CN112067853A - 一种微生物修饰扫描光电化学显微镜系统及其成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物修饰扫描光电化学显微镜系统，包括：电解池，其内部盛装有电解液；负载微生物的基底电极，包括衬底和设置在衬底一侧的多个ITO电极，ITO电极表面附着有微生物膜，衬底设置于电解池底部；SECM探针电极，设置于电解池上方，插入电解液中；电化学工作站，通过导电线路连接ITO电极；光源，照射在微生物膜上。本发明还公开了一种微生物修饰扫描光电化学显微镜成像方法，包括：S1.制备负载微生物的基底电极，S2.构建微生物修饰扫描光电化学显微镜系统，S3.设置基底电极及工作电极的电势进行SECM成像。本发明可研究光照对微生物胞外电子传递能力的影响，微区光源的引入，能够获得局部的光电响应信号，有效的提高了扫描成像的空间分辨率。
Description
技术领域
本发明涉及生物电化学技术领域，具体涉及一种微生物修饰扫描光电化学显微镜系统，以及微生物修饰扫描光电化学显微镜成像方法。
背景技术
微生物对自然界中的能量和物质转化本质上是与电子转移相关的氧化还原反应，对自然界中的元素地球化学循环过程起重要作用。自然界中的昼夜更替影响着微生物的能量代谢机制，间接影响着微生物与矿物等胞外电子受体之间的相互作用，因此，生物电化学系统的光依赖效应及其作用规律也逐渐引起越来越多的关注。目前，与光效应有关的微生物EET机制主要概括为两方面：一方面是在光激发条件下，微生物与半导体矿物的相互作用机制，这个过程主要涉及电子在微生物和矿物之间的转移，包括微生物矿化、矿物溶解的过程与聚合物的相互作用等；另一方面是微生物光合成机制，微生物利用小分子含碳物质作为碳源合成有机燃料或多碳化合物等，也涉及生物电化学系统中的阳极和阴极合成反应。
传统的光电化学反应系统，主要是通过引进光源到反应体系中，这种方式得到光电流结果往往来自于微生物/固体电极界面与电子转移相关的反应总和，对于从微观层面甚至单细胞层面解析微生物的光效应空间分辨率不足。因此，发展提高空间分辨率的光电化学实验方法是从微观尺度研究微生物光电效应需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物修饰扫描光电化学显微镜系统及其成像方法，以提高扫描成像的空间分辨率。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明公开了一种微生物修饰扫描光电化学显微镜系统，包括：
电解池，其内部盛装有电解液；负载微生物的基底电极，所述基底电极包括衬底和设置在所述衬底一侧的多个ITO电极，所述ITO电极表面附着有微生物膜，所述的基底电极密封设置于电解池底部；SECM探针电极，设置于电解池上方，且所述探针电极的一端插入电解液中；电化学工作站，包括多个端口，所述端口与至少一个所述ITO电极通过导线路连接，用于实验测试及给ITO电极施加电位；光源，通过所述SECM探针电极，照射所述微生物膜上。
进一步的，所述的微生物膜为亚满单层生物膜，所述亚满单层生物膜为所述ITO电极在恒电位作用下附着的电化学活性菌。
其中，所述的电化学活性菌为奥奈达希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1。
优选的，所述的电解液中含有FcMeOH作为电子中介体。
其中，所述的SECM探针电极为Pt微电极，所述的ITO电极平行排列，ITO电极的宽度a≤2mm。
进一步的，所述的光源为氙灯，氙灯光线穿过SECM探针电极并通过尖端照在微生物膜表面；所述的探针电极玻璃管套外壁涂覆有遮光材料层。
本发明还公开了一种微生物修饰扫描光电化学显微镜成像方法，包括以下过程：
S1.制备负载微生物的基底电极
