CN1159434C

CN1159434C - 施氏假单胞菌Zh9944和防治青枯病的微生物制剂

Info

Publication number: CN1159434C
Application number: CNB001190180A
Authority: CN
Inventors: 杨仲华; 张春明; 任炽麓; 安凤霞; 任敏; 张逸庆; 张华泉
Original assignee: CHANGZHOU LANLING PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: CHANGZHOU LANLING PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2000-10-11
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2004-07-28
Anticipated expiration: 2020-10-11
Also published as: CN1347981A

Abstract

本发明涉及一种细菌及以该细菌为主要成分的防治作物的青枯病的微生物制剂。所述的细菌为施氏假单胞菌Zh9944。所述的防治青枯病的微生物制剂，以施氏假单胞菌Zh9944为活性成分，以禾本科植物种皮粉或茎杆粉为载体，每克载体含有活菌数500亿CFU以上；含水量为8～15%。本发明的微生物制剂是一种高效、无毒、安全、无残留的新型微生物农药。对因青枯假单胞菌引起的烟草、番茄、花生、茄子、辣椒等植物的青枯病有很强的抑制作用，田间防效达60～80%左右。

Description

施氏假单胞菌Zh9944和防治青枯病的微生物制剂

技术领域

本发明涉及一种细菌和以该细菌为主要成分的防治作物如烟草、番茄等的青枯病的微生物制剂。

背景技术

由青枯病假单胞菌引起的青枯病发病于烟草、番茄、花生、茄子、辣椒等作物，迄今为止尚未发现有效的农药以及防治方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种施氏假单胞菌和以该细菌为主要成分的防治青枯病的微生物制剂。

实现本发明目的中的提供一种施氏假单胞菌的技术方案是：施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)Zh9944(以下简称为PSZh9944菌株)，已于2000年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为NO.0494。

上述施氏假单胞菌的分离筛选和菌株的获得方法是，采用平皿相互拮抗筛选模型与定向筛选相结合的方法，其技术路线为：(1)在烟草、番茄等青枯病发生地区的田块中采集发病株和健康株的根、茎和根围土；(2)从采集样品中分离菌株；(3)通过分离菌株间的平皿相互拮抗试验和分离菌株的致病性试验，区分出拮抗菌株和病原菌株两类；(4)以拮抗率、反拮抗率等生物学参数分析拮抗菌、病原菌和其他类之间相互关系以及在细菌分类上属假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)或芽孢杆菌(Bacillsspp.)选取拮抗菌株；(5)选出的拮抗菌株通过田间小区多点试验以田间防效不小于60％为基准挑选有效菌株。

实现本发明目的中的提供一种防治青枯病的微生物制剂的技术方案是：该微生物制剂为粉剂，以禾本科植物种皮粉、茎干粉为载体，以施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)Zh9944 CGMCC NO.0494为活性成分，每克载体含有活性菌数500亿CFU以上。

上述载体可以是砻糠粉、麸皮粉、稻杆粉、麦杆粉、高粱杆粉或玉米杆粉。

优选的载体是砻糠粉，砻糠粉的粒度以能通过20～60目筛为准，粉剂的颜色为褐色至土黄色。

上述载体含有活性菌数的优选范围是每克1000～6000亿CFU。

本发明具有积极的效果：(1)由于因青枯假单胞菌引起的青枯病日趋严重(包括感病程度、作物和地区的上升和扩展)，迄今为止无任何农药可治。本发明所提供的可以有效用于防治细菌性青枯病的细菌菌株以PSZh9944为主要成分制造出微生物农药，是一种高效、无毒、安全、无残留的新型微生物农药。(2)PSZh9944能在感病作物体内外拮抗青枯病原菌。该菌株具有在感病作物根际土壤中繁殖的能力，并向作物根部聚集和进入根组织内部，向上转移至茎。并且定植于根和茎的韧皮部薄壁细胞间，构成所谓“拮抗防线”，并与感病作物形成互生关系。PSZh9944对青枯假单胞菌拮抗能力的大小与向田间接种PSZh9944的菌量成对应关系。(3)本发明的微生物制剂对因青枯假单胞菌引起的烟草、番茄、花生、茄子、辣椒等植物的青枯病有很强的抑制作用，田间防效达60～80％左右。(4)本发明所述的PSZh9944为主的微生物制剂不仅对青枯假单胞菌引起的青枯病害有治疗作用，而且使受施作物具有对青枯病害的预防作用，还能刺激作物生长。(5)在制造所述的微生物制剂时，以纤维类物质、尤以砻糠粉为载体吸附较适宜，不能与其他杀菌剂混配或混合使用。

具体实施方式

本发明的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)Zh9944(以下简称为PSZh9944菌株)，于1999年3月自我国江苏省常州市郊区的番茄青枯病发生地区的采集样品中分离筛选而得，已于2000年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为NO.0494。

