CN106148525A - 肺癌中的ros激酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了鉴定哺乳动物中具有ROS激酶活性的多肽的存在的方法。在一些实施方案中，具有ROS激酶活性的多肽是编码ROS的多核苷酸和编码第二(非‑ROS)多肽的多核苷酸之间融合的结果。描述了ROS的三种不同的融合伴侣，即由FIG基因、SLC34A2基因、和CD74基因编码的蛋白。本发明实现了用于确定生物样品中具有ROS激酶活性的多肽的存在的新方法、用于筛选抑制蛋白的化合物的方法、和用于抑制癌症(例如，肺癌)进展的方法。

Description

肺癌中的ROS激酶
本申请是以下申请的分案申请：申请日：2012年5月23日；申请号：2012800361189；发明名称：同上。
技术领域
本发明总体涉及参与肺癌的蛋白质和基因(例如，人肺癌)，以及肺癌的检测、诊断和治疗。
背景技术
许多癌症的特征在于导致细胞过程(包括生长和增殖)的控制异常的细胞信号传递途径的破坏。这些破坏经常是由于特定的信号传递蛋白诸如激酶的活性改变引起的。
蛋白激酶蛋白的异常表达可以是癌症的病原因素(和驱动因素)。异常表达可以由蛋白(或其激酶部分)与第二种蛋白(或其部分)的融合、蛋白的截短部分的表达或者由全长蛋白的表达的异常调节所引起。
已知导致产生具有异常信号传递活性的激酶融合蛋白的基因易位可以直接导致某些癌症 (参见例如， Mitelman等人，Nature Reviews Cancer 7: 233–245, 2007,Futreal等人，Nat Rev Cancer 4(3): 177–183 (2004), 和Falini等人，Blood 99(2): 409-426 (2002)。例如，BCR-ABL癌蛋白，一种酪氨酸激酶融合蛋白，是病原因素且驱动人慢性髓性白血病(CML)。在至少90-95％的CML病例中发现的BCR-ABL癌蛋白是通过9号染色体上的c-ABL蛋白酪氨酸激酶的基因序列易位到22号染色体上的BCR序列上产生的，产生所谓的Philadelphia染色体。参见例如Kurzock等人，N. Engl. J. Med. 319: 990-998(1988)。在急性淋巴性白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)病例中也能发现易位。这些发现促使FDA批准甲磺酸伊马替尼(由Novartis以商标Gleevec®销售)和dasatinig(由Bristol-Mysers Squibb以商标Sprycel®销售)(ABL激酶的小分子抑制剂)用于治疗CML和ALL。这些药物是设计用来对驱动肿瘤细胞生长的信号传递通路进行干扰的药物实例。这些药物的开发相对于CML和ALL的常规疗法(化疗和放射)而言代表一种显著的进步，其中常规疗法受到众所周知的副作用的烦扰并且经常具有有限的效果，因为它们不能特异性地靶向癌症的根本原因。
因此，鉴定驱动癌症的蛋白以便在癌症更可能对治疗响应的早期检测癌症将是有用的。额外地，此类蛋白的鉴定将尤其期望产生新方法来选择用于靶向治疗的患者，以及用于筛选和开发能抑制此类蛋白且因此治疗癌症的新药物。
受体酪氨酸激酶(RTKs)的致癌作用已牵涉在许多类型的实体瘤(包括肺癌)中。肺癌(其具有几种亚型，包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)是全世界男性和女性中由癌症导致的死亡的最常见原因。根据美国国家癌症研究所的数据，在美国每14名男性和女性中接近一名将在其人生的某个点被诊断出肺癌。肺癌的两种特别致命的形式是小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌。
不幸的是，肺癌经常无法在早期被诊断，并且它经常完全不能对手术响应，甚至当与化疗或放疗组合时。例如，在美国，NSCLC是癌症死亡的主要原因，并且占所有肺癌的约87％。在美国每年有约151,000个NSCLC新病例，并且据估计仅在美国每年超过120,000位患者将死于该疾病。参见“Cancer Facts and Figures 2005,” American Cancer Society。包括三种不同亚型的NSCLC经常仅在它已经转移以后被检测到，因此在诊断的两年内死亡率是75％。
因此，发现在早期鉴定肺癌的新方法和治疗肺癌的新方法(和新试剂)将是有用的。
发明内容
本发明基于发现癌症、特别是肺癌中异常ROS表达和/或活性。哺乳动物肺癌中ROS的异常表达可能是由于，例如，哺乳动物肺癌中全长ROS激酶的表达，因为健康、正常肺组织和细胞不表达ROS激酶蛋白或ROS激酶活性。哺乳动物肺癌中ROS的异常表达也可能是由于截短ROS(例如，包含ROS激酶的一部分，包括激酶结构域)或本文公开的ROS融合蛋白之一的存在。肺癌中所有公开的ROS的表达导致ROS激酶结构域的表达；因此，所有公开的ROS融合多肽具有活性ROS激酶活性。
因此，在第一个方面，本发明提供了用于检测生物样品中具有ROS激酶活性的多肽的存在的方法，所述生物样品来自哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌。该方法包括以下步骤：获得来自哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌的生物样品；并且利用至少一种特异性结合具有ROS激酶活性的所述多肽的试剂来确定所述多肽是否在所述生物样品中存在，其中所述试剂与所述生物样品的特异性结合的检测表明所述生物样品中存在所述多肽。
在另一个实施方案中，所述试剂是抗体。在一些实施方案中，所述试剂(例如抗体)是可检测地标记的。在另一个实施方案中，所述试剂特异性结合全长ROS多肽。在另一个实施方案中，所述试剂特异性结合ROS激酶结构域。在另一个实施方案中，所述试剂特异性结合ROS融合多肽(例如，特异性结合CD74-ROS融合多肽、SLC34A2-ROS(S)多肽、SLC34A2-ROS(L)多肽、SLC34A2-ROS(VS)多肽、FIG-ROS (L)多肽、FIG-ROS(S) 多肽、或FIG-ROS(VL)多肽。
在本发明方法的各个实施方案中，具有ROS激酶活性的多肽是全长ROS多肽。在另一个实施方案中，所述多肽是ROS融合多肽。在另一个实施方案中，所述ROS融合多肽选自CD74-ROS融合多肽、SLC34A2-ROS(S)多肽、SLC34A2-ROS(L)多肽、SLC34A2-ROS(VS)多肽、FIG-ROS (L)多肽、FIG-ROS(S) 多肽、和FIG-ROS(VL)多肽。在各个实施方案中，具有ROS激酶活性的多肽包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 56、SEQ IDNO: 60、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 22的氨基酸序列。
在一些实施方案中，以选自流式细胞术测定、体外激酶测定、免疫组织化学(IHC)测定、免疫荧光(IF)测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)和Western印迹分析测定的形式实施所述方法。
在一个实施方案中，检测到所述多肽的激酶活性。在另一个实施方案中，所述试剂是重同位素标记(AQUA)肽。在另一个实施方案中，所述重同位素标记(AQUA)肽包含含有ROS融合多肽的融合连接的氨基酸序列。在另一个实施方案中，使用质谱分析法实施所述方法。
在另一个方面，本发明提供了用于检测编码生物样品中具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的存在的方法，所述生物样品来自哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌。该方法包括以下步骤：(a)获得来自哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌的生物样品并且(b)利用特异性结合编码具有ROS激酶活性的所述多肽的所述多核苷酸的试剂来确定所述多核苷酸是否在所述生物样品中存在，其中所述试剂与所述生物样品的特异性结合的检测表明所述生物样品中存在编码具有ROS激酶活性的所述多肽的所述多核苷酸。
在一些实施方案中，多核苷酸包含选自SEQ ID NO:2、6、8、23、29、55、57和59的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述试剂是核酸探针。在一些实施方案中，所述试剂是可检测地标记的。在另一个实施方案中，核酸探针是荧光原位杂交(FISH)探针且用FISH测定实施所述方法。在另一个实施方案中，核酸探针是聚合酶链式反应(PCR)探针且用PCR测定实施所述方法。在进一步的实施方案中，所述试剂是可检测地标记的。
在本发明方法的各个实施方案中，具有ROS激酶活性的多肽是全长ROS多肽。在另一个实施方案中，多肽是ROS融合多肽。在另一个实施方案中，所述ROS融合多肽选自CD74-ROS融合多肽、SLC34A2-ROS(S)多肽、SLC34A2-ROS(L)多肽、SLC34A2-ROS(VS)多肽、FIG-ROS(L)多肽、FIG-ROS(S)多肽、和FIG-ROS(VL)多肽。在各个实施方案中，具有ROS激酶活性的多肽包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 22的氨基酸序列。
在本发明方法的各个实施方案中，肺癌是人肺癌(例如，非小细胞肺癌或小细胞肺癌)。在进一步的实施方案中，生物样品选自肺活检样品、支气管肺泡灌洗物、肿瘤切除样品、细针穿刺物、胸膜渗出液和循环肿瘤细胞。
在本发明方法的各个实施方案中，哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌是非小细胞肺癌。在各个实施方案中，哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌来自人。
在本发明方法的各个实施方案中，生物样品被诊断为来自由ROS激酶活性驱动的哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌。在一些实施方案中，哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌可能对ROS抑制性治疗剂响应。在各个实施方案中，由其获得所述生物样品(其中所述试剂特异性结合所述生物样品)的患者被诊断为患有由ROS激酶活性驱动的哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌。在一些实施方案中，患者被诊断为可能对ROS抑制性治疗剂响应。ROS抑制性治疗剂的一个非限制性实例为克里唑替尼(也称为PF-02341066)。ROS抑制性治疗剂的额外的非限制性实例包括NVT TAE-684、AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CH5424802、CEP11988、WHI-P131和WHI-P154。
在另一个方面，本发明提供了用于抑制表达具有ROS激酶活性的多肽的哺乳动物癌症或疑似哺乳动物癌症进展的方法，所述方法包括在所述哺乳动物癌症或疑似哺乳动物癌症中抑制所述多肽的表达和/或活性的步骤。
在另一个方面，本发明提供了用于抑制包括编码具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的哺乳动物癌症或疑似哺乳动物癌症进展的方法，所述方法包括在所述哺乳动物癌症或疑似哺乳动物癌症中抑制所述多核苷酸的表达的步骤。
在各个实施方案中，肺癌或疑似肺癌来自人。在一些实施方案中，所述多肽或多核苷酸的表达和/或活性被ROS抑制性治疗剂所抑制，所述ROS抑制性治疗剂选自PF-02341066、NVT TAE-684、AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CEP11988、CH5424802、WHI-P131和WHI-P154。
在又另一个方面，本发明提供了将患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鉴定为可能对ROS-抑制性治疗剂响应的患者的方法，所述方法包括：将来自所述患者的肺的生物样品与特异性结合具有ROS激酶活性的多肽的试剂接触，检测所述试剂是否特异性结合所述生物样品，其中所述试剂与所述生物样品的结合的检测将所述患者鉴定为可能对ROS-抑制性治疗剂响应的患者。
在又另一个方面，本发明提供了治疗患有肺癌的患者的方法，所述方法包括：检测生物样品中具有ROS激酶活性的多肽的存在，所述生物样品来自患有或疑似患有肺癌的患者的肺；并且给患者施用治疗有效量的ROS抑制性治疗剂，从而治疗受试者的肺癌。
在又另一个方面，本发明提供了治疗患有肺癌的患者的方法，所述方法包括：检测来自患有或疑似患有肺癌的患者的肺的生物样品中多肽的存在，所述多肽选自具有ROS激酶活性的多肽和具有ALK激酶活性的多肽；并且给患者施用治疗有效量的ALK/ROS抑制性治疗剂，从而治疗受试者的肺癌。
在一个进一步方面，本发明提供了用于将患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鉴定为可能对ROS-抑制性治疗剂响应的患者的方法，所述方法包括：将来自所述患者的肺的生物样品与特异性结合具有ROS激酶活性的多肽的第一试剂和特异性结合具有ALK激酶活性的多肽的第二试剂接触，并且检测所述第一试剂或所述第二试剂是否特异性结合所述生物样品，其中所述第一试剂或所述第二试剂与所述生物样品的结合的检测将所述患者鉴定为可能对ROS-抑制性治疗剂响应的患者。
在一个进一步方面，本发明提供了用于将患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鉴定为可能对ALK-抑制性治疗剂响应的患者的方法，所述方法包括：将来自所述患者的肺的生物样品与特异性结合具有ROS激酶活性的多肽的第一试剂和特异性结合具有ALK激酶活性的多肽的第二试剂接触，并且检测所述第一试剂或所述第二试剂是否特异性结合所述生物样品，其中所述第一试剂或所述第二试剂与所述生物样品的结合的检测将所述患者鉴定为可能对ALK-抑制性治疗剂响应的患者。
在各个实施方案中，所述第一试剂特异性结合全长ROS激酶蛋白。在各个实施方案中，所述第二试剂特异性结合全长ALK激酶蛋白。在各个实施方案中，所述第一试剂特异性结合ROS激酶蛋白的激酶结构域。在各个实施方案中，所述第二试剂特异性结合ALK激酶蛋白的激酶结构域。在一些实施方案中，所述第一试剂是抗体。在一些实施方案中，所述第二试剂是抗体。
在本发明所有方面的各个实施方案中，患者是人患者且肺癌(或疑似肺癌)来自人。在一些实施方案中，肺癌是NSCLC或SCLC。在一些实施方案中，ROS抑制性治疗剂或ALK抑制性治疗剂是PF-02341066、NVT TAE-684或AP26113。在一些实施方案中，ROS抑制性治疗剂或ALK抑制性治疗剂是AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CEP11988、CH5424802、WHI-P131和WHI-P154。
在各个实施方案中，生物样品选自肺活检样品、支气管肺泡灌洗物、循环肿瘤细胞、肿瘤切除样品、细针穿刺物和胸膜渗出液。
在进一步方面，本发明提供了用于确定化合物是否抑制特征在于具有ROS活性的多肽的表达的哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌的进展的方法，所述方法包括确定所述化合物是否抑制所述多肽在所述癌症中的表达的步骤。在另一个方面，本发明提供了用于抑制特征在于具有ROS活性的多肽的表达的哺乳动物癌症或疑似哺乳动物癌症的进展的方法，所述方法包括抑制所述多肽在所述哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌中的表达和/或活性的步骤。在一些实施方案中，癌症来自人。
附图说明
图1 -是人NSCLC细胞系(HCC78)提取物的Western印迹分析，该图表示了具有比全长/野生型ROS低很多的分子量的ROS型的表达。
图2 -显示在人NSCLC细胞系中siRNA对突变ROS激酶的抑制作用：小图A显示在转染siRNA后细胞抑制图，小图B是显示ROS的特异性敲低(knock- down)和增加凋亡(在突变ROS驱动的细胞系中)的免疫印迹，且小图C是显示ROS下游的信号传递分子活性降低的免疫印迹。
图3A-3B - 显示SLC34A2基因和ROS基因分别在染色体4p和6q上的位置(图3A)，和全长SLC34A2和ROS蛋白的结构域位置(图3B)。
图3C - 是显示长SCL34A2-ROS变体的示意图，其中SCL34A2的外显子1-4与ROS的外显子32-43相组合。融合连接发生在ROS的跨膜结构域上游的残基1750，并且融合连接侧翼的核苷酸和氨基酸残基(分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13)显示于图3C的底部(其中来自SCL34A2的核苷酸和氨基酸残基为常规字体，来自ROS的核苷酸和氨基酸残基为粗体文本)。
图3D - 是显示短SCL34A2-ROS变体的示意图，其中SCL34A2的外显子1-4与ROS的外显子32-43相组合。融合连接发生在仅ROS的跨膜结构域上游的残基1853，并且融合连接侧翼的核苷酸和氨基酸残基(分别为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15)显示于图3D的底部(其中来自SCL34A2的核苷酸和氨基酸残基为常规字体，来自ROS的核苷酸和氨基酸残基为粗体文本)。
图3E - 是显示预测的非常短SCL34A2-ROS变体的示意图，其中SCL34A2的外显子1-4与ROS的外显子35-43相组合。预测融合连接发生在ROS的跨膜结构域的N-末端边界处的ROS的残基1882，并且融合连接侧翼的核苷酸和氨基酸残基(分别为SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:17)显示于图3E的底部(其中来自SCL34A2的核苷酸和氨基酸残基为常规字体，来自ROS的核苷酸和氨基酸残基为粗体文本)。
图4A - 是人SLC34A2-ROS融合蛋白的长变体的氨基酸序列(1字母代码)(SEQ IDNO:5)(上小图)，其中还指明编码的DNA序列(SEQ ID NO:6) (下小图)；SLC34A2部分的残基为斜体，而ROS的激酶结构域的残基为粗体。
图4B - 是人SLC34A2-ROS融合蛋白的短变体的氨基酸序列(1字母代码)(SEQ IDNO:7)(上小图)，其中还指明编码的DNA序列(SEQ ID NO:8) (下小图)；SLC34A2部分的残基为斜体，而ROS的激酶结构域的残基为粗体。
图5 -是人SLC34A2蛋白的氨基酸序列(1字母代码)(SEQ ID NO：3)(SwissProt登录号095436)(上小图)，其中还指明编码的DNA序列(SEQ ID NO：4)(GeneBank登录号NM_006424)(下小图)；参与易位的残基用下划线表示。
图6A - 是人ROS激酶的氨基酸序列(1字母代码) (SEQ ID NO:1) (SwissProt登录号P08922)；参与SLC34A2-ROS(长)变体易位的残基用下划线表示，用下划线表示的粗体残基是参与(短)变体易位的残基，并且用下划线表示的粗体红色残基是参与预测的(非常短)变体易位的残基。
图6B - 是人ROS激酶的编码DNA序列(SEQ ID NO:2) (GeneBank登录号NM_002944)；参与第一SLC34A2-ROS(长)变体易位的残基用下划线表示，用下划线表示的粗体残基是参与第二(短)变体易位的残基，并且用下划线表示的粗体大写残基是参与(非常短)变体易位的残基。
图 7 -是显示与对照(泳道1和2)相比SLC34A2-ROS融合蛋白(第一(长)变体)在转染的293细胞(人胚胎肾细胞)中表达的凝胶图。
图8 - 显示CD74基因和ROS基因分别在染色体5q和6q上的位置(小图A)，并且全长CD74和ROS蛋白的结构域位置以及在CD74-ROS融合蛋白中的位置(小图B和C(其中SEQ IDNO:30显示在下面的小图C中))。融合连接发生在ROS的跨膜结构域上游的残基1853。
图9 - 是人CD74-ROS融合蛋白的氨基酸序列(1字母代码)(SEQ ID NO:22)(上小图)，其中还指明编码的DNA序列(SEQ ID NO:23) (下小图)；CD74部分的残基为斜体，而ROS的激酶结构域的残基为粗体。
图10 - 是人CD74蛋白的氨基酸序列(1字母代码)(SEQ ID NO:24) (SwissProt登录号P04233) (上小图)，其中还指明编码的DNA序列(SEQ ID NO:25) (GeneBank登录号NM_001025159) (下小图)；参与易位的残基用下划线表示。
图11A - 是人ROS激酶的氨基酸序列(1字母代码)(SEQ ID NO:1) (SwissProt登录号P08922)；参与CD74-ROS易位的残基用下划线表示。
图11B - 是人ROS激酶的编码的DNA序列(SEQ ID NO:2) (GeneBank登录号NM_002944)；参与CD74-ROS易位的残基用下划线表示。
图12 - 是描绘通过RT-PCR检测CD74和ROS易位形成的融合基因的凝胶图；其中显示了针对CD74-F1(顶部)和ROS-GSP3(底部)的引物序列(分别为SEQ ID NOs:26和27)。
图 13A-13F - 是显示非小细胞肺癌(NSCLC) FFPE肿瘤组织中ROS蛋白和ROS核酸的免疫组织化学和FISH的照片。ROS蛋白定位的变化显示如下：(A) 弥漫性胞质，其中插图(A)中的黄色箭头说明通过FISH对c-ros基因座的平衡易位。(B) 腺癌中ROS的强点状定位，其中插图放大(即放大图像)。(C) 大细胞癌中ROS染色的胞质定位和小图E中相应的苏木精和伊红染色。(D) 具有独特胞质染色和膜定位的腺癌，其中显示膜染色的插图进行放大。(E)对应于小图C中的ROS染色的苏木精和伊红染色。(F) 点状囊泡染色，其中显示囊泡染色的插图放大。
图14A 和B -是使用双色断裂-分离探针(2-color break-a-part probe)通过FISH特异性检测ROS融合/易位(在人NSCLC细胞系中)的图像。图14A显示了ROS基因上FISH探针杂交的位置，并且图14B显示了人NSCLC细胞系(左)和人NSCLC肿瘤中ROS基因的重排，其导致产生分开的橙色和绿色信号。
图15是显示2个探针组的DNA探针与ROS基因和FIG基因杂交的位置的示意图。两个探针组的近端探针(即RP1-179P9)将产生橙色信号，而所有三个远端探针将产生绿色信号。探针组1源自c-ros，并且如果发生平衡易位，则橙色将与绿色分开；然而如果发生FIG-ROS易位，则绿色信号将消失。探针组2源自c-ros(橙色RP1-179P9)和fig (绿色RP11-213A17)。
图16A-16F是显示HCC78细胞(小图A和B)、U118MG细胞(小图C和D)和FFPE肿瘤ID749 (小图E和F)的FISH分析的结果的照片。用探针组1(A)和探针组2(B)探测的HCC78细胞显示了从这些细胞中存在的SLC34A2-ROS融合体预测的结果。黄色箭头指向表明HCC78细胞中的平衡易位的分开信号，白色箭头指向完整染色体。用探针组1(C)和探针组2(D)探测的U118MG细胞显示了从这些细胞中存在的FIG-ROS融合体预测的结果。用探针组1(E)或探针组2(F)探测的FFPE肿瘤749与U118MG细胞相同。在用探针组1探测的U-118 MG和肿瘤ID 749两者中，只有c-ros(橙色)探针退火且缺失区域(绿色探针)不存在(分别为小图C和E)。在用探针组2探测的U-118 MG和肿瘤ID 749(分别为小图E和F)中，c-ros(橙色)和fig(绿色)探针走到一起，表明fig-ros融合。
图17显示了来自肿瘤749的ROS融合蛋白的cDNA测序(在“本序列”行)和其与FIG-ROS(S)核苷酸序列(作为“查询序列”)的比对的结果。
图18是显示在0nM、3nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM 或1000 nM TAE-684存在的情况下表达FIG-ROS(S)的BaF3(红色方形)、表达FIG-ROS(L)的BaF3(蓝色菱形)、表达FLT3ITD的BaF3(绿色三角形)、和Karpas 299细胞(紫色X)的细胞生长响应的线图。
