CN109085222A - 离子液体功能化石墨烯弧菌dna电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种离子液体功能化石墨烯弧菌DNA电化学传感器及其制备方法和应用。先在氧化石墨烯分散液中制备ZIF‑8，然后再用氨基功能化离子液体对石墨烯‑ZIF‑8复合物进行共价修饰，制得离子液体功能化石墨烯‑ZIF‑8复合物，滴涂法制备该复合物修饰的金电极，再将弧菌探针ssDNA通过生物连接剂固定在修饰电极表面，制备所述的弧菌DNA传感器。该DNA传感器具有良好的灵敏性和选择性、较低的检测限和较宽的线性范围。该制备方法包括：电极修饰材料的制备；电化学副溶血性弧菌DNA传感器的制备；电化学副溶血性弧菌DNA传感器与目标DNA的杂交；传感器电化学信号检测。该传感器操作方法简单，有潜在的应用价值。
Description
技术领域：
本发明属于生物电化学传感器技术领域，具体涉及一种离子液体功能化石墨烯弧菌DNA电化学传感器及其制备方法，以及用于高灵敏检测致病性副溶血性弧菌的特异性DNA。
背景技术：
海洋弧菌是一类活动力极强的棒状或弧状革兰氏阴性菌，广泛分布于半咸水、沿岸、河口、海洋水体、沉积物和海洋生物体内，分布在全球河口环境中的一种革兰氏阴性菌，当食用生的、未煮熟的或处理不当的海鲜时，会引起人类急性胃肠炎。其中以副溶血性弧菌的危害最大，研究发现副溶血性弧菌株中都发现了tlh基因，因此它被认为是检测总副溶血性弧菌的一个有用的指标。近年来，DNA电化学生物传感器以其成本低、灵敏度高、响应速度快、选择性好以及仪器小型化等优点引起了人们的广泛关注。迄今为止，各种类型的DNA电化学生物传感器以其广泛的纳米材料如类水滑石(LDH)、碳纳米管(CNTs)和石墨烯(GR)等，被用于提高DNA生物传感器的灵敏度和稳定性，但用于检测弧菌的DNA传感器在灵敏度和检测限方面仍然有很大提升空间。
沸石咪唑骨架(ZIFs)是MOFs的一种，与其它大多数MOFs相比，具有易于合成、热稳定性、和化学稳定性等优点，在气体储存、分离、化学传感和催化等方面显示出巨大的潜力。近年来，以锌离子和2-甲基咪唑为原料的ZIF-8已成为一种很有前途的电化学传感器材料。但ZIF-8的低导电性和易聚集等缺点在很大程度上限制了其在电化学传感领域的应用，为了提高材料的导电性和分散稳定性，在ZIF-8中引入导电性良好的电活性纳米组分是一种有效的方法，如将金属纳米粒子和导电聚合物等引入到MOFs结构中可明显提高相应电化学生物传感器的性能。
石墨烯(GR)以其优异的电子电导率、优异的电子传递速率、优异的化学、热稳定性和机械稳定性成为最具应用前景的电化学分析改性材料之一。在氧化石墨烯(GO)上原位生长ZIF-8纳米复合材料，由于GR与ZIF-8晶体的协同作用，使得GO-ZIF-8复合物具有快速的传质性能和高的导电性能，成为了一种新型的电化学传感材料。然而由于GR片易堆积和ZIF-8的疏水性，导致复合物容易沉降，整体分散性差，致使其在异相体系中的应用受到较大的限制。氨基功能化离子液体(IL)不仅是一种高导电性、具有特殊溶解性能的绿色溶剂，其有功能性氨基可通过与GO表面大量的环氧环发生开环反应，修饰到GO-ZIF-8复合物表面制备IL-GR-ZIF-8。由于特殊的溶解性、大量的电荷以及高的导电性，离子液体的引入可大大提高复合材料的分散性、稳定性和导电性，同时丰富了复合物表面的功能性基团，势必会提高对探针ssDNA固定能力。目前，基于IL-GR-ZIF-8复合物膜修饰金电极固定探针ssDNA构建弧菌DNA传感器并用于检测副溶血性弧菌的研究还未见报道。
本发明以IL-GR-ZIF-8复合膜修饰的金电极为基础，建立了一种高灵敏的弧菌DNA杂交检测方法。IL-GR-ZIF-8复合膜不仅能够有效的固定DNA，而且具有大的比表面积，良好的生物相容性、导电性和分散性，有效地促进了电子转移。与其它报道的方法相比，该方法对目标DNA的检出限较低，线性范围宽，选择性好，可实现对弧菌特征DNA的高灵敏无标记检测。
发明内容：
