CN106167813A - 一种利用有机废物生产聚果糖的固体发酵方法及其应用 - Google Patents

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韦兰和
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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种利用有机废物生产聚果糖的固体发酵方法及其应用。具体是将胶冻样类芽孢杆菌PS04的菌液与有机废物混合培养4～5d得有机废物‑PS04培养物，从有机废物‑PS04培养物中提取即获得聚果糖；所述有机废物中蔗糖的含量为2.5～5.1wt%；水含量为55～63.3 wt%；本发明所述方法克服了液体发酵产聚果糖提取成本高，难以满足禽畜饲料生产需要的缺陷，同时，利用本发明所述方法生产培养物可直接与饲料混合，可以大大降低聚果糖提取和干燥需要的能源消耗，生产成本低，能带来良好的经济效益。

Description

一种利用有机废物生产聚果糖的固体发酵方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，更具体地，涉及一种利用有机废物生产聚果糖的固体发酵方法及其应用。
背景技术
聚果糖是果糖分子以β-1，2糖苷键或β-2，6糖苷键连接的多糖，人们将果糖单元数大于20的称为多聚果糖，小于20的称为低聚果糖。聚果糖是一种优良的水溶性膳食纤维，可以预防便秘与结肠癌、降低血液胆固醇、稳定血糖水平。同时还是一种很好的“益生元”，具有调节肠道菌群、增殖双歧杆菌、促进钙的吸收、促进免疫调节、抗龋齿等保健功能，可减少肝脏毒素，能在肠中生成抗癌的有机酸，有显著的防癌功能；另外，聚果糖不仅是动物的免疫增强剂，也可以诱导植物产生抗性，增强植物体对病害的抵抗力，是一种安全而新型的饲料添加剂。
果寡糖又称低聚果糖（Fructo-oligosaccharides，FOS），是一种天然的饲料添加剂，果寡糖具有非着色性、赋形性、耐碱性、耐高温、保水性和稳定性等优点，果寡糖吸湿性低，可减缓饲料因吸湿而发霉变酸；同时果寡糖的防霉性能好，可以延长饲料保存期。作为添加剂应用于饲料中主要是寡果三糖（GF2）、寡果四糖（GF3）和寡果五糖（GF4）。果寡糖广泛存在于香蕉、大麦、大蒜、洋葱、黑麦、马铃薯、洋姜、小麦、出小麦等植物小，但提取较为困难，且难以批量生产，果寡糖在工业生产上有两种制造方法，一种是用菊粉含量高的菊芋作为原料，用热水抽提菊粉，经微生物菊粉酶部分水解生成果糖聚合度为2～10的链状聚果糖；第二种是用蔗糖作为原料制造的，在一定浓度的蔗糖培养基中，利用微生物产生的β-呋喃果糖苷酶作用，将蔗糖转化为聚果糖；但这两种方法都必须依赖于外源酶的作用，由于生物酶自身的特点，制约了低聚果糖的生产效率和聚合度。另一方面，目前用于生产低聚果糖的菊粉酶和β-呋喃果糖苷酶来源有限，生产成本高，转化效率低，生产时间长，因而开发研究新型聚果糖生产工艺具有明显的现实意义和经济价值。
胶冻样类芽孢杆菌PS04可以产生聚果糖，现有技术研究了PS04在液体培养基中培养产生聚果糖的方法，但液体发酵后聚果糖的提取过程成本较高，很难满足禽畜饲料的生产需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种利用有机废物生产聚果糖的固体发酵方法及其应用。