图19是显示在TAE-684存在的情况下表达FIG-ROS(S)或FIG-ROS(L)的BaF3通过细胞凋亡而死亡的条形图。
图20是显示TAE-684抑制FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)两者以及它们的下游信号传递分子的磷酸化的Western印迹分析的描述。
图21A和21B是显示在0uM、0.01uM、0.03M、0.10uM、0.3uM、1.0uM的TAE-684(图21A)或克里唑替尼(图21B)存在的情况下用neo-myc转导的BaF3细胞(阴性对照；蓝色菱形)；表达FIG-ROS(S)的BaF3(紫色X)、表达FIG-ROS(L)的BaF3(绿色三角形)、表达FLT3ITD的BaF3(红色方形)和Karpas 299细胞(蓝色星号)的细胞生长响应的线图。
图22是显示克里唑替尼抑制FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)两者以及ALK和其他信号传递分子的磷酸化的Western印迹分析的描述。
具体实施方式
本发明基于在人肺癌中发现异常ROS激酶表达。由于ROS激酶在正常肺组织或细胞中不表达，所以预测异常ROS激酶活性驱动其中其表达的肺癌的增殖和存活。此类癌症可以根据本文提供的教导进行鉴定(例如，诊断)和/或治疗。
基于这些发现，其肺癌(或疑似肺癌)表达具有ROS活性的蛋白(例如，全长ROS蛋白或ROS融合蛋白)的患者(其中健康患者的肺组织不表达此类具有ROS活性的蛋白)可以有利地对ROS抑制剂的施用响应(例如，与患有相同癌症的未经治疗的患者相比，癌症的生长可能减缓或停止)。
本文中提到的公开专利、专利申请、网站、公司名称和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识，且完整地通过引用并入本文，其程度等同于各自被特定且单独地指示通过引用并入。本文引用的任何参考文献和本说明书中的具体教导之间的任何冲突应当以有利于后者的方式来解决。
在下文中将更详细地描述本发明的其他方面、优点和实施方案。本文中提到的专利、公开申请和科学文献确立了本领域技术人员的知识，且完整地通过引用并入本文，其程度等同于各自被特定且单独地指示通过引用并入。本文引用的任何参考文献和本说明书中的具体教导之间的任何冲突应当以有利于后者的方式来解决。同样，词或短语的本领域理解的定义和本说明书中具体教导的词或短语的定义之间的任何冲突应当以有利于后者的方式来解决。如本文所使用，以下术语具有所示含义。如本说明书中所使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”还具体包括它们所指术语的复数形式，除非内容另有清楚指出。术语“约”在本文中用来指接近，在…区间中，粗略地或约。当术语“约”连同数值范围使用时，它通过延伸所示数值的上限和下限而修改范围。通常，术语“约”在本文中用来以20％的方差修改所示数值的上限和下限数值。
本文中使用的科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义，除非本文另有定义。本文参考本领域技术人员已知的各种方法和材料。记载抗体和重组DNA技术的一般原则的标准参考著作(所有这些都通过引用整体并入本文)包括Harlow和Lane,Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork (1988), Ausubel等人Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, New York, N.Y. (1989和更新直至2010年9月), Sambrook等人, MolecularCloning: A Laboratory Manual,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork (1989); Kaufman等人, Eds., Handbook of Molecular and Cellular Methods inBiology in Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., DirectedMutagenesis:A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991)。记载药学的一般原则的标准参考著作(所有这些都通过引用整体并入本文)包括Goodman和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics, 第11版, McGraw Hill Companies Inc.,New York (2006)。
在第一个方面，本发明提供了用于检测生物样品中具有ROS激酶活性的多肽的存在的方法，所述生物样品来自哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌。该方法包括以下步骤：获得来自哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌的生物样品；并且利用至少一种特异性结合所述具有ROS激酶活性的多肽的试剂来确定所述多肽是否在所述生物样品中存在，其中所述试剂与所述生物样品的特异性结合的检测表明所述生物样品中存在所述多肽。
人ROS激酶蛋白(由ROS1基因编码)是2347个氨基酸长的受体酪氨酸激酶，其容易发生异常表达，从而导致癌症。全长人ROS激酶(具有人ROS蛋白的氨基酸序列)的描述可见UniProt登录号P08922。如图1中显示，ROS的信号肽、胞外结构域、跨膜结构域和激酶结构域可见以下SEQ ID NO:1中的氨基酸残基：
表 1表 1
结构域 SEQ ID NO: 1中的氨基酸残基
信号肽 1 - 27
胞外结构域 28-1859
跨膜结构域 1860-1882
激酶结构域 1945-2222
额外地，有多个ROS已知的天然存在的变体(参见例如，Greenman等人，Nature446:153-158, 2007)。鼠全长ROS的核苷酸和氨基酸序列是已知的(参见例如，UniProt 登录号Q78DX7)。使用常规实验，普通技术生物学家将能够容易确定非人哺乳动物ROS同源物中的相应序列。
“野生型”ROS是指全长ROS激酶(即，对于人ROS，2347个氨基酸长多肽或在去除信号肽序列之后的2320个氨基酸长多肽)在正常个体(例如，不患癌症的正常个体)的健康(或正常)组织(例如，非癌组织)中的表达和/或激活。ROS激酶(全长或截短的)似乎在人正常肺组织中不表达(例如，参见下文实施例)。然而，使用在以下实施例中描述的方法，本发明人已经作出了ROS激酶在肺癌中表达的令人惊讶的发现。此类在非典型细胞(在此类情况下，癌细胞)中的表达(其中在典型细胞(例如，非癌肺细胞)中没有看到表达)是异常的。
已经在成胶质细胞瘤(参见Charest等人, Charest等人, Genes ChromosomesCancer 37: 58-71, 2003; Charest等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 916-921,2003)和肝癌(参见，例如，PCT公开号WO2010/093928)中报道了以与另一种蛋白(即FIG)的融合体的形式的异常表达的ROS激酶。
如本文所使用，术语“ROS融合体”是指ROS多肽的包含ROS蛋白的激酶结构域的部分(或者编码其的多核苷酸)融合到另一种多肽全部或部分(或者编码其的多核苷酸)，其中该第二种多肽或多核苷酸的名称在融合体中命名。(术语“融合体”仅仅意味着来自第一基因的多肽或多核苷酸的全部或部分融合至来自第二基因的多肽或多核苷酸的全部或部分)。例如，SLC34A2-ROS融合体是SLC34A2多肽的部分(或者编码其的多核苷酸)与ROS多肽的包含激酶结构域ROS的部分(或者编码其的多核苷酸)之间的融合体。ROS融合体经常由于染色体易位或倒置而导致产生。存在许多已知的ROS融合体，所有这些都是本发明的ROS融合体，包括，但不限于，SLC34A2-ROS融合蛋白(其成员包括SLC34A2-ROS(VS)、SLC34A2-ROS(S)、SLC34A2-ROS(L) (参见美国专利公开号20100143918)、CD74-ROS (参见美国专利公开号20100221737))和FIG-ROS融合蛋白(其成员包括FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)和FIG-ROS(XL)(参见PCT公开号WO2010/093928))。
所有已知的ROS融合蛋白包含全长ROS的完整激酶结构域。因此，如本文所使用，“具有ROS激酶活性的多肽”(或“具有ROS激酶活性的多肽”)是指包括全长ROS蛋白的完整激酶结构域并因此保留ROS激酶活性的蛋白(或多肽)。具有ROS激酶活性的蛋白的非限制性实例包括但不限于，全长ROS 蛋白，SLC34A2-ROS融合蛋白(其成员包括SLC34A2-ROS(VS)、SLC34A2-ROS(S)、SLC34A2-ROS(L) (参见美国专利公开号20100143918)、CD74-ROS (参见美国专利公开号20100221737))和FIG-ROS融合蛋白(其成员包括FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)和FIG-ROS(XL) (参见PCT公开号WO2010/093928))和ROS激酶的保留全长ROS激酶蛋白的激酶结构域的任何截短或突变形式。由于ROS的激酶结构域描述于SEQ ID NO:61，“具有ROS激酶活性的多肽”是其氨基酸序列包含SEQ ID NO:61的多肽。
如本文所使用，“多肽”(或“氨基酸序列”或“蛋白”)是指从优选α-氨基酸、D-氨基酸、L-氨基酸及其组合以确定顺序的连接而形成的聚合物。一个氨基酸残基和下一个之间的连接被称为酰胺键或肽键。多肽的非限制性实例包括指寡肽、肽、多肽、或蛋白质序列、以及其片断或部分，并且指天然存在或合成分子。多肽还包括衍生分子，诸如糖蛋白和脂蛋白以及低分子量多肽。“氨基酸序列”和类似术语，诸如“多肽”或“蛋白质”，并不是将所示氨基酸序列限于与所述蛋白质分子有关的完全、天然氨基酸序列。
本领域将会认识到本发明的多肽(例如，FIG-ROS(S)多肽)的一些氨基酸序列可以变化而不明显影响所述突变蛋白的结构或功能。如果考虑序列中的这些差异，应当记住的是在蛋白上存在决定活性的关键区域(例如ROS的激酶结构域)。通常，可以置换形成三级结构的残基，只要使用了执行类似功能的残基。在其他情况下，如果变化发生在蛋白质的非关键区，则残基的类型可以是完全不重要的。
因此，本发明的具有ROS酶活性的多肽进一步包括显示实质上ROS激酶活性的全长ROS蛋白的变体或本文所述的各种ROS融合多肽。一些非限制性保守取代包括：脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间的彼此交换；羟基残基Ser和Thr的交换；酸性残基Asp和Glu的交换；酰胺残基Asn和Gln的交换；碱性残基Lys和Arg的交换；以及芳香残基Phe和Tyr的交换。本领域技术人员已知的保守氨基酸取代的进一步实例为：芳香氨基酸：苯丙氨基酸、色氨酸、酪氨酸(例如，色氨酸残基被苯丙氨酸替换)；疏水氨基酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；极性氨基酸：谷氨酰胺、天冬酰胺；碱性氨基酸：精氨酸、赖氨酸、组氨酸；酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；小氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸。如上面详细说明的，关于哪些氨基酸变化可能是表型沉默的(即，不可能对功能具有显著的有害影响)的进一步指导可以在Bowie等人，Science 247，同上中找到。
在一些实施方案中，变体可以具有“非保守”改变，例如用色氨酸置换甘氨酸。类似的改变还可以包括氨基酸缺失或插入，或者二者。利用本领域众所周知的计算机程序，例如DNASTAR软件，可以找到指导，其用来确定可以取代、插入、或缺失哪些氨基酸残基而不消除生物或免疫活性。
本发明具有ROS激酶活性的多肽包括：全长人ROS蛋白(具有如SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列)和具有如SEQ ID NOs:5、7、22、28、56、58、和60中所述的氨基酸序列的ROS融合多肽(不管包括还是不包括前导序列)，编码包含包括融合连接的至少六个连续氨基酸的多肽的氨基酸序列(即，在非ROS伴侣蛋白和ROS蛋白之间的连接处的序列；参见表2)，以及与上述那些具有至少90%相似性，更优选至少95%相似性，且仍更优选至少96%、97%、98% 或99%相似性的多肽。
可用于如下文所述的检测ROS多肽表达和/或ROS激酶活性的测定中，或者可用作能够抑制ROS蛋白功能/活性的ROS抑制性治疗剂的全长ROS特异性试剂和ROS融合多肽特异性试剂(诸如多克隆和单克隆抗体)。而且，此类多肽可以用于酵母双杂交系统以“捕获”ROS蛋白或ROS融合蛋白-结合蛋白，其还是根据本发明的候选ROS抑制性治疗剂。酵母双杂交系统由Fields和Song在Nature 340: 245-246 (1989)中描述。
在一些实施方案中，试剂可以进一步包含可检测标记(例如，荧光标记或红外标记)。关于本文公开的多肽、多核苷酸或试剂(例如，抗体或FISH探针)的“可检测标记”是指多肽、多核苷酸或抗体的化学、生物或其他修饰或对多肽、多核苷酸或抗体的化学、生物或其他修饰，包括但不限于荧光(例如，FITC或藻红蛋白)、红外、质量(例如，等压标签)、残基、染料(发色团染料)、放射性同位素(例如，32P)、标记或标签(myc标签或GST标签)修饰等，可以通过其检测目标分子的存在。此类多肽、多核苷酸或试剂因此被称为“可检测标记的”。可检测标记可以通过共价(例如，肽键或磷酸二酯键)或非共价化学键(例如，离子键)连接到所述多肽、多核苷酸或结合剂。
可用于本发明方法的试剂包括但不限于，特异性结合肺癌中表达的全长ROS蛋白或许多ROS融合蛋白之一的试剂，诸如抗体或AQUA肽或其结合部分。“特异性结合”或“特异性结合”是指本发明的试剂或结合剂(例如，核酸探针、抗体、或AQUA肽)与其目标分子(例如，ROS融合多肽或多核苷酸、或全长ROS多肽或多核苷酸)相互作用，其中所述相互作用依赖于特定结构(例如，多肽上的抗原决定簇或表位或多核苷酸的核苷酸序列)的存在；换言之，所述试剂识别并结合特定多肽或多核苷酸结构，而不是一般的所有多肽或多核苷酸。“其结合片段”是指特异性结合目标分子的试剂的片段或部分(例如，抗体的Fab片段)。
特异性结合目标分子的试剂可以被称为目标-特异性试剂或抗-目标试剂。例如，特异性结合FIG-ROS(L)多肽的抗体可以被称为FIG-ROS(L)-特异性抗体或抗-FIG-ROS(L)抗体。类似地，特异性结合FIG-ROS(L)多核苷酸的核酸探针可以被称为FIG-ROS(L)-特异性核酸探针或抗-FIG-ROS(L)核酸探针。
在其中目标分子是多肽的一些实施方案中，特异性结合目标分子的试剂对其目标分子(例如，全长ROS或ROS融合多肽)具有1x 10-6 M或更小的结合亲和力(KD)。在一些实施方案中，本发明的特异性结合目标分子的试剂对其目标分子具有1 x10-7 M或更小的KD、或1x10-8 M或更小的KD、或1 x 10-9 M或更小的KD、或1 x 10-10 M或更小的KD、或1 x 10-11 M或更小的KD、或1 x 10-12 M或更小的KD。在某些实施方案中，本发明的特异性结合目标分子的试剂对其目标分子的KD是1 pM至500 pM、或500 pM至1 μM、或1 μM至100 nM、或100 mM至10nM。本发明的试剂特异性结合的目标分子的非限制性实例包括全长ROS多肽或ROS融合多肽，包括SLC34A2-ROS(S)融合多肽、SLC34A2-ROS(VS)融合多肽、SLC34A2-ROS(L)融合多肽、CD74-ROS融合多肽、FIG-ROS(L)融合多肽、FIG-ROS(S)融合多肽、FIG-ROS(XL)融合多肽及其片段，特别是包括ROS部分和ROS融合多肽的第二蛋白(例如，SLC34A2、FIG或CD74)的部分之间的连接的那些片段。
在其中目标分子是多核苷酸的一些实施方案中，本发明的特异性结合其目标分子的试剂是在严格条件与其目标多核苷酸杂交的试剂。关于核苷酸序列或核苷酸探针杂交条件的术语“严格条件”是“严格性”，其发生在约Tm -5℃(即，低于试剂或核酸探针的熔解温度(Tm)5℃)至低于Tm约20℃至25℃的范围内。典型的严格条件是：在42℃下在溶液中过夜孵育，所述溶液包含：50％甲酰胺、5X.SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5X Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖、以及20微克/ml变性的、剪切的鲑鱼精DNA，接着在约65℃的0.1X SSC中洗涤滤膜。如本领域技术人员将理解的，可以改变杂交的严格性以便鉴定或检测相同的或有关的多核苷酸序列。“在严格条件下与目标多核苷酸(例如，全长ROS多核苷酸)杂交的试剂(例如，多核苷酸或核苷酸探针)”是指沿参考多核苷酸的整个长度杂交或与作为参考多核苷酸的至少约15个核苷酸(nt)、或至少约20 nt、或至少约30 nt、或约30-70 nt的参考多核苷酸的部分杂交的试剂(例如，多核苷酸或核苷酸探针(例如，DNA、RNA或DNA-RNA杂合体))。本发明的这些核苷酸探针可用作如本文讨论的诊断探针(例如，对于FISH)和引物(例如，对于PCR)。
本发明的试剂特异性结合的目标分子的非限制性实例包括：全长ROS多肽，例如包含SEQ ID NO: 1(或编码其的多核苷酸)的序列，ROS蛋白的激酶结构域，例如包含SEQ IDNO: 61(或编码其的多核苷酸)的序列，ROS多肽的跨膜结构域(或编码其的多核苷酸)，FIG-ROS(S)融合多肽，例如具有包含SEQ ID NO: 58(或FIG-ROS(S)多核苷酸)的序列，FIG-ROS(L)融合多肽，例如包含SEQ ID NO: 56(或FIG-ROS(L)多核苷酸)的序列，FIG-ROS(VL)融合多肽，例如包含SEQ ID NO: 60 (或FIG-ROS(VL)多核苷酸)的序列，SLC34A2-ROS(VS)融合多肽，例如包含SEQ ID NO: 28 (或SLC34A2-ROS(VS)多核苷酸)的序列，SLC34A2-ROS(S)融合多肽，例如包含SEQ ID NO: 7(或SLC34A2-ROS(S)多核苷酸)的序列，SLC34A2-ROS(L)融合多肽，例如包含SEQ ID NO: 5 (或SLC34A2-ROS(L) 多核苷酸)的序列，CD74-ROS融合多肽，例如包含SEQ ID NO: 22 (或CD74-ROS 多核苷酸)的序列及其片段，特别是包括ROS部分和ROS融合多肽的第二蛋白的部分(例如，SLC34A2、FIG或CD74)之间的连接的那些片段(参见例如，表2)。
可用于所公开方法的实施中的试剂尤其包括全长ROS特异性和ROS融合多肽特异性抗体和AQUA肽(重同位素标记肽)，其对应于且适合于检测和定量生物样品中指示多肽的表达。因此，“ROS多肽特异性试剂”是能够特异性结合、检测和/或定量生物样品中表达的ROS多肽的存在/水平的任何生物学或化学试剂。如果该试剂特异性结合至ROS蛋白的存在于ROS融合蛋白中的部分(例如，激酶结构域)，则ROS多肽特异性试剂也将能够特异性结合至生物样品中的表达的ROS融合多肽，检测和/或定量生物样品中的表达的ROS融合多肽的存在/水平。所述术语包括但不限于下文讨论的抗体和AQUA肽试剂，并且等同结合剂也在本发明的范围之内。
在一些实施方案中，特异性结合具有ROS激酶活性的多肽的试剂是抗体。在一些实施方案中，所述试剂(例如，抗体)特异性结合全长ROS多肽。在一些实施方案中，所述试剂(例如，抗体)特异性结合全长FIG多肽。在一些实施方案中，所述试剂(例如，抗体)特异性结合全长SLC34A2多肽。在一些实施方案中，所述试剂(例如，抗体)特异性结合全长CD74多肽。在一些实施方案中，所述试剂(例如，抗体)特异性结合ROS融合多肽并且不特异性结合全长ROS或其融合伴侣(例如，全长FIG、全长CD74或全长SLC34A2)的全长多肽。
其他试剂也可用于实施本发明的方法，诸如表位-特异性抗体，其特异性结合野生型ROS蛋白序列的细胞外结构域中的表位(因此能够检测样品中野生型ROS的存在(或不存在))或特异性结合野生型ROS蛋白序列的激酶结构域中的表位(因此能够检测样品中具有ROS激酶活性的任何蛋白的存在(或不存在))。
特异性结合肺癌中全长ROS蛋白或ROS融合多肽之一的抗体还可以结合其他哺乳动物物种，例如鼠或兔的高度同源和等价的表位肽序列，并且反之亦然。可用于实施本发明方法的抗体包括(a)单克隆抗体，(b)特异性结合目标多肽(例如融合多肽的融合连接)的纯化的多克隆抗体；(c)如上述 (a)-(b)中所述的特异性结合其他非人类物种(例如小鼠，大鼠)的等价和高度同源的表位或者磷酸化位点的抗体；以及(d)上述(a)-(c)特异性结合由本文公开的示例性抗体结合的抗原(或者更优选表位)的片段。
术语“抗体”是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，包括其结合片段(即，能够特异性结合抗体目标分子的抗体的片段，诸如Fab和F(ab’)2片段)，以及重组、人源化、多克隆和单克隆抗体和/或其结合片段。本发明的抗体可以源自任何动物物种，诸如源自哺乳动物。非限制性的示例性天然抗体包括源自人、鸡、山羊和啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠和兔)的抗体，包括基因工程改造以产生人抗体的转基因啮齿动物的抗体(参见，例如，Lonberg等人, WO93/12227；美国专利号5,545,806；和Kucherlapati, 等人,WO91/10741；美国专利号6,150,584，其通过引用整体并入本文)。本发明的抗体也可以是嵌合抗体。参见例如，M. Wroser 等人， Molec. Immunol. 26: 403-11 (1989); Morrision等人， Proc. Nat’l. Acad. Sci. 81: 6851 (1984); Neuberger等人， Nature 312: 604(1984))。所述抗体可以是按照美国专利号4,474,893 (Reading)或美国专利号4,816,567(Cabilly 等人)所公开的方法制备的重组单克隆抗体。所述抗体还可以是按照美国专利号4,676,980 (Segel等人)公开的方法制备的化学构建的特异性抗体。
天然抗体是由宿主动物产生的抗体，然而本发明还涵盖遗传改造的抗体，其中氨基酸序列已经与天然抗体的氨基酸序列不同。因为重组DNA技术与本申请的相关性，不必局限于在天然抗体中发现的氨基酸序列；抗体可以重新设计，以获得所需特性。可能的变化有很多，范围从改变仅一个或几个氨基酸到完全重新设计例如可变区或恒定区。一般将进行恒定区中的改变以改善或改变特性，诸如补体结合(complement fixation)、与膜的相互作用和其他效应子功能。将进行可变区中的改变以改善抗原结合特性。如本文所使用，术语“人源化抗体”是指这样的抗体分子，其中非抗原结合区中的氨基酸已被代替以便更接近地类似人抗体，同时仍然保留最初的结合能力。具体考虑的其他抗体是寡克隆抗体。如本文所使用，短语“寡克隆抗体”是指不同单克隆抗体的预定混合物。参见，例如，PCT公开WO 95/20401；美国专利号5,789,208和6,335,163。在一个实施方案中，由针对一个或多个表位的抗体的预定混合物组成的寡克隆抗体在单一细胞中生成。在其他实施方案中，寡克隆抗体包含许多能够与共同轻链配对的重链，以生成具有多种特异性的抗体(例如，PCT公开WO04/009618)。当期望寡克隆抗体靶向单一目标分子上的多个表位时，寡克隆抗体特别有用。鉴于本文公开的测定法和表位，本领域技术人员可以生成或选择适用于预期目的和所需要求的抗体或抗体的混合物。