针对现有DNA传感检测技术的不足以及本领域研究和应用的需求，本发明的目的之一是提供一种离子液体功能化石墨烯弧菌DNA电化学传感器，所述DNA传感器以金电极为基底电极，以IL-GR-ZIF-8复合膜为电极修饰材料，探针ssDNA通过生物连接剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)共价键合的方式固定在修饰电极表面；所述IL-GR-ZIF-8复合物是先在氧化石墨烯分散液中制备ZIF-8，然后再用氨基功能化IL对石墨烯-ZIF-8复合物进行共价修饰，制得离子液体功能化石墨烯-ZIF-8复合物；所述金电极记为Au；所述氧化石墨烯记为GO；所述石墨烯记为GR；所述离子液体功能化石墨烯-ZIF-8记为IL-GR-ZIF-8；所述离子液体为1-甲基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸盐，记为IL，其结构式如下：
本发明的目的之二是提供一种离子液体功能化石墨烯弧菌DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：
(1)IL-GR-ZIF-8复合物的制备
先采用Hummer法制备GO，再将一定量所得GO分散于去离子水中，超声分散2h，得到浓度为0.5～1.0mg/mL的GO分散液；在25～60℃搅拌条件下将10mL浓度为90mg/mL的Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液缓慢匀速滴加到上述GO分散液中；在相同条件下将10mL浓度为900mg/mL 2-甲基咪唑甲醇溶液滴加至上述混合液中，搅拌15min，在相同温度下老化24h，离心收集灰白色沉淀，分别用水和甲醇依次洗涤3次，自然干燥后即得GO-ZIF-8复合物；称取40mg GO-ZIF-8复合物分散于去离子水中，使其浓度为1.0mg/mL，缓慢加入20mg IL和20mg KOH后超声处理30min；将超声后的分散液于50～100℃下加热搅拌24h，4000rpm离心5min，依次用去离子去和无水乙醇洗涤3次，干燥后即得IL-GR-ZIF-8复合物；
(2)IL-GR-ZIF-8修饰金电极的制备
金电极经0.05μm的A12O3抛光粉抛光后，用双蒸水冲洗干净，并在超声水浴中超声5min，用高纯氮气吹干；将步骤(1)中得到的IL-GR-ZIF-8复合物超声分散于去离子中，配制成浓度为3mg/mL的分散液，取0.5～50μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到IL-GR-ZIF-8修饰的金电极，记为IL-GR-ZIF-8/Au；
(3)DNA传感器的制备
将IL-GR-ZIF-8/Au浸入0.4mol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.1mol/L N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中30min，使修饰电极表面羧基化；取1～100μL浓度为1×10-6mol/L的探针ssDNA溶液滴涂于修饰电极表面，在25℃～70℃下孵育2h，依次用pH＝7.4的PBS和双蒸水对电极进行冲洗，除去未固定的探针ssDNA，室温自然干燥后得DNA传感器。
其中步骤(1)中制备GO-ZIF-8复合物的过程中，加热温度为35℃；所述IL-GR-ZIF-8复合物是在35℃条件下，IL在碱性介质中与GO-ZIF-8中GO分子上的环氧环反应制备而成的，其粒径范围约为100nm～1μm。步骤(2)中所述抛光后的金电极，采用三电极系统检测，在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中，设置电压为-0.4～0.8V，对金电极进行循环伏安扫描，若氧化还原峰电位差在0～100mV内，则说明电极表面已处理好，否则重新处理，直至符合要求为止。
本发明目的之三是提供一种离子液体功能化石墨烯弧菌DNA电化学传感器用于弧菌的检测应用。具体包括以下具体步骤：
(1)DNA传感器与目标ssDNA的杂交
将不同浓度互补DNA滴入探针固定电极表面，在35℃下孵育50min进行杂交，杂交后依次用PBS(pH为7.4)和双蒸水对电极进行冲洗，去除为杂交的目标DNA，即完成DNA分子在电极表面的杂交。