一种利用有机废物生产聚果糖的固体发酵方法，是将胶冻样类芽孢杆菌PS04的菌液与有机废物混合培养4～5d得有机废物-PS04培养物，从有机废物-PS04培养物中提取即获得聚果糖；所述有机废物中蔗糖的含量为2.5～5.1wt%；水含量为55～63.3 wt %。
在利用胶冻样类芽孢杆菌PS04进行固体发酵时，发现对其固体发酵生产聚果糖产量影响显著的因素包括固体培养基中蔗糖的含量、水含量和发酵的时间，本发明利用有机废物发酵时，必须同时控制这三个因素。
另外，研究还发现，胶冻样类芽孢杆菌PS04的接种量也会影响最终聚果糖的产量，但影响没有上面几个因素显著，优选地，所述胶冻样类芽孢杆菌PS04的接种量为1～10 V/W%。
具体地，本发明所述有机废物为木薯渣或者麸皮。
更优选地，当所述有机废物为木薯渣时，是将胶冻样类芽孢杆菌PS04的菌液与木薯渣混合培养4d得有机废物-PS04培养物，从有机废物-PS04培养物中提取即获得聚果糖；所述有机废物中蔗糖的含量为5.06wt%；水含量为63.3 wt %。
更优选地，当所述有机废物为麸皮时，是将胶冻样类芽孢杆菌PS04的菌液与麸皮混合培养5d得有机废物-PS04培养物，从有机废物-PS04培养物中提取即获得聚果糖；所述有机废物中蔗糖的含量为2.5wt%；水含量为55 wt %。
本发明通过固体发酵培养后获得的有机废物-PS04培养物可直接与饲料混合，从而满足禽畜饲料生产的需要。
因此，本发明还提供所述有机废物-PS04培养物作为饲料添加剂的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过胶冻样类芽孢杆菌PS04在木薯渣培养基中的培养获得聚果糖，具体是将胶冻样类芽孢杆菌PS04的菌液与有机废物混合培养4～5d得有机废物-PS04培养物，从有机废物-PS04培养物中提取即获得聚果糖；所述有机废物中蔗糖的含量为2.5～5.1wt%；水含量为55～63.3 wt %；本发明所述方法克服了液体发酵产聚果糖提取成本高，难以满足禽畜饲料生产需要的缺陷，同时，利用本发明所述方法生产的聚果糖含量高，发酵完的培养物可直接与饲料混合，可以大大降低聚果糖提取和干燥需要的能源消耗，生产成本低，能带来良好的经济效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属 于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
查氏培养基：硝酸钠 3g，磷酸氢二钠 1g，硫酸镁( MgSO4·7H2O) 0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁 0.01g，蔗糖 30g，蒸馏水 1000mL；用于PS04的液体培养。
麸皮培养基：称取麸皮25g，按麸皮：蒸馏水=1：1（W/W）的比例配制麸皮培养基，搅拌混合均匀后，装于500mL锥形瓶中，高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）。作为实施例1的固体培养基用于发酵。
木薯渣培养基：木薯渣25g、自来水50ml，混合均匀后装入500ml三角瓶内，用棉塞塞好包扎好，灭菌后备用，作为实施例2的固体培养基用于发酵。
实施例1 以麸皮为固体培养基发酵生产聚果糖
1、PS04液体培养：查氏培养基按100mL/500mL锥形瓶分装，高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）后备用。刮取新鲜的菌苔1～2 环接种在500mL锥形瓶中，30 ℃、150 r/min，振荡培养84 h后制得PS04液体菌种。