施氏假单胞菌Zh9944的分离筛选和菌株的获得方法：

采用平皿相互拮抗筛选模型与定向筛选相结合的方法，其技术路线为：(1)在烟草、番茄等青枯病发生地区的田块中采集发病株和健康株的根、茎和根围土；(2)从采集样品中分离菌株；(3)通过分离菌株间的平皿相互拮抗试验和分离菌株的致病性试验，区分出拮抗菌株和病原菌株两类；(4)以拮抗率、反拮抗率等生物学参数分析拮抗菌、病原菌和其他类之间相互关系以及在细菌分类上属假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)或芽孢杆菌(Bacills spp.)选取拮抗菌株；(5)选出的拮抗菌株通过田间小区多点试验以田间防效不小于60％为基准挑选有效菌株。

PSZh9944菌株具有下述性质：

1、形态特征

用光学显微镜及电子显微镜观察菌株。结果表明：菌株为单个杆状细胞，大小为0.8×1.5～3.8微米，革兰氏染色菌体为红色、呈阴性，不形成芽孢，以单生极毛运动，在营养琼脂上产生铜绿色水溶性色素，不产生荧光色素及脓青素。

在营养琼脂培养基上，菌落圆形，表面光滑，有光泽，边缘较整齐，浅灰蓝色，半透明，30℃培养48小时，菌落直径在0.5～2.0毫米左右。

2、菌株的生理生化特征

专性好氧，在厌氧条件下能进行反硝化作用，不需要生长因子，在细胞内不积储聚-β-羟基丁酸盐颗粒，水解明胶，不水解淀粉，在蔗糖培养基上不产生果聚糖。其它生理生化特征如下：

氧化酶 (+)；接触酶 (+)；

O/F测定为氧化型产酸； H2S (-)；

赖氨酸脱羧酶 (-)；精氨酸双水解酶 (-)；

M.R.反应 (-)；色氨酸脱氨酶 (-)；

吲哚试验 (+)； V.P.反应 (-)；

脲酶 (-)； 41℃生长 (+)；

精氨酸脱羧酶 (+)。

由于该菌株革兰氏试验呈阴性G(-)，直的杆状，以单生极毛运动，氧化酶(+)，O/F为氧化型，在厌氧条件下能进行反硝化作用，接触酶阳性，在细胞内不积累聚-β-羟基丁酸盐颗粒，不产生荧光色素，在41℃能生长等特征，可归为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。

菌株PSZh9944与施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)模式菌株比较存在相异如下：在培养特征上，生长物不粘连在培养物上，始终光滑，呈浅灰蓝色，在营养琼脂上产生铜绿色水溶性色素，在生理生化性质上，PSZh9944水解明胶，不水解淀粉，不能利用麦芽糖。

培养方法

可以用常规的微生物制剂发醇罐方法培养PSZh9944。所得的培养液以一定的比例与砻糠粉混合，物料含水量应降低在15％以内，约为8％～15％，即制得本发明所述的微生物制剂。培养方法为液体培养，将生产菌的菌悬浮液接种到培养基上，并进行通气搅拌。

对培养基的营养源并无特殊的规定，其中碳源为淀粉、葡萄糖，不宜用蔗糖。氮源可为胨、大豆粉、肉膏、玉米浆等，其它营养源，例如磷酸盐、硫酸镁等可适当添加。

对温度限定在29～31℃之间，pH值可保持在消后6.9～7.0，培养时间为20～24小时。发醇罐培养终止后，及时将培养液与砻糠以适合比例混合，并在干燥通风的条件下，使物料含水量为8％～15％以内，活菌量保持在每克500亿CFU以上。

如以上所得的微生物制剂具有下述物理与生物性质：

1、形状：褐色至土黄色粉末。

2、含活菌量：每克500亿活菌以上；以下毒性试验中含活菌量为每克3000亿活菌。

3、急性毒性分级：大鼠经口LD50＞4640mg/kg，大鼠经皮LD50＞2000mg/kg。按GB-15670-1995“农药登记毒理学试验方法”中农药急性毒性分级标准，属低毒类农药。

4、急性眼睛皮肤刺激分级：急性眼刺激积分指数为2(1小时)，急性皮肤刺激分值为0(1小时)。按GB-15670-1995“农药登记毒理学试验方法”中农药急性皮肤眼睛刺激分级标准，对眼睛、皮肤均无刺激性。

5、对鸟类、鱼类、蜜蜂、家蚕的毒性安全性评价：

对鸟类，用高于最高使用浓度一倍的溶液一次性剂量直接经口注入灌胃，经10天试验观察无死亡现象及其他中毒症状，说明鹌鹑对粉剂的耐受剂量LD₀＞100亿CFU/kg，因此，正常使用该生物制剂对鸟类是安全的。

对鱼类，斑马鱼在高于最高使用浓度一倍的溶液中，经一周试验观察，无死亡现象及其他中毒症状，斑马鱼对粉剂的最大耐受浓度LC₀＞300倍稀释液(10000亿CFU/升)。因此，正常使用该生物制剂对鱼类是安全的。

对蜜蜂，以田间常用量及两倍田间常用量的药液对蜜蜂进行胃杀毒性和触杀毒性试验，受试蜜蜂在试验观察期内均未出现中毒症状及死亡现象。该生物制剂对蜜蜂低毒，正常使用时对蜜蜂安全。