(2)传感器的电化学信号检测
采用循环伏安(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，以不同的修饰金电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，[Fe(CN)6]3-/4-为指示剂，检测底液为0～10mmol L-1[Fe(CN)6]3-/4-和0～1mol L-1KCl的PBS(pH为7～9)缓冲液，应用电化学工作站测试不同修饰电极的循环伏安曲线、差分脉冲伏安曲线，扫描电位为-2～2V，扫描速度为1～200mV/s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。
与现有技术相比，主要优点在于：所述离子液体功能化石墨烯弧菌DNA电化学传感器充分发挥了IL、GR和ZIF-8的协同效应，提高了复合膜的比表面积、导电性和分散性，增加了活性位点，大大增强了对探针ssDNA的固定能力，从而整体提高了DNA电化学传感器检测弧菌特征DNA的性能，对高灵敏无标记检测致病性副溶血性弧菌具有重要的理论意义和潜在的应用价值。该传感器具有灵敏度高选择性好，尤其具有较低的检测限和较宽的线性范围；制备方法简单，检测速度快。
附图说明：
图1为实施例1所得GO-ZIF-8(上)和实施例1所得IL-GR-ZIF-8(下)的扫描电镜图。
图2为对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和实施例1分别对应的Au、GO/Au、ZIF-8/Au、GO-ZIF-8/Au和IL-GR-ZIF-8/Au在5mmol L-1[Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol L-1KCl的PBS(pH＝7.4)缓冲液中的CV结果。
图3为对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和实施例1对应的Au、GO/Au、ZIF-8/Au、GO-ZIF-8/Au和IL-GR-ZIF-8/Au在5mmol L-1[Fe(CN)6]3-/4-和0.1molL-1KCl的PBS(pH＝7.4)缓冲液中的电化学阻抗结果。
图4为实施例1对应的IL-GR-ZIF-8/Au(a)、固定探针ssDNA后(b)以及与目标DNA杂交后(c)在[Fe(CN)6]3-/4-和KCl的PBS中的CV结果。
图5为实施例1对应的固定有探针ssDNA的IL-GR-ZIF-8/Au(a)、与非互补DNA杂交(b)、与三碱基错配DNA杂交(c)、与单碱基错配DNA杂交(d)和完全互补DNA杂交后(e)的DPV结果。
图6为不同浓度目标ssDNA与实施例1对应DNA传感器杂交后的DPV响应结果(a-k):0，1.0×10-16，1.0×10-15，1.0×10-14，1.0×10-13，1.0×10-12，1.0×10-11，1.0×10-10，1.0×10-9，1.0×10-8，1.0×10-7mol L-1，插图为Ipa与-lgC之间的线性关系图。
具体实施方式：
为进一步理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但并不以任何方式限制本发明。
实施例1：
(1)IL-GR-ZIF-8复合物的制备
先采用Hummer法制备GO，再将一定量所得GO分散于去离子水中，超声分散2h，得到浓度为0.5～1.0mg/mL的GO分散液；在35℃搅拌条件下将10mL浓度为90mg/mL的Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液缓慢匀速滴加到上述GO分散液中；在相同条件下将10mL浓度为900mg/mL 2-甲基咪唑甲醇溶液滴加至上述混合液中，搅拌15min，在相同温度下老化24h，离心收集灰白色沉淀，分别用水和甲醇依次洗涤3次，自然干燥后即得GO-ZIF-8复合物；称取40mg GO-ZIF-8复合物分散于去离子水中，使其浓度为1.0mg/mL，缓慢加入20mg IL和20mg KOH后超声处理30min；将超声后的分散液于80℃下加热搅拌24h，4000rpm离心5min，依次用去离子去和无水乙醇洗涤3次，干燥后即得IL-GR-ZIF-8复合物；
