CN106226372B - 一种可以提高产电菌产电效率的修饰ito电极及其制备方法 - Google Patents

一种可以提高产电菌产电效率的修饰ito电极及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种可以提高产电菌产电效率的修饰ITO电极及其制备方法。所述方法为：以M13噬菌体通过其蛋白质外壳上的胺基与二茂铁甲醛反应而连接到一起，再将其均匀涂到ITO的表面。组装三电极的反应器，利用电化学工作站进行电化学参数扫描。以修饰后的电极作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝为负电极。产电菌在此环境中会加快其电子传递效率与能力。这种修饰电极方法相比于对产电菌进行基因层面的改造以提高其产电能力来说，更简单易行，具有良好的发展空间。

Description

一种可以提高产电菌产电效率的修饰ITO电极及其制备方法
技术领域
本发明属于生物电化学传感器领域，具体涉及一种病毒修饰的电极以提高产电菌的产电效率，可用于制备高精度传感器。
背景技术
产电菌是指一类能够利用自身的呼吸链中产生的电子传递给外部电子受体进而产生电流的微生物。其中阳极呼吸菌能够将电子呼吸链延伸到胞外，从而将电子传递给胞外电子受体，如：氧气，金属氧化物(Fe(III)Mn(II))等。由于此性质，使得它们在污染物的处理方面具有着广阔的前景。其中最具代表性的是Geobacter sulfurreducen、Shewanellaoneidensis菌属。它们传递电子的方式主要有直接传递和间接传递。以Shewanella MR-1为例，通过细胞外膜上的细胞色素C蛋白或者纳米导线结构，它可以将电子直接从胞内转移到胞外的电极或是金属氧化物。此外，它还可以通过分泌的电子穿梭体进行间接传递。
除了在环境治理方面的巨大潜力，产电微生物还可用于微生物燃料电池(MFC)进行生物发电。但首先要解决得问题就是如何提高它的产电效率。仍以Shewanella MR-1为例，目前已有的思路是对其基因进行改造，使其外膜表达特定的细胞色素C蛋白或者是加入核黄素作为电子穿梭体加快电子的传递。但需要注意的是，电极的材料、性质也会影响其电子传递效率。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明公开了一种可以提高产电菌电子传递效率的M13修饰的ITO电极及其制备方法，改造方法简单易行，直接对电极进行修饰，效果好。
本发明的技术方案为：一种可以提高产电菌产电效率的修饰ITO电极，二茂铁甲醛对M13噬菌体修饰，然后涂布到氨基化的ITO玻璃上得到修饰后的ITO电极。
一种制备所述的可以提高产电菌产电效率的修饰ITO电极的方法，二茂铁甲醛对M13噬菌体修饰，然后涂布到氨基化的ITO玻璃上得到修饰后的ITO电极。
所述的制备可以提高产电菌产电效率的修饰ITO电极的方法，具体步骤如下：
步骤一：二茂铁甲醛对M13噬菌体的修饰：二茂铁甲醛溶解于二甲亚砜中，加入氰基硼氢化钠，与M13噬菌体室温下反应后，离心移去不溶物，渗析移去未反应物，得到二茂铁甲醛修饰的M13噬菌体混合液；
步骤二：ITO玻璃氨基化：ITO玻璃浸泡于3-氨丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，过夜得到氨基化的ITO玻璃；
步骤三：ITO电极：将步骤一制得的混合液均匀涂到氨基化的ITO玻璃上，4℃下保存即得修饰后的ITO电极。
步骤一中，先测试得到M13噬菌体的浓度，然后再加入二茂铁甲醛，二茂铁甲醛加入过量。
步骤二中，反应在光线充足的地方进行，氨基化的反应容器保持干燥。
步骤三中，涂抹采用电动马达拖动ITO，速度控制为5μm/s。
所述的可以提高产电菌产电效率的修饰ITO电极的应用方法，采用三电极形式，ITO电极为工作电极，铂为负电极，Ag/AgCl为参比电极，产电菌为希瓦氏菌。
所述的希瓦氏菌生长到对数生长期，OD600为0.5-0.6。
三电极反应容器保持无菌无氧，反应过程中不断通入氮气。
有益效果：
对电极进行修饰相比于对产电菌的改造更简单易行。由于病毒对细菌的相容性吸附以及其良好的空间立体结构，对电极进行病毒修饰可以获得提高产电菌的产电效率，因此具有良好的应用潜能。
以修饰后的电极作为工作电极，Ag/Ag为参比电极，铂丝为负电极。产电菌(希瓦氏菌)在此环境中会加快其电子传递效率与能力。这种修饰电极方法相比于对产电菌进行基因层面的改造以提高其产电能力来说，更简单易行，具有良好的发展空间。
附图说明
图1利用电动注射泵将不同反应液均匀涂到ITO表面。
图2 M13与二茂铁甲醛反应示意图。
图3三种修饰电极的i-t信号。
图4混合液修饰的ITO电极在6h,48h的c-v曲线。
图5希瓦氏菌在混合液修饰的ITO电极上48h的生长情况扫描电镜图。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明M13噬菌体是一种丝状噬菌体，其蛋白质与DNA组装成圆柱形结构，蛋白质外壳上有着大量的可供反应的氨基酸残基，如赖氨酸。通过赖氨酸上的胺基可与二茂铁甲醛进行反应从而实现对M13的修饰，再将其均匀涂到ITO玻璃上，M13会自组装形成生物薄膜，从而完成电极的修饰。步骤如下：