在电解池底部设置基底电极为多个ITO电极，在电解池中恒电位培养电化学活性菌，恒电位培养时使用DM培养基，加入1～50mmol·L-1乳酸钠作为电子供体，控制ITO电极表面的电势为0～0.5V，培养时间为25～28h，培养后在ITO电极表面形成微生物膜；
S2.构建微生物修饰扫描光电化学显微镜系统
基底电极微生物膜培养好后，清洗电解池，更换电解液；采用SECM探针电极为工作电极，引进光源照射于微生物膜上，对比研究光照和黑暗条件下的光电流响应；
S3.设置基底电极及SECM探针电极的电势进行SECM成像。
优选的，在SECM成像时，沿与ITO电极平行的方向扫描成像。
优选的，步骤S2中电解液为含有FcMeOH的KCl溶液。
进一步地，电解液中添加1～50mmol·L-1乳酸钠。
优选的，步骤S1中电化学活性菌为奥奈达希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1。
优选的，步骤S2中采用氙灯光源照射于微生物膜上，步骤S3中，基底电极的电势设置为0.5V，SECM探针电极的电势设置为0V。
采用上述技术方案后，本发明具有如下效果：
1、本发明将光源与SECM探针结合，形成负载微生物的基底电极，构建光电化学显微镜系统(SPECM)，该系统的建立实现了微区光照引入微生物/电极界面，微电极和基底的生物修饰可以进一步发展研究不同微生物之间的间接电子转移机制、研究微生物与半导体矿物之间的相互作用机制等，并据此提高SECM的探针电极的空间分辨和灵敏度，实现生物膜内外局部空间存在的电化学活性物质检测等。
2、本发明基于电化学活性菌的电化学氧化还原性质及其与电解液的电子中介体的氧化还原反应，通过将光源耦合进SECM的探针电极，使探针电极具有微区光照功能，可用于研究图案化ITO基底及其附着微生物后的光电反应。
3、本发明方法通过控制ITO电极表面的电势及恒电位培养的时间，实现在ITO得到了亚满单层的生物膜。在此基础上，以FcMeOH作为电子中介体，实现了提高SECM反馈模式成像的空间分辨率。
4、本发明方法通过局部光照增加ITO基底微区的光电流，对比黑暗条件下，探针电极与ITO之间的反馈电流增加。在此基础上，周转条件下(即含有乳酸钠条件下)能进一步提高SECM成像的灵敏度。
附图说明
图1为本发明的结构示意图。
图2为电解池及基底电极的截面示意图。
图3为基底电极示意图。
图4为探针施加不同电位得到的探针扫描曲线。
图5为改变探针和基底电势得到的探针扫描曲线图。
图6为恒电位培养微生物膜的电流-时间曲线。
图7为恒电位培养微生物膜得到的基底电极的循环伏安曲线。
图8为基底电极培养微生物以后，改变探针和基底电势得到的探针扫描曲线图。
图9为SECM探针电极在基底表面沿垂直ITO电极方向的SECM图。
图10a为SECM探针电极在基底表面培养微生物前沿平行ITO电极方向的SECM图。
图10b为SECM探针电极在基底表面培养微生物后沿平行ITO电极方向的SECM图。
图11为基底电极电势为0.5V时在光照和黑暗条件下的探针扫描曲线。
图12为基底电极电势为0V时在光照和黑暗条件下的探针扫描曲线。
图13为电解液中添加乳酸钠前后基底电极在光照和黑暗条件下的探针扫描曲线。
图14为实施例中ITO电极Line4上培养的微生物膜的扫描电镜图。
图15为实施例中ITO电极Line3上培养的微生物膜的扫描电镜图。
主要组件符合说明：
1：电解池，2：SECM探针电极，3：光源，4：电化学工作站，5：ITO电极，6：微生物膜，7：遮光材料层，8：衬底，9：移动控制模组，10：电脑控制端，11：O型密封圈。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
如图1～图3所示，本发明公开了一种微生物修饰扫描光电化学显微镜系统，包括：电解池1、负载微生物的基底电极、SECM探针电极2、光源3、电化学工作站4、移动控制模组9及电脑控制端10。