2、PS04固体培养：在灭菌冷却后的麸皮培养基中，按5%（V/W）的接种量接种PS04液体菌种，接种后搅拌，使菌种和麸皮培养基充分混匀，置于30℃培养箱中静置培养84h，期间不定时震荡翻动3～4次。
制作麸皮培养基，接种后，分别准确称取发酵前和发酵后的麸皮各l0g（无菌操作）作为待测样品，用于测定发酵前和发酵后麸皮中所含菌种量，结果表明：培养前后菌种的量明显增加，说明PS04菌能在麸皮培养基中生长，能以麸皮作为固体培养基（表1）。
3、PS04固体培养基单因素优化
多糖提取及产量的测定：将发酵完的固体培养基加入150mL的蒸馏水搅拌均匀，于100℃的水浴锅中水浴浸提1h，待其冷却后过滤，取滤液，15000 r/min离心30 min（4℃）。量取30mL上清液于离心瓶中，加入9倍体积的 95%乙醇，混合均匀后4℃下静置沉淀多糖30min，15000 r/min离心15 min（4℃），除上清液。将沉淀用镊子轻轻夹起放入准备好的滤纸上（已烘干称质量，记为W1）中，105 ℃烘至恒重，冷却后称质量（记为W2），多糖质量=W2-W1。
（1）蔗糖含量对PS04多糖产量的影响
往麸皮培养基中添加蔗糖，添加量分别为1%，2%，3%，4%，6%，8%，10%（W/W），固体培养84h后结果如表2。
试验结果表明：当蔗糖添加量为2%（W/W）时，麸皮培养基中的多糖含量达到最大值99.12mg/g，之后随着蔗糖添加量的增加，多糖含量呈下降趋势。原因是当蔗糖添加量太低时碳源不够，无法满足细菌的生长，而随着蔗糖添加量的升高，细菌处于较高的渗透压条件下，抑制了细菌的生长。
（2）含水量对PS04多糖产量的影响
往麸皮培养基中添加2%（W/W）蔗糖，调节含培养基水量分别为30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%（W/W），固体培养84h后结果如表3。
试验结果表明，随着含水量的增加，麸皮培养基中的多糖含量相应增加，当含水量为50% （W/W）时，多糖含量达到最大95.2 mg/g，随后含水量继续增大，多糖合成量呈下降趋势。随着含水量的提高，微生物生长所需要的水分增加，有利于微生物的生长；而当含水量高于最适含水量，麸皮的黏度增加，导致培养基中的氧含量下降，进而抑制菌体的生长。
（3）培养时间对PS04多糖产量的影响
往麸皮培养基中添加2%（W/W）蔗糖，调节培养时间分别为0d ，2d，3d，4d，5d，6d，7d；固体培养后结果如表4。
试验结果表明：随着发酵天数的增加，多糖产量增大，在发酵0～3d时，多糖产率增加较平缓，发酵天数为5d时，多糖产量达到最多，为0.08240g/g，之后随着发酵天数增加多糖产量反而呈减少趋势。随着发酵天数的增加，培养基中的碳源被消耗完，菌种会使用次生代谢产物多糖（聚果糖）作为碳源而消耗掉部分聚果糖，导致多糖含量减少。
（）接种量对PS04多糖产量的影响
往麸皮培养基中添加2%（W/W）蔗糖，分别以接种量为1%，3%，5%，7%，10%（V/W）进行接种，固体培养84h后结果如表5。
试验结果表明：1%～10%的接种量对菌体生长多糖产量的影响没有表现出较大的差异，说明接种量对菌株产生胞外多糖有影响。
4、PS04固体培养的正交试验
以优化得到的含水量、蔗糖含量和发酵天数进行3因素3水平的正交试验。采用L9(34)正交表（见表6）确定各组分的最佳配比。
按表7的正交表的方法进行正交试验，测定结果如表8，由此可见：发酵天数是影响PS04 菌株产生多糖的最主要的因素，含水量次之，蔗糖添加量对其影响最小。综合这3个因素不同水平对发酵的影响，确定最适合该菌株发酵产生多糖的麸皮培养基各组分为含水量55%（W/W），蔗糖含量2.5%（W/W），发酵天数为5d。
