KR102123963B1 - 폐암에서 ｒｏｓ 키나아제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포유류 폐암에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 존재의 확인을 제공한다. 일부 실시형태에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 ROS-코딩 폴리뉴클레오타이드 및 제2(비-ROS) 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 사이의 융합의 결과이다. ROS의 3종의 상이한 융합 파트너, 즉 FIG 유전자, SLC34A2 유전자, 및 CD74 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 기재된다. 본 발명은 생물학적 샘플에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 존재를 결정하는 새로운 방법, 그러한 단백질을 억제하는 화합물에 대한 스크리닝 방법, 및 암(예를 들어, 폐암)의 진행을 억제하는 방법을 가능하게 한다.

Description

폐암에서 ＲＯＳ 키나아제{ROS KINASE IN LUNG CANCER}
본 발명은 일반적으로 폐암(예를 들어, 인간 폐암)에 관여하는 단백질 및 유전자, 및 폐암의 검출, 진단 및 치료에 관한 것이다.
많은 암은 성장 및 증식을 포함하는 세포 과정의 비정상적 제어에 이르게 되는 세포 신호전달경로(signaling pathways)에 있어서의 분열(disruptions)에 의해 특징지워진다. 이러한 분열은 키나아제와 같은 특정한 신호전달 단백질의 활성의 변화에 의해 일반적으로 야기된다.
단백질 키나아제 단백질의 비정상적 발현은 암의 병인(및 동인)일 수 있다. 비정상적 발현은 이차 단백질(또는 그 부분)과 단백질(또는 그의 키나아제 부분)의 융합, 그 단백질의 말단이 잘린(truncated) 부분, 또는 전장 단백질 발현의 비정상적인 조절에 의해 야기될 수 있다.
비정상적 신호전달 활성을 갖는 키나아제 융합 단백질을 야기하는 유전자 전좌(translocation)는 직접적으로 일부 암에 이를 수 있는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, Mitelman et al., Nature Reviews Cancer 7: 233-245, 2007, Futreal et al., Nat Rev Cancer 4(3): 177-183 (2004), 및 Falini et al ., Blood 99(2): 409-426 (2002) 참조). 예를 들어, 티로신 키나아제 융합 단백질인 BCR-ABL 종양 단백질(oncoprotein)은 병인이며, 인간 만성 골수성 백혈병 (CML)을 야기한다. CML 사례의 적어도 90-95%에서 발견되는 BCR-ABL 종양 단백질은 9번 염색체의 c-ABL 단백질 티로신 키나아제로부터의 유전자 서열의 소위 필라델피아 염색체를 생산하는 22번 염색체의 BCR 서열로의 전좌에 의해 생성된다. 예를 들어, Kurzock et al ., N. Engl. J. Med . 319: 990-998 (1988) 참조. 전좌는 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 급성 골수성 백혈병 (AML) 사례에서도 관찰된다. 이러한 발견은 CML 및 ALL의 치료를 위한, ABL 키나아제의 소분자 저해제인 이매티닙 메실레이트(Novartis에 의해 상표명 Gleevec®으로 판매됨) 및 다사티니그(dasatinig)(Bristol-Mysers Squibb에 의해 상표명 Sprycel®으로 판매됨)의 FDA 승인의 원동력이 되었다. 이러한 약물은 종양 세포의 성장을 일으키는 신호전달경로를 방해하도록 설계된 약물의 예이다. 그러한 약물의 개발은, 암의 근원적인 원인에 대해 특이적으로 표적화하지 못하기 때문에 종종 제한된 효과를 나타내며, 잘 알려진 부작용으로 고생하는 CML 및 ALL에 대한 종래 치료법에 대하여 큰 진보를 나타낸다.
따라서, 암이 치료법에 대하여 반응하기 좀더 쉬운 초기에 암을 검출하기 위하여 암을 일으키는 단백질을 확인하는 것이 유용하다. 또한, 그 중에서도 그러한 단백질의 확인은 바람직하게 표적화된 치료에 대하여 환자를 선택하는 방법, 및 그러한 단백질을 억제하는, 이에 따라 암을 치료하는 새로운 약물을 스크리닝 및 개발하는 새로운 방법을 가능하게 한다.
수용체 티로신 키나아제 (RTKs)의 종양형성 작용은 폐암을 포함하는 많은 형태의 고형암의 원인인 것으로 나타내어졌다. 비-소세포 폐암 및 소세포 폐암을 포함하는 폐암은 전세계적으로 남성 및 여성 모두에서 암에 의한 사망의 가장 흔한 원인이다. 미국국립암연구소에 따르면, 미국에서 매 12명의 남성 및 여성 중에 약 1명이 생애 중 어떤 시기에 폐의 암을 진단받을 것이다. 폐암의 2종의 특히 치명적인 형태는 소세포 폐암종 (small cell lung carcinoma, SCLC) 및 비-소세포 폐암종(non-small cell lung carcinoma)이다.
불행하게도, 폐암은 화학요법 또는 방사선치료와 결합된 경우에서조차 일반적으로 수술에 완벽하게 반응하지 않는다. 예를 들어, NSCLC는 미국에서 암 사망의 선두적인 원인이며, 모든 폐암의 약 87%에 이른다. 매년 미국에서 약 151,000개의 NSCLC의 새로운 사례가 있으며, 120,000명 이상의 환자들이 미국에서만 매년 이 질병으로 사망하는 것으로 추정된다. "Cancer Facts and Figures 2005", American Cancer Society 참조. 3종의 별개의 아형을 포함하는 NSCLC는 종종 전이된 후에야 검출되며, 따라서 진단 2년 이내에 사망율이 75%이다.
따라서, 초기에 폐암을 확인하는 새로운 방식 및 폐암을 치료하는 새로운 방식(및 새로운 시약)를 발견하는 것이 유용할 것이다.
본 발명은 암, 특히 폐암에서 비정상적 ROS 발현 및/또는 활성의 발견에 기초한다. 건강한 정상적인 폐 조직 및 세포는 ROS 키나아제 단백질 또는 ROS 키나아제 활성을 발현하지 않기 때문에, 포유류 폐암에서 ROS 비정상적 발현은 예를 들어, 포유류 폐암에서 전장 ROS 키나아제의 발현에 기인할 수 있다. 포유류 폐암에서 ROS의 비정상적 발현은 또한 말단이 잘린 ROS (예를 들어, 키나아제 도메인을 포함하는 ROS 키나아제의 일부를 포함하는) 또는 본 명세서에 개시된 ROS 융합 단백질(fusion proteins)의 하나의 존재에 기인할 수 있다. 모든 개시된 폐암에서 ROS의 발현은 ROS 키나아제 도메인의 발현을 야기하고; 따라서 모든 개시된 ROS 융합 폴리펩타이드는 활성화된 ROS 키나아제 활성을 갖는다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암(suspected mammalian lung cancer)으로부터의 생물학적 샘플에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암으로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 ROS 키나아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 시약을 이용하여, 상기 폴리펩타이드가 상기 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기에서, 상기 생물학적 샘플에 대한 상기 시약의 특이적 결합의 검출은, 상기 폴리펩타이드가 상기 생물학적 샘플에 존재하는 것을 나타낸다.
다른 실시형태에서, 시약은 항체이다. 일부 실시형태에서, 시약 (예를 들어, 항체)은 검출가능하게 표지된다. 다른 실시형태에서, 시약은 전장 ROS 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 시약은 ROS 키나아제 도메인에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 시약은 ROS 융합 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다(예를 들어, CD74-ROS 융합 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(S) 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(L) 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(VS) 폴리펩타이드, FIG-ROS (L) 폴리펩타이드, FIG-ROS(S) 폴리펩타이드, 또는 FIG-ROS(VL) 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다).
본 발명의 방법의 다양한 실시형태에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 전장 ROS 폴리펩타이드이다. 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 ROS 융합 폴리펩타이드이다. 다른 실시형태에서, ROS 융합 폴리펩타이드는 CD74-ROS 융합 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(S) 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(L) 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(VS) 폴리펩타이드, FIG-ROS(L) 폴리펩타이드, FIG-ROS(S) 폴리펩타이드, 및 FIG-ROS(VL) 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 실시형태에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 5, 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 유세포 분석(flow cytometry assay), 시험관내 키나아제 분석(in vitro kinase assay), 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 분석, 면역형광(immunofluorescence, IF) 분석, 효소결합면역흡착분석 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 및 웨스턴 블롯팅 분석(Western blotting analysis assay)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포맷에서 실시된다.
일 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드의 키나아제 활성이 검출된다. 다른 실시형태에서, 시약은 중동위원소 표지된 (AQUA) 펩타이드이다. 다른 실시형태에서, 중동위원소 표지된 (AQUA) 펩타이드는 ROS 융합 폴리펩타이드의 융합 접점(fusion junction)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 질량분광분석(mass spectrometry analysis)을 이용하여 실시된다.
다른 측면에서, 본 발명은 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암으로부터의 생물학적 샘플에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암으로부터의 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 및 (b) ROS 키나아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여, 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기에서, 상기 생물학적 샘플에 대한 상기 시약의 특이적 결합의 검출은, ROS 키나아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 생물학적 샘플에 존재하는 것을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2, 6, 8, 23, 29, 55, 57, 및 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 시약은 핵산 프로브이다. 일부 실시형태에서, 시약은 검출가능하게 표지된다. 다른 실시형태에서, 핵산 프로브는 형광 인-시츄 하이브리다이제이션(fluorescence in-situ hybridization, FISH) 프로브이며, 상기 방법은 FISH 분석에서 실시된다. 다른 실시형태에서, 핵산 프로브는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 프로브이며, 상기 방법은 PCR 분석에서 실시된다. 다른 실시형태에서, 시약은 검출가능하게 표지된다.
본 발명의 방법의 다양한 실시형태에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 전장 ROS 폴리펩타이드이다. 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 ROS 융합 폴리펩타이드이다. 다른 실시형태에서, ROS 융합 폴리펩타이드는 CD74-ROS 융합 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(S) 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(L) 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(VS) 폴리펩타이드, FIG-ROS (L) 폴리펩타이드, FIG-ROS(S) 폴리펩타이드, 및 FIG-ROS(VL) 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 실시형태에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 5, 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 방법의 다양한 실시형태에서, 폐암은 인간 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암종 또는 소세포 폐암종)이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 폐 생검(lung biopsy), 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage), 종양 절제물(종양 resection), 미세바늘 흡입물(fine needle aspirate), 흉수(pleural effusion), 및 순환종양세포(circulating tumor cell)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법의 다양한 실시형태에서, 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암은 비-소세포 폐암종이다. 다양한 실시형태에서, 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암은 인간으로부터 유래된 것이다.
본 발명의 방법의 다양한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 ROS 키나아제 활성에 의해 야기되는 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암으로부터의 것으로 진단된다. 일부 실시형태에서, 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암은 ROS-억제 치료제에 반응하기 쉽다. 다양한 실시형태에서, 시약이 생물학적 샘플에 특이적으로 결합하는 경우, 상기 생물학적 샘플이 수득되어지는 환자는 ROS 키나아제 활성에 의해 야기되는 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암을 갖는 것으로 진단된다. 일부 실시형태에서, 환자는 ROS-억제 치료제에 반응하기 쉬운 것으로 진단된다. ROS-억제 치료제의 비제한적인 일 예는 크리조티닙(crizotinib, PF-02341066로도 알려짐)이다. ROS-억제 치료제의 추가적인 비제한적 예는 NVT TAE-684, AP26113, CEP-14083, CEP-14513, CH5424802, CEP11988, WHI-P131 및 WHI-P154를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 활성을 발현하는 포유류 암 또는 포유류 암으로 의심되는 암의 진행을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유류 암 또는 포유류 암으로 의심되는 암에서 상기 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 억제시키는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 포유류 암 또는 포유류 암으로 의심되는 암의 진행을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유류 암 또는 포유류 암으로 의심되는 암에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 억제시키는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 폐암 또는 폐암으로 의심되는 암은 인간으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현 및/또는 활성은 PF-02341066, NVT TAE-684, AP26113, CEP-14083, CEP-14513, CEP11988, CH5424802, WHI-P131 및 WHI-P154로 이루어진 군으로부터 선택되는 ROS-억제 치료제에 의해 억제된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폐암을 갖는 또는 폐암을 갖는 것으로 의심되는 환자를 ROS-억제 치료제에 반응하기 쉬운 환자로 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자의 폐로부터의 생물학적 샘플을 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시키는 단계, 및 상기 시약이 상기 생물학적 샘플에 특이적으로 결합하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하며, 여기에서, 상기 생물학적 샘플에 대한 상기 시약의 결합의 검출에 의해, 상기 환자는 ROS-억제 치료제에 반응하기 쉬운 환자로 확인된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폐암에 대하여 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 폐암을 갖는 또는 폐암을 갖는 것으로 의심되는 환자의 폐로부터의 생물학적 샘플에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계; 및 치료학적 유효량의 ROS-억제 치료제를 상기 환자에게 투여하여, 폐암에 대하여 대상을 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폐암에 대하여 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 폐암을 갖는 또는 폐암을 갖는 것으로 의심되는 환자의 폐로부터의 생물학적 샘플에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 ALK 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계; 및 치료학적 유효량의 ALK/ROS-억제 치료제를 상기 환자에게 투여하여, 폐암에 대하여 대상을 치료하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 폐암을 갖는 또는 폐암을 갖는 것으로 의심되는 환자를 ROS-억제 치료제에 반응하기 쉬운 환자로 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자의 폐로부터의 생물학적 샘플을 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 제1 시약 및 ALK 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 제2 시약에 접촉시키는 단계, 및 상기 제1 시약 또는 상기 제2 시약이 상기 생물학적 샘플에 특이적으로 결합하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하며, 여기에서, 상기 생물학적 샘플에 대한 상기 제1 시약 또는 상기 제2 시약의 결합의 검출에 의해, 상기 환자는 ROS-억제 치료제에 반응하기 쉬운 환자로확인된다.
다른 측면에서, 본 발명은 폐암을 갖는 또는 폐암을 갖는 것으로 의심되는 환자를 ALK-억제 치료제에 반응하기 쉬운 환자로 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자의 폐로부터의 생물학적 샘플을 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 제1 시약 및 ALK 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 제2 시약에 접촉시키는 단계, 및 상기 제1 시약 또는 상기 제2 시약이 상기 생물학적 샘플에 특이적으로 결합하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하며, 여기에서, 상기 생물학적 샘플에 대한 상기 제1 시약 또는 상기 제2 시약의 결합의 검출에 의해, 상기 환자는 ALK-억제 치료제에 반응하기 쉬운 환자로 확인된다.
다양한 실시형태에서, 제1 시약은 전장 ROS 키나아제 단백질에 특이적으로 결합한다. 다양한 실시형태에서, 제2 시약은 전장 ALK 키나아제 단백질에 특이적으로 결합한다. 다양한 실시형태에서, 제1 시약은 ROS 키나아제 단백질의 키나아제 도메인에 특이적으로 결합한다. 다양한 실시형태에서, 제2 시약은 ALK 키나아제 단백질의 키나아제 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 제1 시약은 항체이다. 일부 실시형태에서, 제2 시약은 항체이다.
본 발명의 모든 측면의 다양한 실시형태에서, 환자는 인간 환자이며, 폐암 (또는 폐암으로 의심되는 암)은 인간으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 폐암은 NSCLC 또는 SCLC이다. 일부 실시형태에서, ROS-억제 치료제 또는 ALK-억제 치료제는 PF-02341066, NVT TAE-684, 또는 AP26113이다. 일부 실시형태에서, ROS-억제 치료제 또는 ALK-억제 치료제는 AP26113, CEP-14083, CEP-14513, CEP11988, CH5424802, WHI-P131 및 WHI-P154이다.
다양한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 폐 생검, 기관지 폐포 세척액, 순환종양세포, 종양 절제물, 미세바늘 흡입물, 및 흉수로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명은 화합물이, ROS 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현에 의해 특징지워지는 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암의 진행을 억제하는지 여부를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 화합물이 상기 암에서 상기 폴리펩타이드의 발현을 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 ROS 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현에 의해 특징지워지는 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암의 진행을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암에서 상기 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 억제하는 단계를 포함한다.
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도 1은 전장/야생형 ROS보다 훨씬 더 작은 분자량을 갖는 ROS의 한 형태의 발현을 나타내는, 인간 NSCLC 세포주(HCC78)로부터의 추출물의 웨스턴 블롯팅 분석을 나타낸다.
도 2는 인간 NSCLC 세포주에서 돌연변이 ROS 키나아제의 siRNA 억제를 나타낸다: 패널 A는 siRNA 형질감염(transfection) 후 세포 억제의 그래프를 나타내며, 패널 B는 ROS의 특이적 녹-다운(knock-down) 및 증가된 아포토시스(apoptosis)를 나타내는 면역블롯이며(돌연변이 ROS-유도 세포주(mutant ROS-driven 세포주)), 패널 C는 ROS의 신호전달 분자 다운스트림(signaling molecules downstream)의 감소된 활성을 나타내는 면역블롯이다.
도 3a-3b는 각각 염색체 4p 및 6p에서 SLC34A2 유전자 및 ROS 유전자의 위치를 나타내며(도 3a), 전장 SLC34A2 및 ROS 단백질의 도메인 위치를 나타낸다(도 3b).
도 3c는 긴 SCL34A2-ROS 변이체(long SCL34A2-ROS variant)의 개략도이며, 여기에서 SCL34A2의 엑손 1-4는 ROS의 엑손 32-43과 결합한다. 융합 접점(fusion junction)은 ROS의 막관통 도메인(trasnmembrane domain)의 상류에서 잔기 1750에 존재하며, 융합 접점의 측면에 배치되는 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기(각각 SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13)는 도 3의 하부에 나타내어진다(SCL34A2로부터의 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기는 보통 글씨체로 나타내어지며, ROS로부터의 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기는 볼드체로 나타내어진다).
도 3d는 짧은 SCL34A2-ROS 변이체(short SCL34A2-ROS variant)의 개략도이며, 여기에서, SCL34A2로부터의 엑손 1-4는 ROS로부터의 엑손 32-43과 결합한다. 융합 접점은 ROS의 막관통 도메인의 바로 상류에서 잔기 1853에 존재하며, 융합 접점의 측면에 배치되는 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기(각각 SEQ ID NO: 14 및 SEQ ID NO: 15)는 도 3d의 하부에 나타내어진다(SCL34A2로부터의 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기는 보통 글씨체로 나타내어지며, ROS로부터의 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기는 볼드체로 나타내어진다).
도 3e는 예측되는 매우 짧은 SCL34A2-ROS 변이체의 개략도이며, 여기에서, SCL34A2로부터의 엑손 1-4는 ROS로부터의 엑손 32-43과 결합한다. 융합 접점은 ROS의 막관통 도메인의 N-말단 경계에서, 잔기 1882에 존재하며, 융합 접점의 측면에 배치되는 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기(각각 SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 17)는 도 3e의 하부에 나타내어진다(SCL34A2로부터의 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기는 보통 글씨체로 나타내어지며, ROS로부터의 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기는 볼드체로 나타내어진다).
도 4a는 인간 SLC34A2-ROS 융합 단백질의 긴 변이체의 아미노산 서열이며(1 글자 코드)(SEQ ID NO: 5)(상부 패널), 코딩 DNA 서열도 나타내어진다(SEQ ID NO: 6) (하부 패널); SLC34A2 부분의 잔기는 이탤릭체로 나타내어지며, 키나아제 도메인의 잔기는 볼드체로 나타내어진다.
도 4b는 인간 SLC34A2-ROS 융합 단백질의 짧은 변이체의 아미노산 서열이며(1 글자 코드)(SEQ ID NO: 7)(상부 패널), 코딩 DNA 서열도 나타내어진다(SEQ ID NO: 8)(하부 패널); SLC34A2 부분의 잔기는 이탤릭체로 나타내어지며, 키나아제 도메인의 잔기는 볼드체로 나타내어진다.
도 5는 인간 SLC34A2 단백질의 아미노산 서열이며(1 글자 코드)(SEQ ID NO: 3)(SwissProt Accession No. 095436)(상부 패널), 코딩 DNA 서열도 나타내어진다(SEQ ID NO: 4)(GeneBank Accession No. NM_006424)(하부 패널); 전좌에 관련되는 잔기는 밑줄쳐진다.
도 6a는 인간 ROS 키나아제의 아미노산 서열이며(1 글자 코드)(SEQ ID NO: 1)(SwissProt Accession No. P08922); SLC34A2-ROS (긴) 변이체 전좌에 관련되는 잔기는 밑줄쳐지며, 밑줄쳐진 볼드체의 잔기는 (짧은) 변이체 전좌에 관련되는 것이고, 붉은 색 잔기는 (매우 짧은) 변이체 전좌에 관련되는 것이다.
도 6b는 인간 ROS 키나아제의 코딩 DNA 서열이며(SEQ ID NO: 2)(GeneBank Accession No. NM_002944); 제1 SLC34A2-ROS (긴) 변이체 전좌에 관련되는 잔기는 밑줄쳐지고, 밑줄쳐진 볼드체의 잔기는 제2 (짧은) 변이체 전좌에 관련되는 것이며, 밑줄쳐진 볼드체 대문자의 잔기는 (매우 짧은) 변이체 전좌에 관련되는 것이다.
도 7은 대조군(레인 1 및 2)과 비교하여, 형질감염된 293 세포에서(인간 배아 신장) SLC34A2-ROS 융합 단백질(제1 (긴) 변이체)의 발현을 나타내는 겔이다.
도 8은 각각 염색체 5q 및 6q에서 CD74 유전자 및 ROS 유전자의 위치(패널 A), 전장 CD74 및 ROS 단백질의 도메인 위치, 및 CD74-ROS 융합 단백질에서의 위치를 나타낸다(패널 B 및 C(SEQ ID NO:30은 패널 C 하부에 도시됨). 융합 접점은 ROS의 막관통 도메인의 상류에서 잔기 1853에 존재한다.
도 9는 인간 CD74-ROS 융합 단백질의 아미노산 서열이며(1 글자 코드)(SEQ ID NO: 22)(상부 패널); CD74 부분의 잔기는 밑줄쳐지며, 키나아제 도메인의 잔기는 볼드체로 나타내어진다.
도 10은 인간 CD74 단백질의 아미노산 서열이며(1 글자 코드)(SEQ ID NO: 24)(SwissProt Accession No. P04233)(상부 패널), 코딩 DNA 서열도 나타내어진다(SEQ ID NO: 25)(GeneBank Accession No. NM_001025159)(하부 패널); 전좌에 관련되는 잔기는 밑줄쳐진다.
도 11a는 인간 ROS 키나아제의 아미노산 서열(1 글자 코드)(SEQ ID NO: 1) (SwissProt Accession No. P08922)이며; CD74-ROS 전좌에 관련되는 잔기는 밑줄쳐진다.
도 11b는 인간 ROS 키나아제의 코딩 DNA 서열이며(SEQ ID NO: 2)(GeneBank Accession No. NM_002944); CD74-ROS 전좌에 관련되는 잔기는 밑줄쳐진다.
도 12는 RT-PCR에 의한, CD74 및 ROS 전좌에 의해 형성된 융합의 검출을 나타내는 겔이며; 프라이머 서열은 CD74-F1(상부) 및 ROS-GSP3(하부)(각각 SEQ ID NOs: 26 및 27)에 대하여 나타내어진다.
도 13a-13f는 비-소세포 폐암 (NSCLC) FFPE 종양 조직에서 ROS 단백질 및 ROS 핵산의 면역조직화학 및 FISH를 나타내는 사진이다. ROS 단백질 국재성(localization)에서의 변화(variation)는 하기와 같이 나타내어진다: (A) FISH에 의한 c- ros 위치의 균형 전좌(balanced translocation)를 설명하는 삽입도(A)에서 황색 화살표에 의해 확산된 세포질. (B) 삽입도에서 확대된(즉, 확대된 이미지) 선암종(adenocarcinoma)에서 크게 반점이 있는 국재성. (C) 대세포 암종(large cell carcinoma)에서 ROS 스테이닝(staining)의 세포질 국재성 및 패널 E에서 상응하는 헤마톡시린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 얼룩(stain). (D) 세포막 스테이닝을 나타내는 삽입도에서 확대된, 특유한 세포질 스테이닝에 의한 선암종 및 세포막 국재성. (E) 패널 C에서 ROS 스테이닝에 상응하는 헤마톡시린 및 에오신 얼룩. (F) 소포(vessicle) 스테이닝을 나타내는 삽입도에서 확대된 반점 있는 소포 스테이닝.
도 14a 및 b는 2색 브레이크-어-파트 프로브(2-color break-a-part probe)를 이용하는 FISH에 의해 ROS 융합/전좌(인간 NSCLC 세포주에서)의 특이적 검출을 나타내는 이미지이다. 도 14a는 FISH 브로브가 하이브리다이즈(hybridize)되는, ROS 유전자 상의 위치를 나타내며, 도 14b는 별개의 오렌지색 및 녹색 신호를 야기하는, 인간 NSCLC 세포주(왼쪽) 및 인간 NSCLC 종양에서 ROS 유전자의 재배열(rearrangement)을 나타낸다.
도 15는 2개의 프로브 세트의 DNA 프로브가 ROS 유전자 및 FIG 유전자에 하이브리다이즈하는 것을 나타내는 개략도이다. 양 프로브 세트 중 근위부(proximal) 프로브, 즉 RP1-179P9는 오렌지색 신호를 줄 것이고, 모든 3개의 원위부(distal) 프로브는 녹색 신호를 줄 것이다. 프로브 세트 1은 c-ros로부터 유래되며, 균형 전좌가 일어나는 경우, 오렌지색은 녹색으로부터 분리될 것이나; FIG-ROS 전좌가 일어나는 경우, 녹색 신호는 사라질 것이다. 프로브 세트 2는 c-ros(오렌지색 RP1-179P9) 및 fig(녹색 RP11-213A17)로부터 유래되었다.