负载微生物的基底电极包括衬底8和设置在衬底8一侧的多个ITO电极5，ITO电极5表面附着有微生物膜6。基底电极设置于电解池1底部，电解池1底部通过O型密封圈11与基底电极密封，防止盛装在电解池1内的电解液泄漏，同时，控制ITO电极5与电解液接触的工作区域。如图3所示，本实施例中设置有四条微米级的ITO电极5，ITO电极5的宽度H1为50μm，ITO电极5之间间隔的宽度H2为200μm。电解池1内部盛装有电解液，电解液中电子中介体为FcMeOH(二茂铁甲醇)。
微生物膜6为能在恒电位作用下形成生物膜的电化学活性菌附着在ITO电极表面形成的生物膜，优选的为亚满单层生物膜。电化学活性菌可以为Shewanella woodyi、Shewanella putrefaciens或者Shewanella oneidensis MR-1(奥奈达希瓦氏菌)。
SECM探针电极2(SECM即电化学扫描显微镜)，设置于电解池1上方，插入电解液中。SECM探针电极2可为Pt微电极。Pt微电极作为电化学中常用的工作电极，容易制得实验所需规格，因此选用Pt电极作为探针电极。
电化学工作站4，包括多个端口，端口通过导电线路连接ITO电极5，用于实验测试及给ITO电极5施加恒电位。
光源3采用氙灯光源，氙灯光源的亮度高，光谱稳定性好，输出功率稳定，且其辐射的光谱能量与日光相接近，更贴近于自然条件。SECM探针电极2为由铂丝和玻璃管组成的整体，氙灯光源发出的光线穿过玻璃管内，并通过SECM探针电极2的尖端照在微生物膜6的表面。在SECM探针的玻璃管套外壁涂履有遮光材料层7，起遮蔽及反射光线的作用，使氙灯光线基本通过SECM探针电极尖端照射在微生物膜6上，减小光的损失。
SECM探针电极2安装在一移动控制模组9上，移动控制模组9、电化学工作站4、光源3，SECM探针电极2都与电脑控制端10连接。
本发明还公开了上述系统的构建过程及成像方法，具体过程详述如下。
S1.制备负载微生物的基底电极
在电解池底部设置基底电极为四条ITO电极，自右向左依次标记为Line1、Line2、Line3、Line4，如图3所示。
在电解池中恒电位培养电化学活性菌：电化学活性菌采用奥奈达希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1。恒电位培养时使用DM培养基，加入10mmol·L-1乳酸钠作为电子供体。DM培养基含有：碳酸钠2.5g·L-1，二水氯化钙0.08g·L-1，氯化铵1.0g·L-1，六水氯化镁0.2g·L-1，氯化钠10g·L-1，4-羟乙基哌嗪乙磺酸7.2g·L-1。
控制ITO电极表面的电势为0～0.5V，培养时间为25～28h，培养后在ITO电极表面形成微生物膜。
S2.构建微生物修饰扫描光电化学显微镜系统
基底电极生物膜培养好后，用DM培养基清洗电解池若干次，然后更换电解液，电解液为含有1mmol·L-1FcMeOH的KCl溶液，电解液中添加10mmol·L-1乳酸钠。采用SECM探针电极为工作电极，引进氙灯光源照射于微生物膜上。
S3.将基底电极的电势设置为0.5V，工作电极电势设置为0V，进行SECM成像。在SECM成像时，沿与ITO电极平行的方向扫描成像。
针对本发明的光电化学显微镜的成像过程进行实验测试的过程如下详述：
1、试剂和材料
试剂：二茂铁甲醇(FcMeOH)，购买于Sigma；氧化铟锡导电玻璃(ITO，厚1.1mm)购买于武汉晶格太阳能科技有限公司；Shewanella oneidensis MR-1来自中国科学院城市环境研究所实验室的保藏菌种。
2、SECM探针电极与ITO电极的反应模式
SECM探针电极设置为FcMeOH氧化的电位0.5V时，控制探针电极依次扫描经过Line1至Line4，此时，ITO电极导电的开路电位约为0.08V，处于FcMeOH+还原的电位。因此，在探针电极足够靠近基底表面后，当探针电极扫描经过绝缘区域上方时，本体溶液中的FcMeOH向SECM探针电极表面的扩散受到阻碍，此时SECM探针电极的电流比其在本体溶液中小，即负反馈。