重组抗体也包括在本发明中。这些重组抗体具有与天然抗体相同的氨基酸序列或具有与天然抗体的不同氨基酸序列。它们可以在任何表达系统中制备，所述表达系统包括原核和真核表达系统或使用噬菌体展示法(参见，例如，Dower等人, WO91/17271和McCafferty等人, WO92/01047；美国专利号5,969,108，其通过引用整体并入本文)。抗体可以以多种方式工程改造。它们可以制成单链抗体(包括小型模块化免疫药物或SMIPs™)、Fab和F(ab’)2片段等。抗体可以是人源化的、嵌合化的、去免疫化的或完全人的。许多出版物记载了许多类型的抗体和工程改造此类抗体的方法。例如，参见美国专利号6,355,245;6,180,370; 5,693,762; 6,407,213; 6,548,640; 5,565,332; 5,225,539; 6,103,889;和5,260,203。本发明的遗传改造的抗体可以在功能上等同于上述天然抗体。在某些实施方案中，本发明的修饰抗体提供了改进的稳定性或/和治疗效果。
修饰的抗体的非限制性实例包括没有显著有害地改变抗原结合效用的具有氨基酸残基的保守取代和一个或多个氨基酸的缺失或添加的抗体。取代的范围可以从改变或修饰一个或多个氨基酸残基到完全重新设计区域，只要治疗效用得以维持。本发明的抗体可以在翻译后进行修饰(例如，乙酰化和/或磷酸化)，或者可以合成地修饰(例如，连接标记基团)。具有工程改造或变体的恒定区或Fc区的抗体可用于调节效应子功能，诸如，例如，抗原依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。此类具有工程改造或变体的恒定区或Fc区的抗体可用于其中亲本单独分离的蛋白(parent singling protein)在正常组织中表达的情况；在这些情况下没有效应子功能的变体抗体可以引发所需治疗响应，而不会损伤正常组织。因此，本公开的某些方面和方法涉及具有改变的效应子功能且包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失的抗体。术语“生物上活性的”是指具有天然存在分子的结构、调节、或生化功能的蛋白质。同样，“免疫学上活性的”是指天然、重组或合成全长ROS蛋白或ROS融合多肽(例如，本文所述FIG-ROS融合多肽之一)、或其任何寡肽诱导适当动物或细胞中的特异性免疫应答以及与特异性抗体结合的能力。
还在本发明内的是具有少于4条链的抗体分子，包括单链抗体、骆驼抗体等和抗体的组分，包括重链或轻链。在一些实施方案中，免疫球蛋白链从5'到3'可以包含可变区和恒定区。可变区可以包含散布构架(FR)区的三个互补性决定区(CDRs)，结构为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和FR4。还在本发明内的是重链或轻链可变区、构架区和CDRs。本发明的抗体可以包含重链恒定区，所述重链恒定区包含一些或全部CH1区、铰链、CH2和CH3区。
本发明的融合多肽特异性抗体的一个非限制性表位位点是基本上由融合多肽序列的约11至17个氨基酸组成的肽片段，该片段包括在分子的ROS部分与该分子的来自非ROS融合伴侣的部分之间的融合连接。应当理解的是特异性结合更短或更长的包含ROS融合多肽的融合连接的肽/表位的抗体在本发明的范围之内。
本发明不限于使用抗体，而是包括等价分子，诸如蛋白结合结构域或核酸适配体，其以ROS蛋白特异性或ROS融合蛋白特异性方式，结合可用于本发明方法的全长ROS特异性或ROS融合多肽特异性抗体所结合的基本上相同表位。参见例如， Neuberger等人， Nature 312: 604 (1984)。在下文中进一步描述的本发明的方法中，可以适当地采用此类等价的非抗体试剂。
可用于实施本发明方法的多克隆抗体可以按照标准技术制备，其中按照已知程序，用包括所需融合蛋白质特异性表位(例如，在ROS融合多肽中非ROS蛋白伴侣与ROS蛋白伴侣之间的融合连接)的抗原免疫适宜的动物(例如，兔、山羊等)，从动物收集免疫血清，从免疫血清分离多克隆抗体，以及纯化具有所需特异性的多克隆抗体。所述抗原可以是按照众所周知的技术选择和构建的包括所需表位序列的合成肽抗原。参见例如，Antibodies:ALaboratory Manual, Chapter 5, p. 75-76, Harlow & Lane Eds., Cold SpringHarbor Laboratory (1988); Czernik, Methods In Enzymology, 201: 264-283(1991); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 21-49 (1962))。如下文进一步描述的，可以对如本文所述制备的多克隆抗体进行筛选和分离。
单克隆抗体还可以有利地用于本发明的方法中，并且可以按照Kohler和Milstein的众所周知的技术在杂交瘤细胞系中制备。Kohler和Milstein. Nature 265: 495-97(1975); Kohler和Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); 还参见CurrentProtocols in Molecular Biology, Ausubel等人. Eds. (Wiley and Sins, New York,NY 1989并且每年更新直到包括2010年)。这样制备的单克隆抗体是高度特异性的，能提高本发明提供的测定方法的选择性和特异性。例如，可以将含有适当抗原(例如包含ROS融合多肽的融合连接的合成肽)的溶液注射小鼠，在足够的时间(与常规技术一致)后处死小鼠并获取脾细胞。然后，通常在存在聚乙二醇的情况下，通过将脾细胞与骨髓瘤细胞融合来固定脾细胞，以产生杂交瘤细胞。兔融合杂交瘤例如可以如美国专利号5,675,063中所述来产生。然后在适宜的选择培养基诸如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)中生长杂交瘤细胞，并筛选上清液以获得具有期望特异性的单克隆抗体，如下所述。通过常规方法诸如沉淀、离子交换或亲和层析等，可以从组织培养上清液回收分泌的抗体。
通过本领域技术人员已知的重组技术，还可以在大肠杆菌中产生单克隆Fab片断。参见例如，W. Huse, Science 246: 1275-81 (1989); Mullinax等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. 87: 8095 (1990)。如果一种同种型的单克隆抗体期望用于特定用途，则可以通过从最初融合进行选择来直接制备，或通过利用用来分离类别转换变体的同胞选择技术，从分泌不同同种型的单克隆抗体的亲代杂交瘤来二次制备特定的同种型(Steplewski等人，Proc. Nat’l. Acad. Sci., 82: 8653 (1985); Spira等人，J. Immunol. Methods, 74:307 (1984))。结合单克隆抗体的位点的抗原可以通过PCR加以克隆并且单链抗体产生为噬菌体展示重组抗体或在大肠杆菌中的可溶抗体(参见例如，Antibody EngineeringProtocols, 1995, Humana Press, Sudhir Paul编辑)。
更进一步，美国专利号5,194,392，Geysen(1990)描述了检测或确定单体(氨基酸或其他化合物)的序列的一般方法，该序列是表位的拓扑等同物(即，“模拟表位”)，其互补于目标抗体的特定互补位(抗原结合位点)。更一般地，该方法涉及检测或确定单体的序列，该序列是配体的拓扑等同物，其互补于目标特定受体的配体结合位点。类似地，美国专利号5,480,971，Houghten 等人(1996)公开了线性C1-C-rosyl perrosylated寡肽以及此类肽的组和文库，以及使用此类寡肽组和文库用于确定优先结合于目标受体分子的perrosylated寡肽的序列的方法。因此，本发明含有表位的肽的非肽类似物可以通过这些方法常规制备。
可以按照标准技术针对表位和融合蛋白特异性，来筛选可用于本发明的方法的抗体(不管是多克隆或单克隆)。参见例如，Czernik 等人， Methods in Enzymology, 201:264-283 (1991)。例如，可以针对肽文库并通过ELISA来筛选抗体以确保对于两种所需抗原的特异性，以及如果需要的话，确保仅与，本发明全长ROS蛋白、特定ROS融合多肽(例如，SLC34A2-ROS(S)多肽)或其片段的反应性的特异性。还可以通过针对包含目标蛋白的细胞制剂的Western印迹来试验抗体以证实仅与所期望的目标具有反应性以及确保没有明显结合于其他蛋白。融合蛋白特异性抗体的制备、筛选和使用是本领域技术人员已知的，并已被描述。参见例如，美国专利公开号20050214301。
可用于本发明方法的抗体(例如，全长ROS蛋白特异性或ROS融合多肽特异性)可以表现出与其他蛋白或多肽中的类似表位(诸如类似融合多肽)某些有限的交叉反应性。这并不是意外的，因为大多数抗体表现出一定程度的交叉反应性，并且抗肽抗体将经常与对于免疫肽具有高同源性或同一性的表位进行交叉反应。参见例如，Czernik ,同上。 通过Western印迹连同已知分子量的标记可以容易地表征与其他融合蛋白的交叉反应性。可以检测交叉反应蛋白的氨基酸序列以鉴定抗体结合的与全长ROS 蛋白序列或ROS 融合多肽(例如FIG-ROS(S)多肽)序列高度同源或相同的位点。通过阴性选择并利用肽柱上的抗体纯化可以除去不期望的交叉反应性。
可用于实施本文公开方法的本发明的ROS特异性抗体和ROS融合多肽-特异性抗体对于人融合多肽是理想地特异性的，但并不仅限于结合人物种本身。本发明包括还结合其他哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、猴)中保守的和高度同源或相同的表位的抗体的制备和使用。使用本文公开的人ROS 蛋白序列(SEQ ID NO：1)和人ROS融合多肽序列(SEQ ID NOs：5、7、22、28、56、58和60)通过标准序列比较，诸如使用BLAST，可以容易地确定在其他物种中的高度同源的或相同的序列。
可以通过在特定测定形式中的应用，例如FC、IHC、和/或ICC，来进一步表征和证实在本发明的方法中采用的抗体。本文进一步描述了此类方法中全长ROS蛋白特异性和/或ROS融合多肽-特异性抗体的应用。本文所述抗体(单独或在下文所述的测定中使用)还可以有利地缀合荧光染料(例如Alexa488、藻红蛋白)或标记诸如量子点(quantum dots)，连同其他信号转导(磷酸-AKT、磷酸-Erk1/2)和/或细胞标记(细胞角蛋白)抗体用于多参数分析，如下文进一步描述的。
在实施本发明的方法时，还可以使用对全长ROS蛋白特异性(即，与之特异性结合)的抗体或对ROS融合多肽特异性的抗体有利地检查本发明的ROS融合多肽和/或全长ROS在给定生物样品中的表达和/或活性。例如，ROS特异性抗体(即，特异性结合全长ROS的抗体)可商业上获得(参见Santa Cruz Biotech., Inc. (Santa Cruz, CA) 目录号sc-6347;Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA), 目录号3266); 以及例如，Abcam(Cambridge, MA), 目录号ab5512和ab108492)。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的ROS特异性抗体特异性结合ROS的激酶结构域，且因此将检测本文所述的全长ROS和全部ROS融合多肽。在一些实施方案中，本发明方法中使用的ROS特异性抗体特异性结合ROS蛋白上在ROS的激酶结构域的C'末端的区域，并且因此，将检测到全长ROS和本文所述的所有ROS融合多肽。此类抗体还可以按照标准方法制备。
在生物样品(例如肿瘤样品)中，全长ROS的表达和/或活性和/或ROS融合多肽表达的检测，可以提供关于融合蛋白是否单独驱动肿瘤或者异常表达的全长ROS是否也存在并驱动肿瘤的信息。此类信息临床上可用于评估是否靶向融合蛋白或者全长蛋白、或者二者，或可能最有益于抑制肿瘤的发展，以及有利于选择适当的治疗剂及其组合。对ROS激酶细胞外结构域特异性的抗体(其并不存在于本文公开的突变ROS中)，可以特别用于确定突变ROS激酶的存在/不存在。
应当理解的是实施本文所述方法时，可以使用多于一种抗体。例如，可以同时使用一种或多种ROS融合多肽特异性抗体连同对于另一种激酶、受体、或激酶底物(在其中表达ROS融合多肽的癌症中，其疑似被激活、或潜在被激活)特异性的抗体，以在包含来自此类癌症的细胞的生物样品中检测此类其他信号传递分子的活性。一种或多种
本领域技术人员将能理解的是，上述本发明的融合多肽及其含有表位的片段可以与其他分子的部分组合形成嵌合多肽。例如，全长ROS或ROS融合多肽的携带表位片段可以与免疫球蛋白(IgG)的恒定结构域组合，以促进嵌合多肽的纯化且增加嵌合多肽的体内半衰期(参见，例如，EPA 394,827中CD4-Ig嵌合蛋白的实例；Traunecker等人, Nature 331:84-86(1988))。具有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白(例如，来自IgG部分)还可以比单独的单体多肽更有效地结合并中和其他分子(参见Fountoulakis等人, J Biochem 270:3958-3964(1995))。
在一些实施方案中，特异性结合全长ROS或ROS融合多肽的试剂是重同位素标记的肽(即，AQUA肽)，例如，其对应于包含ROS融合多肽的融合连接的肽序列。此类AQUA肽可适合于生物样品中表达FIG-ROS融合多肽的绝对定量。如本文所使用，术语“重同位素标记肽”与“AQUA肽”可互换使用。用于绝对定量或检测复杂混合物中的蛋白质(AQUA)的AQUA肽的制备和使用已被描述。参见WO/03016861, “Absolute Quantification of Proteins andModified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry,” Gygi 等人，并且还描述在Gerber等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 6940-5 (2003) (它们的教导通过引用整体并入本文)中。关于此类AQUA肽的术语“特异性检测”意指所述肽只检测和定量含有AQUA肽序列的多肽和蛋白质，且基本上不检测不含有AQUA肽序列的多肽和蛋白质。
AQUA方法使用将已知量的至少一种重同位素标记的肽标准(其具有可由LC-SRM层析检测的独特特征(signature))导入到消化的生物样品中，以通过与肽标准比较确定生物样品中的具有相同序列和蛋白质修饰的肽的绝对量。简而言之，AQUA方法具有两个阶段：肽内标准选择和验证以及方法开发；和使用证实的肽内标准检测并定量样品中的目标蛋白来实施。该方法是一种有力的技术，用于检测和定量在复杂的生物混合物中的给定肽/蛋白质，诸如细胞裂解物，并且可以用来，例如，定量由于药物处理而引起的蛋白质磷酸化的变化，或定量在不同生物状态蛋白质水平的差异。
通常，为了开发出适当的内标准，基于其氨基酸序列和用来消化的特定蛋白酶，选择在目标蛋白质序列内的特定肽(或修饰肽)。然后通过固相肽合成方法产生肽，从而使得一个残基被含有稳定同位素(13C、15N)的相同残基置换。结果是这种肽在化学上与通过蛋白质水解形成的天然对应物相同，但容易通过MS并经由7-Da质量漂移加以区别。然后通过LC-MS/MS评价新合成的AQUA内标准肽。通过反向层析、电离效率、以及借助于碰撞诱导解离的片段化，该方法提供了关于肽保留的定性信息。选择用于天然和内标准肽集合的信息和丰富的片断离子，然后作为层析保留的函数快速连续加以具体监测以形成基于肽标准的独特概况的选择反应监测(LC-SRM)方法。
AQUA策略的第二阶段是应用该方法测量复杂混合物中的蛋白质或修饰蛋白质的量。通常使用SDS-PAGE凝胶电泳分级分离全细胞裂解物，并且切出与蛋白质迁移一致的凝胶区域。该过程之后是在AQUA肽存在的情况下进行凝胶内蛋白水解和LC-SRM分析。(参见Gerber等人, 同上。 )将AQUA肽加入到通过蛋白水解酶消化全细胞裂解物获得的复杂肽混合物，然后经受免疫亲和纯化，如上所述。通过消化(例如胰蛋白酶消化)形成的天然肽的保留时间和片段化模式与先前测定的AQUA内标准肽的相同；因此，采用SRM实验进行LC-MS/MS分析导致内标准和直接来自极端复杂肽混合物的分析物两者的高度特异性和敏感的测量。
由于加入了绝对量的AQUA肽(例如250 fmol)，所以曲线下面的比率可以用来确定在最初细胞裂解物中蛋白质或蛋白质的磷酸化形式的精确的表达水平。此外，凝胶内消化形成天然肽时存在内标准，从而使得凝胶片断肽提取效率、处理样品过程中的绝对损失(包括真空离心)和在导入LC-MS系统过程中的易变性不影响天然和AQUA肽丰度的确定的比率。
开发了一种AQUA肽标准，其用于通过IAP-LC-MS/MS方法先前在目标蛋白内鉴定的已知序列。如果位点被修饰，则可以开发一种AQUA肽，其在位点内掺入特定残基的修饰形式；以及开发第二种AQUA肽，其掺入残基的未修饰形式。以这种方式，使用两种标准检测并定量生物样品中位点的修饰和未修饰的形式。
还可以通过检查蛋白质的一级氨基酸序列和确定由蛋白酶剪切产生的肽的边界来产生肽内标准。可替代地，可以用蛋白酶实际消化蛋白质，然后可以对产生的特定肽片断进行测序。合适的蛋白酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶、hepsin)、金属蛋白酶(例如PUMP1)、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、羧肽酶等。
按照一个或多个标准选择目标蛋白内的肽序列，以优化使用该肽作为内标准。优选地，选择肽的大小以便将在其他非目标蛋白中重复肽序列的机会降到最低程度。因此，肽优选为至少约6个氨基酸。还优化肽的大小以使电离频率最大化。因此，在一些实施方案中，肽不大于约20个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度约7-15个氨基酸。还选择在质谱法过程中不可能是化学活性的肽序列，因此避免包含半胱氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的序列。
可以选择不包括目标区域的修饰区域的肽序列，从而使得可以使用所述肽内标准来确定所有形式蛋白质的量。或者，包括修饰氨基酸的肽内标准可以期望用来仅检测和定量目标蛋白的修饰形式。可以一起使用用于修饰和未修饰区域两者的肽标准，确定特定样品中修饰的程度(即确定蛋白质总量的多少部分由修饰形式表示)。例如，可以使用已知在特定位点磷酸化的蛋白的磷酸化和非磷酸化形式两者的肽标准来定量样品中磷酸化形式的量。
使用一种或多种标记的氨基酸来标记肽(即，标记是肽的实际部分)，或较少优选地可以在按照标准方法合成以后连接标记。优选地，标记是基于以下考虑事项所选择的质量变化标记：质量应当对于MS分析所产生的片断质量与具有低背景的谱区的迁移是独特的；离子质量特征成分是标记部分的一部分，其在MS分析中优选呈现独特的离子质量特征；标记的组分原子的质量总和优选独特地不同于所有可能的氨基酸的片断。作为结果，通过在所得到的质谱中的离子/质量模式，标记氨基酸和肽容易与未标记的氨基酸和肽分开。优选地，离子质量特征成分将质量赋予并不匹配任何20种天然氨基酸的残基质量的蛋白质片断。
所述标记在MS的片段化条件下是稳定的，不会经历不利的片段化。在一定范围的条件下，尤其是在变性条件下，标记化学应是有效的，并且标记标签优选仍然可溶于所选择的MS缓冲系统中。标记优选不抑制蛋白质的电离效率并且不是化学反应性的。标记可以含有两种或更多种不同同位素物质的混合物以在每一个标记的片段位置产生独特的质谱模式。稳定的同位素诸如2H、13C、15N、17O、18O或34S是一些非限制性标记。还可以制备掺入不同同位素标记的肽内标准对。重同位素标记可以掺入的非限制性氨基酸残基包括亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。
按照它们的质荷(m/z)比，以及优选地还按照它们在色谱柱(例如，HPLC柱)上的保留时间来表征肽内标准。与相同序列的未标记肽共洗脱的内标准被选为最佳内标准。然后通过任何适当的方法，例如通过使用例如氩气或氦气作为碰撞气体的碰撞诱导解离(CID)对肽进行片段化，来分析内标准。然后采用例如多步质谱法(MSn)分析片段以获得片段离子谱，从而获得肽片段化特征。优选地，肽片断具有显著的m/z比差异，以使得对应于各片段的峰很好分开，以及获得目标肽特有的特征。如果在第一步没有获得适当的片段特征，则进行MS的另一阶段，直到获得独特的特征。
在MS/MS和MS3谱中的片段离子对于目标肽通常是高度特异的，连同LC方法，可以高度选择性地检测和定量复杂蛋白质混合物，诸如细胞裂解物，中的目标肽/蛋白质，其中细胞裂解物包含数千或上万种蛋白质。可以测定潜在地包含感兴趣的目标蛋白/肽的任何生物样品。优选使用粗的或者部分纯化的细胞提取物。通常，样品具有至少0.01 mg的蛋白质，通常浓度为0.1-10 mg/mL，并且可调节到期望的缓冲液浓度和pH。
然后将对应于待检测/定量的目标蛋白的已知量的标记肽内标准，优选约10飞摩尔，加入到生物样品，诸如细胞裂解物中。然后用一种或多种蛋白酶消化掺入样品适当的时间以允许进行消化。然后进行分离(例如通过HPLC、反相HPLC、毛细管电泳、离子交换层析等)以从样品中的其他肽分离标记内标准和其相应的目标肽。微毛细管LC是一种非限制性方法。
然后通过监测MS中的选择反应来检查每种分离的肽。这涉及利用通过表征肽内标准所获得的先前知识，然后获得MS，以连续监测在MS/MS或MSn谱用于目标肽和内标准两者的特定离子。在洗脱后，计算肽标准和目标肽峰两者的曲线下面积(AUC)。两个面积的比率提供绝对定量，其可以加以归一化，以获得在分析中使用的细胞数目和蛋白质的分子量，从而提供每个细胞的精确的蛋白质拷贝数。AQUA方法更详细地描述在Gygi等人，和Gerber等人同上。
如上所述，可以期望制备AQUA内肽标准(重同位素标记肽)以检测本发明突变ROS多肽内的任何量任何独特位点(例如FIG-ROS融合多肽内的融合连接)。例如，可以制备AQUA磷酸肽，其相应于FIG-ROS融合多肽之一的融合连接序列。可以针对FIG-ROS融合连接制成肽标准，且在AQUA方法中使用此类标准检测并定量生物样品中的融合连接(即FIG-ROS 融合多肽的存在)。
例如，本发明的一个非限制性AQUA肽包括氨基酸序列AGSTLP (SEQ ID NO: 66)，其对应于FIG-ROS融合多肽(即，FIG-ROS(S)融合多肽)的短变体中直接侧接融合连接的每一侧的三个氨基酸，其中由FIG基因编码的氨基酸是斜体且由ROS基因编码的氨基酸是粗体。应当理解的是还可以构建包含融合连接序列(和其下游或上游另外的残基)的更大的AQUA肽。类似地，可以可替代地构建更小的AQUA肽，其包含少于此类序列的所有残基(但仍然包含融合连接本身的点)。此类更大或者更短的AQUA肽在本发明的范围之内，并且可以如上所述进行AQUA肽的选择和制备(参见Gygi等人, Gerber等人，同上。)。
应当指出的是，因为AQUA肽跨越本文所述的ROS融合蛋白之一的融合连接的序列也可以是(或者包括在)ROS融合体特异性抗体特异性结合的表位。“表位”是指免疫原性表位(即能够引发免疫应答)或抗原性表位(即，抗体可以特异性结合的蛋白分子的区域)。蛋白的免疫原性表位的数量少于抗原性表位的数量。参见，例如，Geysen等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983)。
表2提供了本发明的ROS融合多肽的所有融合连接的序列的列表，其中非ROS基因编码的氨基酸用斜体表示，并且ROS基因编码的氨基酸用粗体表示。
表 2
在一些实施方案中，哺乳动物肺癌来自人类(即，人)。在一些实施方案中，哺乳动物肺癌是NSCLC(非小细胞肺癌)。在一些实施方案中，哺乳动物肺癌是SCLC(小细胞肺癌)。在本发明方法的进一步实施方案中，所述哺乳动物是人，且人可以是用于治疗肺癌的ROS抑制性治疗剂的候选者。所述人候选者可以是目前用ROS激酶抑制剂治疗或者考虑用ROS激酶抑制剂治疗的患者。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是大型动物，诸如马或牛，而在其他实施方案中，所述哺乳动物是小型动物，诸如狗或猫，已知其均发展肺癌，诸如NSCLC和SCLC。