도 16a-16f는 HCC78 세포(패널 A 및 B), U118MG 세포(패널 C 및 D) 및 FFPE 종양 ID 749(패널 E 및 F)의 FISH 분석 결과를 나타내는 사진이다. 프로브 세트 1(A) 및 프로브 세트 2(B)에 의해 검사된 HCC78 세포는 이 세포에 존재하는 SLC34A2-ROS 융합으로부터 예측된 결과를 나타낸다. 황색 화살표는 HCC78 세포에서의 균형 전좌를 나타내는 나뉘어진 신호를 가리키며, 흰색 화살표는 손상되지 않은(intact) 염색체를 가리킨다. 프로브 세트 1(C) 및 프로브 세트 2(D)에 의해 검사된 U118MG 세포는 이 세포에 존재하는 FIG-ROS 융합으로부터 예측된 결과를 나타낸다. 프로브 세트 1(E) 및 프로브 세트 2(F)에 의해 검사된 FFPE 종양 749는 U118MG 세포와 동일하다. 프로브 세트 1에 의해 검사된 U-118 MG 및 종양 ID 749 양쪽에서, c-ros(오렌지색) 프로브만이 강화되고(anneals), 제거된 영역(deleted region)(녹색 프로브)은 존재하지 않는다(각각 패널 C 및 E). 프로브 세트 2로 검사된 U-118 MG 및 종양 ID 749에서(각각 패널 E 및 F), c-ros(오렌지색) 및 fig(녹색) 프로브는 함께 fig-ROS 융합을 나타낸다.
도 17은 종양 749로부터 ROS 융합 단백질의 cDNA 시퀀싱("sbjt" 라인에서), 및 FIG-ROS(S) 뉴클레오타이드 서열에 의한 그의 배치(alignment)를 나타낸다("query"로서).
도 18은 0nM, 3nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM 또는 1000 nM TAE-684의 존재하에, FIG-ROS(S)를 발현하는 BaF3(적색 사각형), FIG-ROS(L)를 발현하는 BaF3(청색 다이아몬드), FLT3ITD를 발현하는 BaF3(녹색 삼각형), 및 Karpas 299 세포(퍼플색 Xs)의 세포 성장 반응(cellular growth response)을 나타내는 선그래프이다.
도 19는 FIG-ROS(S) 또는 FIG-ROS(L)를 발현하는 BaF3가 TAE-684 존재하에, 아포토시스에 의해 사멸하는 것을 나타내는 바그래프이다.
도 20은 FIG-ROS(S) 및 FIG-ROS(L)의 인산화(phosphorylation), 및 그들의 다운스트림 신호전달 분자(downstream signaling molecules)가 TAE-684에 의해 억제되는 것을 나타내는 웨스턴 블롯팅을 도시한다.
도 21a 및 21b는 TAE-684(도 21a) 또는 크리조티닙(도 21b)의 존재하에, 0uM, 0.01uM, 0.03M, 0.10uM, 0.3uM, 1.0uM의 neo-myc으로 형질도입된 BaF3 세포(음성 대조군; 청색 다이아몬드); FIG-ROS(S)를 발현하는 BaF3(퍼플색 X), FIG-ROS(L)를 발현하는 BaF3(녹색 삼각형), FLT3ITD를 발현하는 BaF3(적색 사각형), 및 Karpas 299 세포(청색 별표)의 세포 성장 반응을 나타내는 선그래프이다.
도 22는 FIG-ROS(S) 및 FIG-ROS(L)의 인산화와, ALK 및 추가적인 신호전달 분자가 크리조티닙에 의해 억제되는 것을 나타내는 웨스턴 블롯팅을 도시한다.
본 발명은 인간 폐암에서 비정상적 ROS 키나아제 발현의 발견에 기초한다. ROS 키나아제는 정상 폐 조직 또는 세포에서 발현되지 않기 때문에, 비정상적 ROS 키나아제 활성은 그것이 발현되는 폐암의 증식 및 생존을 유도하는 것으로 예상된다. 그러한 암은 본 명세서에 제공되는 교시에 따라 확인되거나(identified)(예를 들어, 진단되거나(diagnosed)) 및/또는 치료될 수 있다.
이러한 발견에 기초하여, 건강한 환자의 폐 조직은 ROS 활성을 갖는 그러한 단백질을 발현하지 않으나, 폐암(또는 폐암으로 의심되는 암)이 ROS 활성을 갖는 단백질(예를 들어, 전장 ROS 단백질 또는 ROS 융합 단백질)을 발현하는 환자는 ROS 억제제의 투여에 대하여 유리하게 반응할 수 있다(예를 들어, 동일한 암을 앓고 있는 치료받지 않은 환자에 비하여, 암의 성장이 늦어지거나 중단될 수 있다).
본 명세서에 참조되는 공개된 특허, 특허 출원, 웹사이트, 회사명, 및 학술지는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능한 지식을 수립하는 것이며, 각각 참조로 포함되는 것으로 특별하게 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 인용된 임의의 참고문헌과 본 명세서의 특정 교시내용 사이의 임의의 갈등은 후자를 위하여 유리하게 해결되어야 한다.
본 발명의 추가적인 측면, 이점 및 실시형태는 하기에 상세하게 기재된다. 본 명세서에 참조되는 공개된 특허, 특허 출원, 웹사이트, 회사명, 및 학술지는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능한 지식을 수립하는 것이며, 각각 참조로 포함되는 것으로 특별하게 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 인용된 임의의 참고문헌과 본 명세서의 특정 교시내용 사이의 임의의 갈등은 후자를 위하여 유리하게 해결되어야 한다. 유사하게, 단어 또는 문구에 대한 기술분야에서 이해되는 정의와 본 명세서에서 특별하게 교시된 단어 또는 문구에 대한 정의 사이의 임의의 갈등은 후자를 위하여 유리하게 해결되어야 한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 표시된 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an", "the"는 명확하게 다르게 지시되지 않으면, 그들이 나타내는 용어의 복수형도 포함한다. 용어 "약"은 대략적으로, 영역에서, 거의 또는 쯤을 의미하기 위하여 본 명세서에 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 그 경계를 제시된 수치 범위보다 크거나 낮게 확장함으로써 그 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은 수치를 언급된 값의 20%보다 크게, 및 20%보다 작게 변화시키기 위하여 본 명세서에 사용된다.
본 명세서에 사용된 기술적 및 학술적 용어는 다르게 정의되지 않으면, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 명세서에서 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법론 및 재료가 참고된다. 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 항체 및 재조합 DNA 기술의 일반적인 원칙을 제시하는 표준 레퍼런스 워크(standard reference works)는 Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988), Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1989 and updates through September 2010), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989); Kaufman et al., Eds., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991)를 포함한다. 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 약리학의 일반적인 원칙을 제시하는 표준 레퍼런스 워크는 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., McGraw Hill Companies Inc., New York (2006)를 포함한다.
제1 측면에서, 본 발명은 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암으로부터의 생물학적 샘플에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암으로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 ROS 키나아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 시약을 이용하여 상기 폴리펩타이드가 상기 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기에서, 상기 생물학적 샘플에 대한 상기 시약의 특이적 결합의 검출은 상기 폴리펩타이드가 상기 생물학적 샘플에 존재하는 것을 나타낸다.
인간 ROS 키나아제 단백질(ROS1 유전자에 의해 코딩됨)은 암에 이르는 비정상적 발현을 하는 경향이 있는 2347 아미노산 긴 수용체 티로신 키나아제(2347 amino acid long receptor tyrosine kinase)이다. 전장 인간 ROS 키나아제(인간 ROS 단백질의 아미노산 서열을 갖는)의 기술은 UniProt Accession No. P08922에서 찾아질 수 있다. 표 1에 나타내어진 바와 같이, ROS의 신호 펩타이드, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 키나아제 도메인은 SEQ ID NO: 1의 하기 아미노산 잔기에서 발견된다.
도메인 SEQ ID NO: 1에서의 아미노산 잔기
신호 펩타이드 1-27
세포외 도메인 28-1859
막관통 도메인 1860-1882
키나아제 도메인 1945-2222
또한, 다수의 공지된 ROS의 자연발생 변이체가 존재한다(예를 들어, Greenman et al., Nature 446: 153-158, 2007 참조). 쥐(murine) 전장 ROS의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 알려져 있다(예를 들어, UniProt Accession No. Q78DX7 참조). 일상적인 실험을 이용하여, 통상의 지식을 갖는 생물학자는 인간이 아닌 포유류 ROS 상동에서 상응하는 서열을 쉽게 결정할 수 있을 것이다.
"야생형" ROS는 정상적인 개체(예를 들어, 암을 앓고 있지 않은 정상적 개체)의 건강한(또는 정상적인) 조직에서 전장 ROS 키나아제(즉, 인간 ROS에 있어서, 2347 아미노산 긴 폴리펩타이드 또는 신호 펩타이드 서열의 제거 후 2320 아미노산 긴 폴리펩타이드)의 발현 및/또는 활성화를 의미하는데 사용된다. ROS 키나아제 (전장 또는 말단이 잘린)는 인간의 정상적인 폐 조직에서 발현되는 것으로 보이지 않는다(예를 들어, 하기 실시예 참조). 그러나, 하기 실시예에 기재된 방법을 이용하여, 본 발명자들은 폐암에서 ROS 키나아제 발현이라는 놀라운 발견을 하였다. 전형적인 세포(예를 들어, 비-암 폐 세포)에서 발현이 나타나지 않는 경우, 이례적인 세포(이 경우 암 세포)에서의 발현은 비정상적이다.
다른 단백질, 즉 FIG와의 융합의 형태로 비정상적으로 발현된 ROS 키나아제는 교모세포종(Charest et al., Charest et al., Genes Chromosomes Cancer 37: 58-71, 2003; Charest et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 916-921, 2003) 및 폐암에서 보고되었다(예를 들어, PCT Publication No. WO2010/093928 참조).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ROS 융합(fusion)"은 다른 폴리펩타이드(그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)의 전부 또는 일부에 융합된 ROS 단백질(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)의 키나아제 도메인을 포함하는 ROS 폴리펩타이드의 일부를 나타내며, 여기에서 그 제2 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 명칭은 융합 내에서 명명된다(용어 "융합"은 제2 유전자로부터의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부에 융합된 제1 유전자로부터의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부를 단순히 의미한다). 예를 들어, SLC34A2-ROS 융합은 SLC34A2 폴리펩타이드(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)의 일부와 키나아제 도메인 ROS를 포함하는 ROS 폴리펩타이드(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드) 간의 융합이다. ROS 융합은 종종 염색체의 전좌 또는 역위(inversion)로부터 야기된다. 다수의 공지의 ROS 융합이 있으며, 이들은 모두 본 발명의 ROS 융합이며, 그 일원이 SLC34A2-ROS(VS), SLC34A2-ROS(S), SLC34A2-ROS(L)(U.S. Patent Publication No. 20100143918 참조), CD74-ROS(U.S. Patent Publication No. 20100221737 참조)를 포함하는 SLC34A2-ROS 융합 단백질, 및 그 일원이 IG-ROS(S), FIG-ROS(L), 및 FIG-ROS(XL)(PCT Publication No. WO2010/093928 참조)를 포함하는 FIG-ROS 융합 단백질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
모든 공지의 ROS 융합 단백질은 전장 ROS의 전체 키나아제 도메인을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "ROS 키나아제 활성이 있는 폴리펩타이드"(또는 "ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드")는 전장 ROS 단백질의 전체 키나아제 도메일을 포함하며, 이에 따라 ROS 키나아제 활성을 보유하는 단백질(또는 폴리펩타이드)를 의미한다. ROS 키나아제 활성을 갖는 단백질의 비제한적인 예는, 전장 ROS 단백질, 그 일원이 SLC34A2-ROS(VS), SLC34A2-ROS(S), SLC34A2-ROS(L)(U.S. Patent Publication No. 20100143918 참조), CD74-ROS(U.S. Patent Publication No. 20100221737 참조)를 포함하는 SLC34A2-ROS 융합 단백질, 및 그 일원이 FIG-ROS(S), FIG-ROS(L), 및 FIG-ROS(XL)(PCT Publication No. WO2010/093928 참조)를 포함하는 FIG-ROS 융합 단백질, 및 전장 ROS 키나아제 단백질의 키나아제 도메인을 보유하는 ROS 키나아제의 임의의 말단이 잘린 또는 돌연변이된 형태를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. ROS의 키나아제 도메인이 SEQ ID NO: 61에 제시되므로, "ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드"는 그의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 61을 포함하는 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드"(또는 "아미노산 서열", 또는 "단백질")은 바람직하게, α-아미노산, D-, L-아미노산, 및 그 조합의 정의된 순서로의 결합으로부터 형성된 폴리머를 나타낸다. 하나의 아미노산과 그 다음 아미노산 사이의 결합은 아마이드 결합 또는 펩타이드 결합으로 나타내어진다. 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 올리고펩타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열, 및 그 단편 또는 부분, 및 자연발생 또는 합성 분자를 나타낸다. 폴리펩타이드는 또한 글리코단백질 및 리포단백질와 같은 유도체화된 분자, 및 저분자량 폴리펩타이드를 포함한다. "아미노산 서열" 및 유사한 용어, 예를 들어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 표시된 아미노산 서열을, 인용된 단백질 분자에 관련되는 완전한 네이티브의 아미노산 서열로 제한하는 것을 의미하지 않는다.
본 발명의 폴리펩타이드(예를 들어, FIG-ROS(S) 폴리펩타이드)의 일부 아미노산 서열이 돌연변이 단백질의 구조 또는 기능의 현저한 영향 없이 변화될 수 있음이 당해 기술분야에서 인지될 것이다. 서열에 있어서 그러한 차이가 고려되는 경우, 활성을 결정하는 단백질의 대단히 중요한 영역(예를 들어, ROS의 키나아제 도메인)이 있을 것임을 기억하여야 한다. 일반적으로, 유사한 기능을 수행하는 잔기가 이용되면, 3차 구조를 형성하는 잔기를 대체하는 것이 가능하다. 다른 경우, 변형(alteration)이 단백질의 중요하지 않은 영역에서 발생하면, 잔기의 형태는 전혀 중요하지 않을 수 있다.
따라서, 본 발명의 ROS 활성을 갖는 폴리펩타이드는 실질적인 ROS 키나아제 활성을 나타내는, 본 명세서에 기재된 전장 ROS 단백질의 변이체 또는 다양한 ROS 융합 폴리펩타이드를 더 포함한다. 일부 비제한적 보전적인 치환은 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 중에서 하나를 다른 것으로 교환하는 것; 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 교환; 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환; 아마이드 잔기 Asn 및 Gln의 교환; 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환; 및 방향족 잔기 Phe 및 Tyr의 교환을 포함한다. 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 보전적인 아미노산 치환의 다른 예는: 방향족: 페닐알라닌 트립토판 티로신(예를 들어, 트립토판 잔기가 페닐알라닌으로 대체됨); 소수성: 류신 이소류신 발린; 극성: 글루타민 아스파라긴; 염기성: 알기닌 리신 히스티딘; 산성: 아스파르트산 글루탐산; 소형: 알라닌 세린 트레오닌 메티오닌 글리신이다. 상기에 표시된 바와 같이, 어떤 아미노산 변화가 표현형적으로 조용할 것 같은지(즉 기능에 대하여 현저한 해로운 효과를 갖지 않을 것 같은지)에 대한 추가적인 안내는 Bowie et al., Science 247, supra .에서 찾을 수 있다.
일부 실시형태에서, 변이체(variant)는 "비보전적" 변화, 예를 들어 트립토판에 의한 글리신의 대체가 있을 수 있다. 유사한 변이체는 아미노산은 또한 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 양자 모두를 포함할 수 있다. 어떤 아미노산 잔기가 생물학적 또는 면역학적 활성을 무효화하지 않고 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는데 있어서 안내는 당해 기술분야에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, DNASTAR 소프트웨를 이용하여 찾아질 수 있다.
본 발명의 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 전장 인간 ROS 단백질(SEQ ID NO: 1로 나타내어진 아미노산 서열을 가짐) 및 SEQ ID NOs: 5, 7, 22, 28, 56, 58, 및 60에 나타내어진 아미노산 서열, 융합 접점(비-ROS 파트너 단백질과 ROS 단백질 사이의 접점에서의 서열; 표 2 참조)을 포함하는 적어도 6개의 인접한 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 아미노산 서열을 갖는 ROS 융합 폴리펩타이드, 및 전술한 것과 적어도 90%의 유사성, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 유사성, 및 더욱더 바람직하게 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%의 유사성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
전장 ROS-특이적 시약 및 ROS 융합 폴리펩타이드 특이적 시약(폴리클로날 및 모노클로날 항체와 같은)은 후술하는 바와 같이 ROS 폴리펩타이드 발현 및/또는 ROS 키나아제 활성의 검출을 위한 분석에서, 또는 ROS 단백질 기능/활성을 억제할 수 있는 ROS-억제 치료제로서 유용하다. 또한, 그러한 폴리펩타이드는 본 발명에 따른 ROS-억제 치료제의 후보인, ROS 단백질- 또는 ROS-융합 단백질-결합 단백질을 "포획(capture)"하기 위한 효모 이중 하이브리드 시스템(yeast two-hybrid system)에 이용될 수 있다. 효모 이중 하이브리드 시스템은 Fields and Song, Nature 340: 245-246(1989)에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 시약은 검출가능한 표지(예를 들어, 형광 표지 또는 적외선 표지)를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 시약(예를 들어, 항체 또는 FISH 프로브)에 관하여 "검출가능한 표지(detectable label)"는, 형광(예를 들어, FITC 또는 피코에리트린), 적외선, 질량(예를 들어, 동중원소 택(isobaric tag)), 잔기, 염료(발색단 염료), 방사성동위원소(예를 들어, 32P), 표지, 또는 택(myc 택 또는 GST 택) 변형 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체의, 또는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체에 대한 화학적, 생물학적 또는 다른 변형을 의미하며, 이에 의하여 대상 분자의 존재가 검출될 수 있다. 따라서, 그러한 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 시약은 소위 "검출가능하게 표지된다". 검출가능한 표지는 공유(예를 들어, 펩타이드 결합 또는 인산디에스테르 결합) 또는 비공유 화학결합(예를 들어, 이온 결합)에 의해 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 결합제에 결합될 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 시약은 전장 ROS 단백질 또는 폐암에서 발현되는 많은 ROS 융합 단백질의 하나에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 AQUA 펩타이드와 같은 시약, 또는 그의 결합부분(binding fractions)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합한다"는 본 발명의 시약 또는 결합제(예를 들어, 핵산 프로브, 항체, 또는 AQUA 펩타이드)가 그의 타겟 분자(예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 또는 전장 ROS 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)와 상호작용하는 것을 의미하며, 여기에서 상호작용은 특정 구조(예를 들어, 항원 결정 부위(antigenic determinant) 또는 에피토프(epitope), 또는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열)의 존재에 좌우된다; 다른 말로 하면, 시약은 일반적으로 모든 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드보다는 특이적 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 구조를 인식하고 결합한다. "그의 결합 단편(binding fragment)"은 타겟 분자(예를 들어, 항체의 Fab 단편)에 특이적으로 결합하는 시약의 단편 또는 부분을 의미한다.
타겟 분자에 특이적으로 결합하는 시약은 타겟-특이적 시약 또는 항-타겟 시약으로 나타내어질 수 있다. 예를 들어, FIG-ROS(L) 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 FIG-ROS(L)-특이적 항체 또는 항-FIG-ROS(L) 항체로 나타내어질 수 있다. 따라서, FIG-ROS(L) 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 핵산 프로브는 FIG-ROS(L)-특이적 핵산 프로브 또는 항-FIG-ROS(L) 핵산 프로브로 나타내어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 타겟 분자가 폴리펩타이드인 경우, 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 시약은 그의 타겟 분자(예를 들어, 전장 ROS 또는 ROS 융합 폴리펩타이드)에 대하여 1x 10-6 M 이하의 결합 친화도(binding affinity)(KD)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 본 발명의 시약은 그의 타겟 분자에 대하여 1 x10-7 M 이하의 KD , 또는 1 x10-8 M 이하의 KD, 또는 1 x 10-9 M 이하의 KD, 또는 1 x 10-10 M 이하의 KD, 1 x 10-11 M 이하의 KD, 1 x 10-12 M 이하의 KD를 갖는다. 어떤 실시형태에서, 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 본 발명의 시약의 KD는 그의 타겟 분자에 대하여 1 pM 내지 500 pM, 또는 500 pM 내지 1 μM, 또는 1 μM 내지 100 nM, 또는 100　mM 내지 10 nM 이다. 본 발명의 시약이 특이적으로 결합하는 타겟 분자의 비제한적인 예는, 전장 ROS 폴리펩타이드, 또는 SLC34A2-ROS(S) 융합 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(VS) 융합 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(L) 융합 폴리펩타이드, CD74-ROS 융합 폴리펩타이드, FIG-ROS(L) 융합 폴리펩타이드, FIG-ROS(S) 융합 폴리펩타이드, FIG-ROS(XL) 융합 폴리펩타이드를 포함하는 ROS 융합 폴리펩타이드, 및 그의 단편을 포함하며, 특히 그 단편은 ROS 융합 폴리펩타이드의 ROS 부분과 제2 단백질(예를 들어, SLC34A2, FIG, 또는 CD74) 부분 사이의 접점을 포함한다.
일부 실시형태에서, 타겟 분자가 폴리뉴클레오타이드인 경우, 그의 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 본 발명의 시약은 엄격한 조건(stringent conditions) 하에서 그의 타겟 폴리뉴클레오타이드와 하이브리다이즈하는 시약이다. 뉴클레오타이드 서열 또는 뉴클레오타이드 프로브 하이브리다이제이션(hybridization)에 관한 용어 "엄격한 조건"은 약 Tm - 5℃(즉, 시약 또는 프로브의 용융온도(Tm) 보다 5℃ 낮은)로부터 Tm보다 약 20℃ 내지 25℃ 낮은 온도까지의 범위 내에서 일어나는 "엄격성"이다. 전형적인 엄격한 조건은 다음과 같다: 50% 포름아미드, 5 X.SSC(750 mM NaCl, 75 mM 트리소듐 시트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트(pH 7.6), 5X 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 미생물/ml(변성되고, 잘려진 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 42℃에서 하룻밤동안 배양한 후, 약 65℃에서 0.1X SSC에서 필터를 세척한다. 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이, 하이브리다이제이션의 엄격성은 동일한 또는 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인 또는 검출하기 위하여 변화될 수 있다. 엄격한 조건 하에 타겟 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 전장 ROS 폴리뉴클레오타이드)에 하이브리다이즈하는 "시약"(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 프로브)은 시약(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 프로브(예를 들어, DNA, RNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드))이 레퍼런스 폴리뉴클레오타이드의 전체 길이를 따라 하이브리다이즈하거나, 또는 레퍼런스 폴리뉴클레오타이드의 적어도 약 15 뉴클레오타이드(nt), 또는 적어도 약 20 nt, 또는 적어도 약 30 nt, 또는 약 30-70 nt인 레퍼런스 폴리뉴클레오타이드의 일부에 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. 이러한 본 발명의 뉴클레오타이드 프로브는 본 명세서에 논의된 바와 같이, 진단 프로브(예를 들어, FISH를 위한) 및 프라이머(예를 들어, PCR을 위한)로서 유용하다.
본 발명의 시약이 특이적으로 결합하는 타겟 분자의 비제한적인 예는, 전장 ROS 폴리펩타이드, 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 것(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드), ROS 단백질의 키나아제 도메인, 예를 들어, SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하는 것(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드), ROS 폴리펩타이드의 막관통 도메인(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드), FIG-ROS(S) 융합 폴리펩타이드, 예를 들어, SEQ ID NO: 58의 서열을 갖는 것(또는 FIG-ROS(S) 폴리뉴클레오타이드), FIG-ROS(L) 융합 폴리펩타이드, 예를 들어, SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 것(또는 FIG-ROS(L) 폴리뉴클레오타이드), FIG-ROS(VL) 융합 폴리펩타이드, 예를 들어, SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 것(또는 FIG-ROS(VL) 폴리뉴클레오타이드), SLC34A2-ROS(VS) 융합 폴리펩타이드, 예를 들어, SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 것(또는 SLC34A2-ROS(VS) 폴리뉴클레오타이드), SLC34A2-ROS(S) 융합 폴리펩타이드, 예를 들어, SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 것(또는 SLC34A2-ROS(S) 폴리뉴클레오타이드), SLC34A2-ROS(L) 융합 폴리펩타이드, 예를 들어, SEQ ID NO: 5의 서열을 포함하는 것(또는 SLC34A2-ROS(L) 폴리뉴클레오타이드), CD74-ROS 융합 폴리펩타이드, 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 것(또는 CD74-ROS 폴리뉴클레오타이드), 및 그의 단편을 포함하며, 특히 그의 단편은 ROS 융합 폴리펩타이드의 ROS 부분과 제2 단백질(예를 들어, SLC34A2, FIG, 또는 CD74) 부분 사이에 접점을 포함한다(예를 들어, 표 2 참조).
그 중에서도, 개시된 방법의 실시에 유용한 시약은 생물학적 샘플에서 나타내어진 폴리펩타이드 발현의 검출 및 정량화에 상응하고 적합한, 전장 ROS-특이적 및 ROS 융합 폴리펩타이드-특이적 항체, 및 AQUA 펩타이드(중동위원소 표지된 펩타이드)이다. 따라서, "ROS 폴리펩타이드-특이적 시약"은 생물학적 샘플에서 발현된 ROS 폴리펩타이드에 생물학적 또는 화학적으로 결합할 수 있고, 그 존재/수준을 검출 및/또는 정량화할 수 있는 임의의 시약이다. ROS 융합 단백질에 존재하는 ROS 단백질의 일부(예를 들어, 키나아제 도메인)에 특이적으로 결합하는 경우, ROS 폴리펩타이드-특이적 시약은 생물학적 샘플에서 ROS 융합 폴리펩타이드에 특이적으로 결할할 수 있고, 그 존재/수준을 검출 및/또는 정량화할 수 있다. 이 용어는 후술하는 항체 및 AQUA 펩타이드 시약을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 동등한 결합제는 본 발명의 범위 내에 속한다.
일부 실시형태에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약은 항체이다. 일부 실시형태에서, 시약(예를 들어, 항체)은 전장 ROS 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 시약(예를 들어, 항체)은 전장 FIG 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 시약(예를 들어, 항체)은 전장 SLC34A2 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 시약(예를 들어, 항체)은 전장 CD74 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 시약(예를 들어, 항체)은 ROS 융합 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며, 전장 ROS 또는 그의 융합 파트너의 전장 폴리펩타이드(예를 들어, 전장 FIG, 전장 CD74, 또는 전장 SLC34A2)에는 특이적으로 결합하지 않는다.