当SECM探针电极经过ITO电极上方时，探针氧化FcMeOH产生FcMeOH+能够被ITO还原再生成FcMeOH，FcMeOH扩散至SECM探针电极表面继续反应，这样SECM探针电极的电流可能更大，即正反馈。获得的扫描探针曲线如图4所示。当SECM探针电极施加将FcMeOH+还原的电势时，由于溶液中兼有还原态的FcMeOH，因此在SECM探针电极经过导电区域和绝缘区域时，SECM探针电极均无法检测到还原电流。
本发明的实验以FcMeOH为电子中介体，SECM探针电极为工作电极(Etip)，在Line1和Line2分别施加相同电位(Esub)，Line3和Line4在各个条件下皆处于开路。各个条件下得到的探针扫描曲线如图5所示。当SECM探针电极在绝缘区域上方扫描时，SECM探针电极施加氧化FcMeOH的电位时，溶液中的FcMeOH在探针电极表面被氧化，探针收集到氧化电流。随着探针与基底的距离越来越近，本体溶液中的FcMeOH扩散到电极表面受阻，因此探针收集到的氧化电流小于探针在本体溶液中的电流，此时是负反馈模式。当SECM探针电极施加的电位为FcMeOH的还原电位0V时，由于本体溶液中没有氧化态存在，因此SECM探针电极无法收集到法拉第电流。当探针与电极的电势不同时，ITO基底和探针之间为正反馈模式，探针电流增加。其中，SECM探针电极施加FcMeOH的氧化电位0.5V时，探针扫描至ITO上方时收集到氧化电流，当探针电极施加还原FcMeOH+的还原电位0V时，探针电极收集到还原电流增加。当探针与基底电势相同时，ITO基底与探针之间为竞争模式，探针电流降低。其中，当探针电极和ITO均施加还原FcMeOH+的还原电位0V时，由于电解液中没有FcMeOH+，因此，ITO基底和探针表面均无还原电流，探针电极检测不到法拉第电流。当探针电极和基底同时施加FcMeOH的氧化电位0.5V时，ITO基底和探针表面均发生FcMeOH的氧化反应，由于ITO电极的竞争，使得探针电极检测到的氧化电流减小。
3、在电解池中恒电位培养奥奈达希瓦氏菌
在电解池中恒电位培养奥奈达希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1，电位培养时使用DM培养基。DM培养基中含有：碳酸钠2.5g·L-1，二水氯化钙0.08g·L-1，氯化铵1.0g·L-1，六水氯化镁0.2g·L-1，氯化钠10g·L-1，4-羟乙基哌嗪乙磺酸7.2g·L-1。加入10mmol·L-1乳酸钠作为电子供体。
控制电极表面的电势：将Line 1和Line 4分别设置为0.3V，Line 2和Line 3分别设置为0V，得到培养时间根据电流随时间变化曲线，如图6所示。从电流-时间曲线可以看到，大约经过4h后氧化电流开始明显迅速增加，此时电解液中的微生物利用培养基中的乳酸钠为电子供体，电极作为电子受体，开始附着于ITO表面，电极能收集到电流由微生物产生的电子；当电极表面被接近满单层的微生物覆盖，电流增加缓慢；在培养时间接近20h时，电流迅速降低，这是由于培养基中的乳酸钠即将被耗尽，电极表面收集到的电流减小，当培养至25～28h时，电流进一步降低，优选培养时间为27h。
培养至约27h时，测试电极的循环伏安曲线，结果如图7所示。与Line(2+3)的氧化还原过程相比，Line(1+4)在氧化和还原的过程中均有明显的氧化还原峰，并且氧化峰和还原峰的电位区间与没有电子供体存在的情况下的Shewanella oneidensis MR-1的氧化和还原峰电位区间一致，由此，可以判断电极表面施加更高的阳极电势在同一环境中更有利于微生物附着形成生物膜。对比line4(图14)和line3(图15)的扫描电镜图可见，Line 4表面覆盖的微生物的量比Line 3表面的多，这说明电势会影响生物膜的形成速度，并且这与之前的电化学实验表明的结果一致。另外，从图中可以看出，在绝缘区域也有与导电区域相当的微生物的量覆盖，这很可能是因为在培养过程中基底电极水平与电解液接触，微生物受重力作用也会沉淀附着在基底表面。通过控制电极表面的培养时间，使得电极表面的微生物膜为亚满单层生物膜，有利于提高SECM反馈模式成像的空间分辨率。