(2)IL-GR-ZIF-8修饰金电极的制备
金电极经0.05μm的A12O3抛光粉抛光后，用双蒸水冲洗干净，并在超声水浴中超声5min，用高纯氮气吹干；将步骤(1)中得到的IL-GR-ZIF-8复合物超声分散于去离子中，配制成浓度为3mg/mL的分散液，取5μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到IL-GR-ZIF-8/Au；
(3)DNA传感器的制备
将IL-GR-ZIF-8/Au浸入0.4mol/L EDC和0.1mol/L NHS的混合溶液中30min，使修饰电极表面羧基化；取20μL浓度为1×10-6mol/L的探针ssDNA溶液滴涂于修饰电极表面，在25℃下孵育2h，依次用pH＝7.4的PBS和双蒸水对电极进行冲洗，除去未固定的探针ssDNA，室温自然干燥后得DNA传感器。
实施例2：
(1)IL-GR-ZIF-8复合物的制备
按照实施例1中步骤(a)的方法和条件制备；
(2)IL-GR-ZIF-8修饰金电极的制备
金电极经0.05μm的A12O3抛光粉抛光后，用双蒸水冲洗干净，并在超声水浴中超声5min，用高纯氮气吹干；将步骤(1)中得到的IL-GR-ZIF-8复合物超声分散于去离子中，配制成浓度为3mg/mL的分散液，取8μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到IL-GR-ZIF-8/Au；
(3)DNA传感器的制备
将IL-GR-ZIF-8/Au浸入0.4mol/L EDC和0.1mol/L NHS的混合溶液中30min，使修饰电极表面羧基化；取40μL浓度为1×10-6mol/L的探针ssDNA溶液滴涂于修饰电极表面，在25℃下孵育2h，依次用pH＝7.4的PBS和双蒸水对电极进行冲洗，除去未固定的探针ssDNA，室温自然干燥后得DNA传感器。
实施例3：
(1)IL-GR-ZIF-8复合物的制备
按照实施例1中步骤(a)的方法和条件制备；
(2)IL-GR-ZIF-8修饰金电极的制备
金电极经0.05μm的A12O3抛光粉抛光后，用双蒸水冲洗干净，并在超声水浴中超声5min，用高纯氮气吹干；将步骤(1)中得到的IL-GR-ZIF-8复合物超声分散于去离子中，配制成浓度为3mg/mL的分散液，取10μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到IL-GR-ZIF-8/Au；
(3)DNA传感器的制备
将IL-GR-ZIF-8/Au浸入0.4mol/L EDC和0.1mol/L NHS的混合溶液中30min，使修饰电极表面羧基化；取50μL浓度为1×10-6mol/L的探针ssDNA溶液滴涂于修饰电极表面，在25℃下孵育2h，依次用pH＝7.4的PBS和双蒸水对电极进行冲洗，除去未固定的探针ssDNA，室温自然干燥后得DNA传感器。
实施例4：
(1)IL-GR-ZIF-8复合物的制备
按照实施例1中步骤(a)的方法和条件制备；
(2)IL-GR-ZIF-8修饰金电极的制备
金电极经0.05μm的A12O3抛光粉抛光后，用双蒸水冲洗干净，并在超声水浴中超声5min，用高纯氮气吹干；将步骤(1)中得到的IL-GR-ZIF-8复合物超声分散于去离子中，配制成浓度为3mg/mL的分散液，取15μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到IL-GR-ZIF-8/Au；
(3)DNA传感器的制备
将IL-GR-ZIF-8/Au浸入0.4mol/L EDC和0.1mol/L NHS的混合溶液中30min，使修饰电极表面羧基化；取60μL浓度为1×10-6mol/L的探针ssDNA溶液滴涂于修饰电极表面，在25℃下孵育2h，依次用pH＝7.4的PBS和双蒸水对电极进行冲洗，除去未固定的探针ssDNA，室温自然干燥后得DNA传感器。
对比例1：
按照实施例1中步骤(3)的方法和条件，直接将探针ssDNA固定在裸的Au表面。