야생형 ROS 단백질 서열의 세포외 도메인에서 에피토프에 특이적으로 결합하거나(따라서, 샘플에서 야생형 ROS의 존재(또는 부재)를 검출할 수 있는), 또는 야생형 ROS 단백질 서열의 키나아제 도메인에서 에피토프에 특이적으로 결합하는(따라서, 샘플에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 임의의 단백질의 존재(또는 부재)를 검출할 수 있는) 에피토프-특이적 항체와 같은 다른 시약도 본 발명의 방법을 실시하는데 유용하다.
폐암에서 전장 ROS 단백질 또는 ROS 융합 폴리펩타이드의 하나에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 포유류 종, 그 중에서도 예를 들어, 쥐, 토끼에서 매우 상동성이고 동등한 에피토프 펩타이드 서열에 결합할 수 있다. 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 항체는 (a) 모노클로날 항체,(b) 타겟 폴리펩타이드(예를 들어, 융합 폴리펩타이드의 융합 접점)에 특이적으로 결합하는 정제된 폴리클로날 항체,(c) 인간이 아닌 종(예를 들어, 쥐, 토끼)에서 동등하고 매우 상동성인 에피토프 또는 인산화 부위에 특이적으로 결합하는 전술한(a)-(b)에 기재된 항체, 및 (d) 본 명세서에 개시된 예시적 항체에 의해 결합된 항원(또는 더욱 바람직하게 에피토프)에 특이적으로 결합하는 전술한(a)-(c)의 단편을 포함한다.
용어 "항체", "항체들"은 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 포함하는 모든 형태의 면역글로불린, 및 그의 결합 단편(즉, Fab, 및 F(ab')2 단편과 같은 항체의 타겟 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 단편), 또한 재조합, 인간화된, 폴리클로날, 및 모노클로날 항체 및/또는 그의 결합 단편을 포함한다. 본 발명의 항체는 포유류로부터의 것과 같은 임의의 종의 동물로부터 유래될 수 있다. 자연적 항체의 비제한적 예는 항체는 인간, 닭, 염소, 및 인간 항체를 생산하도록 유전자조작된 형질전환 설치류를 포함하는 설치류(예를 들어, 래트, 생쥐, 햄스터 및 토끼)로부터 유래된 항체를 포함한다(예를 들어, Lonberg et al., WO93/12227; U.S. Pat. No. 5,545,806; 및 Kucherlapati, et al ., WO91/10741; U.S. Pat. No. 6,150,584 참조, 이들은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함됨). 본 발명의 항체는 키메라(chimeric) 항체일 수 있다. 예를 들어, M. Wroser et al ., Molec . Immunol . 26: 403-11(1989); Morrision et al ., Proc . Nat'l Acad . Sci . 81: 6851(1984); Neuberger et al ., Nature 312: 604(1984)) 참조. 항체는 U.S. Pat. No. 4,474,893(Reading) 또는 U.S. Pat. No. 4,816,567(Cabilly et al .)에 개시된 방법에 따라 생산된 재조합 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 U.S. Pat. No. 4,676,980(Segel et al .)에 개시된 방법에 따라 만들어진 화학적으로 구성된 특이한 항체일 수 있다.
자연 항체는 숙주 동물에 의해 생산되는 항체이나, 본 발명은 아미노산 서열이 네이티브 항체의 서열로부터 변화된 유전자 변형된 항체도 고려한다. 본 출원에 대한 재조합 DNA 기술의 관련성 때문에, 자연 항체에서 발견되는 아미노산 서열에 국한될 필요가 없다; 항체는 원하는 특성을 얻기 위하여 재설계될 수 있다. 가능한 변화는 많으며, 단지 하나 또는 몇몇 아미노산의 변화로부터 예를 들어 가변 또는 불변 영역의 완전한 재설계에 이르는 범위이다. 불변 영역에서의 변화는 일반적으로, 보체 고정(complement fixation), 막과의 상호작용 및 다른 반응기 기능과 같은 특성을 향상 또는 변형시키기 위하여 이루어질 것이다. 가변 영역에서의 변화는 항원 결합 특성을 향상시키기 위하여 이루어질 것이다. 본 명세서에 사용된 용어 "인간화된(humanized) 항체"는 인간 항체에 좀더 가깝게 닮기 위하여 비-항원 결합 영역에서 아미노산이 대체되었으나, 여전히 네이티브의 결합 능력은 보유하는 항체 분자를 나타낸다. 특히 고려되는 다른 항체는 올리고클로날(oligoclonal) 항체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "올리고클로날 항체"는 별개의 모노클로날 항체의 소정(predetermined) 혼합물을 나타낸다. 예를 들어, PCT publication WO 95/20401; U.S. Patent Nos. 5,789,208 및 6,335,163 참조. 일 실시형태에서, 일 이상의 에피토프에 대한 항체의 소정 혼합물로 이루어진 올리고클로날 항체는 단일 세포에서 생성된다. 다른 실시형태에서, 올리고클로날 항체는 다중 특이성을 갖는 항체를 생성하기 위하여 통상적인 경쇄와 페어링될 수 있는 다수의 중쇄를 포함한다(예를 들어, PCT publication WO 04/009618). 올리고클로날 항체는 단일 타겟 분자 상에 다중 에피토프를 표적화하도록 설계되는 경우 특히 유용하다. 본 명세서에 개시된 분석 및 에피토프를 고려하여, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 의도된 목적 및 원하는 요구에 적용될 수 있는 항체 또는 항체 혼합물을 생성 또는 선택할 수 있다.
재조합 항체도 본 발명에 포함된다. 이러한 재조합 항체는 자연 항체와 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 사연 항체의 변형된 아미노산 서열을 갖는다. 이들은 원핵 및 진핵 시스템 양자를 포함하는 임의의 발현 시스템에서, 또는 파지 디스플레이 방법을 이용하여 만들어질 수 있다(예를 들어, Dower et al., WO91/17271 and McCafferty et al., WO92/01047; U.S. Pat. No. 5,969,108, 이들은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함됨). 항체는 다수의 방식으로 유전자조작될 수 있다. 이들은 단일 사슬 항체(작은 조절 면역 약물(small modular immunopharmaceuticals) 또는 SMIPs™을 포함), Fab 및 F(ab')2 단편 등으로서 만들어질 수 있다. 항체는 인간화되거나, 키메라화되거나, 탈면역화되거나, 또는 완전한 인간일 수 있다. 다수의 공개문헌들이 많은 형태의 항체 및 그러한 항체를 유전자조작하는 방법을 제시한다. 예를 들어, U.S. Patent Nos. 6,355,245; 6,180,370; 5,693,762; 6,407,213; 6,548,640; 5,565,332; 5,225,539; 6,103,889; 및 5,260,203 참조. 유전학적으로 변형된 본 발명의 항체는 상기 언급된 자연 항체와 기능적으로 동등할 수 있다. 어떤 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 향상된 안정성 또는/및 치료 효능을 제공한다.
변형된 항체의 비제한적인 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 및 항원 결합 유용성을 현저히 유해하게 변형시키지 않는 아미노산의 일 이상의 결실 또는 부가를 갖는 것을 포함한다. 치환은 치료적 유용성이 유지되는 한, 일 이상의 아미노산 잔기의 변화 또는 변형으로부터, 영역의 완전한 재설계에 이르는 범위일 수 있다. 본 발명의 항체는 번역후(post-translationally) 변형될 수 있거나(예를 들어, 아세틸화, 및/또는 인산화), 또는 합성적으로 변형될 수 있다(예를 들어, 표지 관능기의 부착). 유전자조작된, 또는 가변, 불변 또는 Fc 영역을 갖는 항체는 예를 들어, 항원-의존적 세포독성(ADCC) 및 보체-의존적 세포독성(CDC)과 같은 조절 반응기(modulating effector)에 유용할 수 있다. 유전자조작된, 또는 가변, 불변 또는 Fc 영역을 갖는 그러한 항체는 모 단일 단백질이 정상적 조직에서 발현되는 경우 유용할 수 있으며; 반응기 기능을 갖지 않는 변이체 항체는 이 경우 원하는 치료 반응을 도출할 수 있으나 정상 조직에 해를 입히지는 않는다. 따라서, 본 개시의 어떤 측면 및 방법은 일 이상의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함하는 변형된 반응기 기능을 갖는 항체에 관한 것이다. 용어 "생물학적으로 활성인"은 자연 발생 분자의 구조적, 조절적 또는 생화학적 기능을 갖는 단백질을 나타낸다. 유사하게, "면역학적으로 활성인"은 적합한 동물 또는 세포에서 특이적 면역 반응을 유도하고, 특이적 항체와 결합하는, 자연, 재조합 또는 합성 전장 ROS 단백질 또는 ROS 융합 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 FIG-ROS 융합 폴리펩타이드의 하나), 또는 그의 임의의 올리고펩타이드의 능력을 나타낸다.
단일 사슬 항체, 카멜리드 항체 등을 포함하는 4개 사슬보다 적은 사슬을 갖는 항체, 및 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 항체의 구성요소도 본 발명에 속한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 사슬은 5'으로부터 3'으로의 순서로, 가변 영역 및 불변 영역을 포함할 수 있으며, 구조 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4에 대한 산재된 프레임워크(FR) 영역을 갖는다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 프레임워크 영역 및 CRDs도 본 발명에 속한다. 본 발명의 항체는 CH1 영역, 경첩, CH2 및 CH3 영역의 일부 또는 전부를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드-특이적 항체의 비제한적 에피토프 부위는 융합 폴리펩타이드 서열의 11 내지 17개 아미노산으로 본질적으로 이루어진 펩타이드 단편이며, 그 단편은 분자의 ROS 부분과 비-ROS 융합 파트너로부터 분자의 부분 사이에 융합 접점을 포함한다. ROS 융합 폴리펩타이드의 융합 접점을 포함하는 특이적으로 결합하는 더 짧은 또는 긴 펩타이드/에피토프는 본 발명에 속한다.
본 발명은 항체의 이용에 제한되는 것이 아니며, 본 발명의 방법에 이용되는 전장 ROS-특이적 또는 ROS 융합 폴리펩타이드-특이적 항체가 결합하는 본질적으로 동일한 에피토프에 ROS 단백질-특이적 또는 ROS 융합 단백질-특이적 방식으로 결합하는 단백질 결합 도메인 또는 핵산 압타머와 같은 동등한 분자를 포함한다. 예를 들어, Neuberger et al ., Nature 312: 604(1984) 참조. 그러한 동등한 비-항체 시약은 후술되는 본 발명의 방법에 적합하게 채용될 수 있다.
본 발명의 방법의 실시에 이용되는 폴리클로날 항체는, 알려진 과정에 따라 적합한 동물(예를 들어, 토끼, 염소 등)을 원하는 융합-단백질 특이적 에피토프(예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드에서 비-ROS 단백질 파트너과 ROS 단백질 파트너 사이의 융합 접점)를 포함하는 항원으로 면역하고, 동물로부터 면역 혈청을 수집하고, 면역 혈청으로부터 폴리클로날 항체를 분리하고, 원하는 특이성을 갖는 폴리클로날 항체를 정제함으로써, 표준 기술에 따라 제조될 수 있다. 항원은 원하는 에피토프 서열을 포함하는 합성 펩타이드 항원일 수 있으며, 잘 알려진 기술에 따라 선택되고 구성될 수 있다. 예를 들어, Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 5, p. 75-76, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory(1988); Czernik, Methods In Enzymology , 201: 264-283(1991); Merrifield, J. Am . Chem . Soc . 85: 21-49(1962)) 참조. 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조된 폴리클로날 항체는 후술되는 바와 같이 스크리닝되고 분리될 수 있다.
모노클로날 항체도 본 발명의 방법에 유리하게 채용될 수 있으며, Kohler 및Milstein의 잘 알려진 기술에 따라 하이브리도마 세포주에서 제조될 수 있다. Nature 265: 495-97(1975); Kohler and Milstein, Eur . J. Immunol . 6: 511(1976); Current 프로토콜s in Molecular Biology, Ausubel et al . Eds.(Wiley and Sins, New York, NY 1989 및 지금까지 연간 업데이트 및 2010년 것을 포함) 참조. 그와 같이 제조된 모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 본 발명에 의해 제공된 분석 방법의 선택성 및 특이성을 향상시킨다. 예를 들어, 적합한 항원을 함유하는 용액(예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드의 융합 접점을 포함하는 합성 펩타이드)을 마우스에 주입하고, 충분한 시간 후에(통상적인 기술에 의해 유지시킴), 마우스를 희생시키고, 비장 세포를 얻을 수 있다. 이어서, 전형적으로 폴리에틸렌 글리콜의 존재하에, 비장 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 제조한다. 예를 들어, 토끼 융합 하이브리도마는 U.S Patent No. 5,675,063에 기재된 제조될 수 있다. 이어서, 후술하는 바와 같이, 하이브리도마 세포를 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT)과 같은 적합한 선택 매체에서 성장시키고, 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 항체에 대하여 상청액을 스크리닝한다. 분비된 항체를 침전, 이온교환 또는 친화성 크로마토그래피 등과 같은 통상적인 방법에 의해 조직 배양 상청액으로부터 회수할 수 있다.
모노클로날 Fab 단편은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 재조합 기술에 의해 Escherichia coli에서 제조될 수 있다. 예를 들어, W. Huse, Science 246: 1275-81(1989); Mullinax et al ., Proc . Nat'l Acad . Sci . 87: 8095(1990) 참조. 하나의 동종(isotype)의 모노클로날 항체는 특정 적용에 바람직하며, 특정 동종은 초리 융합으로부터 선택함으로써 직접적으로 제조될 수 있으며, 또는 클래스 전화 변이체(class-switch variants)를 분리하기 위하여 친계 선발(sib 선택) 기술을 이용함으로써 다른 동종의 모노클로날 항체를 분비하는 모 하이브리도마로부터 이차적으로 제조될 수 있다(Steplewski, et al., Proc . Nat'l . Acad . Sci ., 82: 8653(1985); Spira et al ., J. Immunol . Methods, 74: 307(1984)). 모노클로날 항체의 항원 결합 부위는 E. coli에서 파지 디스플레이된 재조합 항체 또는 가용성 항체로서 제조되는 단일 사슬 항체, 및 PCR에 의해 클로닝될 수 있다(예를 들어, Antibody Engineering 프로토콜s, 1995, Humana Press, Sudhir Paul editor).
또한, U.S. Pat. No. 5,194,392, Geysen(1990)는 대상 항체의 특정 파라토프(paratope)(항원 결합 부위)에 상보적인 에피토프의 위상적 동등물(topological equivalent)(즉, "미노토프(mimotope)")인 모노머(아미노산 또는 다른 화합물)의 서열을 검출 또는 결정하는 일반적인 방법을 기술한다. 더 일반적으로, 이 방법은 대상 특정 수용체의 리간드 결합 부위에 상보적인 리간드의 위상적 동등물인 모노머의 서열을 검출 또는 결정하는 것을 포함한다. 유사하게, U.S. Pat. No. 5,480,971, Houghten et al .(1996)는 선형 C1-C-로실 페로실레이티드(C1-C-rosyl perrosylated) 올리고펩타이드, 및 대상 억셉터 분자에 우선적으로 결합하는 페로실레이티드 올리고펩타이드의 서열을 결정하는 그러한 올리고펩타이드 세트 및 라이브러리를 이용하는 방법을 개시한다. 따라서, 본 발명의 에피토프-함유 펩타이드의 비-펩타이드 유사체도 이러한 방법에 의해 일상적으로 제조될 수 있다.
폴리클로날이든 모노클로날이든지, 본 발명의 방법에 이용되는 항체는 표준 기술에 따라 에피토프 및 융합 단백질 특이성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, Czernik et al ., Methods in Enzymology , 201: 264-283(1991) 참조. 예를 들어, 항체는 바람직한 항원, 및 원하는 경우 본 발명의 전장 ROS 단백질, 특정 ROS 융합 폴리펩타이드(예를 들어, SLC34A2-ROS(S) 폴리펩타이드), 또는 그 단편에 대한 반응성에 대한 특이성을 확실히 하기 위하여 ELISA에 의하여 펩타이드 라이브러리에 대해 스크리닝될 수 있다. 항체는 원하는 타겟에 대한 반응성을 확인하고, 다른 단백질에 대해서는 인지가능한 결합이 없음을 확실히 하기 위하여 타겟 단백질을 함유하는 세포 제제에 대하여 웨스턴 블롯팅에 의해 시험될 수 있다. 융합 단백질-특이적 항체의 제조, 스크리닝, 및 용도는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 기술되어 있다. 예를 들어, U.S. Patent Publication No. 20050214301 참조.
본 발명의 방법에 이용되는 항체(예를 들어, 전장 ROS 단백질-특이적 또는 ROS 융합 폴리펩타이드-특이적)는 유사한 융합 폴리펩타이드와 같은 다른 단배질 또는 폴리펩타이드에서 유사한 에피토프와의 일부 제한된 교차-반응성(cross-reactivity)을 나나탤 수 있다. 이는 대부분의 항체가 어느 정도의 교차-반응성을 나타내기 때문에 예측불가능한 것은 아니며, 항-펩타이드 항체는 종종 펩타이드를 면역화하기 위하여 높은 상동성 또는 동일성을 갖는 에피토프와 교차 반응한다. 예를 들어, Czernik , supra. 참조. 다른 융합 단백질과의 교차-반응성은 알려진 분자량을 갖는 마커와 함께 웨스텐 블롯팅에 의해 쉽게 특성화된다. 항체가 결합하는 전장 ROS 단백질 서열 또는 ROS 융합 폴리펩타이드(예를 들어, FIG-ROS(S) 폴리펩타이드) 서열과 매우 상동성이거나 동일한 부위를 확인하기 위하여, 교차-반응 단백질의 아미노산 서열이 시험되어질 수 있다. 바람직하지 않은 교차-반응성은 펩타이드 컬럼 상에서의 항체 정제를 이용하여 음성 선택(negative 선택)에 의해 제거될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법을 실시하는데 이용되는 본 발명의 ROS-특이적 항체 및 ROS 융합 폴리펩타이드-특이적 항체는 이상적으로는 인간 융합 폴리펩타이드에 대하여 특이적이나, 인간 종 결합 그 자체에만 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 다른 포유류 종(예를 들어, 마우스, 랫트, 원숭이)의 보존적이며 매우 상동성인 또는 동일한 에피토프에도 결합하는 항체의 제조 및 용도를 포함한다. 다른 종에서 매우 상동성인 또는 동일한 서열은 인간 ROS 단백질 서열(SEQ ID NO: 1), 및 본 명세서에 개시된 인간 ROS 융합 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NOs: 5, 7, 22, 28, 56, 58, 및 60)에 의해, BLAST와 같은 표준 서열 비교에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
본 발명의 방법에 채용되는 항체는 특정 분석 포맷, 예를 들어 FC, IHC, 및/또는 ICC에서의 이용에 의해 더 특성화될 수 있으며, 그 이용을 위하여 입증될 수 있다. 그러한 방법에서 전장 ROS 단백질-특이적 및/또는 ROS 융합 폴리펩타이드-특이적 항체의 이용은 본 명세서에 더 상세하게 기재된다. 단독으로, 또는 후술되는 분석에서 이용되는 본 명세서에 기재된 항체는 후술되는 바와 같이, 다른 신호전달(phospho-AKT, phospho-Erk 1/2) 및/또는 세포 마커(시토케라틴) 항체에 의해 다중 파라미터 분석에 이용되는 형광 염료(예를 들어 Alexa488, 피코에리트린), 또는 양자점과 같은 표지에 유리하게 컨주게이트될 수 있다.
본 발명의 방법의 실시에 있어서, 소정 생물학적 샘플에서 본 발명의 ROS 융합 폴리펩타이드 및/또는 전장 ROS의 발현 및/또는 활성은 전장 ROS 단백질에 특이적인 항체 또는 ROS 융합 폴리펩타이드에 특이적인 항체를 이용하여 유리하게 시험될 수 있다. 예를 들어, ROS-특이적 항체(즉, 전장 ROS에 특이적으로 결합하는 항체)는 상업적으로 구입가능하다(예를 들어, Santa Cruz Biotech., Inc.(Santa Cruz, CA) Catalog No. sc-6347; Cell 신호ing Technology, Inc.(Danvers, MA), Catalog No. 3266); 및 Abcam(Cambridge, MA), Catalog Nos. ab5512 and ab108492 참조). 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 이용되는 ROS-특이적 항체는 ROS 키나아제 도메인에 특이적으로 결합하고, 따라서 본 명세서에 기재된 전장 ROS 및 ROS 융합 폴리펩타이드 전부를 검출한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 이용되는 ROS-특이적 항체는 ROS의 키나아제 도메인에 대하여 C' 말단인 ROS 단백질 상의 영역에 특이적으로 결합하고, 따라서 본 명세서에 기재된 전장 ROS 및 ROS 융합 폴리펩타이드 전부를 검출한다. 그러한 항체는 또한 표준 방법에 따라 제조될 수 있다.
생물학적 샘플(예를 들어, 종양 샘플) 에서 전장 ROS의 발현 및/또는 활성, 및/또는 ROS 융합 폴리펩타이드 발현의 검출은 융합 단백질 단독으로 종양을 유도하는지, 또는 비정상적으로 발현된 전장 ROS가 존재하는지 및 종양을 유도하는지에 대한 정보를 제공할 수 있다. 그러한 정보는 융합 단백질 또는 전장 단백질, 또는 양쪽 모두를 타겟팅하는지를 분석하는데 임상적으로 유용하며, 또는 종양의 진행을 억제하는데, 및 적합한 치료제 또는 그 조합을 선택하는데 가장 이로울 것이다. 본 명세서에 개시된 돌연변이 ROS에 존재하지 않는 ROS 키나아제 세포외 도메인에 대해 특이적인 항체는 돌연변이 ROS 키나아제의 존재/부재를 결정하는데 특히 유용할 수 있다.
2 이상의 항체가 본 명세서에 개시된 방법 실시에 이용될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드가 발현되는 암에서 활성화되는 것으로 의심되는, 또는 잠재적으로 활성화되는 다른 키나아제, 수용체, 또는 키나아제 기질에 대해 특이적인 항체와 함께 일 이상의 ROS 융합 폴리펩타이드-특이적 항체는 그러한 암으로부터 세포를 포함하는 생물학적 샘플에서 그러한 다른 신호전달 분자의 활성을 검출하기 위하여 동시에 채용될 수 있다.
당해 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 융합 폴리펩타이드 및 전술한 그의 에피토프-함유 단편은 키메라 폴리펩타이드를 생성하기 위하여 다른 분자의 부분과 결합할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 키메라 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하고, 키메라 폴리펩타이드의 생체내 반감기를 증가시키기 위하여, 면역글로불린(IgG)의 불변 도메인에 결합될 수 있다(예를 들어, EPA 394,827에서 CD4-Ig 키메라 단백질의 예; Traunecker et al., Nature 331: 84-86(1988) 참조). 디설파이드-결합 다이머 구조(예를 들어, IgG 부분으로부터)를 갖는 융합 단백질은 모노머 폴리펩타이드 단독보다 다른 분자를 결합 및 중화시키는데 더욱 효율적일 수 있다(Fountoulakis et al ., J Biochem 270: 3958-3964(1995) 참조).
일부 실시형태에서, 전장 ROS 또는 ROS 융합 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약은 예를 들어 ROS 융합 폴리펩타이드의 융합 접점을 포함하는 펩타이드 서열에 상응하는 중동위원소 표지된 펩타이드(즉, AQUA 펩타이드)이다. 그러한 AQUA 펩타이드는 생물학적 샘플에서 발현된 FIG-ROS 융합 폴리펩타이드의 절대 정량에 적합할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "중동위원소 표지된 펩타이드"는 "AQUA 펩타이드"와 상호교환적으로 사용된다. 복합체 혼합물에서 단백질의 절대 정량 또는 검출을 위한 AQUA 펩타이드의 제조 및 이용은 기술되어 있다. WO/03016861, "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry," Gygi et al . 및 Gerber et al ., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A. 100: 6940-5(2003)(이들 교시는 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함됨) 참조. 그러한 AQUA 펩타이드에 관한 용어 "특이적으로 검출한다"는 펩타이드가 AQUA 펩타이드 서열을 함유하는 폴리펩타이드 및 단백질만을 검출 및 정량화하고, AQUA 펩타이드 서열을 함유하지 않는 폴리펩타이드 및 단백질은 실질적으로 검출하지 않는 것을 의미한다.
AQUA 방법론은 펩타이드 표준과 비교하여 생물학적 샘플에서 동일한 서열 및 단백질 변형을 갖는 펩타이드의 절대 정량을 결정하기 위하여, 소화된 생물학적 샘플에 알려진 양의 적어도 하나의 중동위원소 표지된 펩타이드 표준(LC-SRM 크로마토그래피에 의해 검출가능한 독특한 특징(시그니처)을 갖는)을 도입하는 것을 채용한다. 요약하면, AQUA 방법론은 2개의 단계를 갖는다: 펩타이드 내부 표준 선택 및 확인 및 방법 개발; 및 샘플에서 타겟 단백질을 검출 및 정량화하기 위하여 확인된 펩타이드 내부 표준을 이용한 실시. 이 방법은 세포 용해물과 같은 복합 생물학적 혼합물 내에 소정 펩타이드/단백질을 검출 및 정량화하기 위한 강력한 기술이며, 예를 들어 약물 치료의 결과로서 단백질 인산화에 있어서의 변화를 정량화하기 위하여, 또는 상이한 생물학적 상태에서 단백질 수준의 차이를 정량화하기 위하여 채용될 수 있다.