通过单因素试验和正交试验相结合，初步得到，菌株PS04在以麸皮为固体培养基产生的胞外多糖发酵过程中，接种量对发酵产生多糖影响不大，发酵的最适培养条件为：固体培养几种含水量为55%（W/W），蔗糖含量为2.5%（W/W），发酵天数为5d。其中发酵天数对多糖发酵影响最大，含水量次之，蔗糖含量影响最小。
实施例2 以木薯渣为固体培养基发酵生产聚果糖
1、PS04的活化：从PS04试管斜面上挑取少许菌苔，接种到已经灭菌的液体查氏培养基中，于30℃活化培养，转速180r/min的摇床上培养84 h。
2、PS04的种子培养：按接种量1%（V/V）吸取活化后的PS04菌液，接种到装有查氏培养基的三角瓶中（控制装液系数（装液体积与容积体积之比）为0.4），于温度30℃，转速180r/min的恒温摇床中培养84 h，即为PS04种子液。
3、PS04的木薯渣培养：定量吸取PS04的种子液，接种到灭菌的木薯渣培养基中（同一批次接种均为同一批次培养的菌液，无特别说明均为3mL），搅拌混合均匀后置于28℃的恒温培养箱中培养；培养时间一般为3～4天。
4、聚果糖的提取：定量称取木薯渣-PS04培养物置于500mL烧杯中，加入250mL或200mL热水，于90℃恒温水浴下提取1.5h,期间用玻璃棒边搅拌。趁热过滤，取其中滤液30mL，加入9倍体积的医用乙醇，搅拌均匀后，静置至少2h，沉淀聚果糖。然后于9000r/min条件下，离心15min，沉淀即为聚果糖。该沉淀为灰白色的，外表性状与聚果糖一致。
5、聚果糖的测定
把沉淀物连带滤纸放入烘干机烘烤5h，直到聚果糖完全干燥。再对其称量，每个实验流程方案的最终产物为3个重复的平均值，聚果糖净产量为每30mL滤液的产物平均值，总产量为每25g木薯渣发酵后得到的聚果糖的量，产率为每克木薯渣得到的聚果糖的量。
6、PS04生物量的测定（稀释平板计数法）
没有经过培养的木薯渣培养基，直接对PS04菌倒平板培养的培养基都以A来代表，A的单菌落数量即为起始生物量；木薯渣培养基经过72h培养，再对PS04菌倒平板培养的培养基都以B表示，B的单菌落数量为培养后的生物量。
7、PS04固体培养基单因素优化
（1）蔗糖含量对PS04多糖产量的影响
在配制好的木薯渣培养基中，分别添加蔗糖0g、1.4g、2.8g、3.5g、4.2g、4.9g、5.6g、7g；其终浓度分别为0%、2%、3.8%、4.8%、5.7%、6.5%、7.4%、9.1%。灭菌后，无菌操作下接PS04种子菌液。其中蔗糖添加为0g的不接种。接种后置于28℃培养箱倒置培养，72h后，测定其聚果糖含量。
注：聚果糖净产量为每30mL滤液的产物平均值，总产量为每25g木薯渣发酵后得到的聚果糖的量，产率为每克木薯渣得到的聚果糖的量。
由表9看出当培养基中蔗糖添加量和接种量为0时，聚果糖产物为0，说明用此法结果并没有受到木薯渣培养基中其他成分的影响，PS04对在该培养基的蔗糖有果糖基转移酶作用。当蔗糖浓度4.8%（3.5g）时，聚果糖产率为0.2206最高。
（2）含水量对PS04多糖产量的影响
往木薯渣培养基中添加蔗糖3.5g，并分别添加0ml、28.5ml、35ml、43ml、50ml、57ml、63ml、71ml水，使得木薯渣培养基的含水量分别为0%、50%、55.1%、60.1%、63.7%、66.7%、68.9%、71.4%。灭菌后，无菌操作下接PS04种子菌液。其中水添加为0的不接种。接种后置于28℃培养箱倒置培养，72h后测定其聚果糖含量。