如在整个说明书中所用，术语“生物样品”以其最广的含义使用，并且指任何疑似包含具有ROS激酶活性的生物样品，包括但不限于，ROS融合多肽或全长ROS蛋白(具有或不具有信号肽序列)或其具有ROS激酶活性的片段。生物样品包括但不限于，唾液、粘液、泪液、血液、循环肿瘤细胞、血清、组织、骨髓、淋巴/间质液、口腔细胞、粘膜细胞、脑脊髓液、精液、排泄物、血浆、尿液、细胞悬浮液、或细胞和病毒的悬浮液及其提取物，以及可以包括细胞、分离自细胞的染色体(例如，一定范围的中期染色体)、基因组DNA(在溶液中或结合于固体载体诸如用于Southern分析)、RNA(在溶液中或结合于固体载体诸如用于northern分析)、cDNA(在溶液中或结合于固体载体)。在一些实施方案中，生物样品包含疑似为癌性的肺细胞。
任何包含来自哺乳动物癌症的细胞(或细胞提取物)的生物样品适合于本发明的方法。在一个实施方案中，生物样品包括从肿瘤活组织检查或肿瘤切除术获得的细胞。活组织检查物或切除术可以按照标准临床技术从哺乳乳动物器官的原发性肿瘤或者从已转移到其他组织的继发性肿瘤获得。在另一个实施方案中，生物样品包括从来源于肿瘤的细针头穿刺物获得的细胞，获得这些穿刺物的技术是本领域众所周知的(参见Cristallini等人，Acta Cytol. 36(3): 416-22 (1992))。
生物样品还可以包括从渗出液诸如胸膜渗出液获得的细胞。已知在许多晚期肺癌(包括NSCLC)患者中形成胸膜渗出液(形成在胸腔中的肺外侧并且包含癌细胞的液体)，并且此类渗出液的存在是不良结果和短存活时间的预兆。已描述了用于获得胸膜渗出液的标准技术并且在本领域是众所周知的(参见Sahn, Clin Chest Med. 3(2): 443-52(1982))。
生物样品可以包括从支气管肺泡灌洗获得的细胞。支气管肺泡灌洗是标准医疗程序，其中使支气管镜通过口腔或鼻腔到肺并且将流体喷入肺部的一小部分，然后重新收集用于检查。
在一些实施方案中，生物样品包括循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞(“CTC”)可以被纯化，例如，使用以商标Vita-Assays™、Vita-Cap™、和CellSearch® (商购自Vitatex, LLC(a Johnson and Johnson corporation))销售的试剂盒和试剂。描述了分离CTC的其他方法(参见，例如，PCT公开号WO/2002/020825, Cristofanilli等人, New Engl. J. of Med.351 (8):781-791 (2004), 和Adams等人, J. Amer. Chem. Soc. 130(27): 8633-8641(July 2008))。在一个具体实施方案中，循环肿瘤细胞(“CTC”)可以被分离并鉴定为源自肺。
因此，本发明提供方法用于分离CTC，然后以一种或多种测定形式筛选CTC以鉴定具有ROS激酶活性的多肽或编码其的核酸分子(例如，全长ROS多肽或多核苷酸或ROS融合多肽或多核苷酸)在CTC中的存在。
按照标准技术，本文所述生物样品的细胞提取物可以制成粗制品，或经过部分(或者完全)纯化，并用于本发明方法。可替代地，包含全细胞的生物样品根据标准方法诸如以下描述的那些(还参见，例如，Ausubel等人，同上)可以用于在测定形式，诸如体外激酶测定法、ELISA测定法、免疫组织化学(IHC)、流式细胞术(FC)、和免疫荧光(IF)、免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)和聚合酶链式反应(PCR)。此类全细胞测定法是有利的，因为它们将肿瘤细胞样品的操作降到最低程度，因此降低了改变细胞的体内信号传递/激活状态和/或引入人工信号的风险。全细胞测定法还是有利的，因为它们仅在肿瘤细胞中、而不是肿瘤和正常细胞的混合物中表征表达和信号传递。
因此，可用于实施本发明方法中的生物样品可以从任何哺乳动物获得，在所述哺乳动物中，特征在于存在具有ROS激酶活性的多肽(例如，全长ROS多核苷酸或多肽或ROS融合多核苷酸或多肽)的癌症或疑似癌症存在或可能存在或发展。如本文所使用，关于癌症(或疑似癌症)和所示分子(例如，具有ROS激酶活性的多肽)的短语“特征在于”是指其中与另一种癌症或正常组织(其中全长ROS和/或具有ROS激酶活性的多肽的此类易位、异常表达不存在)相比其中存在基因易位或突变(例如，引起全长ROS的异常表达)和/或表达的具有ROS激酶活性的多肽的癌症(或疑似癌症)。全长ROS和/或具有ROS激酶活性的多肽的此类易位、异常表达的存在可以，全部或部分，驱动(即，刺激或引起)此类癌症或疑似癌症的生长和存活。
因此，被鉴定为包含具有ROS激酶活性的多肽或编码其的多核苷酸(例如，全长ROS多肽或多核苷酸或ROS融合多肽或多核苷酸)的来自患者的任何生物样品(例如，CTC、胸腔积液、针穿刺物、肿瘤活检等..)可以表明该患者的始发性癌症(例如，肺癌诸如NSCLC或SCLC)被具有ROS激酶活性的多肽驱动，并且因此可能对包含至少一种ROS激酶抑制性治疗剂的组合物响应。
如本文所使用，“可能响应”是指癌症更可能显示对ROS抑制性治疗剂(例如，在与ROS抑制性治疗剂接触或用ROS抑制性治疗剂处理之后)响应的生长迟缓或停止。在一些实施方案中，可能对ROS抑制性治疗剂响应的癌症是响应于ROS抑制性治疗剂而死亡(例如，肿瘤细胞细胞凋亡)的癌症。
在评估包含来自哺乳动物癌症肿瘤的细胞的生物样品中具有ROS激酶活性的多肽(或编码其的多核苷酸)的存在时，可以期望采用代表其中不存在此类具有ROS激酶活性的多肽的细胞(例如，健康肺组织)的对照样品用于比较目的。理想地，对照样品包含来自特定癌症(例如，肺癌)的亚型的细胞，所述亚型代表其中不存在具有ROS激酶活性的多肽(或编码其的多核苷酸)的亚型。因此，对照样品与试验生物样品中水平的比较可以确定是否存在突变多核苷酸和/或多肽。可替代地，因为具有ROS激酶活性的多肽(或编码其的多核苷酸)可能不存在于大多数癌症中，所以类似地不表达具有ROS激酶活性的多肽(或编码其的多核苷酸)的任何组织可以用作对照。
下述方法对于特征在于具有ROS激酶活性的多肽的存在的癌症、以及与其有关的治疗决策将具有有价值的诊断应用。例如，生物样品可以获自以下受试者，所述受试者先前并没有诊断为具有特征在于具有ROS激酶活性的多肽的存在的癌症，也还没有经受针对此类癌症的治疗，并且该方法用来诊断性鉴定此类受试者中的肿瘤为属于其中存在/表达具有ROS激酶活性的多肽(或编码其的多核苷酸)的肿瘤亚型(例如，NSCLC或SCLC)。
可替代地，生物样品可以获得自已经被诊断为具有特征在于存在一种类型的激酶诸如EFGR的癌症并且已经接受用于治疗此类癌症的治疗诸如EGFR抑制剂治疗(例如，Tarceva™、Iressa™)的受试者，并且采用本发明的方法以鉴定受试者的肿瘤是否特征还在于存在具有ROS激酶活性的多肽(或编码其的多核苷酸)，诸如全长ROS蛋白或许多ROS融合多肽之一(例如，SLC34A2-ROS(S))，并且因此可能对现有治疗完全响应和/或可替代或额外的ROS抑制性治疗是否是期望的或保证的。本发明的方法还可以用于监测在用包含ROS抑制性治疗剂或治疗剂组合的组合物对受试者进行治疗以后表达ROS激酶活性的多肽的癌症的发展或抑制。
此类诊断测定法可以在初步评价或外科检视程序之后或之签进行。本发明的鉴定方法可以有利地用作诊断方法来确定患有特征在于具有ROS激酶活性的多肽(诸如，ROS融合蛋白(例如，FIG-ROS(S))的存在的癌症的患者，所述癌症诸如肺癌(例如，非小细胞肺癌)，所述患者将最可能对目标在于抑制ROS激酶活性的治疗剂响应。选择此类患者的能力也将用于临床评估未来ROS抑制性治疗剂的功效以及用于给予患者的此类药物的未来处方。
选择性鉴定其中存在具有ROS激酶活性的多肽(或编码其的多核苷酸)，诸如ROS融合蛋白或ROS融合多核苷酸，或全长ROS多肽或全长ROS多核苷酸的癌症的能力使得能够实现重要的新方法，其用于精确地鉴定此类肿瘤(用于诊断目的)，以及获得信息，当作为单药剂施用以治疗癌症时，该信息可用于确定此类肿瘤是否可能对ROS抑制性治疗剂组合物响应，或是否可能部分或完全地对靶向不同激酶的抑制剂不响应。
如本文所使用，“癌症”或“癌性”是指与相同细胞类型的正常(即，非癌性)细胞相比显示异常生长的细胞。例如，癌性细胞可以是转移性或非转移性的。癌性细胞也可以显示缺乏接触抑制，其中该相同细胞类型的正常细胞显示了接触抑制。在一些实施方案中，癌症是肺癌(例如，非小细胞肺癌或小细胞肺癌)。如本文所使用，“疑似癌症”(如在“疑似哺乳动物肺癌”)或“疑似癌性的组织”是指与疑似癌症相同细胞或组织类型的正常细胞或组织相比具有一些异常特征(例如，增生性或缺乏接触抑制)、但其中细胞或组织尚未由医生或病理学家证实作为癌性的细胞或组织。
在一些实施方案中，本发明的各种方法可以用本领域技术人员已知的各种不同测定形式进行。一些方法的非限制性实例包括免疫测定以及肽和核苷酸测定。
免疫测定
可用于实施本发明方法的免疫测定可以是均质免疫测定(homogenous immunoassay)或者异质免疫测定(heterogeneous immunoassay)。在均质免疫测定中，免疫反应通常涉及特异性试剂(例如ROS特异性抗体)、标记的分析物和目标生物样品。在抗体结合于标记分析物以后，产生自标记的信号被直接或间接地修饰。在均质溶液中进行免疫反应及其程度的检测两者。可以使用的免疫化学标记包括自由基、放射同位素、荧光染料、酶、噬菌体、辅酶等。还可以有利地使用半导体纳米晶体标记或者“量子点”，其制备和使用已被详细描述。通常参见，K. Barovsky, Nanotech. Law & Bus. 1(2): Article 14 (2004)和本文引述的专利。
在异质测定方法中，所述材料通常是生物样品、结合试剂(例如抗体)和用于产生可检测信号的适宜方式。可以使用下文进一步描述的生物样品。抗体通常固定到载体上，诸如珠、平板或载片，并且在液相中与疑似含有抗原的样品接触。然后将载体从液相中分离，检测支持相或液相使用产生可检测信号的手段产生的可检测信号。信号与生物样品中分析物的存在相关。产生可检测信号的手段包括使用放射性标记、荧光标记、酶标记、量子点等。例如，如果待检测的抗原含有第二个结合位点，那么结合该位点的抗体可以缀合可检测基团，并在分离步骤前将所述抗体加入到液相反应溶液中。在固相载体上可检测基团的存在表示在检测的样品中存在抗原。适当的免疫测定的实例为放射免疫测定、免疫荧光方法、酶联免疫测定等。
可用于进行本文公开的方法的免疫测定形式及其变体为本领域众所周知。通常参见E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.);还参见例如美国专利号4,727,022 (Skold等人，“Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application”); 美国专利号4,659,678 (Forrest等人，“Immunoassay of Antigens”); 美国专利号4,376,110 (David等人，“ImmunometricAssays Using Monoclonal Antibodies”)。适合形成试剂-抗体复合物的条件为本领域技术人员众所周知。参见同上。ROS特异性抗体可用于“双位点(two-sites)”或“三明治”测定法中，其中单一杂交瘤细胞系作为标记的单克隆抗体和结合的单克隆抗体两者的来源。此类测定法描述于美国专利号4,376,110。可检测试剂的浓度应当足够，从而使得具有ROS 激酶活性的蛋白(例如，全长ROS蛋白或ROS融合多肽)的结合与背景相比可以被检测到。
可用于实施本文公开的方法中的抗体可以是按照已知技术诸如沉淀缀合到适合用于诊断测定的固体载体上(例如由材料诸如胶乳或聚苯乙烯形成的珠、板、载片或孔)。同样，抗体或者其他结合试剂结合试剂也可以按照已知技术缀合到可检测基团诸如放射性标记(例如35S、125I、131I)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)和荧光标记(例如荧光素)。
基于细胞的测定法，诸如流式细胞术(FC)、免疫组织化学(INC)或者免疫荧光(IF)尤其适合实施本发明方法，因为这些测定形式适合临床，能在体内检测具有ROS激酶活性的蛋白(例如，全长ROS多肽或ROS融合多肽)的表达，并能避免由于操纵从例如肿瘤样品获得的细胞获得提取物时导致的人为活性变化的风险。因此，在一些实施方案中，本发明的方法通过用流式细胞术(FC)、免疫组织化学(IHC)或者免疫荧光(IF)测定形式进行。
可以在用靶向抑制ROS激酶活性的药物处理前、处理中和处理后用流式细胞术(FC)检测哺乳动物肿瘤中具有ROS激酶活性的多肽的表达。例如，可以通过流式细胞术分析来自细针穿刺物的肿瘤细胞的具有ROS激酶活性的多肽或编码其的多核苷酸(例如，全长ROS多核苷酸或多肽或者ROS融合多核苷酸或多肽)的表达和/或激活、以及鉴定癌细胞类型的标记等(如果希望如此)。可以按照标准方法进行流式细胞术。参见例如， Chow等人,Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46: 72–78 (2001)。简而言之，例如可采用以下方案进行细胞计数分析：用2％多聚甲醛在37℃固定细胞10分钟，然后在90％甲醇在冰上透化30分钟。然后用第一抗体(例如，全长ROS特异性或ROS融合多肽特异性抗体)染色细胞、洗涤并用荧光标记的第二抗体标记。然后按照所使用仪器的特定方案用流式细胞仪(例如Beckman Coulter FC500)分析细胞。此类分析将鉴定肿瘤中表达的全长ROS或ROS融合多肽的水平。在用ROS抑制性治疗剂处理肿瘤后，类似的分析将揭示表达全长ROS肿瘤或表达ROS融合多肽的肿瘤对靶向ROS激酶抑制剂的响应。
可以在用靶向抑制ROS激酶活性的治疗剂处理前、处理中和处理后使用免疫组织化学(IHC)染色检测哺乳动物癌症(例如，肺癌)中具有ROS激酶活性的多肽的表达和/或激活状态。可以按照众所周知技术进行IHC。参见例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Chapter 10, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988)。简而言之，例如石蜡包埋的组织(例如来自活组织检查的肿瘤组织)通过对组织切片用二甲苯然后用乙醇脱蜡用于免疫组织化学染色；先用水然后用PBS水化；通过在柠檬酸钠缓冲液中加热载片暴露抗原；在过氧化氢中孵育切片；在封闭溶液中封闭；将载片在第一抗体(例如，ROS-特异性抗体)和第二抗体中孵育；最后使用抗生物素蛋白/生物素方法检测。
在用靶向抑制ROS激酶活性的治疗剂处理前、处理中和处理后，还可以使用免疫荧光(IF)测定法确定哺乳动物癌症中具有ROS激酶活性的多肽(例如，全长ROS多肽或ROS融合多肽)的表达和/或激活状态。可以按照众所周知技术进行IF。参见，例如，J.M. polak和S.Van Noorden (1997) Introduction to Immunocytochemistry, 第2版; RoyalMicroscopy Society Microscopy Handbook 37, BioScientific/Springer-Verlag。简而言之，例如患者样品可以先用多聚甲醛然后用甲醇固定后，在封闭溶液诸如马血清中封闭，与针对(即特异性结合)具有ROS激酶活性的多肽(例如CD74-ROS融合多肽)的第一抗体孵育，随后用荧光染料诸如Alexa 488标记的第二抗体孵育，然后用落射荧光显微镜分析。
用于测量具有ROS激酶活性的多肽的表达和/或活性的各种各样的其他方案，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、Western 印迹分析、体外激酶测定、以及荧光激活细胞分选术(FACS)，在本技术领域是已知的，并且提供用于诊断具有ROS激酶活性的多肽(例如，全长ROS、或ROS融合多肽诸如FIG-ROS(S)融合多肽)存在的基础。通过获自正常哺乳动物受试者(优选人)的体液或细胞提取物在适合于复合物形成的条件下与特异性结合全长ROS多肽的抗体组合，来建立全长ROS多肽表达的正常或标准值。可以通过各种方法，但优选通过光度法，来定量标准复合物形成的量。将在受试者、对照、以及来自活检组织的疾病样品中表达的全长ROS多肽的量与标准值比较。标准和受试者值之间的偏差建立用于诊断疾病的参数。当然，如本文所述，由于在癌性肺组织中发现具有ROS激酶活性的蛋白(例如，FIG-ROS(S)或SLC34A2-ROS(S))，所以预测没有正常肺组织生物样品含有这些具有ROS激酶活性的蛋白(或编码其的多核苷酸)。
在另一个方面，本发明提供了用于检测生物样品中编码具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的存在的方法，所述生物样品来自哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌，所述方法包括以下步骤：(a)获得来自哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌的生物样品并且(b)利用特异性结合编码所述具有ROS激酶活性的多肽的所述多核苷酸来确定所述多核苷酸是否在所述生物样品中存在，其中所述试剂与所述生物样品的特异性结合的检测表明所述生物样品中存在编码所述具有ROS激酶活性的多肽的所述多核苷酸。
可以通过任何标准方法评估编码具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的存在。此外，这些方法可以与方法组合以检测具有如上所述的ROS激酶活性的多肽。
核苷酸测定。
用于实施本发明方法的全长ROS多核苷酸或ROS融合多核苷酸特异性结合试剂还可以是能直接杂交并检测生物样品中的融合或截短多肽表达转录物的mRNA、寡核苷酸或DNA探针。此类探针本文详细讨论。简而言之，例如福尔马林固定的、石蜡包埋的(PPFE)患者样品可以用荧光素标记的RNA探针探测，随后用甲酰胺、SSC和PBS洗涤，并且用荧光显微镜分析。
编码具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸还可以用于诊断目的。可以使用的多核苷酸包括寡核苷酸序列、反义RNA和DNA分子和PNA。该多核苷酸可以用来检测和定量在活检组织中的基因表达，其中具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽或全长ROS)的表达可以与疾病有关。诊断测定可以用来区别具有ROS激酶活性的多肽的缺少、存在、以及过量表达，以及在治疗性干预过程中监测具有ROS激酶活性的多肽的水平的调节。
在一个实施方案中，可以使用能够检测多核苷酸序列包括编码具有ROS激酶活性的多肽(例如，编码ROS融合多肽或全长ROS蛋白)的基因组序列的PCR引物杂交以鉴定编码具有ROS激酶活性的此类多肽的核酸序列。无论探针是来源于高度特异的区域，例如融合连接的10个独特核苷酸，还是来源于特异性较低的区域，例如3′编码区，探针的特异性以及杂交或扩增(最强、高、中等或低)严格性将决定探针是否仅鉴定编码ROS激酶多肽(例如，全长ROS或ROS融合蛋白)的天然存在序列、等位基因或相关序列。
探针还可以用于检测相关序列，并且应当优选含有至少50％的任一个突变ROS多肽编码序列的核苷酸。本发明的杂交探针(例如，FISH探针或Southern或Northern印迹探针)可以是DNA或RNA并且衍生自SEQ ID NO：_______的核苷酸序列[ROS和所有ROS融合蛋白的DNA序列]。在其中具有ROS激酶活性的多肽是ROS融合蛋白的一些实施方案中，杂交探针涵盖融合连接，或来自包括天然存在的ROS基因和融合伴侣基因(例如SLC34A2、FIG、或CD74)的启动子、增强子元件和内含子的基因组序列。
ROS融合多核苷酸(即，编码ROS融合多肽诸如FIG-ROS(S)或CD74-ROS的多核苷酸)或全长ROS多核苷酸可以用于以下方法中以检测改变的具有ROS激酶活性的多肽表达，所述方法包括 Southern或者Northern分析、斑点印迹或者其他基于膜的技术；PCR技术；或者浸测法(dip stick)、针(pin)、ELISA或者使用来自患者活组织检查的体液或者组织的芯片分析。此类定性或者定量方法是本领域所众所周知的。在特定方面，编码具有ROS激酶活性的多肽的核苷酸序列可以用于检测各种肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)的激活或者诱导的测定法中。编码具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸可以通过标准方法可检测地标记，并在适合形成杂交复合物的条件下加入到来自患者的体液或组织样品中。在孵育适当时间后，洗涤样品并定量信号，与标准值比较。如果活组织检查的样品或者提取的样品中信号量与可比较的对照样品相比明显改变，则核苷酸序列与样品中的核苷酸序列杂交，并且样品中编码具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽或全长ROS多肽)的核苷酸序列水平发生改变表示存在相关疾病。此类测定法还可用于评价在动物研究、临床试验或者单个患者的监测治疗中特定治疗方案的效力。
在一些实施方案中，使用PCR测定形式执行本发明的方法。对本领域技术人员而言，聚合酶链式反应(PCR)是标准的。参见例如，Molecular Cloning, A LaboratoryManual, 第2版, Sambrook, J., Fritsch, E. F.和Maniatis, T., eds., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)。PCR引物(也称为寡聚物)可以是化学合成的、酶促产生的或者从重组来源产生的。寡聚物优选由两种核苷酸序列组成，一种具有有义方向(5′到3′)，而另一种具有反义方向(3′到5′)，在最佳条件下使用以鉴定特定基因或条件。相同的两个寡聚体、寡聚体的嵌套集合、或甚至寡聚体的简并合并物可以在较低严格的条件下用于检测和/或定量紧密相关的DNA或RNA序列。
可以使用定量具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽或者全长ROS多肽)表达的方法包括放射性标记或者生物素标记核苷酸、共扩增对照核酸以及实验结果被内插到其上的标准曲线(Melby等人, J. Immunol. Methods, 159 ：235-244 (1993); Duplaa 等人Anal. Biochem. 229-236 (1993))。可以通过以ELISA形式进行测定来加速多个样品的定量速度，其中以不同稀释度提供目标寡聚体，以及分光光度或比色反应给出快速定量。
在本发明的另一个实施方案中，可以使用编码具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸产生杂交探针，所述杂交探针可用于对天然存在的基因组序列作图。可以使用众所周知的技术将所述序列作图至特定染色体或者染色体的特异区域。此类技术包括荧光原位杂交(FISH)、FACS或者人工染色体构建诸如酵母人工染色体、细菌人工染色体、细菌P1构建或者单染色体cDNA文库，这些被综合概括在Price, C. M., Blood Rev. 7: 127-134(1993),和Trask, B. J., Trends Genet. 7: 149-154 (1991)中。
在进一步实施方案中，在本发明的方法中使用荧光原位杂交(FISH)(如在Verma等人Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York,N.Y. (1988)中所述)。在一些实施方案中，FISH测定可以与其他物理染色体作图技术和基因图谱数据关联。FISH 技术是众所周知的(参见例如，美国专利号5,756,696; 5,447,841;5,776,688; 和5,663,319)。基因图谱数据的实例可以在1994 Genome Issue of Science(265: 1981f)中找到。在物理染色体图谱上编码ROS蛋白的基因，和/或在ROS融合多肽的情况下，编码ROS融合蛋白的融合伴侣的基因(例如，FIG 基因、SLC34A2基因或CD74基因)的位置和特定疾病、或特定疾病的倾向性之间的相关性可以有助于限定与遗传疾病有关的DNA区。本发明的核苷酸序列可以用来检测正常、载体、或者感染个体之间的基因序列的差异。