일반적으로, 적합한 내부 표준을 개발하기 위하여, 타겟 단백질 서열 내의 특정 펩타이드(또는 변형된 펩타이드)가 그의 아미노산 서열, 및 소화하기 위하여 이용되는 특정 프로테아제에 근거하여 선택된다. 다음으로, 펩타이드는 하나의 잔기가 안정한 동위원소(13C, 15N)를 함유하는 동일한 잔기로 대체되도록 고체상 펩타이드 합성에 의해 생성된다. 결과는 단백질 가수분해에 의해 형성된 그의 네이티브 대응물과 화학적으로 동일하나, 7-Da 질량 쉬프트를 통해 MS에 의해 쉽게 구별가능한 펩타이드이다. 새롭게 합성된 AQUA 내부 표준 펩타이드는 LC-MS/MS에 의해 평가된다. 이 과정은 역상 크로마토그래피에 의한 펩타이드 정체, 이온화 효율성 및 충돌-유도 해리를 통한 단편화에 관한 정량적 정보를 제공한다. 네이티브 펩타이드 및 내부 표준 펩타이드의 세트에 대한 유익하고 풍부한 단편이 선택되고, 이어서 펩타이드 표준의 독특한 프로파일에 근거하여 선택된 반응 모니터링(LC-SRM)을 형성하기 위하여 크로마토그래피 정체의 함수로써 연달아 특이적으로 모니터링된다.
AQUA 전략의 제2 단계는 복합체 혼합물로부터 단백질 또는 변형된 단백질의 양을 측정하기 위한 그 실시이다. 전세포 용해물은 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 전형적으로 분별되고, 단백질 이동과 일치하는 겔의 영역이 삭제된다. 이 과정 후에, AQUA 펩타이드 존재 하 겔내 단백질 분해(in-gel proteolysis) 및 LC-SRM 분석이 이어진다(Gerber et al ., supra. 참조). AQUA 펩타이드는 단백질 분해 효소에 의한 전세포 용해물의 소화에 의해 얻어지는 복합 펩타이드 혼합물에 섞이고, 전술한 바와 같이 면역친화성 정제되어진다. 소화(예를 들어, 트립신처리)에 의해 형성된 네이티브 펩타이드의 보존 시간(retention time) 및 단편화 패턴(fragmentation pattern)은 이전에 결정된 AQUA 내부 표준 펩타이드의 것과 동일하다; 따라서, SRM 실험을 이용하는 LC-MS/MS 분석은 내부 표준 및 극히 복잡한 펩이드 혼합물로부터 직접적으로 얻어진 분석물 양쪽 모두의 매우 특이적으로 민감한 측정에 이르게 된다.
절대량의 AQUA 펩타이드가 첨가되므로(예를 들어, 250 fmol), 곡선하면적의 비율은 원래 세포 용해물에서 단백질 또는 단백질의 인산화 형태의 정확한 발현 수준을 결정하기 위하여 이용될 수 있다. 또한, 내부 표준은 네이티브 펩타이드가 형성되는 겔내 소화 중에 존재하여, 겔 조각으로부터 펩타이드 추출 효율, 샘플 핸들링(진공 원심분리를 포함) 중 절대 손실, 및 LC-MS 시스템으로의 도입 중 가변성이 네이티브 및 AQUA 펩타이드 풍부도의 결정된 비율에 영향을 미치지 않게 된다.
AQUA 펩타이드 표준은 타겟 단백질 내에서 IAP-LC-MS/MS 방법에 의해 미리 확인된 공지 서열에 대하여 개발된다. 부위가 변형되는 경우, 그 부위 내의 특정 잔기의 변형된 형태를 포함하는 하나의 AQUA 펩타이드가 개발될 수 있으며, 잔기의 비변형된 형태를 포함하는 제2 AQUA 펩타이드가 개발될 수 있다. 이러한 방식으로, 2개의 표준이 생물학적 샘플에서 부의의 변형 및 비변형 형태 모두를 검출하고 정량화하는데 이용될 수 있다.
펩타이드 내부 표준은 단백질의 일차 아미노산 서열을 시험하고, 프로테아제 절단에 의해 생성된 펩타이드의 경계를 결정함으로써 생성될 수 있다. 대안으로, 단백질은 프로테아제에 의해 실제로 소화되고, 생성된 특정 펩타이드 단편이 시퀀싱될 수 있다. 적합한 프로테아제는 세린 프로테아제(예를 들어 트립신, 헵신), 메탈로 프로테아제(예를 들어, PUMP1), 키모트립신, 캐트헵신, 펩신, 서몰리신, 카르복시펩티다아제 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
타겟 단백질 내의 펩타이드 서열은 내부 표준으로서 펩타이드의 이용을 최적화하기 위하여 일 이상의 기준에 따라 선택된다. 바람직하게, 펩타이드의 크기는, 펩타이드 서열이 다른 비-타겟 단백질 내에 반복되는 기회를 최소화하기 위하여 선택된다. 따라서, 펩타이드는 바람직하게 적어도 약 6개의 아미노산이다. 펩타이드의 크기는 이온화 빈도를 최대화하기 위하여 최적화된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 펩타이드는 약 20개 이하의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드는 길이가 약 7개 내지 15개 아미노산이다. 질량분석법 중에 화학적으로 반응성일 것 같지 않은 펩타이드 서열도 선택되며, 따라서 시스테인, 트립토판 또는 메티오닌을 포함하는 서열은 피해진다.
타겟 영역의 변형 영역을 포함하지 않는 펩타이드 서열은 펩타이드 내부 표준이 모든 형태의 단백질의 양을 결정하기 위하여 이용될 수 있도록 하게 위하여 선택될 수 있다. 대안으로, 변형된 아미노산을 포함하는 펩타이드 내부 표준은 타겟 단백질의 변형 형태만을 검출 및 정량화하기 위하여 바람직할 수 있다. 변형 및 비변형 영역 모두에 대한 펩타이드 표준은 특정 샘플 내의 변형 정도(extent of a modification)를 결정하기 위하여(즉, 단백질 총량의 얼마의 부분이 변형된 형태에 의해 나타내어지는지를 결정하기 위하여) 함께 이용될 수 있다. 특정 부위에서 인산화되는 것으로 알려진 단백질의 인산화 및 비인산화 형태 모두에 대한 펩타이드 표준이 샘플의 인산화 형태의 양을 정량화하기 위하여 이용될 수 있다.
펩타이드는 일 이상의 표지된 아미노산을 이용하여 표지되며(즉, 표지는 펩타이드의 실제 부분임), 덜 바람직하게 표지는 표준 방법에 따른 합성 후에 부착될 수 있다. 바람직하게, 표지는 하기 고려사항에 근거하여 선택된 질량-변형(mass-altering) 표지이다: 질량은 MS 분석에 의해 생성된 단편 질량을 낮은 백그라운드를 갖는 스펙트럼의 영역으로 쉬프트하기 위하여 특유하여야 한다; 이온 질량 시그니처 성분(ion mass signiture component)은 MS 분석에서 특유한 이온 질량 시그니처를 나타내는 것이 바람직한 표지부의 일부이다; 표지의 구성 원자의 질량 합은 모든 가능한 아미노산의 단편과 독특하게 상이한 것이 바람직하다. 결과적으로, 표지된 아미노산 및 펩타이드는 수득된 질량 스펙트럼에서 이온/질량 패턴에 의해 비표지된 것으로부터 쉽게 구별된다. 바람직하게, 이온 질량 시그니처 성분은 질량에 20개의 자연 아미노산의 임의의 것에 대하여 남은 질량을 매칭하지 않는 단백질 단편에 질량을 전한다.
표지는 MS의 단편화 조건 하에 강화되어야 하며, 불리한 단편화를 겪지 않아야 한다. 표지 화학은 조건, 특히 변성 조건의 범위 하에서 효율적이어야 하며, 바람직하게 표지된 택은 선택된 MS 버퍼 시스템에서 가용성을 유지한다. 표지는 바람직하게 단백질의 이온화 효율을 억제하지 않으며, 화학적으로 반응성이지 않다. 표지는 각각의 표지된 단편 위치에서 특유한 질량 분광 패턴을 생성하기 위하여 2 이상의 동위원소적으로 별개의 종의 혼합물을 함유할 수 있다. 2H, 13C, 15N, 17O, 18O, 또는 34S와 같은 안정한 동위원소는 일부 비제한적 표지이다. 상이한 동위원소 표지를 포함하는 펩타이드 내부 표준 쌍도 제조될 수 있다. 중동위원소 표지가 포함될 수 있는 비제한적 아미노산 잔기는 류신, 프롤린, 발린, 및 페닐알라닌을 포함한다.
펩타이드 내부 표준은 질량 대 전하(m/z) 비에 따라, 바람직하게, 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, HPLC 컬럼)에서의 보존 시간에 따라 특성화된다. 동일한 서열의 비표지된 펩타이와 함께 공동용리되는 내부 표준은 최적의 내부 표준으로서 선택된다. 이어서, 내부 표준은 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 충돌 가스로서 아르곤 또는 헬륨을 이용하는 충돌 유도 해리(CID)에 의해 분석된다. 이어서, 단편은 다단계 질량분석법(MSn)에 의해 분석되어 단편 이온 스펙트럼을 얻고, 페타이드 단편화 시그니처를 얻는다. 바람직하게, 펩타이드 단편은 각각의 단편에 상응하는 피크를 잘 분리할 수 있도록 하는 m/z 비에서의 현저한 차이를 가지며, 타겟 펩타이드에 대하여 특유한 시그니처가 얻어진다. 적합한 단편 시그니처가 첫번째 단계에서 얻어지지 않는 경우, 특유한 시그니처가 얻어질 때까지 추가적인 MS 단계가 수행된다.
MS/MS 및 MS3 스펙트럼에서 단편 이온은 전형적으로 대상 펩타이드에 매우 특이적이며, LC 법과 함께 수천 또는 수만의 단백질을 함유하는 세포 용해물과 같은 복합 단백질 혼합물에서 타겟 펩타이드/단백질을 검출 및 정량화하는 매우 선택적인 수단을 가능하게 한다. 대상 타겟 단백질/펩타이드를 잠재적으로 함유하는 임의의 생물학적 샘플이 분석될 수 있다. 조(Crude) 또는 부분적으로 정제된 세포 추출물이 채용되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 샘플은 전형적으로 0.1-10 mg/mL의 농도의 단백질을 적어도 0.01 mg 가지며, 원하는 버퍼 농도 및 pH로 조절될 수 있다.
검출/정량화되는 타겟 단백질에 상응하는, 알려진 양, 바람직하게 약 10 펨토몰의 표지된 펩타이드 내부 표준이 세포 용해물과 같은 생물학적 샘플에 첨가된다. 이어서, 섞여진 샘플은 소화를 가능하게 하는 적합한 시간 동안 일 이상의 프로테아제에 의해 소화된다. 이어서, 샘플 내에서 다른 펩타이드로부터 표지된 내부 표준 및 그의 상응하는 타겟 펩타이드를 분리하기 위하여, 분리(예를 들어 HPLC, 역상 HPLC, 모세관 전기영동, 이온교환 크로마토그래피 등에 의해)가 수행된다.
이어서, 각각의 분리된 펩타이드는 MS에서 선택된 반응을 모니터링함으로써 시험된다. 이는, 펩타이드 내부 표준의 특성화에 의하여 얻어진 종래 지식의 이용 및 대상 펩타이드 및 내부 표준 양쪽에 대한 MS/MS 또는 MSn 스펙트럼에서 특이적 이온을 연속적으로 모니터링하기 위하여 MS를 필요로 하는 것을 포함한다. 용리 후에, 펩타이드 표준 및 타겟 펩타이드 피크 양쪽에 대한 곡선하면적(AUC)이 계산된다. 세포당 단백질의 정확한 카피수를 제공하기 위하여, 분석에 사용된 세포의 수 및 단백질의 분자량에 대하여 정상화될 수 있는 절대 정량2개의 영역의 비가 제공된다. AQUA 방법론의 더 상세한 사항은 Gygi et al ., 및 Gerber et al . supra.에 기재되어 있다.
본 발명의 돌연변이 ROS 폴리펩타이드 내에서 임의의 특유한 부위(예를 들어, FIG-ROS 융합 폴리펩타이드 내의 융합 접점)를 검출 또는 정량화하기 위하여, AQUA 내부펩타이드 표준(중동위원소 표지된 펩타이드)이 전술한 바와 같이 바람직하게 제조될 수 있다. 예를 들어, FIG-ROS 융합 폴리펩타이드의 하나의 융합 접점 서열에 상응하는 AQUA 포스포펩타이드가 제조될 수 있다. 펩타이드 표준은 FIG-ROS 융합 접점에 대해 제조될 수 있으며, 생물학적 샘플에서 융합 접점(즉 FIG-ROS 융합 폴리펩타이드의 존재)을 검출 및 정량화하기 위하여 그러한 표준은 AQUA 방법론에 채용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 AQUA 펩타이드의 비제한적 예의 하나는 FIG-ROS 융합 폴리펩타이드의 짧은 변이체(즉, FIG-ROS(S) 융합 폴리펩타이드)의 융합 접점의 각 측의 바로 옆에 있는 3개의 아미노산에 상응하는 아미노산 서열 AGS TLP (SEQ ID NO: 66)을 포함하며, 여기에서 FIG 유전자에 의해 코딩되는 아미노산은 이탤릭체로 표시되고, ROS 유전자에 의해 코딩되는 아미노산은 볼드체로 표시된다. 융합 접점 서열(및 그의 업스트림 또는 다운스트림에서의 추가적인 잔기)를 포함하는 더 큰 AQUA 펩타이드도 구성될 수 있음이 인지될 것이다. 유사하게, 그러한 서열의 모든 잔기보다 작은 서열을 포함하는(그러나 여전히 그 융합 접점 자체를 포함하는) 더 작은 AQUA 펩타이드가 대안적으로 구성될 수 있다. 그러한 더 큰 또는 더 작은 AQUA 펩타이드는 본 발명의 범위 내에 속하고, AQUA 펩타이드의 선택 및 제조는 전술한 바와 같이 수행될 수 있다(Gygi et al., Gerber et al., supra. 참조).
본 명세서에 기재된 ROS 융합 단백질의 하나의 융합 접점에 걸치는 AQUA 펩타이드의 서열이 ROS 융합-특이적 항체가 특이적으로 결합하는 에피토프일 수 있다(또는 에피토프에 포함될 수 있다). "에피토프"는 면역성 에피토프(즉, 면역 반응을 유발할 수 있는), 또는 항원성 에피토프(즉, 항체가 특이적으로 결합하는 단백질 분자의 영역)를 나타낸다. 일반적으로 단백질의 면역성 에피토프의 수는 항원성 에피토프의 수보다 적다. 예를 들어, Geysen et al ., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 81:3998-4002(1983) 참조.
표 2는 본 발명의 ROS 융합 폴리펩타이드의 모든 융합 접점의 리스트를 제공하며, 여기에서 비-ROS 유전자에 의해 코딩되는 아미노산은 이탤릭체로 표시되며, ROS 유전자에 의해 코딩되는 아미노산은 볼드체로 표시된다.
융합 접점 서열 SEQ ID NO :
SLC34A2-ROS(매우 짧은) VGV WHR 62
SLC34A2-ROS(짧은) LVG DDF 63
SLC34A2-ROS(긴) LVG AGV 64
CD74-ROS PPK DDF 65
FIG-ROS(짧은) AGS TLP 66
FIG-ROS(긴) LQV WHR 67
FIG-ROS(매우 긴) VLQ AGV 68
일부 실시형태에서, 포유류 폐암은 인간으로부터의 것이다(즉, 인간). 일부 실시형태에서, 포유류 폐암은 NSCLC(비-소세포 폐 암종)이다. 일부 실시형태에서, 포유류 폐암은 SCLC(소 세포 폐 암종)이다. 본 발명의 방법의 다른 실시형태에서, 포유류는 인간이며, 인간은 폐암의 치료를 위한 ROS-억제 치료제에 대한 후보일 수 있다. 인간 후보는 ROS 키나아제 억제제로 현재 치료되는, 또는 ROS 키나아제 억제제에 의한 치료를 위하여 고려되는 환자일 수 있다. 다른 실시형태에서, 포유류는 말 또는 소와 같은 대형 동물이고, 다른 실시형태에서, 포유류는 개 또는 고양이와 같은 소형 동물이며, 이들은 모두 NSCLC 및 SCLC와 같은 폐암이 발생하는 것으로 알려져 있다.
명세서 전반에 이용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"은 가장 넓은 의미로 사용되며, 융합 폴리펩타이드 또는 전장 ROS 단백질(신호 펩타이드 서열을 갖는, 또는 갖지 않는), 또는 그의 ROS 키나아제 활성을 갖는 단편을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 함유하는 것으로 의심되는 임의의 생물학적 샘플을 의미한다. 생물학적 샘플은 침, 점액, 눈물, 혈액, 순환 종양 세포, 혈청, 조직, 골수, 림프/장관액, 구강 세포, 점막 세포, 뇌척수액, 정액, 변, 혈장, 소변, 세포 현탁액, 세포 및 바이러스 또는 그 추출물의 현탁액을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 세포, 세포로부터 분리된 염색체(예를 들어, 중기 염색체의 스프레드), 게놈 DNA(용액에서, 또는 서던 분석에서와 같이 고형 지지체에 결합되어), RNA(용액에서, 또는 노던 분석에서와 같이 고형 지지체에 결합되어), cDNA(용액에서, 또는 고체 지지체에 결합되어)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 암으로 의심되는 폐 세포를 함유한다.
포유류 암으로부터의 세포(또는 세포 추출물)를 포함하는 임의의 생물학적 샘플은 본 발명의 방법에 이용되기에 적합하다. 일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 종양 생검 또는 종양 절제물로부터 얻어진 세포를 포함한다. 생검 또는 절제물은 포유류의 기관에 발생하는 일차 종양으로부터, 또는 다른 조직에 전이된 이차 종양에 의해 표준 임상 기술에 따라 얻어질 수 있다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 종양으로부터 취해진 미세 바늘 흡입물로부터 얻어진 세포를 포함하며, 그러한 흡입물을 얻기 위한 기술은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다(Cristallini et al ., Acta Cytol . 36(3): 416-22(1992) 참조).
생물학적 샘플은 흉막 삼출액과 같은 유출액으로부터 얻어진 세포를 포함할 수 있다. 흉막 삼출액(가슴 속에서 폐 외부를 형성하며, 암 세포를 함유하는 액체)은 후기 폐암(NSCLC를 포함)을 앓는 많은 환자에서 형성되는 것으로 알려져 있고, 그러한 유출액의 존재는 나쁜 결과 및 짧은 생존시간의 예측이 된다. 흉막 삼출액을 얻는 표준 방법은 기술되어 있으며, 당해 기술분야에 잘 알려져 있다(Sahn, Clin Chest Med . 3(2): 443-52(1982) 참조).
생물학적 샘플은 폐포 세척(Bronchoalveolar lavage)으로부터 얻어진 세포를 포함할 수 있다. 폐포 세척은 표준 의학 과정이며, 여기에서 기관지경이 입 또는 코를 통하여 폐로 지나가고, 유체가 폐의 작은 부분에 뿌려진 후 검사를 위하여 재수집된다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 순환 종양 세포를 포함한다. 순환 종양 세포("CTCs")는 예를 들어 상표명 Vita-분석™, Vita-Cap™, 및 Cellsearch®(Vitatex, LLC(a Johnson and Johnson corporation)로부터 상업적으로 구입가능함)로 구입된 키트 및 시약을 이용하여 정제될 수 있다. CTCs를 분리하기 위한 다른 방법은 기술되어 있다(예를 들어, PCT Publication No. WO/2002/020825, Cristofanilli et al., New Engl. J. of Med. 351(8):781-791(2004), 및 Adams et al., J. Amer. Chem. Soc. 130(27): 8633-8641(July 2008) 참조). 특정 실시형태에서, 순환 종양 세포("CTCs")는 분리될 수 있고, 폐로부터 유래된 것으로 확인될 수 있다.
따라서, 본 발명은 CTC를 분리하고, 이어서 CTC에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그를 코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 전장 ROS 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 ROS 융합 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)의 존재를 확인하기 위한 일 이상의 분석 포맷으로 CTC를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 생물학적 샘플의 세포 추출물은 표준 기술에 따라, 조 또는 부분적으로(또는 전체적으로) 정제된 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 대안으로, 전세포를 포함하는 생물학적 샘플은 하기 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 시험관내 키나아제 분석, ELISA 분석, 면역조직화학(IHC), 유세포분석(FC), 및 면역형광(IF), 면역조직화학(IHC), 형광 인 시츄 하이브리다이제이션(FISH) 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 분석 포맷에서 이용될 수 있다(예를 들어, Ausubel et al., supra 참조). 그러한 전세포 분석은 종양 세포 샘플의 조작을 최소화하므로 세포의 생체내 신호전달/활성화 상태를 변화시키고, 인공 신호를 도입할 위험을 감소시킨다는 점에서 유리하다. 전세포 분석은 종양 및 정상 세포의 혼합물보다는 종양 세포에서만 발현 및 신호전달을 특성화하기 때문에 또한 유리하다.
따라서, 본 발명의 방법 실시에 이용되는 생물학적 샘플은 ROS 키나아제 활성의 존재(예를 들어, 전장 ROS 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 또는 ROS 융합 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드)에 의해 특성화되는 암 또는 의심되는 암이 존재하거나, 존재할 수 있거나, 또는 발생되고 있는 임의의 포유류로부터 얻어질 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 암(또는 의심되는 암) 및 표시된 분자(예를 들어, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드)에 관한 문구 "의해 특징지워지는"은 그러한 전좌, 전장 ROS의 비정상적 발현 및/또는 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드가 존재하지 않는 다른 암 또는 정상 조직과 비교하여, 유전자 전좌 또는 돌연변이(예를 들어, 전장 ROS의 비정상적 발현을 야기하는) 및/또는 ROS 키나아제 활성을 갖는 발현된 폴리펩타이드가 존재하는 암(또는 의심되는 암)을 의미한다. 그러한 전좌, 전장 ROS의 비정상적 발현 및/또는 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 전체적으로 또는 부분적으로 그러한 암 또는 의심되는 암의 성장 및 생존을 유도할 수 있다.
따라서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 전장 ROS 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 ROS 융합 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 것으로 확인된 환자로부터의 임의의 생물학적 샘플(예를 들어, CTC, 흉막 삼출액, 바늘 흡입물, 종양 생검 등)은 환자로부터 유래된 암(예를 들어 NSCLC 또는 SCLC와 같은 폐암)이 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 의해 유도되고, 따라서 적어도 하나의 ROS 키나아제-억제 치료제를 포함하는 조성물에 반응하기 쉽다는 것을 나타낼 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "반응하기 쉬운"은 암이 ROS 억제 치료제에 대하여 반응하여(예를 들어, ROS 억제 치료제와 접촉하거나, 또는 ROS 억제 치료제에 의해 치료될 때), 성장 지연 또는 폐기를 나타내기 더 쉽다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, ROS 억제 치료제에 반응하기 쉬운 암은 ROS 억제 치료제에 대하여 반응하여 죽는(예를 들어, 암 세포가 아포토시스되는) 것이다.
포유류 암 종양으로부터의 세포를 포함하는 생물학적 샘플에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)의 존재를 평가할 때, 그러한 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드가 발생하지 않는 세포를 나타내는 대조군 샘플이 바람직하게 비교 목적을 위하여 채용될 수 있다. 이상적으로, 대조군 샘플은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)가 발생하지 않는 서브셋을 나타내는 특정 암(예를 들어, 폐암)의 서브셋으로부터의 세포를 포함한다. 따라서, 대조군 샘플 대 시험 생물학적 샘플에서의 수준 비교는 돌연변이 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드가 존재하는지 여부를 확인한다. 대안으로, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)가 대다수의 암에서 존재할 수 없기 때문에, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)를 발현하지 않는 임의의 조직이 대조군으로 채용될 수 있다.
후술되는 방법은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 존재에 의해 특성화되는 암에 대하여 가치있는 진단 이용성 및 그를 포함하는 치료 결정을 갖는다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 존재에 의해 특성화되는 암을 갖는 것으로 이전에 진단받지 않았거나, 또는 그러한 암에 대하여 치료를 경험하지 않았던 대상으로부터 얻어질 수 있으며, 이 방법은 그러한 대상에서의 종양을 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)가 존재/발현되는 종양의 서브셋(예를 들어, NSCLC 또는 SCLC)으로서 진단적으로 확인하는데 채용된다.
대안으로, 생물학적 샘플은 EFGR과 같은 일 형태의 키나아제 존재에 의해 특성화되는 암을 갖는 것으로 진단되었고, 그러한 암의 치료를 위하여 EGFR 억제 치료제(예를 들어, Tarceva™, Iressa™)와 같은 치료제를 받았던 대상으로부터 얻어질 수 있으며, 본 발명의 방법은, 대상의 종양이 전장 ROS 단백질 또는 많은 ROS 융합 폴리펩타이드의 하나(예를 들어, SLC34A2-ROS(S))와 같은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)의 존재에 의해 특성화되며, 따라서 현존하는 치료제에 완전하기 반응하기 쉬운지 여부, 및/또는 대안적인 또는 추가적인 ROS-억제 치료제가 바람직하거나 또는 보증되는지 여부를 확인하기 위하여 채용된다. 본 발명의 방법은 또한, ROS-억제 치료제 또는 치료제들의 조합을 포함하는 조성물에 의해 대상을 치료한 후에 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드-발현 암의 진행 또는 억제를 모니터링하기 위하여 채용될 수 있다.
그러한 진단적 분석은 예비 평가 또는 외과적 감시 과정에 이어서, 또는 그 전에 수행될 수 있다. 본 발명의 확인 방법은 ROS 융합 단백질(예를 들어, FIG-ROS(S))과 같은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 존재에 의해 특성화되며, 환자가 ROS 키나아제 활성 억제에 타겟팅된 치료제에 가장 반응하기 쉬운, 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암)과 같은 암을 갖는 환자를 확인하기 위하여 진단 프로그램으로서 유리하게 채용될 수 있다. 그러한 환자를 선택할 수 있는 능력은 미래 ROS-억제 치료제의 효능성의 임상적 평가, 및 환자에 대한 그러한 약물의 미래 처방에도 유용하다.
