CN1061684C - 抗病型增效菌及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示一种抗病型增产菌及其培养方法，其特征在于SD23菌株为一种蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)，其保藏号为CGMCC No.0310。它的起始菌株为DM423，经分离、提纯、复壮、筛选以及一系列理化诱变和高浓度井岗霉素培养后分离得到。

Description

抗病型增效菌及其培养方法
本发明涉及一种微生物及其培养方法，具体涉及一种抗病型增效菌及其培养方法。
防治水稻纹枯病的生物抗菌素－井岗霉素延用至今，在我国已有二十多年，由于药剂的单一性使药效有所下降，甚至加大用量效果仍不理想。如何提高井岗霉素对水稻纹枯病的防治效果已成为科研的热点，开发新型制剂，使之达到比井岗霉素更好的防治和增产效果，已成为本领域中技术人员的攻关方向。
目前市场上出售的增产菌，是根据微生态学理论选育出的一种对作物生长有增产作用的微生物菌，增产菌对作物有明显的增产作用，但在防治水稻纹枯病的试验中，增产菌并未显示出防治效果。
本发明的目的在于提供一种抗病型增效菌SD23及其培养方法。
作为本发明的抗病型增产菌SD23，根据动植物细菌命名法为蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)，该菌株已于1997年6月25日送交北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No．0310。
本发明的上述目的是通过以下方式实现的：一种抗病型增产菌的培养方法，它包括以下培养步骤：首先将出发菌株DM423接于斜面培养基上，在30℃培养2～3天，其次将斜面培养基上的孢子冲洗下来，制成孢子悬浮液，最后将经过诱变处理或自然分离的孢子涂在培养皿的培养基上，在32℃下培养2～3天，挑选生长好的菌落，重复三次，得到目标菌株SD23。
本发明的抗病型增效菌SD23为蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)，已经在北京，中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCCNO．0310。
本发明的优点是明显的：
a．菌种安全性高
由于该产品的应用对象是农作物，对菌种的安全性理应有较高的要求，为确保本发明产品的高安全性，本发明选用了作为治疗婴幼儿腹泻的DM423菌株(芽孢杆菌)该菌株已通过动物安全试验、毒性试验、临床应用等，安全可靠性高。
b．对稻麦有增产作用
以DM423菌株作为出发菌株。通过对单子叶作物的亲和性选择试验和应用试验，优选出对水稻、麦子等单子叶作物增产作用明显的菌株作为本发明的生产用菌株。
c．兼有抗生素和抗病菌的双重效果：
本发明的菌株与生物抗生素井岗霉素配成复合制剂，既提高了防治效果。又增加了产量，使井岗霉素这个老产品焕发青春，为我国水稻生产发展、开发绿色食品和无公害农业以及替代化学农药或少用化学农药开辟了具有重要意义的途径。
本发明抗病型增产菌的培养方法，其优选的培养方案如下：
一、见图1
第一轮：
将出发菌株DM423用诱变剂进行处理，从中选出200个单孢子菌株，然后进行初筛，选出50株，再进行复筛选出5株。
第二轮：
将上述选出的5株菌株作为出发菌株，用5种诱变剂进行处理，每种处理筛选出40个菌株，然后经过初筛选出50株，再经复筛选出5株。
第三轮：
将上述第二轮最后得到的5株菌株再经5种诱变剂进行处理，每种处理筛选出40个菌株，然后经过初筛选出50株，再经复筛选出5株。
二、适应性菌株的培养：
1．选配了不同程度的耐药性培养基，
以井岗霉素浓度不同分别为：
1号    井岗霉素含量为    10000ppm
2号    井岗霉素含量为    20000pm
3号    井岗霉素含量为    30000ppm
4号    井岗霉素含量为    40000ppm
5号    井岗霉素含量为    5000ppm
2．找出菌株在井岗霉素不同浓度中的生长关系：
以相同含量的菌株稀释液同剂量置于以上培养基中培养观察分析生长情况，生长情况定量考查如下表：
培养基类号     平板培养菌落数
    1     22
    2     12
    3     5
    4     3
    5     2
注：平板培养菌落数为每次三只平板，三次重复后的单只平板菌落数。
3．采用阶梯浓度法筛选适应性菌种
应用微机分析技术将增产菌置于不同浓度的井岗霉素中，定向培养经过多世代强制性适应，采用理化诱变方法，终于获得适应性较强的抗病型增效菌变异菌种。
经过阶梯培养法筛选出的适应性菌株，在生产中显示了良好的效果。菌种在不同井岗霉素浓度培养基中的试验结果如下表：
培养基类号     平板培养菌落数
    1     26
    2     23
    3     21
    4     13
    5     8
以下将结合最佳具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例：1．出发菌株：原始菌株DM423(B．Cereus)培养基：斜面、平板培养基：
牛肉膏0．5％    蛋白胨1％    氯化钠0．5％
琼脂1．5-2．0％  pH7．0-7．5
0．105Mpa高压灭菌30分钟摇瓶培养基：豆粉4％  玉米粉2％  鱼粉0．4％
蛋白胨0．2％  酵母粉0．4％
磷酸二氢钾0．02％  硫酸镁0．02％  碳酸钙0．05％
pH7．2-7．5发酵温度32℃
摇床：振荡式
2．菌种选育流程：见图2
a．将出发菌株DM423接于斜面培养基上，在30℃培养2～3天。
b．将斜面上的孢子冲洗下来，制成孢子悬浮液。
c．经诱变处理或自然分离的孢子涂在培养皿的培养基上，在32℃培养2～3天，挑选菌落，然后在30℃～32℃下培养2～3天，再进行筛选，重复三次，得到目标菌株SD23。