染色体制备物的原位杂交和物理作图技术诸如使用建立的染色体标记的连锁分析可用于延伸基因图谱。将基因放置在另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的染色体上，经常可以揭示相关标记，即使特定人染色体的数目或臂是未知的。通过物理作图，可以将新序列分配给染色体臂、或其部分。这为研究者提供有价值的信息，以便利用定位克隆或其他基因发现技术来寻找疾病基因。一旦通过基因连锁将疾病或综合征粗略地定位到特定基因组区，例如AT到11q22-23(Gatti等人，Nature336：577-580(1988))，任何序列作图到该区域可以表示用于进一步研究的相关或调节基因。本发明的核苷酸序列还可以用来检测在正常、载体、或受影响个体之间起因于易位、倒置等的染色体位置差异。
应当理解的是，所有检测编码具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸(例如，全长ROS或ROS融合多核苷酸诸如FIG-ROS(S))的方法，可以与其他检测具有ROS激酶活性的多肽或编码具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的方法组合。例如，在生物样品中的遗传物质中FIG-ROS (S)融合多核苷酸的检测(例如，循环肿瘤细胞中的FIG-ROS(S))可以随后为Western印迹分析或免疫组织化学(IHC)分析样品的蛋白，以确定FIG-ROS(S)多核苷酸实际上是否表达为生物样品中的FIG-ROS(S)融合多肽。此类Western印迹或IHC分析可以使用特异性结合由检测到的FIG-ROS(S)多核苷酸编码的多肽的抗体进行，或者该分析可以使用特异性结合全长FIG(例如，结合蛋白的N-末端)或全长ROS(例如，结合ROS的激酶结构域中的表位)的抗体来进行。此类测定是本领域中已知的(参见，例如，美国专利7,468,252)。
在另一个实例中，Dako的CISH技术允许相同组织切片上的显色原位杂交和免疫组织化学。对于CISH和FISH的比较，参见Elliot等人, Br J Biomed Sci 2008; 65(4): 167-171, 2008。
本发明的另一个方面提供了用于诊断患有由ROS激酶驱动的肺癌或疑似肺癌的患者的方法。该方法包括：将所述肺癌或疑似肺癌的生物样品(其中所述生物样品包含至少一种核酸分子)与探针接触，所述探针在严格条件下与核酸分子杂交，所述核酸分子编码具有ROS激酶活性的多肽，诸如全长ROS多核苷酸或ROS融合多核苷酸(例如，FIG-ROS(S)融合多核苷酸，FIG-ROS(L)融合多核苷酸，FIG-ROS(VL)融合多核苷酸，SLC34A2-ROS(S)融合多核苷酸，SLC34A2-ROS(VS)融合多核苷酸，SLC34A2-ROS(L)融合多核苷酸或CD74-ROS融合多核苷酸)，且其中所述探针与所述生物样品中的至少一种核酸分子的杂交将所述患者鉴定为患有由ROS激酶驱动的肺癌或疑似肺癌。
本发明的又另一个方面提供了用于诊断患有由ROS激酶驱动的肺癌或疑似肺癌的患者的方法。该方法包括将所述肺癌或疑似肺癌的生物样品(其中所述生物样品包含至少一种多肽)与试剂接触，所述试剂特异性结合具有ROS激酶活性的多肽(例如，FIG-ROS(S)融合多肽、FIG-ROS(L)融合多肽、FIG-ROS(VL)融合多肽、SLC34A2-ROS(S)融合多肽、SLC34A2-ROS(VS)融合多肽、SLC34A2-ROS(L)融合多肽、或CD74-ROS融合多肽)，其中所述试剂与所述生物样品中的至少一种多肽的特异性结合将所述患者鉴定为患有由ROS激酶驱动的肺癌或疑似肺癌。
在各个实施方案中，将肺癌或疑似肺癌鉴定为由ROS激酶驱动将具有该肺癌或疑似肺癌的患者鉴定为可能对ROS抑制性治疗剂响应。
为了提供特征在于具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽)的表达的疾病(例如，肺癌)的诊断基础，可以建立表达的正常或标准概况。这可以通过在适合于杂交或扩增的条件下，使获自正常受试者(动物或人)的体液或细胞提取物与编码具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽或全长ROS多肽)的多核苷酸序列或其片断相组合来完成。可以通过比较获自正常受试者的值与来自使用已知量的基本上纯化多核苷酸的实验的值而定量标准杂交。从正常样品获得的标准值可以与从有患有疾病症状的患者的样品获得的值比较。标准值和受试者的值之间的偏差用于确定存在疾病。
一旦疾病被证实且启动治疗方案，则定期重复杂交测定法以评价患者表达水平是否开始接近在正常患者中观察的水平。获自连续分析的结果可以用于表示经历几天到几个月的一段时间内的治疗效果。
可以确立具有ROS激酶活性的多肽的表达或活性水平的类似的正常或标准概况。例如，对于蛋白表达，所述概况可以使用特异性结合该多肽的试剂来确立，也可以使用，例如，特异性结合该多肽(例如，结合全长ROS或结合ROS融合多肽的融合连接)的抗体并且将正常受试者中的结合水平与有肺癌症状的患者中的结合水平相比较来确立。类似地，对于ROS激酶活性水平，与采集自有肺癌症状的患者的样品相比，可以在采集自正常患者的样品上进行标准体外激酶测定(参见Ausubel等人，同上；Sambrook等人，同上)。
在各个实施方案中，使用以下试剂来确定ROS表达或激酶活性的抑制剂：特异性结合ROS融合多核苷酸的试剂，特异性结合ROS融合多肽的试剂，特异性结合全长ROS多核苷酸的试剂或特异性结合全长ROS多肽的试剂。在一些额外的实施方案中，使用以下试剂来确定ROS表达或激酶活性的抑制：特异性结合全长FIG多核苷酸的试剂，特异性结合全长FIG多肽的试剂，特异性结合全长SLC34A2多核苷酸的试剂，或特异性结合全长SLC34A2多肽的试剂，特异性结合全长CD74多核苷酸的试剂，或特异性结合全长CD74多肽的试剂。
在各个实施方案中，用包含治疗剂的组合物抑制所述多肽的表达和/或活性，所述治疗剂选自克里唑替尼(也称为PF-02341066)、NVT TAE-684、AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CEP11988、WHI-P131和WHI-P154。
如本文所使用，“ROS抑制剂”或“ROS抑制性化合物”是指任何包含一种或多种化合物(化学的或生物的)的组合物，其直接或间接地抑制具有ROS激酶活性的多肽的表达和/或活性。此类抑制可以在体外或在体内。“ROS抑制性治疗剂”或“ROS-抑制性治疗剂”是指用作用来治疗具有特征在于存在具有ROS激酶活性的多肽诸如本文所述的异常表达的全长ROS蛋白或ROS融合多肽(例如，FIG-ROS融合蛋白之一)的肺癌(例如，NSCLC或SCLC)的患者的治疗剂的ROS-抑制性化合物。
在本发明的一些实施方案中，ROS抑制剂是特异性结合ROS融合多肽(例如，FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)、FIG-ROS(XL)、SLC34A2-ROS(VS)、SLC34A2-ROS(S)、SLC34A2-ROS(L)、或CD74-ROS)的试剂，特异性结合全长ROS多肽的试剂，靶向ROS融合多核苷酸(例如，SLC34A2-ROS(L)融合多核苷酸)的siRNA 或靶向全长ROS多核苷酸的siRNA。
ROS抑制性治疗剂可以例如是激酶抑制剂，诸如小分子或抗体抑制剂。它可以是对多种不同激酶具有活性的泛激酶(pan-kinase)抑制剂，或者是激酶特异性抑制剂。由于ROS、ALK、LTK、InsR、和IGF1R属于酪氨酸激酶的相同家族，所以它们可能在激酶结构域共有相似的结构。因此，在一些实施方案中，本发明的ROS抑制剂也抑制ALK激酶、LTK激酶、胰岛素受体或IGF1受体的活性。ROS抑制性化合物在下文进一步详细讨论。可以在用抑制剂治疗前或后获取患者生物样品，然后用上述方法分析抑制剂对ROS激酶活性的生物作用，包括下游底物蛋白的磷酸化。此类药效动力学分析可以用于确定药物的生物活性剂量，其优选是最大耐受剂量。此类信息对于通过阐述药物作用机制请求获得药物批准是有用的。
在另一个实施方案中，所述多肽的表达和/或活性被包含ROS抑制性治疗剂的组合物所抑制，所述ROS抑制性治疗剂选自PF-02341066)、NVT TAE-684、AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CEP11988、WHI-P131 和WHI-P154。
根据本发明，具有ROS激酶活性的多肽可以存在于人肺癌的至少一种亚型中。因此，可以通过抑制在此类癌症中ROS激酶的活性体内抑制其中表达具有ROS激酶活性的多肽的哺乳动物癌症的发展。特征在于表达具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽或异常表达全长ROS多肽)的癌症中的ROS活性可以通过将癌症与治疗有效量的ROS抑制性治疗剂相接触而抑制。因此，本发明部分提供了通过将癌症(例如，肿瘤)与治疗有效量的ROS-抑制性治疗剂接触而抑制肺癌中ROS激酶的表达和/或活性从而抑制表达具有ROS激酶活性的多肽的肺癌的进展的方法。
如本文所使用，“治疗有效量”或“药学有效量”是指与未处理的癌症或疑似癌症相比，通过减缓癌症或疑似癌症的生长、降低癌症或疑似癌症的量、减少癌症或疑似癌症的细胞数量、或杀死癌症而足以抑制癌症(或其细胞)或疑似癌症(或其细胞)的ROS抑制性治疗剂的量。
ROS抑制性治疗剂可以是包含至少一种ROS抑制剂的任何组合物。此类组合物还包括只包含单一ROS抑制性化合物的组合物，以及包含多种治疗剂(包括针对其他RTK的那些)的组合物，其还可以包括非特异性治疗剂如化疗剂或一般转录抑制剂。
在一些实施方案中，可用于实施本发明方法的ROS抑制性治疗剂是靶向小分子抑制剂。小分子靶向抑制剂是一类典型抑制其目标酶活性的分子，其通过特异性并经常可逆地结合酶的催化位点和/或结合ATP结合裂缝或者能阻止该酶形成对于其活性必需的构型的酶内部的其他结合位点而抑制其目标酶活性。因为在ROS激酶和ALK激酶之间的结构和功能的紧密相似性，预测任何ALK激酶抑制剂也抑制ROS激酶。此外，如下文实施例中所述，由ROS激酶驱动的肺癌不会由ALK激酶驱动。同样地，由ALK激酶驱动的肺癌不会由ROS激酶驱动。
因此，在另一个方面，本发明提供了治疗患者肺癌的方法，所述方法包括：检测来自患有或疑似患有肺癌的患者的肺的生物样品中多肽的存在，所述多肽选自具有ROS激酶活性的多肽和具有ALK激酶活性的多肽；并且给患者施用有效量的ALK/ROS抑制性治疗剂，从而治疗受试者的肺癌。
在一个进一步方面，本发明提供了用于将患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鉴定为可能对ROS-抑制性治疗剂响应的患者的方法，所述方法包括：将来自所述患者的肺的生物样品与特异性结合具有ROS激酶活性的多肽的第一试剂和特异性结合具有ALK激酶活性的多肽的第二试剂接触，并且检测所述第一试剂或所述第二试剂是否特异性结合所述生物样品，其中所述第一试剂或所述第二试剂与所述生物样品的结合的检测将所述患者鉴定为可能对ROS-抑制性治疗剂响应的患者。在各个实施方案中，第一试剂特异性结合全长ROS激酶蛋白。在各个实施方案中，第二试剂特异性结合全长ALK激酶蛋白。在各个实施方案中，第一试剂特异性结合ROS激酶蛋白的激酶结构域。在各个实施方案中，第二试剂特异性结合ALK激酶蛋白的激酶结构域。
如本文所使用，“具有ALK激酶活性的蛋白”是指保留ALK全部激酶结构域且因此具有ALK激酶活性的任何多肽。具有ALK激酶活性的非限制性多肽包括全长ALK (参见美国专利号5,770,421)、NPM-ALK、ALO17-ALK、TFG-ALK、MSN-ALK、TPM3-ALK、TPM4-ALK、ATIC-ALK、MYH9-ALK、CLTC-ALK、SEC31L1-ALK、RANBP2-ALK、CARS-ALK、EML4-ALK、KIF5B-ALK、和TFG-ALK (参见例如，Palmer等人, Biochem. J. 420(3): 345-361, 2009 (和其中引用的文章), Rikova等人, Cell 131: 1190-1203, 2007; Soda等人, Nature 448: 561-566,2007; Morris等人, Science 263: 1281-1284, 1994; Du等人, J. Mol. Med 84: 863-875, 2007; Panagopoulos等人, Int. J. Cancer 118: 1181-1186, 2006; Cools等人,Genes Chromosomes Cancer 34: 354-362, 2002; Debelenko等人, Lab. Invest. 83:1255-1265, 2003; Ma等人, Genes Chromosomes Cancer 37: 98-105, 2003; Lawrence等人, Am. J. Pathol. 157: 377-384, 1995; Hernandez等人, Blood 94: 3265-3268,1999; Takeuchi K., Clin Cancer Res. 15(9):3143-3149, 2009; Tort等人, Lab.Invest. 81: 419-426, 2001; Trinei等人, Cancer Res. 60: 793-798, 2000; 和Touriol等人, Blood 95: 3204-3207, 2000。也参见Pulford等人, Journal of CellularPhysiology, 199:330-358, 2004。
在各个实施方案中，受试者是人。在各个实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌或者是小细胞肺癌。
一种有用的小分子激酶抑制剂是Pfizer, Inc.的化合物克里唑替尼(也称为PF-02341066)，其抑制ALK和MET激酶活性，并且其特性已经得到很好地描述。参见You等人，Cancer Res 67: 4408 (2007) 和美国专利公开号2008/0300273。可以靶向ROS的其他小分子激酶抑制剂包括TAE-684 (来自Novartis)、CH5424802 (Chugai; 参见Sakamoto, H. 等人, Cancer Cell 19: 679-690, 2011)、AP26113 (Ariad Pharmaceuticals, Inc.)、和CEP-14083, CEP-14513、和CEP-11988 (Cephalon; 参见Wan等人, Blood 107: 1617-1623, 2006)。
PF-02341066具有以下结构：
TAE-684(5-氯-2,4-二氨基苯基嘧啶)具有以下结构：
并且已经显示抑制ROSALK激酶。Grosin,等人, Proc. National Acad. Sci 104(1)270-275, 2007。
可以利用ROS三维结构的X射线晶体学模拟或计算机模拟来合理地设计、或可以通过高通量筛选用于抑制关键上游调节酶和/或必要的结合分子(其导致ROS激酶活性的抑制)的化合物文库来发现ROS激酶活性的额外的小分子抑制剂和其他抑制剂(例如，间接抑制剂)。此类方法在本领域是众所周知的，并且已加以描述。例如，通过检查所述化合物抑制ROS活性、但不抑制其他激酶活性的能力(在一组激酶中)，和/或通过检查在包含癌细胞(例如，肺癌细胞)的生物样品中ROS活性的抑制，可以证实ROS被此类治疗剂所抑制。用于鉴定抑制特征在于ROS激酶活性的多肽的表达/存在的癌症的化合物的方法进一步说明如下。
可用于本发明方法中的ROS抑制性治疗剂还可以是靶向抗体，其特异性结合ROS活性所需的关键催化位点或者结合位点或结构域，并且通过阻断配体、底物或者第二种分子接近α和/或阻止酶采用其活性必需的构型而抑制激酶。人源化目标特异性抗体的制备、筛选和治疗用途已被详细描述。参见Merluzzi等人，Adv Clin Path. 4(2): 77-85 (2000)。用于人源化目标特异性抑制抗体的高通量制备和筛选的技术和系统可以商购获得，诸如Morphosys, Inc.的人组合抗体文库(Human Combinatorial Antibody Library) (HuCAL®)。
各种抗受体激酶的靶向抗体的制备和它们抑制靶向受体的活性的用途已被描述。参见例如，美国专利公开号20040202655, 美国专利公开号20040086503, 美国专利公开号20040033543, 制备和使用受体酪氨酸激酶活性抑制抗体的标准化方法是本领域已知的。参见例如，欧洲专利号EP1423428，
还可以使用噬菌体展示方法制备ROS特异性抗体抑制剂，噬菌体文库构建和重组抗体选择的方案在众所周知的参考文献Current Protocols in Immunology, Colligan等人(编), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Chapter 17, Section 17.1中提供。还参见美国专利号6,319,690, 美国专利号6,300,064, 美国专利号5,840,479, 和美国专利公开号20030219839。
可以产生(参见例如美国专利6,300,064)和筛选展示在噬菌体表面上的抗体片段文库与本文所述的具有ROS激酶活性的多肽(诸如ROS融合多肽)的结合。特异性结合ROS融合多肽(例如，SLC34A2-ROS(S)融合多肽)或全长ROS多肽的抗体片断被鉴定为用于阻断细胞中该融合多肽的组成型激活的候选分子。参见欧洲专利号 EP1423428。
然后可进一步筛选在上述抗体文库的筛选中鉴定的ROS结合靶向抗体在体外激酶分析和体内细胞系和/或肿瘤中阻断ROS活性的能力。ROS抑制可以通过例如检测此类抗体治疗剂在一组激酶中抑制ROS激酶活性的能力和/或通过检测包含癌细胞的生物样品中ROS活性的抑制而证实，如上所述。在一些实施方案中，本发明的ROS抑制性化合物降低了ROS激酶活性，但更低程度上降低(或根本没有降低)其他激酶的激酶活性。筛选用于ROS激酶抑制的此类化合物的方法进一步描述在上文中。
可用于实施公开的方法的ROS抑制性化合物还可以是通过抑制除ROS激酶本身以外的蛋白或分子的活性间接抑制ROS活性的化合物。此类抑制性治疗剂可以是靶向抑制剂，其调节磷酸化或去磷酸化(从而激活或失活)ROS本身或者干扰与配体结合的关键调节激酶的活性。与其他受体酪氨酸激酶一样，ROS通过接头蛋白和下游激酶的网络调节下游信号传递。结果，可以通过靶向这些相互作用或下游蛋白抑制由于ROS活性诱导的细胞生长和存活。
还可以通过使用抑制对于全长ROS或ROS融合多肽(例如，CD74-ROS融合多肽)采用其活性构象(即，从而使得ROS激酶结构域能够被激活)所需的激活分子的结合的化合物间接地抑制ROS激酶活性。例如，已描述了制备和使用抗-PDGF抗体。参见美国专利公开号20030219839, “Anti-PDGF Antibodies and Methods for Producing EngineeredAntibodies,” Bowdish等人。抑制配体(PDGF)与受体的结合直接下调受体活性。
ROS抑制性化合物或治疗剂还可以包括反义和/或转录抑制性化合物，其通过阻断编码全长ROS或ROS融合蛋白的基因的转录抑制ROS激酶活性。各种受体激酶包括VEGFR、EGFR和IGFR和FGFR被用于治疗癌症的反义治疗剂的抑制已被描述。参见例如，美国专利号6,734,017; 6, 710,174, 6,617,162; 6,340,674; 5,783,683; 5,610,288。
可以按照已知技术设计、构建和使用反义寡核苷酸作为针对目标基因的治疗剂。参见例如，Cohen, J., Trends in Pharmacol. Sci. 10(11): 435-437 (1989); Marcus-Sekura, Anal. Biochem. 172: 289-295 (1988); Weintraub, H., Sci. AM. Pp. 40-46(1990); Van Der Krol等人，BioTechniques 6(10): 958-976 (1988);Skorski等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 4504-4508。最近已经描述了使用EGFR的反义RNA抑制剂在体内抑制人肿瘤生长。参见美国专利公开号20040047847。类似地，可以根据标准方法制备包含针对哺乳动物ROS基因或哺乳动物编码ROS融合蛋白的多核苷酸的至少一种反义寡核苷酸的ROS抑制性治疗剂。包含ROS抑制性反义化合物的药物组合物可以如下文进一步描述制备和施用。
小干扰RNA分子(siRNA)组合物通过RNA干扰过程抑制ROS的翻译并因而抑制其活性，其也可以期望地用于本发明方法中。已经详细描述了RNA干扰和通过导入包含与编码目标蛋白的mRNA互补的序列的外源小双链RNA分子选择地沉默目标蛋白表达。参见例如，美国专利公开号20040038921, 美国专利公开号20020086356, 和美国专利公开20040229266。
已表明双链RNA分子(dsRNA)以高度保守的调节机制即已知为RNA干扰(RNAi)阻断基因表达。简而言之，RNAse III切酶(Dicer)将dsRNA加工成约22个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)，其作为引导序列通过RNA诱导性沉默复合物RISC诱导目标特异性mRNA切割(参见Hammond等人，Nature (2000)404：293-296)。RNAi涉及催化型反应，从而通过连续地切割较长dsRNA产生新的siRNA。因此，与反义分子不同，RNAi以非化学剂量方式降解目标RNA。当施用于细胞或生物体时，已经显示外源dsRNA通过RNAi指导内源性信使RNA(mRNA)的序列特异性降解。
目前已可以商购获得大量的目标特异性siRNA产品，包括用于在哺乳细胞中表达和使用的载体和系统。参见例如， Promega, Inc. (www.promega.com); Dharmacon, Inc.(www.dharmacon.com)。用于RNAi的dsRNA的设计、构建和使用的详细技术指南可以得到。参见例如，Dharmacon的“RNAi Technical Reference & Application Guide”; Promega的“RNAi: A Guide to Gene Silencing.”ROS抑制性siRNA产品也可以商购获得，并且可适当用于本发明方法中。参见例如， Dharmacon, Inc., Lafayette, CO (目录号M-003162-03,MU-003162-03, D-003162-07 thru -10 (siGENOME™ SMARTselection 和 SMARTpool®siRNAs)。
最近已建立了长度小于49个核苷酸、优选为19-25个核苷酸的小dsRNA，其包含至少一种基本上与目标mRNA序列的一部分相同的序列，并且该dsRNA最佳在末端具有至少一个1-4个核苷酸的突出，此类dsRNA在介导哺乳动物中RNAi时最有效。参见美国专利公开号20040038921 和 20040229266。这种dsRNA的构建及其在体内沉默目标蛋白表达的药物制剂中的应用详细描述在这些出版物中。
如果在哺乳动物中被靶向的基因的序列是已知的，例如可以制备21-23nt的RNA并测试其在哺乳动物细胞诸如人或其他灵长类细胞中介导RNAi的能力。如果需要，可以在适当动物模型中测试那些显示介导RNAi的21-23nt的RNA分子以进一步评价其体内效力。已知的目标位点也可用于设计靶向那些位点的siRNA分子，所述已知的目标位点为例如根据对其他核酸分子例如核酶或反义分子的研究被确定为有效目标位点的目标位点，或者那些已知与疾病或病症相关的目标位点诸如含有突变或缺失的那些位点。
或者，可以通过例如计算机折叠算法合理设计/预测对于筛选感兴趣目标mRNA的目标位点的有效dsRNA的序列。使用定制的Perl脚本或者可商购的序列分析程序诸如Oligo、MacVector或GCG Wisconsin Package，目标序列可以通过计算机芯片上(insilico)分列为所有特定长度片段或亚序列(subsequence)例如23个核苷酸片段的列表。