ROS 융합 단백질 또는 ROS 융합 폴리뉴클레오타이드, 또는 전장 ROS 폴리펩타이드 또는 전장 ROS 폴리뉴클레오타이드와 같은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)가 존재하는 암을 선택적으로 확인할 수 있는 능력은 진단 목적을 위하여 그러한 종양을 정확하게 확인하고, 그러한 종양이 ROS-억제 치료제 조성물에 반응하기 쉬운지 여부, 또는 암의 치료를 위하여 단일 제제로서 투여되는 경우 다른 키나아제를 타겟팅하는 억제제에 대하여 부분적으로 또는 완전히 비반응성을 나타내기 쉬운지 여부를 결정하는데 유용한 정보를 얻기 위한 중요한 새로운 방법을 가능하게 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "암", 또는 "암의"는 동일한 세포 형태의 정상(즉, 비-암) 세포에 비하여 비정상적 성장을 나타내는 세포를 의미한다. 예를 들어, 암 세포는 전이성 또는 비전이성일 수 있다. 암 세포는 동일한 세포 형태의 정상 세포가 접촉 억제를 나타내는 경우 접촉 억제의 결여를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암 또는 소세포 폐암)일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "의심되는 암"("의심되는 포유류 폐암"에서)은 의심되는 암과 동일한 세포 또는 조직의 정상 세포 또는 조직과 비교하여 일부 비정상적 특성(예를 들어, 과형성 또는 접촉 억제의 결여)을 가지나, 세포 또는 조직이 아직 의사 또는 병리학자에 의해 암으로 확인되지 않은 세포 또는 조직을 의미한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 다양한 방법은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 상이한 분석 포맷에서 수행될 수 있다. 이 방법의 일부 비제한적 예는 면역분석 및 펩타이드 및 뉴클레오타이드 분석을 포함한다.
면역분석.
본 발명의 실시에 이용되는 면역분석은 균질 면역분석 또는 불균질면역분석일 수 있다. 균질 분석에서, 면역반응은 일반적으로 특이적 시약(예를 들어 ROS-특이적 항체), 표지된 분석물, 및 대상 생물학적 샘플을 포함한다. 표지로부터 발생된 신호는 표지된 분석물에 대한 항체의 결합 시에 직접적으로 또는 간접적으로 변형된다. 면역반응 및 그 정도의 검출 모두 균질 용액에서 수행된다. 채용될 수 있는 면역화학 표지는 자유 라디칼, 방사성동위원소, 형광 염료, 효소, 박테리오파지, 조효소 등을 포함한다. 반도체 나노결정 표지 또는 "양자점"도 유리하게 채용될 수 있으며, 그 제조 및 이용은 잘 기술되어 있다. 일반적으로 K. Barovsky, Nanotech. Law & Bus . 1(2): Article 14(2004) 및 그에 인용된 특허 참조.
불균질 분석 접근에서, 재료는 일반적으로 생물학적 샘플, 결합 시약(예를 들어, 항체), 및 검출가능한 신호를 생성하는 적합한 수단이다. 하기에 상세하게 기재되는 생물학적 샘플이 이용될 수 있다. 항체는 일반적으로 비드, 플레이트 및 슬라이드와 같은 지지체 상에서 고정화되며, 액상에서 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉된다. 이어서, 지지체를 액상으로부터 분리하고, 지지체상 또는 액상의 어느 하나가 신호를 생성하는 검출가능한 신호 채용 수단에 대하여 검사된다. 신호는 생물학적 샘플에서 분석물의 존재와 관련된다. 검출가능한 신호를 생성하는 수단은 방사성 표지, 형광 표지, 효소 표지, 양자점 등의 이용을 포함한다. 예를 들어, 결합되는 항원이 제2 결합 부위를 함유하는 경우, 그 부위에 결합되는 항원은 분리 단계 전에 검출가능한 기에 컨주게이트되고, 액상에 첨가될 수 있다. 고체 지지체 상에서 검출가능한 기의 존재는 시험 샘플에서 항원의 존재를 나타낸다. 적합한 면역분석의 예는 방사성면역분석, 면역형광법, 효과-결합 면역분석 등이다.
본 명세서에 개시된 방법을 수행하는데 유용할 수 있는 면역분석 포맷 및 그 변화는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, E. Maggio, Enzyme-Immunoassay,(1980)(CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.) 참조; 또한, 예를 들어, U.S. Pat. No. 4,727,022(Skold et al ., "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application"); U.S. Pat. No. 4,659,678(Forrest et al ., "Immunoassay of Antigens"; U.S. Pat. No. 4,376,110(David et al., "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies" 참조). 시약-항체 복합체 형성에 적합한 조건은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. id 참조. ROS-특이적 항체는 표지된 모노클로날 항체 및 결합된 모노클로날 항체 모두에 대한 소스로 작용하는 단일 하이브리도마 세포주에 의한 "2부위(two-site)" 또는 "샌드위치(snadwich)" 분석에 이용될 수 있다. 그러한 분석은 U.S. Pat. No. 4,376,110에 기술되어 있다. 검출가능한 시약의 농도는 ROS 키나아제 활성을 갖는 단백질(예를 들어, 전장 ROS 단백질 또는 ROS 융합 폴리펩타이드)의 결합이 백그라운드와 비교하여 검출가능하도록 충분하여야 한다.
본 명세서에 개시된 방법의 실시에 이용되는 항체는 침전과 같은 공지 기술에 따라 진단 분석에 적합한 지지체(예를 들어, 라텍스 또는 폴리스티렌과 같은 물질로부터 형성된, 비드, 플레이트, 슬라이드, 또는 웰)에 컨주게이트될 수 있다. 항체 또는 다른 결합 시약은 유사하게 공지 기술에 따라, 방사성표지(예를 들어, 35S, 125I, 131I), 효소 표지(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 로잘린 포스파타제), 및 형광 표지(예를 들어, 플루오레세인)와 같은 검출가능한 기에 컨주게이트될 수 있다.
유세포분석(FC), 면역조직화학(IHC), 또는 면역형광(IF)과 같은 세포-기반 분석은 그러한 분석 포맷이 임상적으로 적합하며, 생체내에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 단백질(예를 들어, 전장 ROS 폴리펩타이드 또는 ROS 융합 폴리펩타이드)의 발현의 검출을 가능하게 하며, 추출물을 얻기 위하여 예를 들어 종양 샘플로부터 얻어진 세포를 조작하는 것으로부터 야기되는 인공적인 변화의 위험을 피하기 때문에, 본 발명의 방법 실시에 특히 바람직하다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 유세포분석(FC), 면역조직화학(IHC), 또는 면역형광(IF) 분석 포맷에서 실시된다.
유세포분석(FC)은 ROS 키나아제 활성을 억제하는데 타겟팅된 약물에 의한 치료 전, 치료 중, 및 치료 후에 포유류 종양에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현을 결정하기 위하여 채용될 수 있다. 예를 들어, 미세 바늘 흡입물로부터 종양 세포는 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 전장 ROS 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 또는 ROS 융합 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드)의 발현 및/또는 활성화를 위하여, 및/또는 바람직한 경우 암 세포 형태를 확인하는 마커를 위하여 유세포분석에 의해 분석될 수 있다. 유세포분석은 표준 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어 Chow et al ., Cytometry(Communications in Clinical Cytometry ) 46: 72-78(2001) 참조. 간단하게 예로써, 세포분석을 위한 하기 프로토콜이 채용될 수 있다: 37℃에서 10분 동안 2% 파라포름알데하이드에 의해 세포 고정화, 및 이어서 얼음상에서 10분 동안 90% 메탄올에서 퍼미어빌라이제이션(permeabilization). 이어서, 세포는 일차 항체(예를 들어, 전장 ROS-특이적 또는 ROS 융합 폴리펩타이드-특이적 항체)에 의해 스테이닝되고, 세척되고, 형광-표지된 이차 항체에 의해 표지될 수 있다. 이어서, 세포는 이용된 기구의 특이적 프로토콜에 따라 유세포 분석기(예를 들어, Beckman Coulter FC500)에서 분석된다. 그러한 분석은 종양에서 발현된 전장 ROS 또는 ROS 융합 폴리펩타이드의 수준을 확인한다. ROS-억제 치료제에 의한 종양 치료 후에 유사한 분석은 ROS 키나아제의 타겟팅된 억제제에 대한 전장 ROS-발현 종양 또는 ROS 융합 폴리펩타이드의 반응성을 밝힌다.
면역조직화학(IHC) 스테이닝도 OS 키나아제 활성을 억제하는데 타겟팅된 약물에 의한 치료 전, 치료 중, 및 치료 후에 포유류 암(예를 들어, 폐암)에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성화 상태를 결정하기 위하여 채용될 수 있다. IHC는 잘 알려진 기술에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 10, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory(1988) 참조. 간단하게 예로써, 파라핀-삽입 조직(예를 들어, 생검으로부터의 종양 조직)은 크실렌 및 이어서 에탄올에 의해 조직 부분의 파라핀을 제거하고; 물 및 이어서 PBS에서 수화시키고; 소듐 시트레이트 버퍼에서 슬라이드를 가열함으로써 항원의 마스크를 제거하고; 과산화수소에서 부분을 배양하고; 차단 용액에서 블로킹하고; 일차 항체(예를 들어, ROS-특이적 항체) 및 이차 항체에서 슬라이드를 배양하고; 마지막으로 아비딘/비오틴 방법을 이용하여 검출함으로써 면역조직화학 스테이닝을 위하여 제조된다.
면역형광(IF) 분석은 ROS 키나아제 활성을 억제하는데 타겟팅된 치료제에 의한 치료 전, 치료 중, 및 치료 후에, 포유류 암에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, 전장 ROS 폴리펩타이드 또는 ROS 융합 폴리펩타이드)의 발현 및/또는 활성화 상태를 결정하기 위하여 채용될 수 있다. IF는 잘 알려진 기술에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, J.M. polak and S. Van Noorden(1997) Introduction to Immunocytochemistry, 2nd Ed.; Royal Microscopy Society Microscopy Handbook 37, BioScientific/Springer-Verlag 참조. 간단하게 예로써, 환자 샘플은 파라포름알데하이드 및 이어서 메탄올에서 고정화되고, 말 혈청과 같은 차단 용액으로 블로킹되며, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, a CD74-ROS 융합 폴리펩타이드)에 대한(즉, 특이적으로 결합하는) 일차 항체 및 이어서 Alexa 488과 같은 형광 염료로 표지된 이차 항체에 의해 배양되고, 에피플로루오레센트 현미경(epifluorescent microscope)에 의해 분석될 수 있다.
ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 측정하기 위한, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성면역분석(RIA), 웨스턴 블롯팅 분석, 시험관내 키나아제 분석, 및 형광-활성화 세포 분류(fluorescent-activated cell sorting, FACS)를 포함하는 다수의 다른 프로토콜이 당해 기술분야에 알려져 있으며, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, 전장 ROS, 또는 FIG-ROS(S) 융합 폴리펩타이드와 같은 ROS 융합 폴리펩타이드)의 존재를 진단하기 위한 기초를 제공한다. 전장 ROS 폴리펩타이드 발현의 정상 또는 표준 값은 복합체 형성을 위한 적합한 조건 하에서, 정상 포유류 대상, 바람직하게 인간으로부터 취해진 체액 또는 세포 추출물을 전장 ROS 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체와 결합시킴으로써 수립된다. 표준 복합체 형성의 양은 다양한 방법에 의해 정량화될 수 있으나, 바람직하게는 광도계에 의해 이루어질 수 있다. 대상, 대조군 및 생검된 조직으로부터 질병 샘플에서 발현된 전장 ROS 폴리펩타이드의 양은 표준 갑과 비교된다. 표준 값과 대상 값 사이의 편차는 질병을 진단하기 위한 파라미터를 수립한다. 물론, 본 명세서에 기재된 바와 같이, ROS 키나아제 활성을 갖는 단백질(예를 들어, FIG-ROS(S) 또는 SLC34A2-ROS(S))은 암인 폐의 조직에서 발견되므로, 정상적인 폐 조직 생물학적 샘플은 이러한 ROS 키나아제 활성을 갖는 단백질(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)를 함유할 것으로 예측되지 않는다.
다른 측면에서, 본 발명은 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암으로부터의 생물학적 샘플에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암으로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 및 (b) 상기 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여, 상기 생물학적 샘플에 상기 폴리뉴클레오타이드가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기에서, 상기 생물학적 샘플에 대한 상기 시약의 특이적 결합의 검출은 상기 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 것을 나타낸다.
ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 존재는 임의의 표준 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 이러한 방법은 전술한 바와 같이, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 검출하기 위한 방법과 조합될 수 있다.
뉴클레오타이드 분석.
본 발명의 방법 실시예 이용되는 전장 ROS 폴리뉴클레오타이드 또는 ROS 융합 폴리뉴클레오타이드-특이적 결합 시약은 생물학적 샘플에서 융합 또는 말단이 잘린 폴리펩타이드 발현 전사물에 직접적으로 하이브리다이즈하고, 이를 검출할 수 있는 mRNA, 올리고뉴클레오타이드 또는 DNA 프로브일 수 있다. 그러한 프로브는 본 명세서에 상세하게 논의된다. 간단하게 예로써, 포르말린-고정된, 파라핀-삽입된(PPFE) 환자 샘플은 플루오레세인-표지된 RNA 프로브에 의해 검사된 후, 포름아미드, SSC 및 PBS에 의해 세척되고, 형광 현미경으로 분석될 수 있다.
ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 진단 목적을 위하여 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 서열, 안티센스 RNA 및 DNA 분자, 및 PNAs를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드 또는 전장 ROS)의 발현이 질병과 연관성을 가질 수 있는 생검된 조직에서 유전자 발현을 검출 및 정량화하는데 이용될 수 있다. 진단 분석은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 부재, 존재 및 과발현 간에 구별하기 위하여, 및 치료제 개입 중에 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 수준의 조절을 모니터링하기 위하여 이용될 수 있다.
일 실시형태에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는(예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드 또는 전장 ROS 단백질을 코딩하는) 게놈 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 검출할 수 있는 PCR 프라이머에 의한 하이브리다이제이션이 그러한 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 확인하기 위하여 이용될 수 있다. 매우 특이적 영역, 예를 들어 융합 접점에서 10개의 특유한 뉴클레오타이드로부터 만들어졌든지, 또는 덜 특이적 영역, 예를 들어 3' 코딩 영역으로부터 만들어졌든지 간에 프로브의 특이성, 및 하이브리다이제이션 또는 증폭(최대, 높은, 중간 또는 낮은)의 엄격성은 프로브가 ROS 키나아제 폴리펩타이드(예를 들어, 전장 ROS 또는 ROS 융합 단백질)를 코딩하는 자연 발생 서열만 확인하는지, 대립형질(alleles)을 확인하는지, 또는 관련된 서열을 확인하는지 여부를 결정한다.
프로브는 관련된 서열의 검출에 이용될 수 있으며, 바람직하게 돌연변이 ROS 폴리펩타이드를 코딩하는 서열로부터 적어도 50%의 뉴클레오타이드를 함유하여야 한다. 본 발명의 하이브리다이제이션 프로브(예를 들어, FISH 프로브 또는 서던 또는 노던 블롯팅 프로브)는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, SEQ ID NOs:_______[ROS 및 모든 ROS 융합 단백질의 DNA 서열]의 뉴클레오타이드 서열로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 OS 융합 단백질, 융합 접점을 포함하는 하이브리다이제이션 프로브, 또는 자연 발생 ROS 유전자 및 융합 파트너 유전자(예를 들어, SLC34A2, FIG, 또는 CD74)의 프로모터, 인핸서 요소, 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터의 것이다.
ROS 융합 폴리뉴클레오타이드(즉, FIG-ROS(S) 또는 CD74-ROS와 같은 ROS 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드) 또는 전장 ROS 폴리뉴클레오타이드는 서던 또는 노던 분석, 도트 블롯, 또는 다른 막-기반 기술에서; PCR 기술에서; 또는 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 변형된 발현을 검출하기 위하여 환자 생검으로부터 유체 또는 조직을 이용하는 딥 스틱(dip stick), 핀(pin), ELISA 또는 칩 분석에서 이용될 수 있다. 그러한 정성적 및 정량적 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 특정 측면에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 및 소세포 폐 암종을 포함하는 다양한 폐암의 활성화 또는 유도를 검출하는 분석에서 이용될 수 있다. ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 표준 방법에 의해 검출가능하게 표지될 수 있으며, 하이브리다이제이션 복합체 형성에 적합한 조건 하에서 환자로부터의 유체 또는 조직 샘플에 첨가될 수 있다. 적합한 배양 기간 후에, 샘플은 세척되고, 신호는 정량화되고 표준 값고 비교된다. 생검된 또는 추출된 샘플에서 신호의 양이 비교되는 대조군 샘플의 것으로부터 현저하게 변화된 경우, 뉴클레오타이드 서열은 샘플에서의 뉴클레오타이드 서열과 하이브리다이즈되고, 샘플에서 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드 또는 전장 ROS 폴리펩타이드)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 변화된 수준의 존재는 관련된 질병의 존재를 나타낸다. 그러한 분석은 동물 연구에서, 임상 시험에서, 또는 개별적인 환자 치료의 모니터링에서 특정 치료 계획의 효능을 평가하기 위하여 이용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 PCR 분석 포맷에서 수행될 수 있다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 표준이다. 예를 들어, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. edition, Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989) 참조. PCR 프라이머(및 올리고머로도 불림)는 화학적으로 합성되거나, 효소적으로 생성되거나, 또는 재조합 소스로부터 제조될 수 있다. 올리고머는 바람직하게, 하나는 센스 배향(5'에서 3') 및 다른 하나는 안티센스(3'에서 5')인 2개의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지며, 특정한 유전자 또는 상태의 확인을 위한 최적화된 조건 하에서 채용된다. 동일한 2개의 올리고머, 올리고머의 네스티드 세트(nested sets), 또는 올리고머의 디제너레이트 풀(degenerate pool)도 밀접하게 관련된 DNA 또는 RNA 서열의 검출 및/또는 정량화를 위한 덜 엄격한 조건 하에서 채용될 수 있다.
ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드 또는 전장 ROS 폴리펩타이드)의 발현을 정량화하는데 이용될 수 있는 방법은 뉴클레오타이드의 방사성표지 또는 비오틴화, 대조군 핵산의 공동 증폭, 및 실험 결과가 보간되는(interpolated) 표준 곡선을 포함한다(Melby et al., J. Immunol . Methods, 159: 235-244(1993); Duplaa et al . Anal . Biochem . 229-236(1993)). 다중 샘플의 정량화 속도는 대상 올리고머가 다수의 희석액으로 존재하고, 분광광도분석 또는 비색 분석 반응이 신속한 정량을 제공하는 ELISA 포맷에서의 분석을 수행함으로써 촉진될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생 게놈 서열을 맵핑하는데 유용한 하이브리다이제이션 프로브를 생성하기 위하여 이용될 수 있다. 서열은 잘 알려진 기술을 이용하여, 특정 염색체에 대하여, 및 염색체의 특이적 영역에 대해 맵핑될 수 있다. 그러한 기술은 형광 인시츄 하이브리다이제이션(FISH), FACS, 또는 효소 인공 염색체, 박테리아 인공 염색체, 박테리아 P1 구조물과 같은 인공 염색체 구조물, 또는 Price, C. M., Blood Rev . 7: 127-134 (1993), and Trask, B. J., Trends Genet. 7: 149-154(1991)에 리뷰된 바와 같이 단일 염색체 cDNA 라이브러리를 포함한다.
다른 실시형태에서, 형광 인시츄 하이브리다이제이션(FISH)이 본 발명의 방법에 채용된다(Verma et al . Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.(1988)에 기재된 바와 같이). 일부 실시형태에서, FISH 분석은 물리적 염색체 맵핑 기술 유전자 맵 데이터와 연관성을 가질 수 있다. FISH 기술은 잘 알려져 있다(예를 들어, US Patent Nos. 5,756,696; 5,447,841; 5,776,688; 및 5,663,319 참조). 유전자 맵 데이터의 예는 Science (265: 1981f)의 1994 Genome Issue에서 찾아질 수 있다. 물리적 염색체 맵에서, ROS 단백질을 코딩하는 유전자, ROS 융합 폴리펩타이드의 경우, ROS 융합 단백질의 융합 파트너를 코딩하는 유전자(예를 들어, FIG 유전자, SLC34A2 유전자, 또는 CD74 유전자)의 위치와 특이적 질병, 또는 특이적 질병에 대한 소인 간의 연관성은 유전적 질병에 관련된 DNA 영역의 범위를 정하는데 도움이 될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 정상, 캐리어(carrier), 또는 병에 걸린(affected) 개체 사이의 유전자 서열의 차이를 검출하기 위하여 이용될 수 있다.
염색체 제제의 인시츄 하이브리다이제이션 및 수립된 염색체 마커를 이용하는 결합 분석과 같은 물리적 맵핑 기술은 유전자 맵을 확장하기 위하여 이용될 수 있다. 종종 마우스와 같은 다른 포유류 종의 염색체 상에서의 유전자의 배치는 특정 인간 염색체의 수 및 팔(arm)이 알려져 있지 않더라도 관련된 마커를 밝힐 수 있다. 새로운 서열은 염색체 팔, 또는 그 부분에 물리적 맵핑에 의하여 배치될 수 있다. 이는 위치적 클로닝 및 다른 유전자 발견 기술을 이용하여 질병 유전자를 검색하는 연구자들에게 가치있는 정보를 제공한다. 질병 또는 증후군이 특정 게놈 영역에 대한 유전자 결합에 의해 대략적으로 위치가 찾아지면, 예를 들어, 11q22-23에 대해 AT(Gatti et al ., Nature 336: 577-580(1988)), 그 영역에 대한 임의의 서열 맵핑은 추가적인 조사를 위하여 관련된 유전자 또는 조절 유전자를 나타낼 수 있다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 정상, 캐리어, 또는 질병에 걸린 개체 중에서, 전좌, 역위 등에 기인한 염색체의 위치의 차이를 검출하기 위하여 이용될 수 있다.
ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 전장 ROS 또는 FIG-ROS(S)와 같은 ROS 융합 폴리뉴클레오타이드)를 검출하는 모든 방법(예를 들어, PCR 또는 FISH)는 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드, 또는 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 다른 방법과 결합될 수 있음이 이해되어야 한다. 생물학적 샘플의 유전자 물질에서 FIG-ROS(S) 융합 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 순환 종양 세포에서 FIG-ROS(S))의 검출 후에, FIG-ROS(S) 폴리뉴클레오타이드가 생물학적 샘플에서 FIG-ROS(S) 융합 폴리펩타이드로서 실제로 발현되는지를 결정하기 위하여 웨스턴 블롯팅 분석 또는 면역조직화학(IHC) 분석이 이루어질 수 있다. 그러한 웨스턴 블롯팅 또는 IHC 분석은 FIG-ROS(S) 폴리뉴클레오타이드에 의해 코디오디는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 수행될 수 있으며, 또는 분석은 전장 FIG(예를 들어, 단백질의 N-말단에 결합하는) 또는 전장 ROS(예를 들어, ROS의 키나아제 도메인에서 에피토프에 결합하는)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 그러한 분석은 당해 기술분야에 알려져 있다(예를 들어, US Patent 7,468,252 참조).
다른 예에서, Dako의 CISH 기술은 동일한 조직에서 면역조직화학에 의한 크로마토제닉(chromatogenic) 인시츄 하이브리다이제이션을 가능하게 한다. CISH 및 FISH의 비교를 위하여 Elliot et al., Br J Biomed Sci 2008; 65(4): 167- 171, 2008 참조.
본 발명의 다른 측면은 환자를, ROS 키나아제에 의해 유도되는 폐암 또는 의심되는 폐암을 갖는 것으로 진단하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 폐암 또는 의심되는 폐암의 생물학적 샘플(생물학적 샘플은 적어도 하나의 핵산 분자를 포함함)을, 엄격한 조건 하에 전장 ROS 폴리뉴클레오타이드 또는 ROS 융합 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, FIG-ROS(S) 융합 폴리뉴클레오타이드, FIG-ROS(L) 융합 폴리뉴클레오타이드, FIG-ROS(VL) 융합 폴리뉴클레오타이드, SLC34A2-ROS(S) 융합 폴리뉴클레오타이드, SLC34A2-ROS(VS) 융합 폴리뉴클레오타이드, SLC34A2-ROS(L) 융합 폴리뉴클레오타이드, 또는 CD74-ROS 융합 폴리뉴클레오타이드)와 같은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자에 하이브리다이즈하는 프로브와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기에서, 상기 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 핵산 분자에 대한 상기 프로브의 하이브리다이제이션에 의해, 상기 환자는 ROS 키나아제에 의해 유도되는 폐암 또는 의심되는 폐암을 갖는 것으로 확인된다.
본 발명의 또 다른 측면은 환자를 ROS 키나아제에 의해 유도되는 폐암 또는 의심되는 폐암을 갖는 것으로 진단하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 상기 폐암 또는 의심되는 폐암의 생물학적 샘플(예를 들어, FIG-ROS(S) 융합 폴리펩타이드, FIG-ROS(L) 융합 폴리펩타이드, FIG-ROS(VL) 융합 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(S) 융합 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(VS) 융합 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS(L) 융합 폴리펩타이드, 또는 CD74-ROS 융합 폴리펩타이드)와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기에서 상기 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 폴리펩타이드에 대한 상기 시약의 특이적 결합에 의해, 상기 환자는 ROS 키나아제에 의해 유도되는 폐암 또는 의심되는 페암을 갖는 것으로 확인된다.
다양한 실시형태에서, 폐암 또는 의심되는 폐암이 ROS 키나아제에 의해 유도되는 것으로 확인되면, 이러한 폐암 또는 의심되는 폐암을 갖는 환자는 ROS-억제 치료제에 대하여 반응하기 쉬운 것으로 확인된다.
ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드)의 발현에 의해 특성화되는 질병(예를 들어, 폐암)의 진단을 위한 기초를 제공하기 위하여, 발현에 대한 정상 및 표준 프로파일이 수립될 수 있다. 이는, 하이브리다이제이션 또는 증폭에 적합한 조건 하에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드 또는 전장 ROS 폴리펩타이드)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 그 단편을 갖는, 동물 또는 인간인 정상적인 대상으로부터 취해진 체액 또는 세포 추출물을 결합함으로써 수행될 수 있다. 표준 하이브리다이제이션은 정상적인 대상으로부터 얻어진 값을, 알려진 양의 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오타이드가 이용된 실험으로부터의 값과 비교함으로써 정량화될 수 있다. 정상적인 샘플로부터 얻어진 표준 값은 질병의 증상을 나타내는 환자로부터의 샘플로부터 얻어진 값과 비교될 수 있다. 표준 값과 대상 값과 사이의 편차는 질병의 존재를 수립하기 위하여 이용된다.
