM培养液进行2倍倍比稀释，并分别作用于正常生长至80％融合的Bend.3细胞中。24h后，用CCK-8法测试各孔细胞存活率，结果见表4。

表4对体外培养Bend3细胞毒性作用(n＝3)

结果表明，在3.9μg/mL-5mg/mL的浓度范围内，供试药1、2、7、8、9对体外培养的Bend.3细胞无毒性作用。

实验例3对体外培养Bend.3细胞缺血损伤模型的治疗作用

采用Na₂S₂O₄以2.0mmol/L浓度作为刺激浓度，将体外培养Bend.3细胞缺氧1h复氧23h，制备小鼠脑微血管内皮细胞缺氧模型，将起始浓度为500μg/mL的供试药物1、2、7、8、9分别进行倍比稀释后，分别作用于损伤后的细胞，培养至24h，采用CCK-8法，测定各孔细胞死亡保护率，结果见表5。

表5对细胞死亡保护率的影响(n＝3)

结果表明，供试药1、2、7、8、9均显示出良好的提高损伤细胞存活率的作用，且细胞死亡保护率与给药浓度呈正相关。

实验例4对体外培养Bend.3细胞缺血模型上清液中炎症因子的影响

采用小鼠脑微血管内皮细胞缺氧缺糖1h再复氧23h模型，将起始浓度为500μg/mL的供试药物1、2、7、8、9分别作用于复氧后的细胞，于4h，8h，12h，24h四个时间点提取细胞上清液，分析细胞存活率，检测肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)的含量，结果分别见表6-15。

表6供试药1对IL-6(pg/mL)含量的影响(n＝3)

与正常组比较#P<0.05；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

表7供试药1对TNF-α(pg/mL)含量的影响(n＝3)

与正常组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

表8供试药2对IL-6(pg/mL)含量的影响(n＝3)

与正常组比较#P<0.05；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

表9供试药2对TNF-α(pg/mL)含量的影响(n＝3)

与正常组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

表10供试药7对IL-6(pg/mL)含量的影响(n＝3)

与正常组比较#P<0.05；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

表11供试药7对TNF-α(pg/mL)含量的影响(n＝3)

与正常组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

表12供试药8对IL-6(pg/mL)含量的影响(n＝3)

与正常组比较#P<0.05；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

表13供试药8对TNF-α(pg/mL)含量的影响(n＝3)

与正常组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

表14供试药9对IL-6(pg/mL)含量的影响(n＝3)

与正常组比较#P<0.05；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

表15供试药9对TNF-α(pg/mL)含量的影响(n＝3)

与正常组比较^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

结果表明，体外培养Bend.3细胞经Na₂S₂O₄缺氧复氧造模后，上清液中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)含量明显增加，与正常细胞对照组比较有显著性差异(P<0.01)；给供试物1、2、7、8、9后上清液中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)含量明显降低，与模型细胞对照组比较有显著性差异(P<0.01、P<0.05)。

实验例5小鼠急性毒性实验

药物浓度设计：每个受试药物用蒸馏水配制成最大可注射浓度，分别为：

供试物1：250mg/mL；

供试物2、3、4、5、6：200mg/mL；

供试物7：150mg/mL；

供试物8、9：130mg/mL；

取小鼠160只，雌雄各半，饲养在20-22℃的室温环境中，5只一笼，自由摄取饲料及水。禁食12小时后按体重随机分为10组，正常对照组及9个供试药给药组，每组20只，雌性各半。各给药组按0.2mL/10g体重腹腔注射给予最大浓度的各药液，共2次，间隔4小时，对照组给以等体积的生理盐水。给药后观察动物的不良反应和死亡情况，连续7天。计算总给药量和临床倍数。

最大给药量(g/kg)＝最大给药浓度×最大给体积/10g×100×给药次数

小鼠急性毒性实验结果见表16。

表16小鼠急性毒性实验

结果表明，各组动物给药后，出现活动减少，对刺激反应迟缓，症状通常在给药后5-15分钟出现，在给药后5小时之内恢复；体重增长正常；9个供试药均无明显毒性。

实验例6大鼠长期毒性实验

1实验材料

1.1受试药物

以供试药1、2、7、8、9为供试药物。

1.2实验动物

健康Wistar大鼠，SPF/VAF级，雌雄各半，体重130±10g。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.3试剂盒