可以用各种参数确定哪些位点是目标RNA序列中最合适的目标位点。这些参数包括但不限于二级或三级RNA结构、目标序列的核苷酸碱基组成、目标序列的不同区域之间的同源性程度、或者在RNA转录物中目标序列的相对位置。根据这些确定，可以通过使用例如体外RNA切割分析、细胞培养或动物模型选择RNA转录物中任何数量的目标位点以筛选siRNA分子的效力。参见例如，美国专利公开号20030170891。最近还描述了鉴定和筛选RNAi目标位点的算法。参见，美国专利公开号20040236517。
通常可用的基因转移技术包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、微注射和病毒方法(Graham等人 (1973) Virol. 52: 456; McCutchan等人, (1968), J. Natl. Cancer Inst. 41: 351; Chu 等人(1987), Nucl. Acids Res. 15: 1311; Fraley等人(1980),J. Biol. Chem. 255: 10431; Capecchi (1980), Cell 22:479)。还可以使用阳离子脂质体将DNA导入细胞 (Feigner等人(1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 7413)。商业上可用的阳离子脂质制剂包括Tfx 50 (Promega Corp., Fitchburg, WI)或Lipofectamin200 (Life Technologies, Carlsbad, CA)。或者，可以使用病毒载体将dsRNA运送到细胞并介导RNAi。参见，美国专利公开号20040023390。
用于哺乳动物细胞中RNAi的转染和载体/表达系统是可商购的并已经详细地描述。参见例如，Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO), DharmaFECT™ system; Promega,Inc., siSTRIKE™ U6 Hairpin系统; 还参见Gou 等人(2003) FEBS. 548, 113-118;Sui, G. 等人A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression inmammalian cells (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 5515-5520; Yu等人(2002)Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 6047-6052; Paul, C. 等人(2002) Nature Biotechnology 19, 505-508; McManus等人(2002) RNA 8, 842-850。
使用制备的dsRNA分子在哺乳动物中进行siRNA干扰然后可以通过将包含dsRNA的药物制剂施用于哺乳动物实现。药物组合物以足以抑制目标基因的表达的剂量施用。典型地，dsRNA以小于5mg dsRNA/每天每公斤体重的剂量施用，并且足以抑制或完全抑制目标基因的表达。通常，dsRNA合适的剂量为0.01-2.5毫克/每天每公斤受体体重，优选为0.1-200微克/每天每公斤体重，更优选为0.1-100微克/每天每公斤体重，甚至更优选为1.0-50微克/每天每公斤体重，和最优选为1.0-25微克/每天每公斤体重。包含dsRNA的药物组合物每天施用一次，或者以多种亚剂量施用，例如使用本领域众所周知的缓释制剂。这些药物组合物的制备和施用可以按照如下进一步描述的标准技术进行。
然后，如上所述，通过制备包含治疗有效量的此类dsRNA的药物制剂，并将该制剂施用于患有肺癌或疑似为肺癌(例如，NSCLC或SCLC)(所述癌症表达具有ROS激酶活性的多肽(诸如，例如，全长ROS蛋白的异常表达或ROS融合蛋白的表达))的人受试者(例如，经由直接注射到肿瘤)，此类dsRNA可以用来在癌症中抑制ROS表达和活性。最近描述了使用siRNA抑制剂类似地抑制其他受体酪氨酸激酶诸如VEGFR和EGFR。参见美国专利公开号20040209832, 美国专利公开号 20030170891, 和美国专利公开号20040175703。
可用于实施本发明方法的ROS抑制性治疗剂可以通过本领域已知的任何手段施用于哺乳动物，所述手段包括但不限于口腔或腹膜途径，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、经皮、气道(气雾剂)、直肠、阴道和局部(包括口腔和舌下)施用。
对于口服施用，ROS抑制性治疗剂通常以片剂或胶囊的形式以粉状或颗粒、或以水溶液或悬液的形式提供。用于口服使用的片剂可以包括用药学上可接受的载体和赋形剂诸如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、风味剂、着色剂和防腐剂混合的活性成分。适当的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙，磷酸钠和磷酸钙，和乳糖；而玉米淀粉和海藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶；而如果存在润滑剂，通常为硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，所述片剂可以用材料诸如甘油单硬脂酸酯和甘油二硬脂酸酯包衣以延长胃肠道中的吸收。
用于口服使用的胶囊包括其中活性成分与固体稀释剂混合的硬明胶胶囊和其中活性成分与水或油诸如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊。对于肌内、腹膜内、皮下和静脉内使用，本发明的药物组合物通常以缓冲到合适pH和等渗的无菌水溶液或悬浮液的形式提供。适当的水性媒介物包括Ringer氏溶液和等渗氯化钠。载体可以仅由水性缓冲液组成(“仅”意指不存在可能影响或介导ROS抑制性治疗剂吸收的辅剂或包囊化物质)。此类物质包括例如下文描述的胶束(micellar)结构，诸如脂质体或衣壳。水性悬浮液可以包括悬浮剂诸如纤维素衍生物、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和西黄芪胶树胶，和润湿剂诸如卵磷脂。用于水性悬浮剂的适当防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。
ROS抑制性治疗剂组合物还可以包括包囊化制剂以保护治疗剂(例如dsRNA化合物或特异性结合ROS融合多肽的抗体)免于被机体快速地清除，所述包囊化制剂诸如控制释放制剂，包括埋植物和微囊化递送系统。可以用可生物降解和生物相容的聚合物诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这些制剂的制备方法对于本领域技术人员将是显而易见的。所述材料也可商业获得自Alza Corporation and NovaPharmaceuticals，Inc.。脂质混悬剂(包括靶向受感染细胞的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可以按照本领域技术人员已知的技术制备，例如如美国专利号4,522,811；PCT公开WO 91/06309；和欧洲专利公开号EP-A-43075中所述。包囊化的制剂可以包括病毒外壳蛋白。病毒外壳蛋白可以来自病毒或与病毒有关，诸如多瘤病毒，或者它可以是部分或者完全人工的。例如，外壳蛋白可以是多瘤病毒的病毒蛋白1和/或病毒蛋白2或其衍生物。
ROS抑制性治疗剂还可以包括施用于受试者的递送媒介物(包括脂质体)、载体和稀释剂及其盐和/或可以存在于药学上可接受的制剂中。例如，递送核酸分子的方法描述在Akhtar 等人，1992, Trends Cell Bio., 2, 139; Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotide Therapeutics, ed. Akbtar, 1995, Maurer等人, 1999, Mol. Membr. Biol., 16, 129-140; Hofland和Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165- 192; 和 Lee等人，2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192。美国专利号6,395,713 和 PCT公开号WO 94/02595进一步描述了递送核酸分子的一般方法。这些方案可以用于递送事实上任何核酸分子。
ROS抑制性治疗剂(即，ROS抑制性化合物作为治疗剂施用)可以通过各种本领域技术人员已知的方法施用于哺乳动物肿瘤，所述方法包括但不限于在脂质体中包囊化，通过离子电渗或者通过掺入到其他媒介物诸如水凝胶、环化糊精、可生物降解的纳米胶囊和生物粘合微球体中、或者通过蛋白质载体(参见PCT公开号WO00/53722)。或者，所述治疗剂/媒介物组合通过直接注射或通过使用输注泵局部递送。不管是通过皮下、肌内或者皮内，直接注射所述组合物都可以使用标准针头和注射器方法学，或者通过无针头技术诸如由Conry等人， 1999, Clin . Cancer Res., 5, 2330-2337 和PCT 公开号WO 99/3 1262中描述的那些技术进行。
ROS抑制性治疗剂的药学上可接受的制剂包括上述化合物的盐，例如酸加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐和苯磺酸盐。药物组合物或制剂是指以适合用于施用(例如全身性施用)于细胞或患者(包括例如人)的形式的组合物或制剂。合适的形式部分取决于使用或进入的途径，例如口服、经皮或通过注射。此类形式应当不会妨碍所述组合物或制剂到达目标细胞。例如，注射到血流中的药物组合物应当是可溶的。其他因素是本领域已知的，并且包括一些考虑诸如毒性和阻止组合物或制剂发挥其效应的形式。
导致全身性吸收的施用途径(例如，药物在血流中的全身性吸收或积聚，随后分布到整个机体中)是所需的，并且包括但不限于：静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口腔、肺内和肌内。这些施用途径的每一种都将ROS抑制性治疗剂暴露给能接近的患病组织或肿瘤。已表明药物进入到循环系统中的速率是分子量和大小的函数。使用包含本发明化合物的脂质体或者其他药物载体可以潜在地将药物定位到例如某些组织类型，诸如网状内皮系统(RES)组织。能促进药物连接到细胞诸如淋巴细胞和巨噬细胞的表面的脂质体制剂也是有用的。这种方法可以通过利用巨噬细胞和淋巴细胞免疫识别异常细胞(诸如癌细胞)的特异性的优势将药物以增强的方式递送到目标细胞。
“药学上可接受的制剂”是指能将本发明的核酸分子有效地分布到最适合它们所需活性的身体位置的组合物或制剂。适合用于与本发明核酸分子配制的试剂的非限制性实例包括：P-糖蛋白抑制剂(诸如Pluronic P85), 其能增强药物进入NCS (Jolliet-Riant和 Tillement, 1999, Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 16-26); 可生物降解聚合物，诸如用于在脑内埋植后持续释放的聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球体(Emerich等人，1999,Cell Transplant, 8, 47-58) (Rosermes, Inc. Cambridge, Mass.); 和负载纳米颗粒，诸如由聚丁基氰基丙烯酸酯制成的那些，其能将药物递送通过血脑屏障并且能改变神经元摄取机制 (Prog Neuro-psychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999)。用于可用于本发明方法的ROS抑制性化合物的递送策略的其他非限制性实例包括由Boado等人，1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler等人，1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge等人，1995, PNAS USA., 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107; Aldrian-Herrada等人1998, Nucleic Acids Res., 26,4910-4916; 和Tyler等人1999, PNAS USA., 96, 7053-7058中描述的材料。
包括表面修饰的含有聚(乙二醇)脂质的脂质体(PEG-修饰的，或者长循环脂质体或者隐形脂质体(stealth liposomes))的治疗组合物也适合用于本发明的方法中。这些制剂提供了一种增加药物在目标组织中积聚的方法。这类药物载体抵抗单核吞噬细胞系统(MPS或RES)的调理作用和清除作用，从而实现包囊化药物的更长血液循环时间和增强的组织暴露(Lasic等人Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata等人, Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011)。已显示这些脂质体可能通过在新血管化目标组织中外渗和捕获而选择性在肿瘤中积聚(Lasic等人, Science 1995, 267, 1275-1276; Oku等人,1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90)。尤其与已知在MPS组织中积聚的常规阳离子脂质体相比(Liu等人, J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; PCT公开号WO 96/10391;PCT公开号WO 96/10390; 和PCT 公开号WO 96/10392)，长循环脂质体增强了DNA和RNA的药代动力学和药效动力学。根据其在代谢迅速的MPS组织诸如肝和脾中避免积聚的能力，长循环脂质体与阳离子脂质体相比还可能更大程度地保护药物免于被核酸酶降解。
治疗组合物可以包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的药学有效量的所需化合物。用于治疗应用的可接受的载体或稀释剂是药学领域众所周知的，并且描述在例如Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit.1985)。例如可以提供防腐剂、稳定剂、染料和风味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
在一些实施方案中，以有效量施用ROS抑制性治疗剂和/或ALK/ROS抑制性治疗剂。“有效量”或“有效剂量”是指防止、抑制疾病状态的发生、或治疗疾病状态(减轻症状到一定程度、优选所有症状)所需要的治疗剂的量。有效剂量取决于疾病类型、所使用的治疗剂、施用途径、治疗的哺乳动物类型、考虑的具体哺乳动物的身体特征、共同药物治疗和其他药物领域技术人员将意识到的因素。通常，取决于带负电荷聚合物的能力，施用的有效量为活性成分的0.1 mg/kg -100 mg/kg体重/天的量。
约0.1 mg - 约140 mg/kg体重/天的剂量水平可用于治疗上述病症(约0.5 mg-约7 g/患者/天)。能组合载体材料以产生单剂量形式的活性成分的量根据治疗的宿主和施用的特定模式而变化。剂量单位形式通常含有约1 mg -约500 mg的活性成分。应当理解的是对于任何特定患者的特定剂量水平取决于各种因素，包括所使用的特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度、药物组合和经历治疗中的特定疾病的严重度。
对于施用于非人类动物，组合物还可以添加到动物的饲料和饮水中。可以便利地制成动物饲料和饮水组合物，从而使得动物在饮食时摄取治疗合适量的组合物。还可以便利地将所述组合物制成预混合物用于添加到饲料或饮水中。
可用于实施本发明的ROS抑制性治疗剂可以包括上述单一化合物，或者多种化合物的组合，无论为同类抑制剂(例如，抗体抑制剂)还是不同类抑制剂(例如，抗体抑制剂和小分子抑制剂)。化合物的此类组合可以增加抑制表达融合蛋白癌症的进展的总体治疗效果。例如，治疗组合物可以是小分子抑制剂，诸如单独的由Pfizer, Inc.生产的克里唑替尼(也称为PF-02341066)(参见美国公开号2008/0300273)，或其与其他靶向ROS活性的克里唑替尼类似物和/或ROS的小分子抑制剂(诸如由Novartis, Inc.生产的NVP-TAE684，或Sakamoto等人, Cancer Cell 19:679-690, 2011中描述的CH5424802化合物)的组合。治疗组合物除了一种或多种靶向抑制剂外还可以包含一种或多种非特异性化疗剂。最近表明此类组合在多种癌症中提供了协同肿瘤杀伤效果。此类组合在体内抑制ROS活性和肿瘤生长的效力可以按照下文所述评价。
本发明还部分地提供了用于确定化合物是否抑制特征在于具有ROS激酶活性的多肽或编码其的多核苷酸的癌症(例如，肺癌)的进展的方法，该方法通过确定所述化合物是否抑制癌症中该多肽的ROS激酶活性而实现。在一些实施方案中，通过检测包括来自骨髓、血液或肿瘤的细胞的生物样品确定ROS活性的抑制。在另一个实施方案中，至少使用以下试剂确定ROS活性的抑制：特异性结合ROS多肽的试剂(例如，ROS特异性抗体)或特异性结合编码ROS多肽的多核苷酸的试剂(例如，siRNA 或ROS反义)。
测试化合物可以是上述的任何类型的治疗剂或组合物。评价化合物在体外或体内效力的方法在本领域中已经充分确立并是已知的。例如，可以使用其中ROS激酶被激活的细胞或细胞提取物检测组合物在体外抑制ROS的能力。可以使用一组化合物以检测所述化合物对ROS的特异性(与其他目标，诸如EGFR或PDGFR相反)。
另一种可以使用的药物筛选技术提供了高通量筛选具有与目标蛋白适当结合亲和力的化合物，如PCT公开号W084/03564中所述。在这种方法中，如应用于具有ROS活性的多肽(例如，全长ROS蛋白或多种ROS融合蛋白之一)，大量不同的小测试化合物在固相基底诸如塑料针或一些其他表面上合成。测试化合物与本发明多肽或其片段反应，并洗涤。然后通过本领域众所周知的方法检测结合的多肽(例如，SLC34A2-ROS(VS)、SLC34A2-ROS(S)、SLC34A2-ROS(L)、CD74-ROS、FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)、或FIG-ROS(XL)融合多肽或全长ROS多肽)。纯化的多肽还可以直接包被到板上以用于上述药物筛选技术。或者，可以使用非中和抗体以捕获肽并将它固定到固体载体上。
对于发现是在体外ROS活性的有效抑制剂的化合物，然后可以检查其体内抑制表达具有激酶活性的多肽的癌症(诸如，肺癌或其他癌症，诸如肝癌、肺癌、结肠癌、肾癌或胰腺癌)的进展的能力，其利用，例如，携带表达具有ROS激酶活性的多肽的人肺癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、肺癌或结肠肿瘤的哺乳动物异种移植物。在该程序中，可以将已知表达具有ROS激酶活性的蛋白(例如，全长ROS或ROS融合蛋白之一)的癌细胞系皮下置于动物中(例如，置于裸鼠或SCID小鼠或其他免疫缺陷动物)。然后这些细胞长成肿瘤块，可以通过肉眼监视。然后可以用药物处理动物。药物处理对肿瘤大小的效果可以从外部观察。然后，处死动物并取出肿瘤通过IHC和Western印迹进行分析。类似地，可以通过标准方法制备哺乳动物骨髓移植物以检测在表达具有ROS激酶活性的蛋白的血液肿瘤中的药物反应。通过这种方式，可以观察药物在最接近模拟患者的生物环境中的效果。可以通过用磷酸化特异性抗体的分析确定药物改变肿瘤细胞中或周围基质细胞中信号传导的能力。还可以通过用凋亡特异性标记诸如切割的胱天蛋白酶3和切割的PARP分析而观察药物诱导细胞死亡或抑制细胞增殖的效力。
可以通过在细胞培养或者实验动物中的标准药学程序确定此类化合物的毒性和治疗效力，例如确定LD50(50％群体致死剂量)和ED50(50％群体治疗有效剂量)。毒性和治疗效果的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比率LD50/ED50。在一些实施方案中，化合物展示了高治疗指数。
在实施所公开的方法确定化合物是否抑制特征在于存在具有ROS激酶活性的多肽(或编码其的多核苷酸)的肿瘤的进展中，还可以有利地采用包含来自哺乳动物异种移植物(或骨髓移植物)的细胞的生物样品。非限制性的异种移植物(或移植受体)是小型哺乳动物(诸如小鼠)，其携带表达具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽(诸如CD74-ROS或FIG-ROS(S))或全长ROS)的人肿瘤(或白血病)。携带人肿瘤的异种移植物是本领域众所周知的(参见 Kal, Cancer Treat Res. 72: 155-69 (1995))，并且携带人肿瘤的哺乳动物异种移植物的制备被很好地描述(参见Winograd等人, In Vivo. 1(1): 1-13 (1987))。类似地，骨髓移植模型的产生和使用被很好地描述(参见例如，Schwaller, 等人，EMBO J. 17: 5321-333 (1998); Kelly等人, Blood 99: 310-318 (2002))。
提供下述实施例只是为了进一步说明本发明并不是为了限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求所限定。本发明包括本文教导方法的各种修改和改变，这对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。提及的材料、试剂等可获自商业来源，除非另有说明。
实施例1
通过总磷酸肽谱分析鉴定NSCLC细胞系中的ROS激酶活性
使用用于从复杂混合物中分离和质谱表征修饰肽的IAP技术检测包括HCC78的几种人NSCLC细胞系中激酶激活的总磷酸化谱(参见美国专利号 7,300,753 和 7,198,896)。使用磷酸酪氨酸特异性抗体(商购获得自Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA,目录号#9411)进行IAP技术以便从NSCLC细胞系的提取物中分离并随后表征含有磷酸酪氨酸的肽。
特别地，使用IAP方法促进鉴定NSCLC细胞系中激活的酪氨酸激酶以鉴定这种疾病中的新驱动因素。
细胞培养
从DSMZ(the German National Resource Centre for Biological Material)获得HCC78细胞，生长在具有10％胎牛血清(FBS)(Sigma)的RPMI-1640培养基(Invitrogen)中。
磷酸肽免疫沉淀
将总共2×108个细胞在尿素裂解缓冲液(20mM HEPES pH 8.0, 9M 尿素、1 mM钒酸钠、2.5 mM焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸酯)中以1.25×108个细胞/ ml裂解，并超声处理。以20,000xg离心澄清超声裂解物，并按前述还原并烷基化蛋白质(参见 Rush等人, Nat.Biotechnol. 23(1): 94-101 (2005))。用20 mM HEPES pH 8.0将样品稀释到尿素终浓度为2M。以1:100 v/v将胰蛋白酶(1mg/ml 于 0.001 M HCl中)加入澄清的裂解物中。在室温下消化样品过夜。
消化后，将裂解物酸化到TFA的终浓度为1％。使用Sep-Pak C18柱按前述进行肽的纯化(参见Rush等人，同上)。纯化后，将所有的洗脱液(8％、12％、15％、18％、22％、25％、30％、35％和40％的在0.1% TFA中的乙腈)合并并冻干。将干燥的肽重悬在1.4 ml MOPS缓冲液(50 mM MOPS/NaOH pH 7.2, 10 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl)中，并通过在12,000 x g下离心10分钟除去不溶物质。
将来自腹水的磷酸酪氨酸单克隆抗体P-Tyr-100 (Cell Signaling Technology)在4℃过夜非共价偶联到4 mg/ml珠的蛋白G琼脂糖珠(Roche)上。偶联后，使用PBS洗涤抗体-树脂两次，用MOPS缓冲液洗涤三次。将于MOPS IP缓冲液中的1:1浆料的固定抗体(40 µl, 160 µg)加入到溶解的肽级分中，并在4℃将混合物孵育过夜。将固定的抗体珠用MOPS缓冲液洗涤三次，然后ddH2O洗涤两次。通过每次使用40 µl的0.15% TFA孵育20分钟从珠洗脱肽两次，合并级分。