d．将菌株制成砂土管或冷冻管或石蜡油管保藏。
3．选育方法
(1)自然分离：
a．菌种单孢子悬浮液制备：将天冬门葡萄糖斜面于28℃培养6-7天的菌种，用0．85％生理盐水，洗下孢子加玻璃珠，振荡数分钟，使孢子团打成单孢子，经过灭菌漏斗(内有棉花或纱布)过滤去除菌丝即成为单孢子悬浮液。
b．将上述悬浮液用生理盐水稀释成不同倍数，一般为102-108倍即可，以每一种稀释度取数滴于含有培养基(天冬素葡萄糖琼脂)的培养皿中，用无菌推棒涂抹置温箱中28℃或37℃培养、一般28℃约6天，37℃约3天左右即可挑选菌种再经以下(2)、(3)、(4)、(5)和／或(7)物理化学诱变后进行筛选。
(2)紫外线处理步骤
取上述5ml单孢子悬浮液于直径9cm的培养皿中在10-50瓦紫外灯下距离5-50cm避光照射0．5-5分钟稀释涂皿。
(3)紫外线氯化锂复合处理步骤：
经紫外线处理后的孢子悬浮液稀释在0．1-1％(重量)氯化锂的天冬素-葡萄糖培养基中25°-35℃培养5-10天。
(4)快中子处理步骤：
将上述制备好的单孢子悬浮液，放在静电加速器产生快中子的减速剂铍旁，处理剂量为20krad-6krad的处理0．1-2分钟，稀释涂皿。
(5)X光处理步骤：
将上述制备好的单孢子悬浮液置于X光照射机旁以2千、5千、1万-5万伦琴处理0．5-50秒钟后稀释涂皿。
(6)Co 60处理：
每支试管取上述单孢子悬浮液2ml分别放于γ射线中照射，分别用0．5-10万伦琴处理0．5-2秒钟，照射后稀释涂皿。
(7)高浓度井岗霉素培养基培养后自然分离步骤：
将上述筛选出的菌株制成孢子悬浮液在天冬素-葡萄糖培养基中加入井岗霉素，使井岗霉素浓度分别达2000-100000ppm(每隔1000ppm计50个处理)，在上述培养基中，于20-45℃温箱中培养3-10天后挑选出SD23菌株测定活性和耐药性。
经过上述培养方法得到的SD23菌株具有如下特性：
    菌号     SD23
菌落形态     型     圆型
表面 成白蜡状，低凸
边缘 较整齐，微波状
颜色     乳白
光学特征     不透明
个体形态 革兰氏染色     阳性
形状     杆状
排列 单、双或成链
大小 1.0-1.2×2.0-5.0μm
芽孢 形状 卵圆-圆柱形
位置 中生-次端生
膨大       -
聚β-羟基丁酸盐       +
    伴孢晶体       -
    运动性 运动很缓慢
    厌氧生长       +
    接触酶       +
    5％NaCl       +
    7％NaCl       +
pH5.7 斜面       +
液体       +
生长温度℃     50       -
    48       -
    45       +
    15       +
    10       -
    石蕊牛奶     胨化
酪素水解       +
淀粉水解       +
M.R.试验       +
V.P.反应       +
硝酸盐还原       +
柠檬酸盐利用       +
糖醇发酵产酸 阿拉伯糖       -
木糖       -
甘露醇       -
淀粉       +
麦芽糖       +
蔗糖       +
乳糖       -
葡萄糖       +
从葡萄糖产气       -
鉴定菌名     蜡状芽孢杆菌
应用效果：
将井岗霉素5．0×104μg／ml和本发明的抗病型增效菌SD23 20×104μg／ml 以下述比例混配，每亩施用200ml，试验对水稻纹枯病的防治效果：
比例                   对水稻纹枯病的防治效果(％)
井岗霉素：SD23
1∶1                               92．29
1∶2                               84．54
1∶3                               82．54
1∶4                               79．22
2∶1                               81．46
2∶3                               87．32
3∶1                               78．54
3∶2                               86．58
3∶4                               90．14
4∶1                               75．67
4∶3                               89．58
5∶1                               73．45
从应用效果可以看出，井岗霉素中加入本发明的SD23菌后，使用正常剂量防治效果对水稻纹枯病的防效增加了11．1-20％，另外，经大田试验结果证明，增产效果提高了6-10个百分点。
上述实施例仅为了说明的目的，本发明的保护范围将在权利要求书中体现。

Claims (2)

1．一种抗病型增产菌，其特征是一种SD23菌株为蜡状芽孢杆菌(BacillusCereus)，其保藏号为CGMCC No．0310。
2．一种抗病型增产菌的培养方法，其特征在于，它包括以下培养步骤：首先将出发菌株DM423接于斜面培养基上，在30℃培养2～3天，其次将斜面培养基上的孢子冲洗下来，制成孢子悬浮液，最后将经过诱变处理或自然分离的孢子涂在培养皿的培养基上，在32℃下培养2～3天，挑选生长好的菌落，重复三次，得到目标菌株SD23。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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