对比例2：
(1)GO修饰金电极的制备
按照实施例1中步骤(2)的方法和条件，配制浓度为3mg/mL的GO分散液，取5μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到GO/Au；
(3)DNA传感器的制备
按照实施例1中步骤(3)的方法和条件，将探针ssDNA固定在裸的GO/Au表面。
对比例3：
(1)ZIF-8修饰金电极的制备
按照实施例1中步骤(2)的方法和条件，配制浓度为3mg/mL的ZIF-8分散液，取5μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到ZIF-8/Au；
(3)DNA传感器的制备
按照实施例1中步骤(3)的方法和条件，将探针ssDNA固定在裸的ZIF-8/Au表面。
对比例4：
(1)GO-ZIF-8复合物的制备
按照实施例1中步骤(1)中前半段描述的方法和条件制备GO-ZIF-8复合物；
(2)GO-ZIF-8修饰金电极的制备
按照实施例1中步骤(2)的方法和条件，配制浓度为3mg/mL的GO-ZIF-8分散液，取5μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到GO-ZIF-8/Au；
(3)DNA传感器的制备
按照实施例1中步骤(3)的方法和条件，将探针ssDNA固定在裸的ZIF-8/Au表面。
图1为实施例1所得GO-ZIF-8(上图)和实施例1所得IL-GR-ZIF-8(下图)的扫描电镜图。从上图中可以看出，ZIF-8的晶体颗粒呈现标准的正十二面体，ZIF-8的晶体颗粒之间有GO片相连，说明ZIF-8晶体在GO衬底上原位生成。相比之下，离子液体功能化后，IL-GR-ZIF-8(下图)中ZIF-8晶体颗粒的棱角和轮廓变得模糊，这主要是由于IL在GO-ZIF-8表面功能化的结果。
图2为对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和实施例1对应的Au、GO/Au、ZIF-8/Au、GO-ZIF-8/Au和IL-GR-ZIF-8/Au在5mmol L-1[Fe(CN)6]3-/4-和0.1molL-1KCl的PBS(pH＝7.4)缓冲液中的CV结果。由图2可知，由于GO本身不导电的特性阻碍氧化还原探针电子的传递，因而GO/Au的CV曲线给出了最小的氧化还原响应。ZIF-8/Au的伏安响应的略高于裸的Au电极，说明ZIF-8具有一定的电化学催化作用。ZIF-8@GO/Au给出了更高的氧化还原信号，说明GO和ZIF-8通过协同作用阻止了GO和ZIF-8两种组分的聚集，加速了探针电子的传递速率。IL功能化后，IL-ZIF-8@GO/Au给出最高的伏安响应信号，这是由于IL的共价修饰不仅提高了纳米复合材料的表面积和活性位点，而且提高了材料的导电性和分散性，提高其电化学催化活性。
图3为对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和实施例1对应的Au、GO/Au、ZIF-8/Au、GO-ZIF-8/Au和IL-GR-ZIF-8/Au在5mmol L-1[Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol L-1KCl的PBS(pH＝7.4)缓冲液中的电化学阻抗结果。从图3中可以看出，由于GO的不导电性GO/Au给出了最大的阻抗结果。ZIF-8/Au和GO-ZIF-8/Au的阻抗都小于裸的Au，表明ZIF-8和GO-ZIF-8两种修饰材料都能促进探针分子上的电子转移速率。经过IL-GR-ZIF-8修饰后，其电化学阻抗进一步降低，表现出了最佳的电子传递能力，表明离子液体功能化的纳米复合物提高了修饰电极的导电性，加速了[Fe(CN)6]3-/4-探针的电子转移。
实施例5：
分别将不同浓度互补DNA滴加到对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和实施例1对应的固定有探针ssDNA的Au、GO/Au、ZIF-8/Au、GO-ZIF-8/Au和IL-GR-ZIF-8/Au表面，在35℃下孵育50min进行杂交，杂交后依次用pH为7.4的PBS和双蒸水对电极进行冲洗，去除为杂交的目标DNA，完成DNA分子在电极表面的杂交。