肌酐(CRE)，批号：20110808；

谷丙转氨酶(ALT)，批号：20110829；

谷丙转氨酶(AST)，批号：20110824；

钾(K)，批号：20110330；

钠(Na)，批号：20110729；北京北化康泰临床试剂有限公司产品。

碱性磷酸酶(AKP)，批号：110461；

总蛋白(TP)，批号：110391；

白蛋白(ALB)，批号：110461；

总胆固醇(CHOL)，批号：111201；葡萄糖(GLU)，批号：110551；

总胆红素(TBIL)，批号：110671；

尿素氮(UREA)，批号：110801；

γ-谷氨酰基转移酶(GGT)，批号：110591；

甘油三酯(TG)，批号：114731；

肌酸激酶(CK)，批号：110741；

氯(Cl)，批号：110551，北京中生北控生物技术股份公司产品。

凝血酶原时间(PT)测定试剂盒，批号：STG20102-48；

活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒，批号：ST20201-53，北京世帝科学仪器公司产品。

1.4检验仪器

全自动五分类血液分析仪，型号：Sysmex XT-2000iv；

血小板聚集凝血因子分析仪，型号：LG-PABER-1；

体重电子天平，Precisa XS 4250C，Max:420g d＝0.01g，瑞士precisa公司产品；

半自动生化分析仪RT9000型，深圳雷杜生命科学股份有限公司产品；

图仪ECG-6851K型，日本NIHON KOHDEN CORPORATION公司产品；

尿检仪CLINITEK50型，德国Bayer公司产品。

2实验方法

2.1实验周期

临床最长疗程7天，长期毒性取其3倍以上，故定为连续给药1个月，停药后恢复期2周。

2.2剂量设计

2.2.1供试药1、供试药2：20g/kg/d、10g/kg/d、5g/kg/d；

2.2.2供试药7：15g/kg/d、7.5g/kg/d、3.25g/kg/d；

2.2.3供试药8、供试药9：25g/kg/d、12.5g/kg/d、6.25g/kg/d；

2.3药液配制

实验前用蒸馏水配制成含2.0g/mL供试药1、2.0g/mL供试药2、1.5g/mL供试药7、2.5g/mL供试药8、2.5g/mL供试药9的药液，按1.0mL/100g体重腹腔注射给药做为大剂量组，中、小剂量组做2倍倍比稀释，各剂量组用等容不等浓灌胃给药，每日1次，正常对照组给予等容积的蒸馏水。

2.4实验方法

取大鼠120只，雌雄各半，室温环境下分笼饲养，自由取食及摄水，适应性饲养3天后按体重随机分为16组，分别为正常对照组、各药物三个剂量组，每组20只，雌雄各半。给药组每日腹腔注射给药1次，连续1个月，对照组在同等条件下给予蒸馏水。给药1个月后解剖动物，每组10只(雌性5只，雄性5只)，其余动物停药观察，2周后解剖。

2.5观察指标

2.5.1一般情况

给药期间观察动物的精神、活动、进食量、毛发、大小便等有无异常情况。

2.5.2每周称体重，根据体重情况调整给药量；记录进食量。

2.5.3血常规

分别在给药后1个月、停药后2周测定红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、白细胞计数(WBC)、白细胞分类(LYM、NEU、MONO、EO、BASO)、血小板计数(PLT)、网织红细胞计数(RET)。

2.5.4血液生化指标

分别在给药后1个月、停药后2周测定血清中ALT、AST、CRE、TBIL、TP、ALB、GLU、ALP、CHO、GGT、TRIG、CK、Urea、K、Na、Cl含量。

2.5.5分别于给药后1个月、停药后2周描记心电图。

2.5.6重要脏器指数

分别于给药后1个月、停药后2周解剖动物称取心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、肾上腺、甲状腺、胃、子宫、卵巢、睾丸、附睾、前列腺重量，计算脏器指数。

2.5.7病理组织学检查

分别于给药后1个月、停药后2周解剖动物，摘取心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、肾上腺、胃、十二指肠、子宫和卵巢等主要脏器，肉眼检查及病理组织学检查。

2.5.8相关的病理切片，HE染色，10×20放大拍照

3实验结果

大鼠腹腔注射给予供试药1、2号20g/kg/d、10g/kg/d、5g/kg/d；供试药7号15g/kg/d、7.5g/kg/d、3.25g/kg/d及供试药8、9号25g/kg/d、12.5g/kg/d、6.25g/kg/d，连续1个月，停药后继续观察2周，结果显示：给药期间动物的一般活动正常、精神状态良好；大小便正常，无呕吐发生；毛发光滑、未见脱落现象；未见异常出血倾向。对体重、进食量、心电无明显影响；各项生化指标、外周血象及重要脏器的重量指数均在正常范围内波动；各脏器肉眼检查均未见明显病理改变；组织病理学观察亦未见由于药物所引起的病理形态学改变；未见由药物引起的毒副反应。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.组合物B在制备治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述组合物B的原料药组成为：京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷1重量份、京尼平苷1重量份、山栀苷甲酯0.5重量份。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物B按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、贴膏剂、栓剂、气雾剂、软膏剂或注射剂。