LC-MS/MS质谱分析
于IP洗脱液(40μl)中的肽使用Stop和Go提取秘诀(Stop and Go extraction tips)(StageTips)从洗脱的抗体中浓缩和分离(参见Rappsilber等人，Anal. Chem., 75(3):663-70 (2003))。用1 μl的60% MeCN、0.1% TFA将肽从微柱洗脱于7.6 µl的0.4％乙酸/0.005％七氟丁酸(HFBA)。使用具有惰性样品注射阀(Dionex)的Famos自动进样仪将样品加入具有Magic C18 AQ反相树脂(Michrom Bioresources)的10 cm x 75 µm的PicoFrit毛细柱(New Objective)中。用以280 nl/min递送的于0.4％乙酸、0.005％HFBA (Ultimate,Dionex)中的45-min线性梯度乙腈展开柱子。
用LCQ Deca XP和离子捕获分光计(ThermoFinnigan)并采用top-four方法以数据依赖方式收集串联质谱，动态排除重复计数为1，且重复持续时间为0.5min。
数据分析和分配
使用(以作为BioWorks 3.0一部分提供的Sequest Browser package (v. 27, rev.12))TurboSequest(ThermoFinnigan)评价MS/MS谱。使用Sequest Browser programCreateDta以下述参数将单个的MS/MS谱从原始数据文件中提取：最低MW为700；最高MW为4,500；最少离子数为20；最小TIC为4×105；和前体电荷状态未指定。在将样品注射到最终的稀释梯度前从原始数据文件的开始部分提取谱。不使用IonQuest 和VuDta程序进一步选择MS/MS谱进行Sequest分析。使用下述的TurboSequest参数评价MS/MS谱：肽质量允差(masstolerance)，2.5；片段离子允差，0.0；每修饰的差别氨基酸的最大数目，4；质量类型亲本(mass type parent)，平均值；质量类型片段(mass type fragment)，平均值；内部裂解位点的最大数目，10；在相关分析中考虑来自b和y离子的水和氨中性丢失(neutral losses)。除了收集自弹性蛋白酶消化物的谱之外，具体说明了蛋白水解酶。
针对2004年8月24日公布的NCBI人数据库进行了检索，该数据库包含27,175个允许氧化的甲硫氨酸(M+16)和磷酸化(Y+80)作为动态修饰的蛋白质。
在蛋白质组学研究中，期望仅仅基于观察在一个实验结果中的单个肽来验证蛋白质鉴定，以便指示蛋白质事实上存在于样品中。这已导致了仍未被普遍接受的验证肽分配的统计方法以及关于本实施例中所遵循的公开蛋白质和肽鉴定结果的指南的发展(参见Carr等人, Mol. Cell Proteomics 3: 531-533 (2004))。然而，因为免疫亲和策略将磷酸化的肽与未磷酸化的肽分开，所以只观察来自蛋白质的一个磷酸肽是通常结果，由于许多磷酸化的蛋白只有一个酪氨酸-磷酸化位点。
出于该原因，使用额外的标准来验证磷酸肽分配是适当的。如果以下这些额外标准中的任何可以满足，则分配可能是正确的：(i)相同序列分配给具有不同电荷状态的共洗脱离子，因为MS/MS谱随电荷状态显著变化；(ii)由于来自不完全蛋白水解或使用除胰蛋白酶之外的蛋白酶的序列重叠，所述位点见于超过一个肽序列中；(iii)由于同源但非相同的蛋白质同种型，所述位点见于超过一个肽序列中；(iv)由于在物种中同源但非相同的蛋白质，所述位点见于超过一个肽序列背景中；和(v)由于离子阱质谱仪产生高度可重现的MS/MS谱，经合成的对应于分配序列的磷酸肽的MS/MS分析验证位点。最后的标准常规用来证实特别感兴趣的目标新的位点分配。
由Sequest进行的所有谱和所有序列分配被输入相关数据库。分配的序列在保守两步法之后被接受或拒绝。在第一步中，高评分序列分配的子集通过过滤XCorr值进行选择，对于+1的电荷状态XCorr值至少为1.5，对于+2为2.2，对于+3为3.3，以使最大的RSp值为10。如果下述的标准中任何一个被满足，子集中的分配被拒绝，所述标准为：(i)所述谱含有至少一个主峰(至少为所述谱中至少10％与最强离子一样强)，该主峰不能作为a、b或y离子、作为a、b或y离子的水或氨中性丢失产生的离子或者作为多质子化离子(multiplyprotonated ion)被作图到分配序列；(ii) 所述谱不含有一系列等价于至少六个不间断残基的b或y离子；或者(iii)在我们进行的所有研究中至少有五次没有观察到该序列(除了由于不完全蛋白水解或者使用除胰蛋白酶外的蛋白酶导致的重叠序列)。第二步，如果低评分谱表现出与在其他研究中收集的高评分谱的高度相似性，则接受具有低于阈值的分配，这模仿真实参考文库搜索策略(true reference library-searching strategy)。所有支持最终的分配序列表(此处未显示)的谱将由至少三个科学家评价以建立其可信度。
上述IAP分析从HCC78细胞中鉴定了454个非冗余含磷酸酪氨酸肽，395个磷酸酪氨酸位点和240个酪氨酸磷酸化蛋白，大多数都是新的(数据未显示)。这些酪氨酸磷酸化激酶中，检测到的那些中有几种是在其他NSCLC细胞系中通常用MS分析检测不到的(数据未公开)，包括ROS激酶。
实施例 2
采用总磷酸肽谱分析检测突变ROS激酶在人癌症样品中的表达
为了进一步证实在人NSCLC中ROS融合突变的发生率，使用上述总磷酸肽谱分析的IAP技术检测几份人NSCLC肿瘤(参见实施例1)以鉴定在这些肿瘤中的ROS磷酸肽。肿瘤样品(速冻切割的肿瘤并保存在液氮中)从中国临床合作者(湘雅二医院，中南大学，长沙，湖南，中国)获得。
简而言之，将约300毫克-500毫克的肿瘤组织均质化。例如，将组织均质化并且以1.25 x 108个细胞/ml裂解在尿素裂解缓冲液 (20mM HEPES pH 8.0，9M尿素，1 mM钒酸钠，2.5 mM焦磷酸钠，1mM β-甘油磷酸酯)，并且进行超声处理。超声裂解物通过20,000 x g离心而澄清，并且如先前所述将蛋白还原和烷基化(参见Rush等人, Nat. Biotechnol. 23(1): 94-101 (2005))。将样品用20 mM HEPES pH 8.0稀释至2M的最终尿素浓度。将胰蛋白酶(1mg/ml，在0.001 M HCl中)以1:100 v/v添加至澄清的裂解物。样品在室温下消化过夜。
这些样品的总磷酸酪氨酸谱分析按照上述实施例1所述的方法进行。谱分析结果表明肿瘤样品之一具有ROS磷酸肽和SLC34A2磷酸肽两者(参见下表1(其他检测的磷酸肽未显示)，并且显示下游分子诸如IRS-1和IRS-2磷酸肽。如期望，这种肿瘤的酪氨酸谱分析特征与NSCLC细胞系HCC78的非常相似(参见表3)。FISH分析也显示肿瘤具有ROS易位(参见下文实施例10)。可以使用RT-PCR、DNA测序分析进一步证实在该患者中的ROS激活(其他携带ROS易位的患者)是由于SLC34A2/ROS的异常转录物所致。
表3 人NSCLC肿瘤的磷酸肽谱分析
实施例 3
Western印迹分析NSCLC细胞系中的ROS激酶表达
通过使用对于ROS和其他受体酪氨酸激酶(RTK)以及下游激酶特异性的抗体Western印迹分析细胞提取物来证实HCC78 NSCLC细胞系(但不是其他 NSCLC细胞系)表达激活的ROS激酶的观察。
用添加Protease Arrest™ (G Biosciences)的1X细胞裂解缓冲液(CellSignaling Technology)裂解HCC78细胞，并通过电泳分离。所有用于免疫印迹的抗体和试剂都来自于Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA)。按照“WesternImmunoblotting Protocol” (Cell Signaling Technology, Inc., 2005-2006 目录)所述进行Western印迹。抗ROS抗体得自Santa Cruz Biotechnology, Inc.。
图1显示Western印迹结果。在多种不同的NSCLC细胞系中，只有HCC78表达ROS蛋白。HCC78中的ROS蛋白比野生型ROS蛋白具有小得多的分子量，表示是融合蛋白。
Western印迹证实ROS融合蛋白是酪氨酸磷酸化的。通过磷酸酪氨酸抗体免疫沉淀HCC78细胞的蛋白裂解物，并且用总ROS抗体进行免疫印迹。通过ROS抗体从pY-IP检测到与从总裂解物相同的条带，其中IP’ed条带具有较小更慢迁移，也表明蛋白质的磷酸化。
实施例 4
使用siRNA对表达异常ROS激酶的哺乳动物NSCLC细胞系的生长抑制
为了证实截短形式的ROS驱动HCC78细胞系的细胞生长和存活，检测siRNA沉默抑制这些细胞生长的能力。RNA干扰下调ROS的表达。下述ROS siRNA购自Proligo, Inc.，其在括号中表示相应的ROS序列：
。
在转染前一天将2×105个细胞接种到12孔板中。使用Mirus TransIT-TKOTransfection Reagent转染100 nM ROS1 siRNA。转染48小时后，将细胞转移到饥饿培养基中再24小时。通过胰蛋白酶消化收集细胞并计数，然后细胞裂解物用于WB以检测ROS蛋白质水平。
免疫印迹分析表明在将siRNA转染到HCC78细胞后72小时，ROS的表达特异并且显著地降低，而对照细胞系H2066不表达ROS蛋白(参见图2，小图B)。如预期，这伴随下游底物诸如p-Erk1/2 和 p-Akt磷酸化的减少(参见图2，小图C)。此外，如预期，用ROS siRNA处理导致HCC78细胞系凋亡增加(但在对照细胞系H2066中没有)，如通过检测切割的PARP确定(参见图2，小图B)。用ROS siRNA转染后3天杀死80％细胞，如图2，小图A中显示。这些结果表明在HCC78细胞系中，突变/截短的ROS激酶驱动这些NSCLC细胞的增殖和生长，并且此类该增殖和生长可以被使用抑制ROS激酶表达的siRNA所抑制。
实施例5
SLC34A2-ROS融合基因的分离和测序
鉴于在NSCLC细胞系(HCC78)中检测到存在截短形式的ROS激酶，在编码ROS的激酶结构域的序列上进行5′快速扩增cDNA末端以确定是否存在嵌合ROS转录物。
快速扩增互补DNA末端
使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从HCC78细胞系提取RNA。使用DNeasy Tissue Kit(Qiagen)提取DNA。使用5’ RACE系统(Invitrogen)快速扩增cDNA末端，对于cDNA合成的引物为ROS-GSP1，且对于嵌套PCR反应的引物为ROS-GSP2和ROS-GSP3。
PCR测定
对于RT-PCR，使用SuperScriptTM III第一链合成系统(Invitrogen)用oligo (dT)20(商业获自Invitrogen, Carlsbad, CA, 目录号18080)从2.5 μg总RNA合成第一链cDNA。然后，使用引物对SLCROS-F1和SLCROS-R1、SLCROS-F2和SLCROS-R2扩增SLC34A2-ROS融合基因。
构建体
使用Platinum Taq DNA高保真聚合酶(Invitrogen)和引物对SLC-Fb和ROS-Rb(具有Bgl II限制性位点)从HCC78细胞的cDNA通过PCR扩增SLC34A2-ROS融合基因的开放阅读框。该PCR产物被克隆到逆转录病毒载体MSCV-Neo中。引物为：
。
在两轮后检测PCR扩增产物。然后通过5’ RACE分析ROS的5’序列鉴定了该激酶融合至SLC34A2的N-末端。得到产物的序列分析表明ROS的c-末端融合到SLC34A2基因N-末端(参见图3C 和 3D)。SLC34A2-ROS融合基因是符合读框的，并且将SLC34A2的前126个氨基酸融合到ROS的最后598或495个氨基酸(参见图3B，1750处的箭头显示C’末端598个氨基酸的断裂，且1853处的箭头显示C’末端495个氨基酸的断裂)分别导致产生了两种变体融合蛋白(长的，短的)。基因结构的分析预测了另一种变体，非常短的变体，预测其包含SLC34A2的前126个氨基酸与ROS的最后467个氨基酸(参见图3E)。SLC34A2定位到染色体4p15，而ROS在染色体6q22上。因此，由t(4;6)(p15;q22)产生了融合基因。参见图3A。
预测的SLC34A2-ROS(VS)(即，非常短的变体)的氨基酸和核酸序列分别提供在SEQID NOs:28和29中。
SLC34A2融合体的序列显示在图4A(长变体，上面为氨基酸序列，下面为核酸序列)和图4B(短变体，上面为氨基酸，下面为核酸)。人SLC34A2蛋白的氨基酸和核酸序列提供在图5中，其中参与易位的残基用下划线表示。
类似地，人ROS蛋白的氨基酸序列与核酸序列分别显示在图6A和6B中。在图6A和6B中，参与长变体的残基用下划线表示，用下划线表示的粗体残基是参与(短)变体易位的残基，并且用下划线表示的粗体红色残基是预测参与预测的(非常短)变体易位的残基。
对于长版本和短版本的SLC34A2和ROS的融合体通过对RNA的逆转录酶PCR证实。
实施例6
SLC34A2-ROS融合蛋白驱动转染的293细胞的生长和存活。
为了证实SLC34A2-ROS融合蛋白的表达能将正常细胞转化为癌性表型，用上述编码SLC34A2-ROS融合蛋白的长变体的cDNA构建体转染人胚胎肾细胞(293细胞)。
将上述SLC34A2-ROS cDNA构建体(编码长变体融合蛋白)插入MSCV病毒载体，并使用SuperFect转染试剂(商业获自Qiaqen, Valencia, CA)将该构建体转染HEK293细胞。48小时后，收集转染的HEK293细胞，并通过Western印迹证实所期望分子量的重组SLC34A2-ROS融合蛋白(长变体)的表达(参见图7)。
实施例7
SLC34A2-ROS融合蛋白驱动转化的哺乳动物细胞系的生长和存活。
为了证实SLC34A2-ROS融合蛋白的表达可以将正常细胞转化为癌性表型，可以使用上述cDNA构建体转化3T3细胞。将细胞维持在具有10％胎牛血清(FCS)(Invitrogen,Carslbad, CA)的DMEM培养基(Invitrogen)中。
如前述制备逆转录病毒上清液和转导。参见Schwaller等人，Embo J. 17(18):5321-33 (1998)。分别使用逆转录病毒上清液转导3T3细胞，所述逆转录病毒上清液分别含有MSCV-Neo或MSCV-Neo/SLC34A2-ROS(长的)或者MSCV-Neo/ROS(短的)载体，然后针对G418(500 ug/ml)选择。稳定转染的细胞将用于软琼脂分析以证实SLC34A2-ROS将转化3T3细胞。
此类分析将证实SLC34A2-ROS融合蛋白的表达是否转化了3T3细胞，从而使得细胞生长将不依赖贴壁。然后进行Western印迹分析以检测ROS、SLC34A2、SHP-1和其他可能的ROS下游目标的磷酸化状态。
实施例8
CD74-ROS融合基因的分离和测序
还使用实施例1和2中描述的方法使用总磷酸肽谱分析的IAP技术筛选第二批次的几种人NSCLC肿瘤(包括来自患者CD042的肿瘤)。在患者CD042中检测到磷酸化的ROS激酶。为了确定该患者中存在的该ROS激酶是否是SLC34A2蛋白和ROS激酶蛋白之间的融合体，在编码ROS的激酶结构域的序列上进行cDNA末端的5'快速扩增，以确定嵌合ROS转录物是否存在于那些患者。有趣的是，如下所述，使用这种方法发现了另一种ROS融合基因，即CD74和ROS之间的融合体。
如实施例4中所述，使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)来从肿瘤组织提取RNA。以用于cDNA 合成的引物ROS-GSP1和用于嵌套式PCR反应的ROS-GSP2和ROS-GSP3使用5’ RACE系统(商购自Invitrogen (Life Technologies, Inc.的部分),Carlsbad, CA)。
PCR测定
对于RT-PCR，使用SuperScriptTM III第一链合成系统(Invitrogen)与寡聚(dT)20(Invitrogen目录号18080)从2.5 µg总RNA合成第一链cDNA。然后，使用引物对CD74-F1和ROS-GSP3扩增CD74-ROS融合基因：
所得产物的序列分析表明，ROS的c-末端融合至CD74基因N-末端(参见图8，小图B和C)。CD74-ROS融合基因符合读框，并且将CD74的前208个氨基酸融合至ROS的最后495个氨基酸(参见图8，小图B)，导致产生融合蛋白。CD74位于染色体5q32，而ROS在染色体6q22上(参见图8，小图A)。因此，融合基因由t(5;6)(q32;q22)生成。
CD74-ROS的序列提供在图9中(上面，氨基酸序列；下面，核苷酸序列)。如图9中显示，来自CD74的残基用下划线表示，而ROS激酶结构域的残基以粗体字型显示。
图10显示了人CD74的序列(上面的氨基酸和下面的核酸)，其中存在于CD74-ROS融合体中的残基用下划线表示。类似地，图11A和11B显示了人ROS的氨基酸和核酸序列，其中存在于CD74-ROS融合体中的残基用下划线表示。
CD74和ROS的融合通过对RNA的逆转录酶-PCR证实。图12是显示了用指示引物的PCR获得的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶。
实施例9
通过免疫组织化学(IHC)检测ROS激酶蛋白
为了确定NSCLC中发现的ROS融合蛋白是否可以通过免疫组织化学检测，使用ROS特异性兔单克隆抗体。这些研究中使用的ROS特异性抗体(即兔单克隆抗体ROS1 D4D6)先前已经描述(参见PCT公开号WO2010/093928)，并且特异性结合人ROS激酶蛋白上在ROS蛋白的激酶结构域的C-末端的区域。尽管D4D6抗体尚未商售，但是类似的ROS特异性抗体可商购自多个供应商，包括但不限于，来自Santa Cruz Biotechnology, Inc.,(Santa Cruz, CA)的Ros(C-20)抗体，目录号sc-6347和来自Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA)的ROS (69D6) 抗体，目录号#3266。
对于这些研究，将556份人NSCLC肿瘤样品的组群制备为石蜡块。所有肿瘤样品由两位独立的病理学家评价，并且发现包含246份腺癌病例，64份支气管肺泡癌病例，226份鳞状细胞癌病例和20份大细胞癌病例。
免疫组织化学：将4-6 μm组织切片分别通过二甲苯和分级乙醇脱石蜡且再水化(例如，通过三次改变二甲苯，每次5分钟，然后通过两次改变100％乙醇和两次改变95％乙醇(每次5分钟)而再水化)。载片在diH2O中冲洗，然后使用1.0 mM EDTA, pH 8.0和制造商设置在Decloaking Chamber (Biocare Medical, Concord, CA)中进行抗原修复：SP1 125℃持续30秒和SP2 90℃持续10秒。载片在3% H2O2中猝灭10分钟，然后在diH2O中洗涤。在湿室中在Tris缓冲盐水阳性0.5％ Tween-20 (TBST)/5%山羊血清中封闭之后，载片在4℃下用稀释在SignalStain®抗体稀释剂(#8112 Cell Signaling Technology, Danvers, MA)的0.19 μg/ml的ROS1 (D4D6) XP™兔mAb孵育过夜。用TBST洗涤之后，在室温下在湿室中用Envisionpositive (Dako, Carpinteria, CA)或SignalStain® Boost IHC检测试剂(HRP, 兔)(目录号8114 Cell Signaling Technology, Danvers, MA)以30分钟孵育进行检测。对于SignalStain® Boost IHC载片，在洗涤载片(例如，在TBST中三次)之后，接下来将载片暴露于根据制造商的说明书制备的NovaRed (Vector Laboratories, Burlingame,CA)。
载片显色1分钟，然后在diH2O中冲洗。载片通过在苏木精中孵育(即用的商售自Invitrogen (Carlsbad, CA)，目录号00-8011) 1分钟而复染，在diH2O中冲洗30秒，在发蓝试剂(Richard Allan Scientific, Kalamazoo, MI (Thermo Scientific company), 目录号7301)中孵育20秒，然后最后在diH2O中洗涤30秒。通过2次更换95％乙醇(每次20秒)和2次更换100％乙醇(每次2分钟)而使载片脱水。将载片以2次更换二甲苯(每次20秒)而清洁，然后在空气中干燥。使用VectaMount (Vector Laboratories, Burlingame, CA)将盖载片封固。载片在空气中干燥，然后在显微镜下评估。使用配备Olympus DP70相机和DP控制器软件的Olympus CX41显微镜而获得图像(20x)。
在通过用ROS特异性Rmab ROS1 D4D6的免疫组织化学筛选的556份NSCLC肿瘤中，鉴定出9份ROS1-阳性肿瘤。分类(breakdown)如下：
在246份腺癌中，8份(或3.3％)对于ROS1激酶呈阳性。
在20份大细胞癌中，1份(或5.0％)对于ROS1激酶呈阳性。
观察到多种ROS IHC染色模式，范围从弱细胞质到强核周围聚集(参见图13A-F)。在5/9(55％)情况下，ROS在细胞质中弥漫定位(图13 A)。在1份大细胞癌中观察到强细胞质染色(图13C)。两种情况具有彼此不同的独特表型，一种是具有点状质膜染色区域的弥散细胞质的(图13D)，其他则为整个区域呈水泡性染色(图13F)。还应当注意的是，在罕见情况下，非肿瘤细胞诸如巨噬细胞和支气管上皮细胞被ROS D4D6染色。在周围间质组织不存在ROS表达。
实施例10
使用FISH测定法检测人癌症样品中的ROS融合体
使用前述荧光原位杂交(FISH)测定法检测人NSCLC肿瘤样品中SLC34A2-ROS融合蛋白和/或CD74-ROS蛋白(或另一种ROS融合蛋白)的存在。参见例如，Verma等人 HumanChromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.(1988)。检测了超过200份石蜡包埋的人NSCLC肿瘤样品。
为了分析涉及ROS的重排，设计了双色断裂分离探针(break-apartprobe)。获得了一个近端探针(proximal probe)(BAC克隆RP1-179P9)和两个远端探针(distal probe)(BAC克隆RP1l-323O17，RP1-94G16)(所有的都可以商业上获得，例如来自InvitrogenInc., Carlsbad, CA, 如目录号RPCI1.C和RPCI11.C )。这些探针结合到ROS基因的位置示意性地显示在图14。如图19A中显示，近端探针用橙色光谱的dUTP标记，并且远端探针用绿色光谱的dUTP标记。根据制造商的说明(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY)使用切口平移DNA标记试剂盒完成探针的标记。根据标准方法在4-μm厚FFPE组织切片上进行FISH。例如，将石蜡包埋的组织切片再水化，并在0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中微波抗原修复11分钟。在37℃用蛋白酶(4mg/ml胃蛋白酶，2000-3000U/mg)消化切片25分钟、脱水并用FISH探针在37℃杂交18小时。洗涤后，使用于Vectashield封固介质(VectorLaboratories，Burlingame，CA)中的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；mg/ml)对核复染。
ROS 的FISH-阳性病例被定义为在肿瘤细胞中>15％分裂信号。使用Nikon C1共聚焦显微镜(60 X 物镜和三滤片(dapi, TRITC, FITC))用于对每种情况进行评分。对于图像采集，使用具有40 X物镜和Metamorph软件的Olympus BX-51宽视场荧光显微镜来生成三色图像。