질병이 수립되고, 치료 프로토콜이 개시되며, 하이브리다이제이션 분석은 환자에서 발현 수준이 정상 환자에서 관찰된 것과 가까워지기 시작하는지 여부를 평가하기 위하여 정기적으로 반복될 수 있다. 연속적인 분석으로부터 얻어진 결과는 며칠에서 몇달의 범위인 기간에 걸쳐 치료의 효능을 나타내기 위하여 이용될 수 있다.
ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현 또는 활성 수준에 대한 유사한 정상 또는 표준 프로파일이 수립될 수 있다. 예를 들어, 단백질 발현에 있어서, 프로파일은 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 수립될 수 있으며, 또한, 예를 들어 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는(예를 들어, 전장 ROS에 결합하는, 또는 ROS 융합 폴리펩타이드의 융합 접점에 결합하는) 항체를 이용하여, 폐암 증상을 나타내는 환자에서 결합의 수준을 정상 대상에서의 결합 수준과 비교함으로써 수립될 수 있다. 유사하게, ROS 키나아제 활성 수준에 있어서, 표준 시험관내 키나아제 분석(Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra 참조)는 폐암 증상을 보이는 환자로부터 취해진 샘플과 비교하여 정상 환자로부터 취해진 샘플에서 수행될 수 있다.
다양한 실시형태에서, ROS 발현 또는 키나아제 활성의 억제는 ROS 융합 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 시약, ROS 융합 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약, 전장 ROS 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 시약, 또는 전장 ROS 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 결정된다. 일부 부가적인 실시형태에서, ROS 발현 또는 키나아제 활성의 억제는 전장 FIG 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 시약, 전장 FIG 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약, 전장 SLC34A2 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 시약, 전장 SLC34A2 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약, 전장 CD74 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 시약 또는 전장 CD74 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 결정된다.
다양한 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성은 크리조티닙(PF-02341066로도 알려짐), NVT TAE-684, AP26113, CEP-14083, CEP-14513, CEP11988, WHI-P131 및 WHI-P154로 이루어진 군으로부터 선택된 치료를 포함하는 조성물에 의해 억제된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "ROS 억제제", 또는 "ROS-억제 화합물"은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는, 화학적 또는 생물학적 일 이상의 화합물을 포함하는 임의의 조성물을 의미한다. 그러한 억제는 시험관내 또는 생체내일 수 있다. "ROS 억제제 치료제" 또는 "ROS-억제 치료제"는 본 명세서에 기재된 비정상적으로 발현된 전장 ROS 단백질 또는 ROS 융합 폴리펩타이드(예를 들어, FIG-ROS 융합 단백질의 하나)와 같은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 존재에 의해 특성화되는 폐암(예를 들어, NSCLC 또는 SCLC)을 앓는 환자를 치료하기 위한 치료제로서 이용되는 ROS-억제 화합물을 의미한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, ROS 억제제는 ROS 융합 폴리펩타이드(예를 들어, FIG-ROS(S), FIG-ROS(L), FIG-ROS(XL), SLC34A2-ROS(VS), SLC34A2-ROS(S), SLC34A2-ROS(L), 또는 CD74-ROS)에 특이적으로 결합하는 시약, 전장 ROS 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약, SiRNA 타겟팅 ROS 융합 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, SLC34A2-ROS(L) 융합 폴리뉴클레오타이드) 또는 SiRNA 타겟팅 전장 ROS 폴리뉴클레오타이드이다.
ROS-억제 치료제는, 예를 들어, 소분자 또는 항체 억제제와 같은 키나아제 억제제일 수 있다. 이는 몇몇 상이한 키나아제에 대한 활성을 갖는 판-키나아제 억제제(pan-kinase inhibitor) 또는 키나아제-특이적 억제제일 수 있다. ROS, ALK, LTK, InsR, 및 IGF1R가 티로신 키나아제와 동일한 패밀리에 속하므로, 이들은 키나아제 도메인과 유사한 구조를 공유할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 ROS 억제제는 ALK 키나아제, LTK 키나아제, 인슐린 수용체, 또는 IGF1 수용체의 활성을 억제한다. ROS-억제 화합물은 하기에 상세하게 논의된다. 환자 생물학적 샘플은 억제제에 의한 치료 전 및 후에 취해질 수 있으며, 이후 상기한 방법을 이용하여 다운스트림 기질 단백질의 인산화를 포함하는 ROS 키나아제 활성에 대한 억제제의 생물학적 효과에 대하여 분석될 수 있다. 그러한 약역학적 분석은 바람직하게는 최대 내성 용량(maximal tolerable dose)까지일 수 있는 약물의 생물학적 활성 용량을 결정하는데 이용될 수 있다. 그러한 정보는 약물 작용의 메커니즘을 입증함으로써 약물 승인을 위한 제출에 이용될 것이다.
다른 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성은 PF-02341066), NVT TAE-684, AP26113, CEP-14083, CEP-14513, CEP11988, WHI-P131 및 WHI-P154로 이루어진 군으로부터 선택된 ROS 억제 치료제를 포함하는 조성물에 의해 억제된다.
본 발명에 따르면, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 인간 폐암의 적어도 하나의 서브그룹에 존재할 수 있다. 따라서, ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드가 발현되는 포유류 암의 진행은 그러한 암에서 ROS 키나아제의 활성을 억제함으로써, 생체내에서 억제될 수 있다. ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드 또는 비정상적으로 발현된 전장 ROS 폴리펩타이드)의 발현에 의해 특성화되는 암에서 ROS 활성은 치료학적 유효량의 ROS-억제제 치료제와 암을 접촉시킴으로써 억제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 부분적으로, 암(예를 들어, 종양)을 치료학적 유효량의 ROS-억제 치료제와 접촉시킴으로써 폐암에서 ROS 키나아제의 발현 및/또는 활성을 억제함으로써 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드-발현 폐암의 진행을 억제하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료학적 유효량" 또는 "약학적 유효량"은 암 또는 의심되는 암의 성장을 늦추거나, 암 또는 의심되는 암의 세포 수를 감소시키거나, 또는 암을 죽이는 것에 의하여, 치료되지 않은 암 또는 의심되는 암과 비교하여, 암(또는 그 세포) 또는 의심되는 암(또는 그 세포)을 억제하는데 적합한 ROS-억제 치료제의 양을 의미한다.
ROS-억제 치료제는 적어도 하나의 ROS 억제제를 포함하는 임의의 조성물일 수 있다. 그러한 조성물은 하나의 ROS-억제 화합물만을 포함하는 조성물, 및 화학치료제 또는 유전자 전사 억제제와 같은 비특이적 치료제를 포함할 수 있는, 다중 치료제(다른 RTKs에 대한 것을 포함)를 포함하는 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 실시에 이용되는 ROS-억제 치료제는 타겟팅된 소분자 억제제이다. 억제제에 타겟팅된 분자는 특이적으로, 및 종종 비가역적으로, 효소의 촉매 부위에 대한 결함으로써, 및/또는 효소가 그 활성을 위하여 필요한 배열을 채택하는 것을 막는 효소 내의 ATP-결합 클레프트(cleft) 또는 다른 결합 부위에 대하여 결합함으로써 효소의 활성을 전형적으로 억제하는 분자의 분류이다. ROS 키나아제와 ALK 키나아제 사이의 구조 및 기능에서의 밀접한 유사성 때문에, 임의의 ALK 키나아제 억제제는 ROS 키나아제도 억제할 것으로 예측된다. 부가적으로, 실시예에 후술되는 바와 같이, ROS 키나아제에 의해 유도되는 폐암은 ALk 키나아제에 의해 유도되지 않는다. 유사하게, ALK 키나아제에 의해 유도되는 폐암은 ROS 키나아제에 의해 유도되지 않는다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 폐암에 대하여 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 ALK 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 폐암을 갖는, 또는 갖는 것으로 의심되는 환자의 폐로부터의 생물학적 샘플의 존재를 검출하는 단계; 및 환자에게 유효량의 ALK/ROS-억제 치료제를 투여함으로써 폐암에 대해 대상을 치료하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 폐암 또는 의심되는 폐암을 앓는 환자를, ROS-억제제 치료제에 반응하기 쉬운 환자로 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자의 폐로부터의 생물학적 샘플을 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 제1 시약 및 ALK 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 제2 시약과 접촉시키는 단계; 및 상기 제1 시약 및 제2 시약이 상기 생물학적 샘플에 특이적으로 결합하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하며, 여기에서, 생물학적 샘플에 대한 제1 시약 또는 제2 시약의 결합의 검출에 의해, 상기 환자는 ROS-억제 치료제에 반응하기 쉬운 환자로 확인된다. 다양한 실시형태에서, 제1 시약은 전장 ROS 키나아제 단백질에 특이적으로 결합한다. 다양한 실시형태에서, 제2 시약은 전장 ALK 키나아제 단백질에 특이적으로 결합한다. 다양한 실시형태에서, 제1 시약은 ROS 키나아제 단백질의 키나아제 도메인에 특이적으로 결합한다. 다양한 실시형태에서, 제2 시약은 ALK 키나아제 단백질의 키나아제 도메인에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "ALK 키나아제 활성을 갖는 단백질"은 ALK의 전체 키나아제 도메인을 보유하여 ALK 키나아제 활성을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 나타낸다. ALK 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 비제한적 예는 전장 ALK(U.S. Patent No. 5,770,421 참조), NPM-ALK, ALO17-ALK, TFG-ALK, MSN-ALK, TPM3-ALK, TPM4-ALK, ATIC-ALK, MYH9-ALK, CLTC-ALK, SEC31L1-ALK, RANBP2-ALK, CARS-ALK, EML4-ALK, KIF5B-ALK, 및 TFG-ALK를 포함한다(예를 들어, Palmer et al., Biochem. J. 420(3): 345-361, 2009(및 그에 인용된 문헌), Rikova et al., 세포 131: 1190-1203, 2007; Soda et al., Nature 448: 561-566, 2007; Morris et al., Science 263: 1281-1284, 1994; Du et al., J. Mol. Med 84: 863-875, 2007; Panagopoulos et al., Int. J. Cancer 118: 1181-1186, 2006; Cools et al., Genes Chromosomes Cancer 34: 354-362, 2002; Debelenko et al., Lab. Invest. 83: 1255-1265, 2003; Ma et al., Genes Chromosomes Cancer 37: 98-105, 2003; Lawrence et al., Am. J. Pathol. 157: 377-384, 1995; Hernandez et al., Blood 94: 3265-3268, 1999; Takeuchi K., Clin Cancer Res. 15(9):3143-3149, 2009; Tort et al., Lab. Invest. 81: 419-426, 2001; Trinei et al., Cancer Res. 60: 793-798, 2000; 및 Touriol et al., Blood 95: 3204-3207, 2000 참조). 또한, Pulford et al., Journal of Cellular Physiology, 199:330-358, 2004 참조.
다양한 실시형태에서, 환자는 인간이다. 다양한 실시형태에서, 폐암은 비-소세포 폐암 또는 소세포 폐암이다.
하나의 유용한 소분자 키나아제 억제제는 Pfizer, Inc.의 화합물 크리조티닙(PF-02341066로도 알려짐)이며, ALK 및 MET 키나아제 활성을 억제하고, 그 특성은 잘 기술되어 있다. You et al., Cancer Res 67: 4408(2007) 및 U.S. Patent Pub. No. 2008/0300273 참조. ROS를 타겟팅할 수 있는 추가적인 소분자 키나아제 억제제는 TAE-684(Novartis), CH5424802(Chugai; Sakamoto, H. et al., Cancer Cell 19: 679-690, 2011), AP26113(Ariad Pharmaceuticals, Inc.), 및 CEP-14083, CEP-14513, 및 CEP-11988(Cephalon; Wan et al., Blood 107: 1617-1623, 2006)를 포함한다.
PF-02341066은 하기 구조를 갖는다:
Figure 112013117795402-pct00001
5-클로로-2,4-디아미노페닐피리미딘인 TAE-684는 하기 구조:
Figure 112013117795402-pct00002
를 가지며, ROSALK 키나아제를 억제하는 것으로 나타내어졌다. Grosin, et al., Proc. National Acad. Sci 104(1) 270-275, 2007.
추가적인 ROS 키나아제 활성의 소분자 억제제 및 다른 억제제(예를 들어, 간접 억제제)는 ROS 3차원 구조의 X-선 결정학 또는 컴퓨터 모델링을 이용하여 합리적으로 설계될 수 있으며, 또는 ROS 키나아제 활성의 억제를 야기하는 핵심 업스트림 조절 효소 및/또는 필요한 결합 분자의 억제에 대하여 화합물 라이브러리의 고속대량스크리닝에 의해 발견될 수 있다. 그러한 접근은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 기술되어 있다. 그러한 치료제 의한 ROS 억제는 예를 들어, 키나아제의 패널에서, ROS 활성은 억제하나, 다른 키나아제 활성은 억제하지 않는 화합물의 능력을 시험함으로써, 및/또는 암 세포(예를 들어, 폐암 세포)를 포함하는 생물학적 샘플에서 ROS 활성의 억제를 시험함으로써 확인될 수 있다. ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현/존재에 의해 특성화되는 암을 억제하는 화합물을 확인하는 방법은 하기에 더 기재된다.
본 발명의 방법에 유용한 ROS-억제 치료제는 ROS 활성에 요구되는 촉매 또는 결합 부위 또는 도메인에 특이적으로 결합하고, 리간드, 기질 또는 이차 분자의 접근을 차단함으로써, 및/또는 효소가 그 활성을 위하여 필요한 배열을 채택하는 것을 막음으로써 키나아제를 억제하는 타겟팅된 항체일 수 있다. 인간화된 타겟-특이적 항체의 제조, 스크리닝, 및 치료적 용도는 잘 기술되어 있다. Merluzzi et al., Adv Clin Path . 4(2): 77-85(2000) 참조. 인간화된 타겟-특이적 억제 항체의 고속대량 생성 및 스크리닝을 위한 Morphosys, Inc.의 Human Combinatorial Antibody Library(HuCAL®)과 같은 상업적 기술 및 시스템이 이용가능하다.
다양한 항-수용체 키나아제 타겟팅된 항체의 제조 및 타겟팅된 수용체의 활성을 억제하기 위한 그 용도가 기술되어 있다. 예를 들어, U.S. Patent Publication No. 20040202655, U.S. Patent Publication No. 20040086503, U.S. Patent Publication No. 20040033543 참조. 수용체 티로신 키나아제 활성-억제 항체의 제조 및 이용의 표준화된 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, European Patent No. EP1423428 참조.
파지 디스플레이 접근은 ROS-특이적 항체 억제제를 생성하기 위하여 채용될 수 있으며, 박테리오파지 라이브러리 구성, 및 재조합 항체의 선택을 위한 프로토콜은 잘 알려진 레퍼런스 교과서, Current Protocols in Immunology, Colligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Chapter 17, Section 17.1에 제공된다. 또한, U.S. Patent No. 6,319,690, U.S. Patent No. 6,300,064, U.S. Patent No. 5,840,479, 및 U.S. Patent Publication No. 20030219839 참조.
박테리오파지의 표면에 디스플레이된 항체 단편의 라이브러리는 제조될 수 있으며(예를 들어, U. S. Patent 6,300,064 참조) 및 본 명세서에 기재된 ROS 융합 폴리펩타이드와 같은 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 결합에 대하여 스크리닝될 수 있다. ROS 융합 폴리펩타이드(예를 들어, SLC34A2-ROS(S) 융합 폴리펩타이드) 또는 전장 ROS 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 단편은 세포에서 그러한 융합 폴리펩타이드의 구성적 활성화를 차단하기 위한 후보 분자로서 확인된다. European Patent No. EP1423428 참조.
전술한 바와 같은 항체 라이브러리의 스크리닝에서 확인된 ROS-결합 타겟팅된 항체는 시험관내 키나아제 분석 및 생체내 세포주 및/또는 종양 모두에서, ROS의 활성을 차단할 수 있는 능력에 대하여 더 스크리닝될 수 있다. ROS 억제는 전술한 바와 같이, 예를 들어, 키나아제 패널에서 ROS 키나아제 활성을 억제하는 그러한 항체 치료제의 능력을 검사함으로써, 및/또는 암 세포를 포함하는 생물학적 샘플에 ROS 활성의 억제를 검사함으로써 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ROS-억제 화합물은 ROS 키나아제 활성은 감소시키지만, 다른 키나아제의 키나아제 활성은 더 적은 정도로 감소시킨다(또는 전혀 감소시키지 않는다). ROS 키나아제 억제에 대하여 그러한 화합물의 스크리닝 방법은 상기에서 더 기재된다.
본 명세서에 개시된 방법의 실시에 이용될 수 있는 ROS-억제 화합물은 ROS 키나아제 그 자체가 아닌 단백질 또는 분자의 활성을 억제함으로써 ROS 활성을 간접적으로 억제하는 화합물도 포함할 수 있다. 그러한 억제 치료제는 ROS 자체를 인산화 또는 탈인산화(및 따라서, 활성화 또는 비활성화)하는 핵심 조절 키나아제의 활성을 조절하는, 또는 리간드의 결합을 방해하는 타겟팅된 억제제일 수 있다. 다른 수용체 티로신 키나아제에 의한 것과 같이, ROS는 어댑터 단백질의 네트워크 및 다운스트림 키나아제를 통하여 다운스트림 신호전달을 조절한다. 결과적으로, ROS 활성에 의한 세포 성장 및 생존의 유도는 이러한 상호작용 또는 다운스트림 단백질을 타겟팅함으로써 억제될 수 있다.
ROS 키나아제 활성은 그의 활성 배열을 채택하기 위하여(즉, ROS 키나아제 도메인이 활성화될 수 있도록) 전장 ROS 또는 ROS 융합 폴리펩타이드(예를 들어, CD74-ROS 융합 폴리펩타이드)에 필요한 활성화 분자의 결합을 억제하는 화합물을 이용함으로써 간접적으로 억제될 수 있다. 예를 들어, 항-PDGF 항체의 생산 및 이용이 기술되어 있다. U.S. Patent Publication No. 20030219839, "Anti-PDGF Antibodies and Methods for Producing Engineered Antibodies," Bowdish et al 참조. 수용체에 대한 리간드(PDGF) 결합의 억제는 수용체 활성을 직접적으로 하향 조절한다.
ROS 억제 화합물 또는 치료제는 전장 ROS 또는 ROS 융합 단백질를 코딩하는 유전자의 전사를 차단함으로써 ROS 키나아제 활성을 억제하는 안티센스 및/또는 전사 억제 화합물을 포함할 수 있다. 암의 치료를 위한 안티센스 치료제에 의해, VEGFR, EGFR, 및 IGFR, 및 FGFR을 포함하는 다양한 수용체 키나아제의 억제가 기술되어 있다. 예를 들어, U.S. Patent Nos. 6,734,017; 6, 710,174, 6,617,162; 6,340,674; 5,783,683; 5,610,288 참조.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 공지된 기술에 따라 타겟 유전자에 대한 치료제로서 설계, 구성 및 채용될 수 있다. 예를 들어, Cohen, J., Trends in Pharmacol. Sci . 10(11): 435-437(1989); Marcus-Sekura, Anal . Biochem . 172: 289-295(1988); Weintraub, H., Sci . AM . Pp. 40-46(1990); Van Der Krol et al., Bio기술s 6(10): 958-976(1988); Skorski et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA(1994) 91: 4504-4508 참조. EGFR의 안티센스 RNA 억제제를 이용하는 인간 암종의 생체내 성장의 억제가 최근에 기술되었다. U.S. Patent Publication No. 20040047847 참조. 유사하게, 포유류 ROS 유전자 또는 포유류 ROS 융합 단백질-코딩 폴리뉴클레오타이드에 대한 적어도 하나의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 ROS-억제 치료제가 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. ROS-억제 안티센스를 포함하는 약학적 조성물은 하기 기재되는 바와 같이 제조 및 투여될 수 있다.
RNA 간섭(interference) 과정을 통하여 ROS의 번역 및 그에 따라 활성을 억제하는, 소간섭 RNA 분자(siRNA) 조성물은 본 발명의 방법에 바람직하게 채용될 수 있다. RNA 간섭, 타겟 단백질을 코딩하는 mRNA에 대해 상보적인 서열을 포함하는 외생적인 작은 이중가닥 RNA 분자의 도입에 의해 타겟 단백질 발현의 선택적 침묵이 잘 기술되어 있다. 예를 들어, U.S. Patent Publication No. 20040038921, U.S. Patent Publication No. 20020086356, 및 U.S. Patent Publication 20040229266 참조.
이중 가닥 RNA 분자(dsRNA)는 RNA 간섭(RNAi)으로 알려진 매우 보존적인 조절 메커니즘에서 유전자 발현을 차단하는 것으로 나타내어졌다. 요약하면, RNAse III Dicer는 dsRNA를 약 22개 뉴클레오타이드인 소간섭 RNAs(siRNA)로 처리하고, 이는 RNA-유도 침묵 복합체 RISC에 의한 타겟-특이적 mRNA 절단을 유도하기 위한 가이드 서열로 작용한다(Hammond et al., Nature (2000) 404: 293-296 참조). RNAi는 촉매형태 반응을 수반하며, 이에 의해 더 긴 dsRNA의 연속적인 절단을 통해 새로운 siRNAs가 생성된다. 따라서, 안티센스와 달리, RNAi는 비-화학양론적 방식으로 타겟 RNA를 분해한다. 세포 또는 기관에 투여되는 경우, 외생적 dsRNA는 RNAi를 통한 내생적 메신저 RNA(mRNA)의 서열-특이적 분해로 향하는 것으로 나타내어졌다.
포유류 세포에서 발현 및 이용을 위한 벡터 및 시스템을 포함하는 광범위한 타겟-특이적 siRNA 산물은 현재 상업적으로 구입가능하다. 예를 들어, Promega, Inc.(www.promega.com); Dharmacon, Inc.(www.dharmacon.com) 참조. RNAi를 위한 dsRNA의 설계, 구성 및 이용에 대한 상세한 기술적 매뉴얼이 이용가능하다. 예를 들어, Dharmacon의 "RNAi Technical Reference & Application Guide"; Promega의 "RNAi: A Guide to Gene Silencing" 참조. ROS-억제 siRNA 산물도 상업적으로 이용가능하며, 본 발명의 방법에 적합하게 채용될 수 있다. 예를 들어, Dharmacon, Inc., Lafayette, CO(Cat Nos. M-003162-03, MU-003162-03, D-003162-07 thru -10(siGENOME™, SMARTselection 및 SMARTpool®siRNAs 참조).
타겟 mRNA 서열의 일부와 실질적으로 동일한 적어도 하나의 서열을 포함하며, 말단에서 1-4개 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 오버행(overhang)을 최적으로 갖는, 길이가 49개 뉴클레오타이드 미만, 바람직하게 19-25개 뉴클레오타이드인 작은 dsRNA가 포유류에서 RNAi를 조정하는데 가장 효과적이라는 것이 최근 수립되었다. U.S. Patent Publication Nos. 20040038921 및 20040229266 참조. 그러한 dsRNA의 구성, 및 생체내에서 타겟 단백질의 발현을 침묵시키기 위한 약학적 제제에서의 용도는 그러한 공개문헌에 상세하게 기술되어 있다.
포유류에서 타겟팅된 유전자의 서열이 알려진 경우, 예를 들어 21-23 nt RNAs가 제조될 수 있으며, 이간 또는 다른 영장류 세포와 같은 포유류 세포에서 RNAi를 조정할 수 있는 능력에 대하여 시험될 수 있다. RNAi를 조정하는 것으로 나타내어진 그러한 21-23 nt RNA 분자는 그들의 생체내 효능을 더 평가하기 위하여, 원하는 경우 적합한 동물 모델에서 시험될 수 있다. 다른 핵산 분자, 예를 들어, 리보자임 또는 안티센스에 의한 연구에 기초하여 효과적인 타겟 부위인 것으로 결정된 공지의 타겟 부위, 또는 돌연변이 또는 결실을 함유하는 그 부위와 같은 질병 또는 상태와 관련되는 것으로 알려져 있는 타겟은 그러한 부위를 타겟팅하는 siRNA 분자를 설계하는데 이용될 수 있다.
대안으로, 효과적인 dsRNA의 서열은 예를 들어, 컴퓨터 폴딩 알고리즘을 이용함으로써 타겟 부위에 대하여 대상 타겟 mRNA를 합리적으로 설계/예측된 스크리닝을 할 수 있다. 타겟 서열은 custom Perl script, 또는 Oligo, MacVector, 또는 the GCG Wisconsin Package와 같은 상업적인 서열 분석 프로그램을 이용하여, 모든 단편, 또는 예를 들어 23개 뉴클레오타이드 단편인 서브서열의 리스트로 인실리코 분석될 수 있다.
다양한 파라미터가, 어떤 부위가 타겟 RAN 서열 내에서 가장 적합한 타겟 부위인지를 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 파라미터는 이차 또는 삼차 RNA 구조, 타겟 서열의 뉴클레오타이드 염기 조성물, 타겟 서열의 다양한 영역 사이의 상동성의 정도, 또는 RNA 전사물 내에서 타겟 서열의 상대적 위치를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 결정에 근거하여, 예를 들어, 시험관내 RNA 절단 분석, 세포 배양, 또는 동물 모델을 이용함으로써 효능에 대해 siRNA 분자를 스크리닝하기 위하여 RNA 전사물 내에서 임의의 수의 타겟 부위가 선택될 수 있다. 예를 들어, U.S. Patent Publication No. 20030170891 참조. RNAi 타겟 부위를 확인 및 선택하기 위한 알고리즘은 최근 기술되었다. U.S. Patent Publication No. 20040236517 참조.