1.将M13噬菌体进行提纯并大量扩增，并用紫外分光光度计测量其在260nm处吸光度，从而确定其浓度，以便确定后续各反应物的量。
2.氰基硼氢化钠活化病毒的胺基，然后与二茂铁甲醛反应，使M13与二茂铁甲醛连接。并将产物进行渗析而除去未反应的反应物。
3.将ITO导电玻璃依次经过丙酮，无水乙醇，超纯水进行超声清洗，然后浸入到10wt.％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中中进行表面的氨基化。反应在光线充足的地方进行，氨基化的反应容器保持干燥，否则3-氨丙基三乙氧基硅烷会发生分子间交联。
4.将修饰后M13溶液均匀涂到氨基化的ITO玻璃上并在室温下过夜干燥。
5.将希瓦氏菌接种到LB培养基中，30℃，110r条件下生长12h至对数生长期(OD600：0.5～0.6),取菌液20ml加入到装有生长液的电池容器中，以之前修饰过的ITO玻璃片作为工作电极，铂丝作为负电极，Ag/AgCl为参比电极，进行定电压条件下的I-t测量，并在不同时间点扫描c-v图像以分析反应过程中的电子传递过程。进行I-t测量时，电压选择不应超过0.5v,且反应信号与外加电压呈正相关。
实施例1ITO电极的修饰
(1)噬菌体的修饰
1.采用双层平板进行噬菌体的平板培养，配方如下：
SolA溶液121℃灭菌20min后加入solB即可制得1.5％的培养基，同理，若加入的琼脂的量为7.6g制得0.8％的培养基。首先在平板底部倒入1.5％的培养基，待其冷却凝固后，再将M13菌液与0.8％的培养基混合倒入平板上部，凝固后倒置平板，30℃过夜，第二天即可长出菌斑。然后挑取菌落于E.coil的LB培养基中，30℃摇床中过夜，即可获得扩增的M13噬菌体，其浓度可通过读取269nm处的紫外吸收得到(消光系数为3.84)，本实验中实测为140mg/ml。
2.配置20mg/ml的二茂铁甲醛的DMSO(二甲亚砜)的溶液。
3.配置80％PBS(790ul PBS与200ul DMSO混合)，并加入0.0042g的氰基硼氢化钠。
4.取步骤2中的溶液700ul,步骤3中的溶液400ul与10ul的步骤1中的M13菌液混合，室温下反应1h,反应溶液变为深红色。
5.产物14000rpm高速离心10min以移去不溶物，再将产物通过300,000Da的渗析袋，渗析4h除去未反应物。
(2)修饰后的噬菌体与ITO连接
1.ITO的清洗与氨基化：将ITO玻璃片(3cm*3cm)依次浸泡于95％丙酮，无水乙醇超声清洗各10min，然后用二次水清洗干净，N2吹干。再将其浸泡于10％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，过夜。二次水清洗干净并用N2吹干，即制得了氨基化的ITO玻璃，4℃下保存备用。
2.噬菌体具有吸附生长的特性，将其溶液沉积于玻璃片上并缓慢干燥即可制得噬菌体薄膜。但为了克服其方向性不好的问题，采用拉膜的方法，使噬菌体均匀沉积到ITO玻璃片上。过程见示意图。然后室温下干燥24h即获得了修饰后的ITO玻璃片。4℃保存备用。
(3)产电菌(shewanella MR-1)的培养。
MR-1菌株首先接种于LB液体培养基中，30℃，110rpm培养12h至其对数培养期(OD600：0.5～0.6),然后取20ml接种于装有60ml growth media的电池容器中。Growthmedia(1L)如下：
(4)三电极组装及电化学实验
1.以修饰后的ITO玻璃作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为负电极。接通前，玻璃瓶先通N2以排净空气。
2.接通CHI660电化学工作站，选用I-t工作模式，电压设为0.5V,工作时间设置为48h.分别在当曲线出现峰时和48h结束时进行C-V的测量。
实施例2M13噬菌体直接与ITO的连接
取10ul M13噬菌体溶液与990ul的80％PBS混合，均匀涂于ITO玻璃片上，依旧进行电化学实验的测量，步骤同上
实施例3二茂铁甲醛与ITO的连接
取实施例1的步骤2中的700ul二茂铁甲醛溶液，与400ul步骤3的溶液混合，室温下反应1h,仍按照之前的步骤进行实验。
所有实验结果如下：
图3可以看出，三种修饰的ITO电极以M13和二茂铁混合液的产电信号最好，I-t图像出现了很明显的峰，达到了35uA,,而当只连接M13或者二茂铁的时候，电流基本不变，维持在5uA以内。由此可知，修饰后的电极可以促进希瓦氏菌的吸附，从而利于其电子传递。其原因可能是病毒促进产电菌的吸附，然后通过二茂铁将电子传递到ITO电极从而产生电信号。当只有M13或者二茂铁的时候，希瓦氏菌的传递电子的能力大大减弱。
图5是希瓦氏菌在混合液修饰的ITO玻璃上生长48h的电镜图,可以看出，希瓦氏菌覆盖了ITO表面的大部分，这也进一步验证了它通过吸附到电极上直接传递电子的产电机制。