以固定有探针ssDNA的不同修饰金电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，[Fe(CN)6]3-/4-为指示剂，检测底液为5mmol L-1[Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol L-1KCl的PBS(pH＝7.4)缓冲液，在电化学工作站测试不同修饰电极的CV和DPV曲线，扫描电位为-0.4～0.8V，扫描速度为100mV/s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。
图4为实施例1对应的IL-GR-ZIF-8/Au(a)、固定探针ssDNA后(b)以及与目标DNA杂交后(c)在[Fe(CN)6]3-/4-和KCl的PBS中的CV结果。可以看出，相对于IL-GR-ZIF-8/Au(a)，固定探针ssDNA后(b)，其氧化还原峰电流有明显下降，主要原因是ssDNA表面带负电荷的磷酸根骨架排斥带负电荷的[Fe(CN)6]3-/4-探针到达电极表面，表明探针ssDNA已成功固定。与目标DNA杂交后(c)，峰电流进一步降低，这可归因于带负电荷的探针与杂交后带更多负电荷的磷酸盐骨架结合，所引起的静电排斥作用的增强，因而电化学响应更低。显然，这种峰电流变化与目标DNA的选择性结合可以作为DNA传感器的传感信号。
图5为实施例1对应的固定有探针ssDNA的IL-GR-ZIF-8/Au(a)、与非互补DNA杂交(b)、与三碱基错配DNA杂交(c)、与单碱基错配DNA杂交(d)和完全互补DNA杂交后(e)的DPV结果。由图可看出，当固定有探针ssDNA的IL-GR-ZIF-8/Au与单碱基错配的DNA杂交后(d)，其伏安响应和与完全互补DNA杂交后(e)的结果相比，其峰电流信号有所增强。与此类似，探针ss DNA与三碱基错配的DNA杂交后(c)，峰电流信号进一步增强。当与完全非互补DNA杂交后(b)，峰电流信号明显变大，但固定有ssDNA的IL-GR-ZIF-8/Au(a)给出了最大峰电流。这说明基于IL-GR-ZIF-8/Au的DNA传感器具有很高的选择性，可以区分出单碱基、三碱基错配和非互补DNA。
图6为不同浓度目标ssDNA与实施例1对应DNA传感器杂交后的DPV响应结果(a-k):0，1.0×10-16，1.0×10-15，1.0×10-14，1.0×10-13，1.0×10-12，1.0×10-11，1.0×10-10，1.0×10-9，1.0×10-8，1.0×10-7mol L-1，插图为Ipa与-lgC之间的线性关系图。由图看出，峰电流信号随着目标ssDNA浓度的减小而变大，这是因为不同浓度的目标ssDNA与探针ssDNA杂交形成dsDNA的量不同，对电子传递的阻碍作用也不同。信号越小表明在修饰电极表面形成越多的dsDNA。插图为氧化峰电流值(Ipa)与目标DNA浓度(C)对数的负值(-lgC)之间的线性关系图，目标DNA的浓度在10-7～10-16mol L-1范围之间，Ipa与-lgC有良好的线性关系：Ipa(μA)＝2.21lg(C/M)+1.49，(R2＝0.996)，其检测限为3.6×10-17mol L-1。表明本发明所得弧菌DNA传感器具有很高的灵敏度。
表1为本发明所述IL-GR-ZIF-8/Au的弧菌DNA传感器与其DNA传感器分析性能比较
从表1可看出，采用本发明所述的基于IL-GR-ZIF-8/Au的电化学DNA传感器与其它电化学DNA传感器相比，线性范围明显增大，检测限显著降低，说明IL-GR-ZIF-8纳米复合膜促进了电子转移，增加了探针DNA的固定量，降低了检出限。
Claims (4)