由表10看出当培养基的含水量为零蔗糖添加量并不为零时，聚果糖产物也为零，说明经过热水浸提和乙醇离心沉淀后产物中排除了蔗糖，验证产物为聚果糖。当含水量为63.7%，即培养基组成为木薯渣25g+蔗糖3.5g+水50mL时，聚果糖产率0.4357最高。
木薯渣培养基的含水量也是PS04菌株能否正常生长和积累代谢物的重要因素之一。如果培养基含水量过少，则会导致菌株生长延缓，减弱了果糖基转移酶作用，从而降低了产量。而培养基含水量过多，则培养基在高压灭菌过程中，木薯渣容易出现黏糊状，降低了培养基内部的透气性，使其缺少氧气，不利于菌株进一步生长，进而影响到产量。通过对木薯渣培养基不同含水量的比较试验，得出适合PS04菌的含水量，进而可以提高聚果糖的产量和品质。
（3）发酵时间对PS04多糖产量的影响
25g木薯渣中，蔗糖添加量为3.5g，水添加量为50ml。灭菌后，无菌操作下接PS04种子菌液。接种后置于28℃培养箱倒置培养，分别于46h、69h、93h、120h、148h取样，每个时间段取样2个，提取聚果糖，测定其聚果糖含量。
从表11看出，PS04菌在木薯渣培养基中对蔗糖起果糖基转移酶作用积累聚果糖的适宜培养时间为69h，产率最高为0.4589。
8、PS04固体培养的正交试验
根据实验实际情况，拟定影响木薯渣培养基得出产物的3个主要因素，即A（蔗糖含量）、B（水添加量）、C（培养时间）为优选因素。每个因素选3个水平进行L9(34)正交试验，以聚果糖产量为评价指标。实验因素水平设计见表12。
注：A为蔗糖含量g，B为水的含量mL，C为培养天数d，D为温度，实际温度都为28℃。
由于RC>RB>RA，因此影响PS04菌在木薯渣培养基积累聚果糖的3个主要因素的主次顺序为C>B>A。再由3个主要因素的K1、K2、K3最大值，可以得出最佳工艺为C3B2A3，再结合实验因素水平表L9(34)，得出PS04积累聚果糖的最佳木薯渣培养基为：25g木薯渣培养基中，蔗糖含量4g，水的含量50ml，培养时间为4天。木薯渣、蔗糖、水含量占总重的百分比分别为：31.65%、5.06%、63.29%。

Claims (7)

1.一种利用有机废物生产聚果糖的固体发酵方法，其特征在于，将胶冻样类芽孢杆菌PS04的菌液与有机废物混合培养4～5d得有机废物-PS04培养物，从有机废物-PS04培养物中提取即获得聚果糖；所述有机废物中蔗糖的含量为2.5～5.1wt%；水含量为55～63.3wt%。
2. 根据权利要求1所述的利用有机废物生产聚果糖的固体发酵方法，其特征在于，所述胶冻样类芽孢杆菌PS04的接种量为1～10 V/W %。
3.根据权利要求1所述的利用有机废物生产聚果糖的固体发酵方法，其特征在于，所述有机废物为木薯渣或者麸皮。
4. 根据权利要求3所述的利用有机废物生产聚果糖的固体发酵方法，其特征在于，当所述有机废物为木薯渣时，是将胶冻样类芽孢杆菌PS04的菌液与木薯渣混合培养4d得有机废物-PS04培养物，从有机废物-PS04培养物中提取即获得聚果糖；所述有机废物中蔗糖的含量为5.06wt%；水含量为63.3 wt %。
5. 根据权利要求3所述的利用有机废物生产聚果糖的固体发酵方法，其特征在于，当所述有机废物为麸皮时，是将胶冻样类芽孢杆菌PS04的菌液与麸皮混合培养5d得有机废物-PS04培养物，从有机废物-PS04培养物中提取即获得聚果糖；所述有机废物中蔗糖的含量为2.5wt%；水含量为55 wt %。
6.权利要求1至5任一项所述方法获得的有机废物-PS04培养物。
7.权利要求6所述有机废物-PS04培养物作为饲料添加剂的应用。
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