CN106267177B - 林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗及其制备方法。本发明的实际内容是取细胞培养出现细胞病变效应的林麝肺脏及化脓灶，用无菌手术剪剪成约1 cm³的小块，置于研砵中，加液氮进行研磨，重复4次。待研磨的组织浆液解冻为液态，加入约等体积的1×PBS，混合均匀，用0.22μL一次性过滤器进行过滤，向滤液中加入甲醛溶液，使甲醛的终浓度为0.5%，置于37℃灭活24h。按体积比1:1加入完全弗氏佐剂，混合均匀制得林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗。本疫苗能够有效预防林麝肺炎和化脓性疾病的发生，并能显著减少注射疫苗后林麝的应激反应，因此具有较大的应用价值。

Description

林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗及其制备方法。

背景技术

林麝肺炎和化脓性疾病主要是由麝致病性大肠埃希菌、麝致病性沙门菌、化脓隐秘杆菌、绿脓杆菌、蜡状芽孢杆菌和葡萄球菌等病原微生物以及病毒性病原等造成的多病源、多病因的一类疾病。其病理组织学变化主要变现为：肺脏化脓性肺炎, 肝脏急性肝炎,心脏急性心肌心包膜炎, 肾脏急性肾小球肾炎。多年林麝疾病的流行情况表明，患有与化脓相关疾病的林麝在所有病麝中占50％以上；而在因病死亡的林麝中，与化脓有关的占总数的50％以上，林麝的肺炎和化脓性疾病一直严重制约着人工养麝的发展。

在疫苗的制备过程当中为增强疫苗的免疫源性，常在灭活疫苗的研制过程中加入免疫佐剂。弗氏佐剂是免疫佐剂的一种，因其具有很高的佐剂效能而广泛应用于科学研究工作中。弗氏佐剂包括弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA) 和弗氏不完全佐剂(Freun’s incomplated adjuvant，FlA)两种。FIA由液体石蜡与羊毛脂按一定比例混合而成；向FIA中加入卡介苗(最终浓度为2-20 mg／mL)或死的结核分枝杆菌便得到FCA。由于FCA含有灭活结核分支杆菌，对体液和细胞免疫系统具有很强的激活作用，而具有更强的免疫增强效应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗的制备方法，经动物试验证明，该灭活苗免疫林麝后的应激反应小，免疫力强，免疫期长，因此该疫苗具有较大的应用价值。

具体实施步骤：

1. 林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒灭活原液的制备。

1）取细胞培养出现CPE的林麝肺脏及化脓灶，用无菌手术剪剪成约1 cm³的小块，置于研砵中，加液氮进行研磨，重复4次。

2）待研磨的组织浆液解冻为液态，加入约等体积的1×PBS，混合均匀，然后将混合液装入50 mL离心管并置于4℃冰箱保存备用。

3）取研磨组织液，在超净工作台内用0.22 μL一次性过滤器进行过滤，向滤液中加入甲醛溶液，使甲醛的终浓度为0.5%，置于37℃恒温保存灭活24 h。

2. 完全弗氏佐剂溶液的制备：用液体石蜡与无水羊毛脂按2:1比例混合的混合液，高压灭菌，加入80℃灭活1 h 的减毒卡介苗制成。

3. 成品疫苗的制备：按体积比1:1加入完全弗氏佐剂，混合均匀制得林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗。

具体实施方式

实施例一：

灭活疫苗的制备：取细胞培养出现CPE的林麝肺脏及化脓灶，用无菌手术剪剪成约1 cm³的小块，置于研砵中，加液氮进行研磨，重复4次。待研磨的组织浆液解冻为液态，加入约等体积的1×PBS，混合均匀，然后将混合液装入50 mL离心管并置于4℃冰箱保存备用。取研磨组织液，在超净工作台内用0.22μL一次性过滤器进行过滤，向滤液中加入甲醛溶液，使甲醛的终浓度为0.5%，置于37℃恒温保存24 h(每隔2-3 h震荡一次）。按体积比1:1加入完全弗氏佐剂，混合均匀制得林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗。

实施例二：

林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗的检测

1. 性状检测

对按上述方法制得的林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗进行性状检测，疫苗为乳白色乳浊液，滴一滴到水面上较长时间不分散。

2.甲醛含量测定

所制疫苗按《中国兽药典》附录中的乙酰丙酮法进行甲醛含量测定，疫苗甲醛含量符合安全标准。

3.无菌检验、支原体检验

所制疫苗按《中国兽药典》附录中的方法进行检测，疫苗均无细菌、支原体生长。

4. 安全检验

取4周龄雌雄各半的SPF级BALB/c小鼠20只，随机分成A、B两组，每组10只；其中A组为安全检验试验组，B组为空白对照组。正常饲养观察2 d无异常后进行安全检验试验。A组每只小鼠分别腹腔注射无菌检验后的林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗0.5 mL。B组每只小鼠分别腹腔注射无菌生理盐水0.5 mL做对照，观察14 d，接种小鼠均无异常临床反应。