因此，ROS重排探针含有两种在野生型(WT)序列中ROS基因断裂点相对侧上的不同标记探针(参见图14A)。当杂交时，天然ROS区域将出现橙色/绿色融合信号，而在这个基因座的重排(如在SLC34A2-ROS融合蛋白中)将导致产生单独的橙色和绿色信号。
如图14B中显示，在HCC78中发现重排的ROS基因(图14B，左小图)，如上所述，其含有导致SLC34A2-ROS融合的基因重排。在一份人肺样品(即肺306)中，发现类似的ROS基因重排，其可以是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。
FISH分析揭示了在研究的样品群体中这种ROS突变发生率低。最初筛选的123份肿瘤中，123份肿瘤中的两份或者1.6％的肿瘤含有ROS融合突变。然而，鉴于在世界范围内NSCLC的发生率很高(仅在美国，每年超过151,00新病例)，可以预期有大量的患者携带这种突变ROS，这些患者可能从ROS抑制性治疗剂方案中获益。
实施例11
FIG-ROS阳性NSCLC肿瘤的发现
来自实施例9的一份肿瘤样品(即肿瘤749)显示定位于囊泡区室的ROS1染色(参见图13F)。该染色模式不同于所有其他ROS1阳性肿瘤，这指向不同ROS1融合伴侣的可能性。
为了确定该肿瘤749的FISH模式是什么，从Invitrogen 获得第三远端探针RP11-213A17，以进一步研究该肿瘤中的ROS突变是否可能是由于FIG-ROS融合。FIG基因和ROS基因之间的融合已经描述于成胶质细胞瘤、胆管癌和肝癌中(参见Charest等人, GenesChromosomes Cancer 37: 58-71, 2003; Charest等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA100: 916-921, 2003;和PCT公开号WO2010/093928)，但该融合以前从未在肺中描述过。由于FIG基因和ROS基因之间的融合没有导致易位或倒置，而是反而由240千碱基的染色体6上的染色体内缺失而导致，所以设计一组新的FISH探针。
先前所述(参见上文实施例11)的IHC验证测试中使用的FISH探针鉴定了具有ROS平衡易位的那些肿瘤和细胞，所述ROS平衡易位可能是由于SLC34A2-ROS融合蛋白或CD74-ROS融合蛋白中一种的存在而导致的。在肺749中的FISH模式表明，该重排不是这两种融合体中的一种，但可能是FIG-ROS的模式。为了确定肺ID 749是否确实是FIG-ROS阳性的，设计另一个FISH探针组(图15)。如上实施例11中所述，含有179P9和323O17 BACs的探针组1位于本文所述的ROS融合蛋白中ROS断裂点的任一侧的侧翼(例如，在ROS的外显子34、35或36之后)(参见图15和图14A)。在SLC34A-ROS阳性HCC78细胞(参见图14B，左小图和图16A)中，探针组1导致平衡易位。在FIG-ROS阳性人U118MG成胶质细胞瘤细胞系中，323O17 BAC没有杂交，因为染色体6的该部分缺失，导致只有橙色信号(图16C)。探针组2含有位于ROS上的179P9和位于FIG基因上的213A7，因此U118MG用该探针组显示橙色和绿色信号两者(参见图16D)。HCC78细胞显示具有平衡易位的1条染色体 (例如，来自SLC34A2-ROS融合体；参见图16B中的两个黄色箭头)，并且图16B中的白色箭头指向具有靠近在一起的绿色和橙色信号的正常染色体，因为FIG基因和ROS基因事实上在相同染色体上靠近在一起(参见图16B)。野生型染色体由于探针之间的距离而显示分离的信号。肺ID 749，当用探针组1(图16E)或探针组2(参见图16F)探测时，模拟了U118MG细胞的信号(图16C和D)。这些数据首次显示FIG-ROS 融合体作为NSCLC中染色体6上的染色体内缺失。
实施例12
来自肺肿瘤749的FIG-ROS(S)融合基因的分离和测序
为了分离和测序来自肿瘤749的ROS融合体(这是福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤)，使用以下方案。
从FFPE肿瘤样品RT-PCR：遵循标准方案(RNeasy FFPE试剂盒，Qiagen)从3 X 10 μm切片提取RNA。使用SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen)以基因特异性引物从500 ng总RNA合成第一链cDNA。然后，使用用于短同种型的PCR引物对FIG-F3和ROS-GSP3.1与用于长同种型的PCR引物对FIG-F7和ROS-GSP3.2扩增FIG-ROS融合cDNA。GAPDH引物购自Qiagen (Valencia, CA)。
引物
选择用于FIG的引物，因为基于肿瘤749中观察到的FISH模式和关于FIG-ROS融合体的公开信息，预测肿瘤749是FIG-ROS融合体。
如预测，肿瘤749中的ROS融合蛋白的确是FIG-ROS融合体，特别是先前描述的FIG-ROS (S)融合体(参见PCT公开号WO2010/0923828)。图17显示了来自肿瘤749的FFPE 块的序列(在“本序列”行)与PCT公开号WO2010/0923828中描述的FIG-ROS(S)的序列(在“查询序列”行中)的比对。如图17中显示，同一性为100％，缺口为0。由于FIG-ROS(S)含有ROS激酶的整个激酶结构域，所以预测该FIG-ROS(S)保留激酶活性，因此，是具有如本文所述的ROS激酶活性的蛋白。
FIG-ROS(S)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:58，并且FIG-ROS(S)的核苷酸序列示于SEQ ID NO:57。
也已经描述了肝癌中的FIG-ROS(L)(参见PCT公开号WO2010/0923828)。FIG-ROS(L)的氨基酸和核苷酸序列分别示于SEQ ID NOs 56和55。此外，基于FIG和ROS基因的基因结构分析，已经提出了第三种ROS变体(即FIG-ROS(XL))(参见PCT公开号WO2010/0923828)。FIG-ROS(XL)的氨基酸和核苷酸序列分别示于SEQ ID NOs 60和59。鉴于NSCLC中的FIG-ROS(S)这一发现，在NSCLC中还发现了FIG-ROS融合蛋白的其他变体。
实施例13
使用PCR测定法检测ROS激酶在人肺癌样品中的表达。
可以使用前面描述的基因组或逆转录酶(RT)聚合酶链式反应(PCR)检测人肺癌样品中异常表达的全长ROS蛋白或ROS融合蛋白(例如，SLC34A2-ROS融合蛋白之一、CD74-ROS融合蛋白、或FIG-ROS融合蛋白之一)的存在。参见，例如，Cools等人, N. Engl. J. Med.348: 1201-1214 (2003)。
简而言之，例如可以使用标准技术从患有NSCLC的患者中获得肿瘤或胸膜渗出液样品。构建针对截短的ROS激酶、SLC34A2-ROS融合蛋白、CD74-ROS或FIG-ROS的PCR探针。可以使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从肿瘤或胸膜渗出液样品中提取RNA。可以使用DNeasyTissue Kit(Qiagen)提取DNA。对于RT-PCR，使用例如SuperScriptTM III第一链合成系统(Invitrogen)用oligo (dT)20从例如2.5 mg总RNA合成第一链cDNA。然后，使用引物对例如SLC34A2-F1和ROS-P3(参见上述实施例5)扩增ROS基因或ROS融合基因(例如，SLC34A2-ROS、CD74-ROS、或FIG-ROS)。对于基因组PCR，可以使用Platinum Taq DNA高保真聚合酶(Invitrogen)并采用引物对例如SLC34A2-F1和ROS-R1、或者SLC34A2-F1和ROS-R2扩增融合基因。
此类分析将鉴定患有特征在于表达截短的ROS激酶(和/或ROS融合蛋白，诸如FIG-ROS、SLC34A2-ROS或CD74-ROS)的癌症的患者，所述患者是使用ROS抑制性治疗剂治疗的候选者。
实施例14
ROS激酶融合体对TAE-684和克里唑替尼(Crizotinib)的敏感性
小分子TAE-684(5-氯-2,4-二氨基苯基嘧啶)抑制ALK激酶。Galkin,等人, Proc.National Acad. Sci 104(1) 270-275, 2007(通过引用并入)中提供了TAE-684的结构。另一种小分子，即克里唑替尼，也抑制ALK激酶，以及MET激酶。Zou HY等人, Cancer Research67: 4408-4417, 2007和美国专利公开号20080300273(通过引用并入)中提供了克里唑替尼(也称为PF-02341066)的结构。
确定TAE-684和/或克里唑替尼是否也抑制ROS融合多肽。
BaF3和Karpas 299细胞从DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH, Germany)获得。需要白介素-3存活的BaF3细胞在37℃下维持在具有10％胎牛血清(FBS) (Sigma)和1.0 ng/ml鼠IL-3 (R&D Systems)的RPMI-1640培养基(Invitrogen)中。Karpas 299细胞(淋巴瘤细胞系)生长在具有10% FBS 的RPMI- 1640中。
BaF3细胞用编码FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)或FLT- 3ITD(在FLT3中的内部串联重复突变引起AML白血病)的逆转录病毒转导，并且选择IL3依赖性生长。表达NPM-ALK的Karpas299细胞被用作阳性对照。如前所述生成逆转录病毒(参见PCT公开号WO 2010/093928，其通过引用并入)。
使用CellTiter 96水性单溶液试剂(Promega, 目录号G3582)进行MTS测定。简而言之，24孔板中的1 x 105个细胞/孔在1 mL培养基中生长，所述培养基包括0 nM、3 nM、10nM、30 nM、100 nM、300 nM 或1000 nM TAE-684。72小时后，将20 μl CellTiter 96水性单溶液试剂添加至96孔测定板(平底)的各孔中，然后添加100 μl在处理或没有处理的情况下生长的细胞。仅有培养基的孔用作对照。96孔板在37℃下孵育1-4小时，然后使用96孔读板器通过读取490 nm处的吸光度而计数活细胞。
如图18中显示，用表达FIG-ROS 多肽之一的逆转录病毒转导的BaF3细胞在TAE-684存在的情况下停止生长。与FIG-ROS(L)相比，FIG-ROS(S)更不易受TAE-684影响。Karpas299细胞在TAE-684存在的情况下也响应(即停止生长)。用FLT3/ITD转导的BaF3细胞不易受TAE-684影响。来自两次实验的IC50值在如下表4中，其中数据来自最后的细胞系，即表达myc-标签的新霉素的BaF3细胞，其仅在第二次实验中可获得。
表 4
接下来通过使用切割的胱天蛋白酶-3作为细胞凋亡的标记通过流式细胞术测量切割的胱天蛋白酶-3阳性细胞的百分比来评估BaF3和Karpas 299细胞的死亡机制。这些结果使用从Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA)可公开获得的方案获得。如图19中显示，TAE-684的存在引起表达FIG-ROS(S)或FIG-ROS(L)的BaF3细胞通过细胞凋亡而死亡。在TAE-684存在的情况下停止生长的Karpas 299细胞没有通过细胞凋亡而死亡 -它们只是经历细胞周期停滞。因此，TAE-684抑制FIG-ROS融合多肽的机制不同于TAE-684抑制ALK激酶的机制。
为了进一步鉴定TAE-684对ROS融合多肽的作用机制，所有四个细胞系(即，用编码FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)和FLT-3ITD的逆转录病毒转导的Karpas 299细胞和BaF3细胞)在用0、10、50、或100 nM TAE-684处理三个小时之后进行Western印迹分析。所有抗体均来自Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA)。
如图20中显示，表达FIG- ROS(S)和FIG-ROS(L)的BaF3细胞中FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)两者的磷酸化均受TAE-684抑制。此外，STAT3、AKT、和ERK、和Shp2的磷酸化在表达FIG-ROS(S)和FIG- ROS(L)的BaF3细胞中被抑制。STAT3、AKT、和ERK、和Shp2的磷酸化在用FLT-3ITD逆转录病毒转导的BaF3细胞中不受影响。TAE-684还抑制Karpas 299细胞中的ALK和ERK磷酸化。由于ROS、ALK、LTK、InsR、和IGFlR属于酪氨酸激酶的相同家族，所以它们可能在激酶结构域共有相似的结构。针对ALK、LTK、InsR、和IGFlR设计的激酶抑制剂或抗体可能具有针对ROS激酶的治疗效果。
接下来使用相同的方案在相同细胞上进行平行组实验，其中添加另一个阴性对照，即用neo-myc标签转导的BaF3细胞，以比较两种ALK治疗剂，即TAE-684和克里唑替尼。
如图21A (TAE-684)和图21B(克里唑替尼)中显示，在相同浓度的各治疗剂时，与对克里唑替尼相比，含有FIG-ROS融合蛋白的BaF3细胞对TAE-684更敏感。这可能是克里唑替尼没有和类似剂量的TAE-684一样有效，因为与相同浓度的TAE-684相比，甚至阳性对照(即表达NPM-ALK融合蛋白的Karpas 299细胞)对克里唑替尼也不敏感。与表达FIG-ROS蛋白的BaF3细胞和表达NPM-ALK蛋白的Karpas 299相比，两个阴性对照(即，用FLT3-ITD转导的BaF3或用neo-myc转导的BaF3)都对克里唑替尼和TAE-684不太敏感。
在用0、0.1、0.3、或1.0 uM克里唑替尼处理三个小时之后，接下来使用从CellSignaling Technology, Inc获得的抗体进行Western印迹分析。如图22中显示，表达FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)的BaF3细胞中FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)两者的磷酸化均被克里唑替尼抑制。此外，STAT3和ERK的磷酸化在表达FIG-ROS(S)和FIG- ROS(L)的BaF3细胞中被克里唑替尼抑制。在克里唑替尼处理之后，STAT3和ERK的磷酸化在用FLT-3ITD逆转录病毒转导的BaF3细胞中不受影响。克里唑替尼还抑制Karpas 299细胞中ALK、STAT3和ERK磷酸化。由于ROS、ALK、LTK、InsR、和IGFlR属于酪氨酸激酶的相同家族，所以它们可能在激酶结构域共有相似的结构。针对ALK、LTK、InsR、和IGFlR设计的激酶抑制剂或抗体可能具有针对ROS激酶的治疗效果。
实施例15
表达ALK和/或ROS的NSCLC的调查。
除了ROS激酶以外，也已经描述了含有具有ALK活性的蛋白的NSCLC(参见，例如，美国专利号7,700,339；7,605,131；7,728,120)。使用上述实施例9中描述的IHC方法，筛选人NSCLC肿瘤的许多FFPE样品被抗ROS或抗ALK抗体的特异性结合。此类抗体可商购自许多来源。
还使用标准方法用针对ROS基因或对ALK基因的FISH筛选相同样品。例如，对于ROS基因的FISH方案描述在上述实施例中。对于ALK的FISH方案描述在美国专利号7,700,339(其通过引用并入本文)中。同样，另一种FISH测定法描述在美国专利公开号20110110923(其通过引用并入本文)中。筛选结果显示在下表5(ROS阳性样品)和表6(ALK阳性样品)。
表5 ROS1阳性样品的组织病理学
患者编号 肿瘤ID 诊断 组织学模式(%) ROS1 FISH
1 147 腺癌 BAC (40)，乳头状(30)，腺泡状(20)，实体(10) +
2 306 腺癌 腺泡状(70)，乳头状(20)，和实体(10) +
3 570 腺癌 腺泡状(90)，BAC (5)，微乳头状(5) +
4 400037 腺癌 腺泡状 +
5 668 腺癌 实体(80)，腺泡状(10)，BAC (10) +
6 702 腺癌 乳头状(40)，腺泡状(30)，实体(30) +
7 749 腺癌 实体(80)，腺泡状(20) +，绿色缺失
8 760 腺癌 印戒细胞(Signet cells) +
9 575 大细胞 无法评分的
表6：ALK阳性病例的组织病理学。
基于这种通过IHC和FISH两者对人NSCLC的筛选，发现ALK和ROS在这些肿瘤中的表达是相互排斥的。换言之，如果NSCLC肿瘤被ALK驱动，则它将不表达ROS。同样，如果NSCLC肿瘤被ROS驱动，则它将不表达ALK。因此，抑制ROS活性和ALK活性两者的治疗剂诸如克里唑替尼或TAE-684在治疗NSCLC中将是特别有效的。
等同方案
应当理解的是，尽管本公开已经结合其详述进行了描述，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，所述本发明的范围由所附权利要求的范围所定义。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围之内。
1.用于检测生物样品中FIG-ROS融合多肽的存在的方法，所述生物样品来自哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌，所述方法包括以下步骤：
(a) 获得哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌的生物样品；并且
(b) 利用至少一种特异性结合所述多肽的试剂来确定在所述生物样品中是否存在所述多肽，其中所述试剂与所述生物样品的特异性结合的检测表明所述生物样品中存在所述多肽。
2.实施方案1的方法，其中所述哺乳动物肺癌是人肺癌。
3.实施方案1的方法，其中所述FIG-ROS融合多肽与选自下列的多肽95%相同：FIG-ROS(S)多肽(SEQ ID NO: 58)、FIG-ROS (L)多肽 (SEQ ID NO: 56)和FIG-ROS(VL)多肽(SEQ ID NO: 60)。
4.实施方案1的方法，其中所述试剂是抗体。
5.实施方案1的方法，其中所述方法以选自流式细胞术测定、免疫组织化学(IHC)测定、免疫荧光(IF)测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)测定法和Western印迹分析测定的形式实施。
6.用于检测生物样品中编码FIG- ROS融合多肽的多核苷酸的存在的方法，所述生物样品来自哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌，所述方法包括以下步骤：
(a) 获得哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌的生物样品，并且
(b) 利用特异性结合编码所述多肽的所述多核苷酸的试剂来确定在所述生物样品中是否存在所述多核苷酸，其中所述特异性结合所述编码所述多肽的多核苷酸的试剂与所述生物样品的特异性结合的检测表明所述生物样品中存在所述编码所述多肽的多核苷酸。
7.实施方案6的方法，其中所述哺乳动物肺癌是人肺癌。
8.实施方案6的方法，其中所述FIG-ROS融合多肽与选自下列的多肽95%相同：FIG-ROS(S)多肽(SEQ ID NO: 58)、FIG-ROS (L)多肽 (SEQ ID NO: 56)和FIG-ROS(VL)多肽(SEQ ID NO: 60)。
9.实施方案6的方法，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO: 59的核苷酸序列。
10.实施方案6的方法，其中所述试剂是核酸探针。
11.实施方案10的方法，其中所述核酸探针是荧光原位杂交(FISH)探针，且所述方法用FISH测定法实施。
12.实施方案6的方法，其中所述试剂包含聚合酶链式反应(PCR)引物对，且所述方法用PCR测定法实施。
13.实施方案1或6的方法，其中所述试剂是可检测地标记的。
14.物质在制备试剂中的用途，所述试剂用于抑制表达FIG-ROS融合多肽的肺癌的进展的方法中，所述方法包括抑制所述多肽在所述癌症中的表达和/或活性的步骤。
15.物质在制备试剂中的用途，所述试剂用于抑制包含编码FIG-ROS融合多肽的多核苷酸的肺癌的进展的方法中，所述方法包括抑制所述多核苷酸在所述癌症中的表达的步骤。
16.实施方案14或15的用途，其中所述哺乳动物肺癌来自人。
17.实施方案14的用途，其中所述物质是选自PF-02341066、NVT TAE-684和AP26113的治疗剂。
18.将患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鉴定为可能对ROS-抑制性治疗剂响应的患者的方法，所述方法包括：
将来自所述患者的肺的生物样品与特异性结合FIG-ROS融合多肽的试剂相接触，
检测所述试剂是否特异性结合所述生物样品，其中所述试剂与所述生物样品的结合的检测将所述患者鉴定为可能对ROS-抑制性治疗剂响应的患者。
19.实施方案18的方法，其中所述ROS抑制性治疗剂是PF-02341066、NVT TAE-684或AP26113。
20.ROS-抑制性治疗剂在制备试剂中的用途，所述试剂用于治疗患者的肺癌的方法中，所述方法包括检测来自患有肺癌或疑似患有肺癌的患者的生物样品中FIG-ROS融合多肽的存在，并且将有效量的所述试剂施用于所述患者。
21.实施方案20的用途，其中所述治疗剂是PF-02341066、NVT TAE-684或AP26113。

Claims (10)

1.用于检测生物样品中FIG-ROS融合多肽的存在的方法，所述生物样品来自哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌，所述方法包括以下步骤：
(a) 获得哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌的生物样品；并且
(b) 利用至少一种特异性结合所述多肽的试剂来确定在所述生物样品中是否存在所述多肽，其中所述试剂与所述生物样品的特异性结合的检测表明所述生物样品中存在所述多肽。
2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物肺癌是人肺癌。
3.权利要求1的方法，其中所述FIG-ROS融合多肽与选自下列的多肽95%相同：FIG-ROS(S)多肽(SEQ ID NO: 58)、FIG-ROS (L)多肽 (SEQ ID NO: 56)和FIG-ROS(VL)多肽(SEQID NO: 60)。
4.权利要求1的方法，其中所述试剂是抗体。
5.权利要求1的方法，其中所述方法以选自流式细胞术测定、免疫组织化学(IHC)测定、免疫荧光(IF)测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)测定法和Western印迹分析测定的形式实施。
6.用于检测生物样品中编码FIG- ROS融合多肽的多核苷酸的存在的方法，所述生物样品来自哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌，所述方法包括以下步骤：
(a) 获得哺乳动物肺癌或疑似哺乳动物肺癌的生物样品，并且
(b) 利用特异性结合编码所述多肽的所述多核苷酸的试剂来确定在所述生物样品中是否存在所述多核苷酸，其中所述特异性结合所述编码所述多肽的多核苷酸的试剂与所述生物样品的特异性结合的检测表明所述生物样品中存在所述编码所述多肽的多核苷酸。
7.权利要求6的方法，其中所述哺乳动物肺癌是人肺癌。
8.权利要求6的方法，其中所述FIG-ROS融合多肽与选自下列的多肽95%相同：FIG-ROS(S)多肽(SEQ ID NO: 58)、FIG-ROS (L)多肽 (SEQ ID NO: 56)和FIG-ROS(VL)多肽(SEQID NO: 60)。
9.权利要求6的方法，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 55、SEQID NO: 59的核苷酸序列。
10.权利要求6的方法，其中所述试剂是核酸探针。
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