Claims (9)

1.一种可以提高产电菌产电效率的修饰ITO 电极，其特征在于，二茂铁甲醛对M13噬菌体修饰，然后涂布到氨基化的ITO玻璃上得到修饰后的ITO电极，所述的产电菌为希瓦氏菌。
2.一种制备权利要求1所述的可以提高产电菌产电效率的修饰ITO 电极的方法，其特征在于，二茂铁甲醛对M13噬菌体修饰，然后涂布到氨基化的ITO玻璃上得到修饰后的ITO电极，所述的产电菌为希瓦氏菌。
3.根据权利要求2所述的制备可以提高产电菌产电效率的修饰ITO 电极的方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤一：二茂铁甲醛对M13噬菌体的修饰：二茂铁甲醛溶解于二甲亚砜中，加入氰基硼氢化钠，与M13噬菌体室温下反应后，离心移去不溶物，渗析移去未反应物，得到二茂铁甲醛修饰的M13噬菌体混合液；
步骤二：ITO玻璃氨基化：ITO 玻璃浸泡于3-氨丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，过夜得到氨基化的ITO玻璃；
步骤三 ： ITO电极：将步骤一制得的混合液均匀涂到氨基化的ITO 玻璃上，4℃下保存即得修饰后的ITO电极。
4.根据权利要求2所述的制备可以提高产电菌产电效率的修饰ITO 电极的方法，其特征在于，步骤一中，先测试得到M13噬菌体的浓度，然后再加入二茂铁甲醛，二茂铁甲醛加入过量。
5.根据权利要求2所述的制备可以提高产电菌产电效率的修饰ITO 电极的方法，其特征在于，步骤二中，反应在光线充足的地方进行，氨基化的反应容器保持干燥。
6.根据权利要求2所述的制备可以提高产电菌产电效率的修饰ITO 电极的方法，其特征在于，步骤三中，涂抹采用电动马达拖动ITO，速度控制为5μm/s。
7.权利要求1所述的可以提高产电菌产电效率的修饰ITO 电极的应用方法，其特征在于，采用三电极形式，ITO电极为工作电极，铂为负电极，Ag/AgCl为参比电极，产电菌为希瓦氏菌。
8.根据权利要求7所述的可以提高产电菌产电效率的修饰ITO 电极的应用方法，其特征在于，所述的希瓦氏菌生长到对数生长期，OD600为0.5-0.6。
9.根据权利要求7所述的可以提高产电菌产电效率的修饰ITO 电极的应用方法，其特征在于，三电极反应容器保持无菌无氧，反应过程中不断通入氮气。
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