对家蚕，以田间常用量及两倍田间常用量的药液浸渍过的桑叶饲喂受试二龄起蚕，24小时后改喂未浸药桑叶，受试家蚕在24小时、48小时，至三龄起蚕的观察期内未出现中毒症状及死亡。继续观察至四龄起，生长正常。以上结果表明，该生物制剂对蚕低毒，正常使用对家蚕安全。

防治青枯病的微生物制剂制造例

以葡萄糖1.5％、淀粉2.0％、酵母粉1.5％、蛋白胨0.4％，MgSO₄为0.05％，KH₂PO₄为0.05％，CaCO₃为0.6％的比例制成培养基，灭菌前pH值为7.2～7.4，在250毫升三角瓶放置70毫升培养基，将PSZh9944接种于该培养基中。在30℃、220r.p.m下振荡培养48小时作为种子液，取1000ml种子液于1吨发醇罐中，内盛600升的上述相同比例的培养基。在30℃，向发酵罐通风、搅拌培养20～24小时。培养终止后，及时将培养液与粒度为过40目筛的砻糠以1∶1～1∶3的比例混合，通风干燥至物料含水量为8～15％，活菌量达1000～6000亿CFU/g，色泽为土黄色至褐色。

试验和应用例

根据细菌性青枯病的发病原理，对于此类病害的控制，能被普遍接受的方法只能用以生物防治为主的预防方法，以此达到阻止青枯病菌侵入植物根内潜伏和发展成为病害。因此，使用本发明的生物制剂的时机应在播种、假植、定植和定植后的20～60天，总共4～5次，总用量为2～2.5kg(3000亿CFU/g)，在使用时以水为“溶剂”、使菌体释放出来，防效可达60～80％。具体的试验例见表1、应用例见表2。

表1

试验编号	作物名称	试验地点	试验年份	供试面积(亩)	处理方法	处理		对照		防效％
						处理		对照			病株率％	病情指数	病株率％	病情指数
						1	番茄	江苏常州	2000		病株率％	病情指数	病株率％	病情指数	1.0	浸种+苗床泼浇，共一次。150g/亩	10.13	10.13	14.96	16.51	38.6
2	番茄	江苏常州	2000	1.0	浸种+苗床泼浇，假植浇根，共两次。1.1kg/亩。	1	番茄	江苏常州	2000	40		64		37.5	1.0	浸种+苗床泼浇，共一次。150g/亩	10.13	10.13	14.96	16.51	38.6
2	番茄	江苏常州	2000	1.0	浸种+苗床泼浇，假植浇根，共两次。1.1kg/亩。	3	番茄	江苏常州	2000	40		64		37.5	1.0	浸种+苗床泼浇，假植浇根，定植浇根，共三次。1.5kg/亩	40.0		87.0		54.0
4	番茄	江西南昌	1999	7.3	浸种+苗床泼浇，假植浇根，定植浇根，定植后浇根，共四次。2kg/亩	3	番茄	江苏常州	2000	8.7	4.8	33	19.7	75.6	1.0	浸种+苗床泼浇，假植浇根，定植浇根，共三次。1.5kg/亩	40.0		87.0		54.0

表2

试验编号	作物名称	试验地点	试验年份	供试面积(亩)	处理方法	处理		对照		防效％
						处理		对照			病株率％	病情指数	病株率％	病情指数
						1	番茄	江苏常州	1999		病株率％	病情指数	病株率％	病情指数	20	浸种+苗床泼浇，假植浇根，定植浇根，定植后浇根，共四次。2kg/亩.	4.2		40.7		89.7
2	番茄	江西南昌	2000	50	同上	1	番茄	江苏常州	1999	18.1		89.2		79.4	20	浸种+苗床泼浇，假植浇根，定植浇根，定植后浇根，共四次。2kg/亩.	4.2		40.7		89.7
2	番茄	江西南昌	2000	50	同上	3	烟草	湖南郴州	1999	18.1		89.2		79.4	10	同上	44.67	22.57	77.28	51.01	55.05

Claims

1、一种施氏假单胞菌，其特征在于：施氏假单胞菌Zh9944，已于2000年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为NO.0494。

2、一种防治青枯病的微生物制剂，该微生物制剂为粉剂，其特征在于：以禾本科植物种皮粉、茎杆粉为载体，以施氏假单胞菌Zh9944 CGMCC NO.0494为活性成分，每克载体含有活性菌数500亿CFU以上，含水量为8～15％。

3、根据权利要求2所述的防治青枯病的微生物制剂，其特征在于：载体是砻糠粉、麸皮粉、稻草粉、麦杆粉、高粱杆粉或玉米杆粉。

4、根据权利要求3所述的防治青枯病的微生物制剂，其特征在于：载体是砻糠粉，砻糠粉的粒度以能通过20～60目筛为准，粉剂的颜色为褐色至土黄色。

5、根据权利要求2至4之一所述的防治青枯病的微生物制剂，其特征在于：每克载体含有活性菌数1000～6000亿CFU。