4、空间分辨率及SECM成像分析
SECM探针电极重新回到之前基底无微生物的扫描位置，设置SECM探针和基底的位置和电位与图4中一致，得到的探针扫描曲线如图8所示。通过对比培养微生物前后SECM探针电极在相同条件下收集到的电流曲线，分析微生物在电极界面对电子转移的作用。其中，对比当Etip＝0.5V，Esub＝0V时得到的探针扫描曲线：当探针扫描过基底有微生物的ITO电极界面上方时，探针收集到的氧化电流均明显增加，这表明正反馈增强，这一方面是因为微生物在基底表面对FcMeOH+的还原使得局部FcMeOH的浓度相对增加，另一方面可能是因为生物膜的形成使得探针与基底的距离相对减小，反馈增强。类似原理，当探针和基底电极电位变化时，电流均有增强。通过对比图5和8中的每条探针扫描曲线上电流的相对大小可见，当基底电势设置为0.5V，探针电极电势设置为0V时，探针对电极反应表现的灵敏度和分辨率会更高，因此，选择该电势条件下，进一步进行SECM成像。
SECM成像首先沿垂直ITO方向扫描，结果如图9所示，成像过程中，探针扫描过ITO电极时，还原电流会明显增强，但是对比沿平行ITO方向扫描的结果，如图10a所示，垂直扫描时边界范围相对较宽且不整。因此，在SECM成像时，选择沿着与ITO平行的方向扫描。对比图10b中基底电极表面附着微生物前后扫描成像的结果，说明基底电极表面附着了微生物以后，SECM成像的空间分辨率得到了提高。
5、光照对SECM探针电极和基底电极之间氧化还原反应的影响
(1)首先，测定SECM探针电极在含1mmol L-1FcMeOH本体溶液中的循环伏安曲线，在光照和黑暗条件下得到的FcMeOH的循环伏安曲线没有明显的区别，因此，在探针靠近基底过程中，如果探针电流有明显变化，仅需要考虑光照对基底电极的影响。
(2)基底负载微生物之前的光电流响应分析
基底电极负载微生物之前，在Line1和Line2施加FcMeOH的氧化电位0.5V，Line3和Line4为开路电位时，SECM探针电极在光照和黑暗条件下的探针扫描曲线如图11所示。其中，在黑暗条件下，当SECM探针电极经过绝缘区域上方时，探针电极收集到的电流不变，说明光照对绝缘区域没有影响。当探针电极经过Line1-4上方时，探针电极收集到的还原电流均有所减小，由此可以推断光照和黑暗条件下电流的变化来自于ITO的光电效应。
为了进一步确定反馈模式受光照的影响，在Line1和Line2上施加FcMeOH+的还原电位0V，Line3和Line4为开路电位，探针电极在光照和黑暗条件下的探针扫描曲线如图12所示。其中，当探针电极扫描经过Line1和Line2上方时，探针电极表面为氧化FcMeOH的电势，因为探针电极本身性质不受光照影响，因此，相比黑暗条件下，光照时探针上氧化电流的增加来自于局部FcMeOH的浓度增加。基于正反馈模式，反馈电流增加，说明光照能增强ITO对FcMeOH+的还原。ITO作为n型透明半导体功能材料，在光照条件下，光生电子为载流子利于电极表面有更多的电子转移，在控制电势0V的时，载流子趋于从导带转移，促进FcMeOH+的还原。而Line3和Line4为开路电位，光照使n型半导体的开路电位更负，因此利于基底对FcMeOH+的还原，使正反馈电流增加。
(3)基底负载微生物之后的光电流响应分析