1.一种离子液体功能化石墨烯弧菌DNA电化学传感器，其特征在于所述弧菌DNA电化学传感器以金电极为基底电极，以离子液体功能化石墨烯-ZIF-8复合膜为电极修饰材料，探针ssDNA通过生物连接剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺共价键合的方式固定在修饰电极表面；所述离子液体功能化石墨烯-ZIF-8复合物是先在氧化石墨烯分散液中制备ZIF-8，然后再用氨基功能化离子液体对石墨烯-ZIF-8复合物进行共价修饰，制得离子液体功能化石墨烯-ZIF-8复合物；所述金电极记为Au；所述氧化石墨烯记为GO；所述石墨烯记为GR；所述离子液体功能化石墨烯-ZIF-8记为IL-GR-ZIF-8；所述离子液体为1-甲基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸盐，记为IL，其结构式如下：
离子液体功能化石墨烯弧菌DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：
(1)IL-GR-ZIF-8复合物的制备
先采用Hummer法制备GO，再将一定量所得GO分散于去离子水中，超声分散2h，得到浓度为0.5～1.0mg/mL的GO分散液；在25～60℃搅拌条件下将10mL浓度为90mg/mL的Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液缓慢匀速滴加到上述GO分散液中；在相同条件下将10mL浓度为900mg/mL的2-甲基咪唑甲醇溶液滴加至上述混合液中，搅拌15min，在相同温度下老化24h，离心收集灰白色沉淀，分别用水和甲醇依次洗涤3次，自然干燥后即得GO-ZIF-8复合物；称取40mg GO-ZIF-8复合物分散于去离子水中，使其浓度为1.0mg/mL，缓慢加入20mg IL和20mg KOH后超声处理30min；将超声后的分散液于50～100℃下加热搅拌24h，4000rpm离心5min，依次用去离子去和无水乙醇洗涤3次，干燥后即得IL-GR-ZIF-8复合物；
(2)IL-GR-ZIF-8修饰金电极的制备
金电极经0.05μm的A12O3抛光粉抛光后，用双蒸水冲洗干净，并在超声水浴中超声5min，用高纯氮气吹干；将步骤(1)中得到的IL-GR-ZIF-8复合物超声分散于去离子中，配制成浓度为3mg/mL的分散液，取0.5～50μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到IL-GR-ZIF-8修饰的金电极，记为IL-GR-ZIF-8/Au；
(3)DNA传感器的制备
将IL-GR-ZIF-8/Au浸入0.4mol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.1mol/LN-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中30min，使修饰电极表面羧基化；取1～100μL浓度为1×10- 6mol/L的探针ssDNA溶液滴涂于修饰电极表面，在25℃～70℃下孵育2h，依次用pH＝7.4的PBS和双蒸水对电极进行冲洗，除去未固定的探针ssDNA，室温自然干燥后得DNA传感器。
2.根据权利要求书1所述离子液体功能化石墨烯弧菌DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤(1)中制备GO-ZIF-8复合物的过程中，加热温度为35℃；所述IL-GR-ZIF-8复合物是在35℃条件下，IL在碱性介质中与GO-ZIF-8中GO分子上的环氧环反应制备而成的，其粒径范围约为100nm～1μm。
3.根据权利要求书1所述离子液体功能化石墨烯弧菌DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述抛光后的金电极，采用三电极系统检测，在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中，设置电压为-0.4～0.8V，对金电极进行循环伏安扫描，若氧化还原峰电位差在0～100mV内，则说明电极表面已处理好，否则重新处理，直至符合要求为止。
4.如权利要求1-3所述一种离子液体功能化石墨烯弧菌DNA电化学传感器用于弧菌的检测。
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