통상적으로 이용되는 유전자 전달 기술은 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 전기천공 및 마이크로 주입 및 바이러스 방법을 포함한다(Graham et al.(1973) Virol. 52: 456; McCutchan et al.,(1968), J. Natl . Cancer Inst . 41: 351; Chu et al.(1987), Nucl . Acids Res . 15: 1311; Fraley et al .(1980), J. Biol . Chem . 255: 10431; Capecchi(1980), Cell 22: 479) 참조. DNA는 양이온성 리포좀을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다(Feigner et al.(1987), Proc . Natl . Acad . Sci USA 84: 7413). 상업적으로 이용가능한 양이온성 리피드 포뮬레이션은 Tfx 50(Promega Corp., Fitchburg, WI) 또는 Lipofectamin 200(Life Technologies, Carlsbad, CA)을 포함한다. 대안으로, 바이러스 벡터가 세포에 dsRNA를 전달하고, RNAi를 조정하기 위하여 채용될 수 있다. U.S Patent Publication No. 20040023390 참조.
포유류 세포에서 RNAi에 대한 형질 감염 및 벡터/발현 시스템은 상업적으로 이용가능하며, 잘 기술되어 있다. 예를 들어, Dharmacon, Inc.(Lafayette, CO), DharmaFECT™ system; Promega, Inc., siSTRIKE™ U6 Hairpin system 참조; 또한, Gou et al .(2003) FEBS . 548, 113-118; Sui, G. et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells (2002) Proc . Natl . Acad . Sci . 99, 5515-5520; Yu et al . (2002) Proc . Natl . Acad . Sci . 99, 6047-6052; Paul, C. et al .(2002) Nature Biotechnology 19, 505-508; McManus et al.(2002) RNA 8, 842-850 참조.
제조된 dsRNA 분자를 이용한 포유류에서의 siRNA 간섭은 포유류에 대해 dsRNA를 포함하는 약학적 제제를 투여함으로써 이루어질 수 있다. 약학적 조성물은 타겟 유전자의 발현을 억제하는데 충분한 투여량으로 투여된다. dsRNA는 1일에 체중 킬로그램당 5 mg 미만의 투여량으로 전형적으로 투여될 수 있으며, 타겟 유전자의 발현을 저해 또는 완전히 억제하는데 충분하다. 일반적으로 dsRNA의 적합한 용량은 1일에 수용자 체중 킬로그램당 0.01 내지 2.5 밀리그램의 범위이며, 바람직하게 1일에 수용자 체중 킬로그램당 0.1 내지 200 밀리그램의 범위이며, 더욱 바람직하게 1일에 수용자 체중 킬로그램당 0.1 내지 100 밀리그램의 범위이며, 더욱더 바람직하게 1일에 수용자 체중 킬로그램당 1.0 내지 50 밀리그램의 범위이며, 가장 바람직하게 1일에 수용자 체중 킬로그램당 1.0 내지 25 밀리그램의 범위이다. dsRNA를 포함하는 약학적 조성물은 1일에 한번, 또는 예를 들어 당해 기술분야에 잘 알려진 지연 방출 제제를 이용하여, 다수의 서브-용량으로 투여될 수 있다. 그러한 약학적 조성물의 제조 및 투여는 하기에 설명되는 바와 같이 표준 기술에 따라 수행될 수 있다.
그러한 dsRNA는 전술한 바와 같이 치료학적 유효량의 dsRNA를 포함하는 약학적 제제를 제조하고, 그러한 제제를 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 발현하는(예를 들어, 전장 ROS 단백질의 비정상적 발현 또는 ROS 융합 단백질의 발현과 같은) 폐암 또는 의심되는 폐암(예를 들어, NSCLC 또는 SCLC)을 갖는 인간 환자에게, 예를 들어 종양에 대한 직접 주사를 통해 투여함으로써, 암에서 ROS 발현 및 활성을 억제하는데 이용될 수 있다. siRNA 억제제를 이용하는, VEGFR 및 EGFR와 같은 다른 수용체 티로신 키나아제의 유사한 억제가 최근 기술되었다. U.S. Patent Publication No. 20040209832, U.S. Patent Publication No. 20030170891, 및 U.S. Patent Publication No. 20040175703 참조.
본 발명의 실시에 이용되는 ROS-억제 치료제는 경구 또는 복막 경로, 정맥내, 근육내, 복막내, 피하, 경피, 기관(에어로졸), 직장, 질 및 국부(구강 및 설하를 포함하는) 투여를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 임의의 수단에 의해 포유류에 대하여 투여될 수 있다.
경구 투여에 있어서, ROS-억제 치료제는 정제 또는 캡슐의 형태로, 분말 또는 과립으로서, 또는 수성 용액 또는 현탁액으로서 일반적으로 제공된다. 경구 이용을 위한 정제는 비활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 착색제 및 보존제와 같은 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제와 혼합된 활성 성분을 포함할 수 있다. 적합한 비활성 희석제는 소듐 및 칼슘 카보네이트, 소듐 및 칼슘 포스페이트, 및 락토오스를 포함하며, 옥수수 전분 및 알긴산은 적합한 붕해제이다. 결합제는 전분 및 젤라틴을 포함할 수 있으며, 존재하는 경우 윤활제는 일반적으로 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 또는 탈크이다. 원하는 경우, 정제는 위장관에서의 흡수를 지연시키기 위하여 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 물질로 코팅될 수 있다.
경구 이용을 위한 캡슐은 활성 성분이 고체 희석제와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐, 및 활성 성분이 물, 또는 땅콩유, 액체 파라핀, 또는 올리브유와 같은 오일과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐을 포함한다. 근육내, 복막내, 피하 및 정맥내 이용을 이하여, 본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 적합한 pH 및 등장성으로 버퍼링된 멸균 수성 용액 또는 현탁액으로 제공된다. 적합한 수성 비히클은 링거 용액(Ringer's solution) 및 등장성 소듐 클로라이드를 포함한다. 담체는 수성 버퍼로 배타적으로 이루어질 수 있다("배타적으로"는 ROS-억제 치료제의 흡수에 영향을 미치거나 흡수를 조정할 수 있는 보조제 또는 캡슐화 물질이 존재하지 않는 것을 의미한다). 그러한 물질은 후술하는 바와 같이 리포좀 또는 캡시드와 같은 예를 들어 교질입자(micellar) 구조를 포함한다. 수성 현탁액은 셀룰로오스 유도체, 소듐 알기네이트, 폴리비닐-피롤리돈 및 검 트라간트와 같은 현탁제, 및 레시틴과 같은 습윤제를 포함할 수 있다. 수성 현탁액을 위한 적합한 보존제는 에틸 및 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트를 포함한다.
ROS-억제 치료제 조성물은 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제와 같은, 신체로부터 신속한 제거에 대하여 치료제(예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 dsRNA 화합물 또는 항체)를 보호하기 위한 캡슐화된 제제를 포함할 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성 생체적합성 폴리머가 이용될 수 있다. 그러한 제제의 제조 방법은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 재료는 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc로부터 상업적으로 얻어질 수 있다. 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대하여 모노클로날 항체로 감염된 세포에 대하여 타겟팅된 리포좀을 포함하는)이 약학적으로 허용가능한 담체로 이용될 수 있다. 이는 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 알려진 방법, 예를 들어, S. Pat. No. 4,522,811; PCT publication WO 91/06309; 및 European patent publication EP-A-43075에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 캡슐화된 제제는 바이러스 코팅(viral coat) 단백질을 포함할 수 있다. 바이러스 코팅 단백질은 폴리오마 바이러스와 같은 바이러스로부터 유래되거나, 이와 관련될 수 있으며, 부분적으로 또는 전체적으로 인공일 수 있다. 예를 들어, 코팅 단백질은 폴리오마 바이러스의 Virus Protein 1 및/또는 Virus Protein 2, 또는 그 유도체일 수 있다.
ROS-억제 치료제는 대상에 대한 투여를 위하여, 리포좀, 담체, 및 희석제 및 그의 염을 포함하는 전달 비히클을 포함할 수 있으며, 및/또는 약학적으로 허용가능한 제제로 존재할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자의 전달을 위한 방법은 Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio ., 2, 139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akbtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol . Membr . Biol ., 16, 129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb . Exp . Pharmacol ., 137, 165-192; 및 Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192 참조. U.S. Pat. No. 6,395,713 및 PCT Publication No. WO 94/02595는 핵산 분자를 전달하는 일반적인 방법을 더 기술한다. 이러한 프로토콜은 임의의 핵산 분자의 가상 전달을 위하여 이용될 수 있다.
ROS-억제 치료제(즉, 치료제로 투여되는 ROS-억제 화합물)은 리포좀내에서 캡슐화, 이온토포레시스(iontophoresis)에 의해, 또는 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐 및 생부착성 마이크로스피어와 같은 다른 비히클로의 결합에 의해, 또는 단백질 벡터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법에 의해 포유류 종양에 투여될 수 있다(PCT Publication No. WO 00/53722 참조). 대안으로, 치료제/비히클 조합은 직접 주사에 의해, 또는 인퓨전 펌프의 이용에 의해 국부적으로 전달된다. 피하, 근육내 또는 피내이든지 간에, 조성물의 직접 주사는 표준 바늘 및 시린지 방법론을 이용하여, 또는 Conry et al., 1999, Clin . Cancer Res ., 5, 2330-2337 및 PCT Publication No. WO 99/3 1262에 기재된 것과 같이 바늘이 없는 기술에 의해 행해질 수 있다.
ROS-억제제 치료제의 약학적으로 허용가능한 제제는 전술한 화합물의 염, 예를 들어, 산 부가염, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 아세트산 및 벤젠설폰산의 염을 포함한다. 약리학적 조성물 또는 제제는 세포, 또는 예를 들어 인간을 포함하는 환자에 대한 투여, 예를 들어 전신 투여에 적합한 형태의 조성물 또는 제제를 나타낸다. 적합한 형태는 부분적으로, 용도 및 도입 경로, 예를 들어, 경구, 경피 또는 주사에 의한 경로에 따라 달라진다. 그러한 형태는 조성물 또는 제제가 타겟 세포에 도달하는 것을 막지 않아야 한다. 예를 들어, 혈류내로 주입된 약리학적 조성물은 가용성이어야 한다. 다른 인자는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 조성물 또는 제제가 그 효과를 발휘하는 것을 막는 독성 및 형태와 같은 고려사항을 포함한다.
전신 흡수(예를 들어, 혈류 내에 약물의 전신 흡수 또는 축적 후에 신체 전체적으로 분포되는 것)에 이르게 되는 투여 경로가 바람직하며, 정맥내, 피하, 복막내, 흡입, 경구, 폐내, 및 근육내를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 투여 경로의 각각은 접근가능한 질병이 있는 조직 또는 종양에 ROS-억제 치료제를 노출시킨다. 순환계로의 약물 도입 속도는 분자량 또는 크기의 함수로 나타내어진다. 리포좀 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 다른 약물 담체의 이용은 세망내피계(reticular endothelial system, RES)의 조직과 같은, 예를 들어 일부 조직 형태에서, 약물을 잠재적으로 국부화시킬 수 있다. 림프구 및 마크로파지와 같은 세포 표면과 약물의 회합(association)을 용이하게 할 수 있는 리포좀 제제도 유용하다. 이러한 접근은 암 세포와 같은 비정상적 세포의 마크로파지 및 림크구 면역 인식의 특이성을 이용함으로써 타겟 세포에 대한 약물의 증강된 전달을 제공할 수 있다.
"약학적으로 허용가능한 제제"는 그의 바람직한 활성에 대하여 가장 적합한 물리적 위치에 본 발명의 핵산 분자를 효과적으로 분포시키도록 하는 조성물 또는 제제를 의미한다. 본 발명의 핵산 분자를 갖는 제제에 적합한 비제한적 예는 CNS로의 약물 도입을 증강시킬 수 있는 P-글리코단백질 억제제(Pluronic P85와 같은)(Jolliet-Riant and Tillement, 1999, Fundam . Clin . Pharmacol ., 13, 16-26); 뇌내 이식 후 지연된 방출 전달을 위한 폴리(DL-락티드-코글리콜리드) 마이크로파지와 같은 생분해성 폴리머(Emerich et al, 1999, Cell Transplant , 8, 47-58)(Rosermes, Inc. Cambridge, Mass.); 및 혈액뇌장벽을 가로질러 약물을 전달할 수 있고, 뉴런 흡수 메커니즘을 변화시킬 수 있는 폴리부틸시아노아크릴에티으로 만들어진 것과 같은 탑재된 나노입자(loaded nanoparticles)(Prog Neuro -psychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999)를 포함한다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 ROS-억제 화합물의 전달 전략의 다른 비제한적 예는 iBoado et al., 1998, J. Pharm . Sci ., 87, 1308-1315; Tyler et al., 1999, FEBS Lett ., 421, 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA ., 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev ., 15, 73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res ., 26, 4910-4916; 및 Tyler et al ., 1999, PNAS USA ., 96, 7053-7058 에 기재된 물질을 포함한다.
폴리(에틸렌글리콜) 리피드(PEG-변형된, 또는 긴-순환 리포좀 또는 스틸스 리포좀(stealth liposomes))를 함유하는 표면-변성된 리포좀을 포함하는 치료적 조성물도 본 발명의 방법에 적합하게 채용될 수 있다. 이러한 제제는 타겟 조직엥서 약물의 축적을 증가시키는 방법을 제공한다. 이러한 분류의 약물 담체는 단핵 식세포 시스템(mononuclear phagocytic system(MPS 또는 RES))에 의한 옵소닌 작용 및 제거에 저항함으로써, 더 긴 혈액 순환, 및 캡슐화된 약물에 대한 증강된 조직 노출을 가능하게 한다(Lasic et al. Chem . Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem . Pharm . Bull. 1995, 43, 1005-1011 참조). 그러한 리포좀은 아마 혈관소생된(neovascularized) 타겟 조직에서의 분출 및 포획에 의해, 종양에서 선택성을 축적하는 것으로 나타내어졌다(Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim . Biophys . Acta, 1238, 86-90 참조). 긴-순환 리포좀은 특히 MPS의 조직에 축적되는 것으로 알려진 통상적인 양이온성 리포좀에 비하여, DNA 및 RNA의 약역학 및 약동학을 증강시킨다(Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; PCT Publication No. WO 96/10391; PCT Publication No. WO 96/10390; and PCT Publication No. WO 96/10392 참조). 긴-순환 리포좀은 간 및 비장과 같은 대사적으로 공격적인 MPS 조직에서의 축적을 피할 수 있는 능력에 기인하여, 양이온성 리포좀에 비하여 더 큰 정도로 뉴클레아제 분해로부터 약물을 보호하기 쉽다.
치료 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제에 약학적 유효량의 바람직한 화합물을 포함할 수 있다. 치료 용도를 위하여 적합한 담체 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다. 예를 들어, 보존제, 안정화제, 염료 및 풍미제가 제공될 수 있다. 이는 소듐 벤조에이트, 소르브산, p-하이드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 또한, 항산화제 및 현탁제도 이용될 수 있다.
일부 실시형태에서, ROS-억제 치료제 및/또는 ALK/ROS-억제 치료제가 유효량으로 투여된다. "유효량" 또는 "유효 용량"은 질병 상태(예를 들어, 폐암)의 예방, 발생 억제, 또는 치료(어느 정도의 증상, 바람직하게는 증상의 전부의 완화)하는데 요구되는 치료학적 양을 의미한다. 유효 용량은 질병의 형태, 이용되는 치료제, 투여 경로, 치료되는 포유류의 형태, 고려되어야 하는 특이적 포유류의 신체적 특성, 동시에 투여되는 의약, 및 의학 분야의 통상의 기술자가 인정하는 다른 인자에 따라 달라진다. 일반적으로, 유효량은 1일에 체중 킬로그램당 0.1 mg 내지 100 mg 범위의 양이며, 활성제는 음전하를 갖는 폴리머의 효능에 따라 투여된다.
1일에 체중 킬로그램당 약 0.1 mg 내지 약 140 mg 정도의 투여량 수준이 전술한 조건의 치료에 이용될 수 있다(1일에 환자당 약 0.5 mg 내지 약 7 g). 단일 제형을 제조하기 위하여 담체 물질과 결합될 수 있는 활성제의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 모드에 따라 달라진다. 단위 투여량(Dosage unit)은 활성제 약 1 mg 내지 약 500 mg을 형성한다. 임의의 특정 환자에 대한 특이적 용량 수준은 채용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 분리 속도, 약물 조합 및 치료가 진행되는 특정 질명의 심각성을 포함하는 다수의 인자에 따라 달라지는 것으로 이해된다.
인간이 아닌 동물에 대한 투여에 있어서, 조성물은 동물 사료 또는 음료수에 첨가될 수 있다. 동물 사료 및 음료수 조성물을, 동물이 그 식이와 함께 이론적으로 적합한 양의 조성물을 섭취하도록 제제화하는 것이 편리할 수 있다. 사료 또는 음료수에의 첨가를 위한 프리믹스로서 조성물을 제공하는 것이 편리할 수 있다.
본 발명의 실시예 이용될 수 있는 ROS-억제 치료제는 전술한 바와 같은 단일 화합물, 또는 동일한 분류의 억제제이든지(예를 들어, 항체 억제제) 또는 다른 분류인든지(예를 들어, 항체 억제제 및 소분자 억제제), 다수 화합물의 조합을 포함할 수 있다. 그러한 화합물의 조합은 융합 단백질-발현 암의 진행을 억제하는데 있어 전체적인 치료 효과를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 치료 조성물은 Pfizer, Inc.(U.S. Pub. No. 2008/0300273 참조)에 의해 생산되는 크리조티닙(PF-02341066로도 알려짐)과 같은 소분자 억제제 단독, 또는 Sakamoto et al., Cancer Cell 19: 679-690, 2011에 기재된 CH5424802 화합물과 같은, ROS 활성을 타겟팅하는 다른 크리조티닙 유사체 및/또는 ROS의 소분자 억제제와의 조합일 수 있다. 치료 조성물은 일 이상의 타겟팅된 억제제에 더해 일 이상의 비-특이적 화학치료제를 포함할 수 있다. 그러한 조합은 많은 암에서 상승적인 종양 살인 효과를 제공하는 것으로 최근에 나타내어졌다. 생체내에서 ROS 활성 및 종양 성장을 억제하는데 있어 그러한 조합의 효과는 하기에서 평가될 수 있다.
본 발명은 부분적으로, 화합물이 암에서 폴리펩타이드의 ROS 키나아제 활성을 억제하는지 여부를 결정함으로써, 화합물이 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 특성화되는 암(예를 들어, 폐암)의 진행을 억제하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, ROS의 활성의 억제는 골수, 혈액 또는 종양으로부터의 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 검사함으로써 결정된다. 다른 실시형태에서, ROS의 활성의 억제는 ROS 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약(예를 들어, ROS-특이적 항체) 또는 ROS 폴리펩타이드-코딩 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 시약(예를 들어, SiRNA 또는 ROS 안티센스)을 이용하여 결정된다.
시험된 화합물은 전술한 바와 같은 임의의 형태의 치료제 또는 조성물일 수 있다. 시험관내 및 생체내에서 화합물의 효능을 평가하는 방법은 당해 기술분야에서 잘 수립되고 알려져 있다. 예를 들어, 조성물은 ROS 키나아제가 활성화되는 세포 또는 세포 추출물을 이용하여 시험관내에서 ROS를 억제할 수 있는 능력에 대하여 시험될 수 있다. 화합물 패널이 ROS에 대한 화합물의 특이성(EGFR 또는 PDGFR과 같은 다른 타겟과 반대로)을 시험하기 위하여 채용될 수 있다.
이용될 수 있는 약물 스크리닝의 다른 기술은 PCT Publication No. W0 84/03564에 기재된 바와 같이 대상 단백질에 대한 적합한 결합 친화도를 갖는 화합물의 대량고속 스크리닝을 제공한다. 이 방법에서, ROS 활성을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, 전장 ROS 단백질 또는 다수의 ROS 융합 단백질의 하나)에 적용된, 다수의 상이한 소형 시험 화합물은 플라스틱 핀 또는 일부 다른 표면과 같은 고체 기질 상에서 합성된다. 시험 화합물은 본 발명의 폴리펩타이드, 또는 그 단편과 반응하고, 세척된다. 결합된 폴리펩타이드(예를 들어, SLC34A2-ROS(VS), SLC34A2-ROS(S), SLC34A2-ROS(L), CD74-ROS, FIG-ROS(S), FIG-ROS(L), 또는 FIG-ROS(XL) 융합 폴리펩타이드 또는 전장 ROS 폴리펩타이드)는 당해 기술분야에 잘 알려진 방법에 의해 검출된다. 정제된 폴리펩타이드는 전술한 약물 스크리닝 기술에 이용되기 위하여 직접적으로 플레이트상에 코팅될 수 있다. 대안으로, 비-중화 항체는 펩타이드를 포획하고 이를 고형 지지체 상에 고정화하기 위하여 이용될 수 있다.
시험관내 ROS 활성의 효과적인 억제제로 발견된 화합물은 예를 들어 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 발현하는 인간 폐, 간, 췌장, 신장, 폐, 또는 결장을 함유하는 포유류 이종이식편을 이용하여, 생체내에서, 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 발현하는 암(폐암, 똔느 간암, 폐암, 결장암, 신장암, 또는 췌장암과 같은 다른 암)의 진행을 억제할 수 있는 능력에 대하여 시험될 수 있다. 이 과정에서, ROS 키나아제 활성을 갖는 단백질(예를 들어, 전장 ROS 또는 ROS 융합 단백질의 하나)을 발현하는 것으로 알려진 암 세포주는 동물에서 피하에 위치할 수 있다(예를 들어, 누드 또는 SCID 마우스, 또는 다른 면역-손상된 동물로). 이어서, 세포는 육안으로 모니터링될 수 있는 종양 덩어리로 성장한다. 이어서, 동물은 약물로 치료될 수 있다. 종양 크기에 대한 약물 치료의 효과는 외부적으로 관찰될 수 있다. 이어서, 동물을 희생하고, 종양을 IHC 및 웨스턴 블롯에 의한 분석을 위하여 제거한다. 유사하게, 포유류 골수 이식물이 ROS 키나아제 활성을 갖는 단백질을 발현하는 혈액 종양에서 약물 반응을 검사하기 위하여 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방식으로, 약물의 효과는 환자에 가장 근접하게 닯은 생물학적 세팅에서 관찰될 수 있다. 종양 세포에서 또는 기질 세포 주위에서 신호전달을 변화시킬 수 있는 약물의 능력은 인산화-특이적 항체에 의한 분석으로 결정될 수 있다. 세포사의 유도 또는 세포 증식의 억제에 있어서 약물의 효능은 절단된 카르파제 3 및 절단된 PARP와 같은 아포토시스 특이적 마커에 의해 관찰될 수 있다.
그러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 예를 들어 LD50(집단의 50%에 대하여 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위하여, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효능 사이의 용량비는 치료지수이며, 비 LD50/ED50로 표현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화합물은 높은 치료 지수를 나타내다.
화합물이 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)의 존재에 의해 특성화되는 종양의 진행을 억제하는지 여부를 결정하기 위한 개시된 방법의 실시에 있어서, 포유류 이종이식편(또는 골수 이식물)으로부터의 세포를 포함하는 생물학적 샘플은 유리하게 채용될 수 있다. 비제한적 이종이식편(또는 이식 수용자)는 ROS 키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, ROS 융합 폴리펩타이드(CD74-ROS 또는 FIG-ROS(S)와 같은) 또는 전장 ROS)를 발현하는 인간 종양(또는 백혈병)을 함유하는 생쥐와 같은 소형 포유류이다. 인간 종양을 함유하는 이종이식편은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며(Kal, Cancer Treat Res . 72: 155-69(1995)), 인간 종양을 함유하는 포유류 이종이식편의 제조는 잘 기술되어 있다(Winograd et al ., In Vivo . 1(1): 1-13(1987) 참조). 유사하게 골수 이식 모델의 생성 및 이용은 잘 기술되어 있다(예를 들어, Schwaller, et al., EMBO J. 17: 5321-333(1998); Kelly et al ., Blood 99: 310-318(2002) 참조).
하기 실시예는 본 발명을 더 설명하기 위하여 제공되며, 첨부된 청구항에 제공되는 것을 제외하고 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 본 발명은 당해 기술분야의 통상의 지식을 갖는 자에게 명백할 것인 본 명세서의 교시의 변형 및 변화를 포함한다. 참조된 재료, 시약 등은 다르게 언급되지 않으며 상업적 소스로부터 얻어질 수 있다.
실시예 1
글로벌 포스포펩타이드 프로파일링( Global Phosphopeptide Profiling )에 의한 NSCLC 세포주에서 ROS 키나아제 활성의 확인
HCC78를 포함하는 몇몇 인간 NSCLC 세포주에서 키나아제 활성화의 글로벌 인산화 프로파일이 복합체 혼합물로부터 변형된 펩타이드의 분리 및 질량분광분석 특성화를 위하여 IAP 기술을 이용하여 시험되었다(U.S. Patent Nos. 7,300,753 및 7,198,896 참조). IAP 기술은 NSCLC 세포주의 추출물로부터 포스포티로신-함유 펩타이드를 분리 및 이어서 특성화하기 위하여, 포스포티로신-특이적 항체(Cell Signaling Technology, Inc., Danver, MA, Cat. #9411로부터 상업적으로 이용가능함)을 이용하여 수행되었다.
특히, 이 질병의 새로운 유도자를 확인하기 위하여, IAP 접근은 NSCLC 세포주에서 활성화된 티로신 키나아제의 확인을 용이하게 하도록 채용되었다.
세포 배양.
HCC78 세포는 DSMZ(the German National Resource Centre for Biological Material)로부터 얻어지고, 10% 소태아혈청(FBS)(Sigma)을 갖는 RPMI-1640 배지(Invitrogen)에서 성장되었다.
포스포펩타이드 면역침전.
총 2 x 108개의 세포가 1.25 x 108 세포/ml에서 우레아 라이시스 버퍼(20mM HEPES pH 8.0, 9M 우레아, 1 mM 소듐 바나데이트, 2.5 mM 소듐 파이로포스페이트, 1mM 베타-글리세로포스페이트)에서 용해되고, 초음파처리되었다. 초음파처리된 용해물은 20,000 x g에서 원심분리에 의해 맑아졌고, 단백질은 이전에 기술된 바와 같이 감소 및 알킬화되었다(Rush et al., Nat. Biotechnol. 23(1): 94-101(2005) 참조). 샘플은 20 mM HEPES pH 8.0로 2M의 최종 우레아 농도까지 희석되었다. to ation of 2M. 트립신(1mg/ml in 0.001 M HCl)이 맑아진 용해물에 1:100 v/v로 첨가되었다. 샘플은 하룻밤동안 실온에서 소화되었다.