基底表面培养微生物之后，原位测定了光照和黑暗条件下的探针扫描曲线，如图13所示。当SECM探针电极施加0.5V，基底为开路电位时，探针依次扫描过Line1至4表面时，探针反馈电流分别增加了0.038、0.051、0.046和0.058nA。当电解液中添加了10mmoL-1乳酸钠时，探针反馈电流分别增加了0.099、0.097、0.094和0.101nA。添加乳酸钠(碳源)作为电子供体后，黑暗条件下，Line1-4表面的反馈电流增加约了0.01nA；光照后，正反馈电流的增加是黑暗条件下正反馈电流的增加的约2倍。由此可见，微生物在周转条件下能够增强其还原FcMeOH+的能力，而且在有电子供体乳酸钠存在的条件下，反馈电流的增加不但来源于ITO产生的光电流，还来源于微生物还原FcMeOH+的能力增强。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种微生物修饰扫描光电化学显微镜系统，其特征在于，包括：
电解池，其内部盛装有电解液；
负载微生物的基底电极，所述基底电极包括衬底和设置在所述衬底一侧的多个ITO电极，所述ITO电极表面附着有微生物膜，所述的基底电极密封设置于电解池底部；
SECM探针电极，设置于电解池上方，且所述探针电极的一端插入电解液中；
电化学工作站，包括多个端口，所述端口与至少一个所述ITO电极通过导线路连接，用于实验测试及给ITO电极施加电位；
光源，通过所述SECM探针电极，照射于所述微生物膜上。
2.如权利要求1所述的微生物修饰扫描光电化学显微镜系统，其特征在于：所述的微生物膜为亚满单层生物膜，所述亚满单层生物膜为所述ITO电极在恒电位作用下附着的电化学活性菌。
3.如权利要求2所述的微生物修饰扫描光电化学显微镜系统，其特征在于：所述的电化学活性菌为奥奈达希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1。
4.如权利要求1所述的微生物修饰扫描光电化学显微镜系统，其特征在于：所述的电解液中含有FcMeOH作为电子中介体。
5.如权利要求1所述的微生物修饰扫描光电化学显微镜系统，其特征在于：所述的SECM探针电极为Pt微电极，所述ITO电极平行排列，ITO电极的宽度a≤2mm。
6.如权利要求1所述的微生物修饰扫描光电化学显微镜系统，其特征在于：所述的光源为氙灯，氙灯光线穿过SECM探针电极尖端照在微生物膜表面；SECM探针电极玻璃管套外壁涂覆有遮光材料层。
7.一种微生物修饰扫描光电化学显微镜成像方法，其特征在于，包括以下过程：
S1.制备负载微生物的基底电极
在电解池底部设置基底电极为多个ITO电极，在电解池中恒电位培养电化学活性菌，恒电位培养时使用DM培养基，加入1～50mmol·L-1乳酸钠作为电子供体，控制ITO电极表面的电势为0～0.5V，培养时间为25～28h，培养后在ITO电极表面形成微生物膜；
S2.构建微生物修饰扫描光电化学显微镜系统
基底电极微生物膜培养好后，清洗电解池，更换电解液；采用SECM探针电极为工作电极，引进光源照射于微生物膜上；
S3.设置基底电极及SECM探针电极的电势，进行SECM成像。
8.如权利要求7所述的微生物修饰扫描光电化学显微镜成像方法，其特征在于，步骤S3中，在SECM成像时，沿与ITO电极平行的方向扫描成像。
9.如权利要求7所述的微生物修饰扫描光电化学显微镜成像方法，其特征在于：步骤S2中电解液为含FcMeOH的KCl溶液，所述的电解液中添加1～50mmol·L-1乳酸钠。
10.如权利要求7所述的微生物修饰扫描光电化学显微镜成像方法，其特征在于：步骤S1中电化学活性菌为奥奈达希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1；步骤S2中采用氙灯光源照射于微生物膜上；步骤S3中，基底电极的电势设置为0.5V，SECM探针电极的电势设置为0V。
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