5. 效力检测

1）免疫程序和方法：将制得的林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗按照标准免疫程序对仔麝和成年麝做疫苗免疫试验。其中，仔麝和成年麝各2只为实验组，肌肉注射疫苗；仔麝和成年麝各1只为对照组，肌肉注射生理盐水。期间，首免前采血2mL并分离血清；二免前采血2 mL并分离血清；三免前采血2 mL并分离血清；三免后7 d、14d、21 d和30 d分别采血2 mL并分离血清；所有分离的血清均放于4℃冰箱备用。所用免疫程序为：首免，1 mL/头仔麝，肌肉注射；2 mL/头成年麝，肌肉注射；二免，首免后7 d，1 mL/头仔麝，肌肉注射；2 mL/头成年麝，肌肉注射；三免，二免后14 d，1mL/头仔麝，肌肉注射；2mL/头成年麝，肌肉注射。

2）对流免疫电泳检测抗体效价

用1×TBE溶液配制0.8%琼脂糖，将配好的琼脂糖溶液加热融化，微冷倒入放有载玻片的平板内，使琼脂糖液面高于载玻片3 mm左右。待琼脂糖完全冷却凝固，用刀沿载玻片的轮廓切割，将载玻片和上面凝胶取出，用3 mm打孔器孔径，孔间距5 mm。抗原抗体相对滴加，疫苗（抗原）浓度为10^-1，血清（抗体）2倍稀释，每孔15 μL，每个样品做一个重复。另作抗原空白实验，实验组抗原全换为蒸馏水；抗体空白实验，加抗体的一孔洞换加蒸馏水。然后，将玻片置于电泳槽内进行电泳，疫苗（抗原）为负极，血清（抗体）为正极，用多层滤纸悬搭于玻片两端，倒入1×TBE溶液，液面淹至电泳槽两小槽一半以上，且保证滤纸下端浸入液面以下。调节电压40 V，电泳1.5 h。

检测结果显示，抗原和抗体孔洞之间有沉淀线出现，随血清浓度的降低，沉淀线的颜色依次变浅，呈梯度变化。 而抗原空白实验（抗原用蒸馏水代替）抗体空白实验（抗体用蒸馏水代替）的抗原抗体孔洞间无沉淀线。抗体检测结果表明：成年麝和仔麝使用麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗后均能产生较高的抗体效价，最高可达到2^-4 。

6. 免疫保护检验

将60只体重均一，雌雄各半的BALB/c小鼠进行随机分组，每组6只，共10组。1-9组为疫苗免疫保护试验组，10组为空白对照组，正常饲养观察2 d。将制备好的林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗按0.5 mL/只的剂量分别于7 d、14 d、21 d对1-9组小鼠进行首免、二免和三免。10组小鼠按0.5 mL/只的剂量以生理盐水为对照。三免后7 d进行抗原抗体检测。三免后14 d开始对1组和10组每只小鼠按LD₅₀剂量进行腹腔注射林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒。三免后21 d、28 d……63 d和70 d按相同剂量分别对2组、3组……8组和9组进行病毒原毒攻毒。攻毒后正常饲喂，连续观察详细记录各组死亡数，死亡率及存活率。出现小鼠死亡则立即解剖，观察组织病变情况。实验结果表明，本发明所述的林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗对实验小白鼠的保护率为100%；实验小白鼠注射该疫苗后能够产生母源抗体，产的仔也能100%存活，保护率100%；而没有用疫苗直接攻毒组的小白鼠产死胎、弱胎。另外，对家兔进行同样的保护实验，其结果显示：本发明所述的林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗对家兔的保护率也为100%。

Claims (1)

1.一种林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒弗氏完全佐剂灭活苗，其特征在于：所述灭活苗是将林麝肺炎和化脓性疾病病毒接种细胞培养出现细胞病变效应的林麝肺脏及化脓灶，经研磨灭活后与完全弗氏佐剂混合均匀制成灭活苗；

所述的灭活苗的制备方法，主要包括如下步骤：

1)林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒灭活原液的制备，制备步骤包括：取细胞培养出现细胞病变效应的林麝肺脏及化脓灶用无菌手术剪剪成1cm³的小块，置于研碎中，加液氮进行研磨，重复4次；待研磨的组织浆液解冻为液态，加入等体积的1×PBS，混合均匀，在超净工作台内用0.22μm一次性过滤器进行过滤，向滤液中加入甲醛溶液，使甲醛的终浓度为0.5％，置于37℃灭活24h，期间每隔2-3h震荡一次；

2)完全弗氏佐剂溶液的制备，包括以下步骤：取液体石蜡与无水羊毛脂按2：1比例混合的混合液，高压灭菌，加入80℃灭活1h的减毒卡介苗制成；

3)成品疫苗的制备：按1：1的比例向林麝肺炎和化脓性疾病病毒原毒灭活原液中加入完全弗氏佐剂溶液，搅拌15-20min，使其充分混合乳化。