소화 후에, 용해물은 1% TFA의 최종 농도로 산성화되었다. 펩타이드 정제는 이전에 기술된 바와 같이 Sep-Pak C18 컬럼을 이용하여 수행되었다(Rush et al., supra. 참조). 정제 후에, 모든 용리액(0.1% TFA 중 8%, 12%, 15%, 18%, 22%, 25%, 30%, 35% 및 40% 아세토니트릴)이 합쳐지고 동결건조되었다. 건조된 펩타이드는 1.4 ml MOPS buffer(50 mM MOPS/NaOH pH 7.2, 10 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl)에 재현탁되고, 불용성 물질은 10분 동안 12,000 x g에서 원심분리함으로써 제거되었다.
복수로부터의 포스포티로신 모노클로날 항체 P-Tyr-100(Cell Signaling Technology)는 4℃에서 하룻밤동안 4 mg/ml 비드에서 단백질 G 아가로스 비드(ROche)에 비공유적으로 결합되었다. 결합 후에, 항체-수지는 PBS로 2회, MOPS buffer로 3회 세척되었다. 고정화된 항체(40 ㎕, 160℃)는 MOPS IP buffer에서 1:1 슬러리로서 가용화된 펩타이드 분획에 첨가되었고, 혼합물을 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 고정화된 항체 비드는 MOPS buffer로 3회, ddH2O로 2회 세척되었다. 펩타이드는 각 20분 동안 40 ㎕의 0.15% TFA에 의해 배양됨으로써 비드로부터 2회 용리되었고, 분획물이 합쳐졌다.
LC - MS / MS 질량분석법에 의한 분석.
IP 용리액(40 ㎕) 중의 펩타이드는 농축되고, Stop and Go extraction tips (StageTips)을 이용하여 용리된 항체로부터 분리되었다(Rappsilber et al., Anal. Chem., 75(3): 663-70(2003) 참조). 펩타이드는 1 ㎕의 60% MeCN, 0.1% TFA을 갖는 마이크로컬럼으로부터 7.6 ㎕의 0.4% 아세트산/0.005% 펩타플루로오부티르산(HFBA)으로 용리되었다. 샘플은 비활성 샘플 주입 밸브(Dionex)를 구비한 Famos autosampler를 이용하여 Magic C18 AQ 역상 수지(Michrom Bioresources)가 패킹된 10 cm x 75 ㎛ PicoFrit capillary column(New Objective)에 적재되었다. 컬럼에 280 nl/min로 전달되는 0.4% 아세트산 중의 아세토니트릴, 0.005% HFBA의 45-분 선형 경사가 전개되었다(Ultimate, Dionex).
이중질량 스펙트럼이 탑-4 방법, 1의 동적 배제 반복 계수(dynamic exclusion repeat count), 및 0.5분의 반복 지속시간을 이용하여 LCQ Deca XP Plus ion trap mass spectrometer(ThermoFinnigan)에 의해 데이터 의존적 방식으로 수집되었다.
데이터베이스 분석 및 배치.
MS/MS 스펙트럼은 TurboSequest(ThermoFinnigan)(BioWorks 3.0의 일부로서 공급되는 Sequest Browser package(v. 27, rev. 12)에서)를 이용하여 평가되었다. 개별적인 MS/MS 스펙트럼은 하기 세팅에 의해 Sequest Browser program CreateDta을 이용하여 원데이터로부터 추출되었다: 하부 MW, 700; 상부 MW, 4,500; 최소 이온 수, 20; 최소 TIC, 4 x 105; 및 전구체 전하 상태, 비특이적. 용리 경사의 마지막에 대한 샘플 주입 전에 스펙트럼은 원데이터 파일의 처음으로부터 추출되었다. IonQuest 및 VuDta 프로그램은 Sequest 분석을 위한 MS/MS 스펙트럼을 더 선택하기 위하여 사용되지 않았다. MS/MS 스펙트럼은 하기 TurboSequest 파라미터에 의해 평가되었다: 펩타이드 질량 내성(mass tolerance), 2.5; 단편 이온 내성(ion tolerance), 0.0; 변형 당 차이나는 아미노산의 최대 수(maximum number of differential amino acids per modification), 4; mass type parent, 평균; mass type frament, 평균; 내부 절단 부위의 최대 수, 10; b 및 y 이온으로부터 물 및 암모니아의 중성 손실은 상관관계 분석에서 고려되었다. 단백질분해효소는 엘라스타제 소화로부터 수집된 스펙트럼을 제외하고 특정되었다.
동적 변형으로서 산화된 메티오닌(M+16) 및 인산화(Y+80)를 가능하게 하는, 27,175개 단백질을 함유하는 2004년 8월 24일에 공개된 NCBI 인간 데이터베이스에 대하여 검색이 이루어졌다.
실제로 단백질이 샘플 내에 존재하는 것을 나타내기 위하여, 프로테오믹 연구에서, 하나의 실험 결과에서의 단일 펩타이드의 발견에만 기초하여 단백질 확인을 입증하는 것이 바람직하다. 이는, 아직 전세계적으로 받아들여지지 않는 펩타이드 입증을 위한 통계적 방법, 및 이 실시예가 따르고 있는 단백질 및 펩타이드 확인 결과의 공개를 위한 가이드라인의 개발에 이르렀다(Carr et al., Mol. Cell Proteomics 3: 531-533(2004) 참조). 그러나, 면역친화성 전략이 인산화된 펩타이드를 비인산화된 펩타이드로부터 분리하기 때문에, 많은 인산화된 단백질이 단지 하나의 티로신-인산화 부위를 가지므로 단백질로부터 단지 하나의 포스포펩타이드를 관찰하는 것은 공통된 결과이다.
이러한 이유로, 포스포펩타이드 배치를 확인하기 위하여 추가적인 기준을 이용하는 것이 적합하다. 이러한 추가적인 기준의 어느 것이 하기 기준을 만족하는 경우, 배치는 정확할 것 같다: (i) MS/MS 스펙트럼은 전하 상태에 따라 현저하게 변화되므로, 동일한 서열은 상이한 전하 상태를 갖는 이온을 공동용리하도록 배치된다; (ii) 부위는, 불완전한 단백질 분해 또는 트립신 이외의 프로테아제의 이용으로부터의 서열 오버랩에 기인하여 2 이상의 펩타이드 서열에서 발견된다; (iii) 부위는, 상동성이지만 동일하지는 않은 단백질 동형에 기인하여 2 이상의 ㅍ베타이드 서열에서 발견된다; (iv) 부위는, 종 간의 상동성이지만 동일하지는 않은 단백질에 기인하여 2 이상의 펩타이드 서열에서 발견된다; 및 (v) 이온 트랩 질량 분광광도계는 매우 재현성 있는 MS/MS 스펙트럼을 생성하므로, 부위는, 배치된 서열에 상응하는 합성 포스포펩타이드의 MS/MS 분석에 의해 입증된다. 마지막 기준은 특정한 대상의 신규한 부위 배치(site assignments)를 확인하기 위하여 일상적으로 채용된다.
Sequest에 의해 이루어지는 모든 스펙트럼 및 모든 서열 배치는 상관관계에 있는 데이터베이스로 불려졌다. 배치된 서열은 보존적 2단계 과정에 따라 수용 또는 거부되었다. 제1 단계에서 높은 스코어 서열 배치의 서브셋은, 10의 최대 RSp 값 을 가능하게 하는, 전하 상태 +1에 대하여 적어도 1.5, +2에 대하여 2.2 및 +3에 대하여 3.3인 XCorr 값에 대하여 필터링함으로써 선택되었다. 이 서브셋에서의 배치는 하기 기준이 만족되는 경우 거부되었다: (i) 스펙트럼은, a, b, 또는 y 이온으로서, a, b, 또는 y 이온으로부터 물 또는 암모니아의 중성-손실에 의하여 야기된 이온으로서, 또는 다중으로 양자화된 이온으로서 배치된 서열에 맵핑될 수 없는, 적어도 하나의 주요 피크(스펙트럼에서 가장 강한 이온의 적어도 10% 만큼 강한)를 함유한다; (ii) 스펙트럼은 적어도 6개의 연속적인 잔기에 동등한 b 또는 y 이온의 시리즈를 함유하지 않는다; 또는(iii) 서열은 우리가 수행하였던 모든 연구에서 적어도 5회 관찰되지 않았다(불완전 단백질 분해 또는 트립신 이외의 프로테아제 이용에 의한 중첩된 서열 제외). 두 번째 단계에서, 낮은 스코어 스펙트럼이 진정한 레퍼런스 라이브러리-검색 전략을 자극하는, 다른 연구에서 수집된 높은 스코어 스펙트럼과 높은 정도의 유사성을 나타내는 경우, 역치 이하 스코어(below-threshold scores)를 갖는 배치는 수용되었다. 배치된 서열(여기에서 나타내어지지 않음)의 최종 리스트를 뒷받침하는 모든 스펙트럼은 그 신뢰도를 수립하기 위하여 적어도 3명의 과학자에 의해 리뷰되었다.
전술한 IAP 분석에 의해, 454 비-과잉의(non-redundant) 포스포티로신-함유 펩타이드, 395 포스포티로신 부위, 및 240 티로신 인산화 단백질이 확인되었으며, 그 대부분은 신규한 것이며, HCC78 세포로부터의 것이다(데이터는 나타내어지지 않음). 티로신 인산화 키나아제 중에서, 검출된 몇몇은 ROS 키나아제를 포함하는, 다른 NSCLC 세포주에서의 MS 분석에 의하여 정상적으로 검출되지 않는다(비발표된 데이터).
실시예 2
글로벌 포스포펩타이드 프로파일링을 이용한 인간 암 샘플에서 돌연변이 ROS 키나아제 발현의 글로벌 검출
인간 NSCLC에서 ROS 융합 돌연변이의 발생 정도를 더 확인하기 위하여, 몇몇 인간 NSCLC 종양이, 전술한 글로벌 포스포페타이드 프로파일링의 IAP 기술을 이용하여(실시예 1 참조) 시험되어, 이러한 종양에서 ROS 포스펩타이드를 확인하였다. 종양 샘플(액체 질소에서 동결 및 보존된 절개된 종양 스냅(snap))은 중국에서의 임상 공동연구자로부터 얻어졌다(Second Xiangya Hospital, Central South University Changsha, Hunan, P.R. China).
요약하면, 약 300 밀리그램-500 밀리그램의 종양 조직이 균질화되었다. 예를 들어, 조직은 1.25 x 108 세포/ml로 우레아 라이시스 버퍼(20mM HEPES pH 8.0, 9M 우레아, 1 mM 소듐 바나데이트, 2.5 mM 소듐 파이로포스페이트, 1mM 베타-글리세로포스페이트)에서 균질화 및 용해되었고, 초음파처리되었다. 초음파처리된 용해물은 20,000 x g에서의 원심분리에 의해 맑아졌고, 단백질은 전술한 바와 같이 감소 및 알킬화되었다(Rush et al., Nat. Biotechnol. 23(1): 94-101(2005) 참조). 샘플은 20 mM HEPES pH 8.0에 의해 최종 우레아 농도 2M까지 희석되었다. 트립신(1mg/ml in 0.001 M HCl)은 1:100 v/v로 맑아진 용해물에 첨가되었다. 샘플은 실온에서 하룻밤동안 소화되었다.
이 샘플의 글로벌 포스포티로신 프로파일링은 전술한 실시예 1에 기재된 것과 같이 수행되었다. 프로파일링의 결과는, 종양 샘플의 하나가 ROS 포스포-펩타이드 및 SLC34A2 포스포-펩타이드를 모두 가지며(표 1 하부 참조(다른 검출된 포스포펩타이드는 나타내어지지 않음), 또한 IRS-1 및 IRS-2 포스포펩타이드와 같은 다운스트림 분자를 가졌다. 이 종양의 티로신 프로파일링 시그니처는 예측되는 바와 같이 NSCLC 세포주HCC78와 매우 유사하다(표 3 참조). FISH 분석은 종양이 ROS 전좌를 가짐을 나타내었다(하기 실시예 10 참조). RT-PCR, DNA 시퀀싱 분석은 이 환자(및 ROS 전좌를 함유하는 다른 환자)에서의 ROS 활성화가 SLC34A2/ROS의 비정상적 전사에 의한 것임을 더 확인하는데 이용될 수 있다.
인간 NSCLC 종양의 포스포펩타이드 프로파일링.
명칭 Accession 부위 펩타이드 SEQ ID NO. HCC78
(세포주)		 cs042
(종양)
ROS P08922 1923 GLAAGVGLANACyAIHTLPTQEEIENLPAFPR
35		 1 1
ROS P08922 2110 DIyKNDYYR; DIyKNDYyR; DIyKNDyYR; DIyKNDyyRKRGEGLLPVR 36; 37 12 4
ROS P08922 2114 DIYKNDyYR; DIyKNDyYR; DIyKNDyyRKRGEGLLPVR 36;
37		 11 3
ROS P08922 2115 DIyKNDYyR; DIyKNDyyRKRGEGLLPVR 36;
37		 1 1
ROS P08922 2274 EGLNyMVLATECGQGEEK; NREGLNyMVLATECGQGEEK; EGLNyMVLATECGQGEEKSEGPLGSQESESCGLR; NREGLNyMVLATECGQGEEKSEGPLGSQESESCGLR 38;
39;
40;
41		 20
ROS P08922 2323 QVAyCPSGKPEGLNYACLTHSGYGDGSD; QVAyCPSGKPEGLNYACLTHSGyGDGSD; QVAyCPSGKPEGLNyACLTHSGYGDGSD 42 4 1
ROS P08922 2334 QVAYCPSGKPEGLNyACLTHSGYGDGSD; QVAYCPSGKPEGLNyACLTHSGyGDGSD; QVAyCPSGKPEGLNyACLTHSGYGDGSD 42 7 2
ROS P08922 2342 QVAYCPSGKPEGLNyACLTHSGyGDGSD; QVAyCPSGKPEGLNYACLTHSGyGDGSD 42 3
IRS-1 P35568 612 GGHHRPDSSTLHTDDGyMPMSPGVAPVPSGR 43 1
IRS-1 P35568 632 KGSGDyMPMSPK 44 2 1
IRS-1 P35568 662 VDPNGyMMMSPSGGCSPDIGGGPSSSSSSSNAVPSGTSYGK 45 3
IRS-2 Q9Y4H2 598 QRPVPQPSSASLDEyTLMR 46 1
IRS-2 Q9Y4H2 653 SSSSNLGADDGyMPMTPGAALAGSGSGSCR 47 4 5
IRS-2 Q9Y4H2 675 SDDyMPMSPASVSAPK 48 3 4
IRS-2 Q9Y4H2 742 ASSPAESSPEDSGyMR 49 3 3
IRS-2 Q9Y4H2 823 APYTCGGDSDQyVLMSSPVGR; SYKAPYTCGGDSDQyVLMSSPVGR 50 2 5
SLC34A2 O95436 54 IELLPSySTATLIDEPTEVDDPWNLPTLQDSGIK 51 1 1
실시예 3
NSCLC 세포주에서 ROS 키나아제 발현의 웨스턴 블롯 분석
HCC78 NSCLC 세포주 -그러나, 다른 NSCLC 세포주는 아님- 가 활성화된 ROS 키나아제를 발현한다는 관찰은 ROS 및 다른 수용체 티로신 키나아제(RTKs), 및 다운스트림 키나아제에 특이적인 항체를 이용하는 세포 추출물의 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다.
HCC78 세포는 프로테아제 Arrest™(G Biosciences)가 보충된 1 x 세포 라이시스 버퍼(Cell Signaling Technology)에서 용해되고, 전기영동에 의해 분리되었다. 면역블롯팅을 위한 모든 항체 및 시약은 Cell Signaling Technology, Inc.(Danvers, MA)로부터 얻어졌다. 웨스턴 블롯팅은 "웨스턴 블롯팅 프로토콜"(Cell Signaling Technology, Inc., 2005-2006 catalogue)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 항-ROS 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.로부터 얻어졌다.
도 1은 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 많은 상이한 NSCLC 세포주 중에서 HCC78만이 ROS 단백질을 발현한다. HCC78 중의 ROS 단백질은 야생형 ROS 단백질보다 훨씬 더 작은 분자량을 가지며, 이는 융합 단백질을 나타내는 것이다.
웨스턴 블롯은 ROS 융합 단백질이 티로신 인산화되는 것을 확인하였다. HCC78 세포로부터의 단백질 용해물은 포스포-티로신 항체에 의해 면역침전되고, 전체 ROS 항체에 의해 면역블롯팅되었다. ROS 항체에 의한 전체 용해물로부터의 것과 동일한 밴드가 pY-IP로부터 검출되었고, IP'ed 밴드는 약간 느린 이동을 가졌으며, 이 또한 단백질의 인산화를 나타낸다.
실시예 4
siRNA 를 이용하는 비정상적 ROS 키나아제 -발현 포유류 NSCLC 세포주의 성장 억제
ROS의 말단이 잘린 형태가 HCC78 세포주의 세포 성장 및 생존을 유도하고 있음을 확인하기 위하여, 이러한 세포의 성장을 억제할 수 있는 siRNA 침묵(silencing)의 능력이 시험되었다. ROS의 발현은 RNA 간섭에 의해 하향조절되었다. 하기 ROS siRNA가 Proligo, Inc.로부터 주문되었고, 상응하는 ROS 서열은 괄호 안에 표시된다:
5'AGCCCGGAUGGCAACGUUTT3'(ROS1(6318-6340)(SEQ ID NO: 31);
5'AGCCUGAAGGCCUGAACUTT3'(ROS1(7181-7203)(SEQ ID NO: 32).
형질감염 전날에 2x105개의 세포가 12 웰 플레이트에 씨뿌려졌다. 100 nM ROS1 siRNA는 Mirus TransIT-TKO Transfection 시약을 이용하여 형질감염되었다. 형질감염 48시간 후에, 추가 24시간 동안 세포는 세포 스타베이션 배지(starvation medium)로 옮겨졌다. 세포는 트립신화에 의해 수집되고, 계수되었으며, 세포 용해물은 ROS 단백질 수준을 확인하기 위하여 WB에 이용되었다.
면역블롯 분석은, ROS의 발현이 HCC78 세포로의 siRNA의 형질 감염 후 72시간에 특이적으로 현저하게 감소되나, 대조군 세포주 H2066은 ROS 단백질을 발현하지 않는 것을 나타내었다(도 2, 패널 B 참조). 이는, 예측되는 바와 같이, p-Erk1/2 및 p-Akt와 같은 다운스트림 기질의 인산화의 저하를 수반하였다(도 2, 패널 C 참조). 또한, 예측되는 바와 같이, ROS siRNA에 의한 처리는 절단된 PARP의 검출에 의해 결정되는 바와 같이, HCC78 세포주의 증가된 아포토시스(그러나, 대조군 세포주 H2066에서는 아님)에 이르렀다(도 2, 패널 B 참조). 도 2, 패널 A에 도시된 바와 같이 세포의 80%가 ROS siRNA에 의한 형질감염 3일 후에 죽었다. 그러한 결과는, HCC78 세포주에서 돌연변이/말단이 잘린 ROS 키나아제가 이러한 NSCLC 세포의 증식 및 성장을 유도하고, 그러한 성장 및 증식은 ROS 키나아제 발현을 억제하는 siRNA를 이용함으로써 억제될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 5
SLC34A2 - ROS 융합 유전자의 분리 및 시퀀싱
NSCLC 세포주(HCC78)에서 ROS 키나아제의 말단이 잘린 형태의 존재가 검출된 것을 고려하여, 키메라 ROS 전사물이 존재하는지 여부를 결정하기 위하여 ROS의 키나아제 도메인을 코딩하는 서열 상의 cDNA 말단의 5' 급속 증폭(rapid amplification)이 수행되었다.
상보적 DNA 말단의 급속 증폭
HCC78 세포주로부터 RNA를 추출하기 위하여 RNeasy Mini Kit(Qiagen)가 이용되었다. DNA는, DNeasy Tissue Kit(Qiagen를 이용하여 추출되었다. cDNA 말단의 급속 증폭은 cDNA 합성을 위한 프라이머 ROS-GSP1 및 네스티드 PCR 반응을 위한 프라이머 ROS-GSP2 and ROS-GSP3에 의한 5' RACE 시스템(Invitrogen)을 이용하여 수행되었다.
PCR 분석
RT-PCR에 있어서, 처음 가닥 cDNA는 oligo(dT)20(Invitrogen, Carlsbad, CA, Catalog No. 18080으로부터 상업적으로 이용가능함)에 의해 SuperScriptTM III 처음 가닥 synthesis system(Invitrogen)를 이용하여 2.5 ㎍의 총 RNA로부터 합성되었다. 이어서, SLC34A2-ROS 융합 유전자는 프라이머쌍 SLCROS-F1 및 SLCROS-R1, SLCROS-F2 및 SLCROS-R2를 이용하여 증폭되었다.
구조물
SLC34A2-ROS 융합 유전자의 오픈 리딩 프레임은 Platinum Taq DNA polymerase high fidelity(Invitrogen) 및 프라이머쌍 SLC-Fb 및 ROS-Rb(Bgl II 제한 부위를 갖는)을 이용하여 HCC78 세포의 cDNA로부터 PCR에 의해 증폭되었다. 이 PCR 생서물은 레트로바이러스 벡터 MSCV-Neo에서 클로닝되었다. 프라이머는 다음과 같다:
ROS-GSP1: ACCCTTCTCGGTTCTTCGTTTCCA (SEQ ID NO: 9)
ROS-GSP2: GCAGCTCAGCCAACTCTTTGTCTT (SEQ ID NO: 10)
ROS-GSP3: TGCCAGACAAAGGTCAGTGGGATT (SEQ ID NO: 11)
SLCROS-F1: TCCATCCCAGCACCTGCGGAG (SEQ ID NO: 18)
SLCROS-R1: CTCAACTCTCTATTTCCCAAACAACGC (SEQ ID NO: 20)
SLCROS-F2: CATGGCTCCCTGGCCTGAATTG (SEQ ID NO: 19)
SLCROS-R2: CAACGCTATTAATCAGACCCATCTCC (SEQ ID NO: 21)
SLC-Fb: GAAGATCTCTGACCATGGCTCCCTGGCCTGAA (SEQ ID NO: 33)
ROS-Rb: GAAGATCTACGCTATTAATCAGACCCATCTCC (SEQ ID NO: 34)
PCR 증폭 생성물은 2라운드 후에 검출되었다. 이어서, 5' RACE에 의한 ROS에 대한 서열 5'의 분석은, SLC34A2의 N-말단에 키나아제가 융합되었음을 확인하였다. 수득된 생성물의 서열 분석은, ROS의 c-말단이 SLC34A2 유전자 N-말단에 융합되었음을 나타내었다(도 3c 및 3d 참조). SLC34A2-ROS 융합 유전자는 인프레임(in-frame)이었고, SLC34A2의 처음 126개 아미노산을 ROS의 마지막 598 또는 495개 아미노산에 융합하여(도 3b 참조, 1750에서의 화살표는 C' 말단 598 아미노산의 브레이크를 나타내며, 1853에서의 화살표는 C' 말단 495 아미노산의 브레이크를 나타낸다), 각각 2개의 변이체 융합 단백질(긴, 짧은)에 이르었다. 유전자 구조의 분석은 다른 변이체인 매우 짧은 변이체를 예측하였고, 이는 SLC34A2의 처음 162개 아미노산 및 ROS의 마지막 467개 아미노산을 포함하는 것으로 예측된다(도 3e 참조). SLC34A2는 염색체 4p15 상에 위치하는 반면, ROS는 염색체 6q22 상에 위치한다. 따라서, 융합 유전자는 t(4;6)(p15;q22)에 의해 생성된다. 도 3a 참조.
예측되는 SLC34A2-ROS(VS)(즉, 매우 짧은 변이체)의 아미노산 및 핵산 서열은 각각 SEQ ID NOs: 28 및 29에 주어진다.
SLC34A2 융합의 서열은 도 4a(긴 변이체, 아미노산 서열은 상부에, 핵산 서열은 하부에) 및 도 4b(짧은 변이체, 아미노산 서열은 상부에, 핵산 서열은 하부에)에 나타내어진다. 인간 SLC34A2 단백질의 아미노산 및 핵산 서열은 도 5에 주어지며, 전좌에 포함된 잔기는 밑줄쳐진다.
유사하게, 인간 ROS 단백질의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 각각 도 6a 및 6b에 나타내어진다. 도 6a 및 6b에서, 긴 변이체에 포함되는 잔기는 밑줄쳐지며, 밑줄친 볼드체로 표시된 잔기는 (짧은) 변이체 전좌에 포함된 것이며, 밑줄친 볼드체의 붉은색으로 표시된 잔기는 예측되는 (매우 짧은) 변이체 전좌에 포함되는 것으로 예측되는 것이다.
긴 변이체 및 짧은 변이체 대한 SLC34A2 및 ROS의 융합은 RNA에 대하여 역전자효소-PCR에 의해 확인되었다.
실시예 6
SLC34A2 - ROS 융합 단백질은 형질감염된 293 세포의 성장 및 생존을 유도한다.
SLC34A2-ROS 융합 단백질의 발현이 정상 세포를 암 표현형으로 변형시킬 수 있음을 확인하기 위하여, 인간 배아 신장 세포(293 세포)가 SLC34A2-ROS 융합 단백질의 긴 변이체를 코딩하는, 전술한 cDNA 구조물로 형질감염되었다.
전술한 SLC34A2-ROS cDNA 구조물(긴 변이체 융합 단백질을 코딩함)은 MSCV 바이러스 벡터에 삽입되고, SuperFect 형질감염 시약(Qiaqen, Valencia, CA으로부터 상업적으로 이용가능함)을 이용하여 HEK293 세포로 형질감염되었다. 48시간 ㅏ후에, 형질감염된 HEK293 세포를 수집하고, 웨스턴 블롯에 의해 체크하여, 예측되는 분자량의 재조합 SLC34A2-ROS 융합 단백질(긴 변이체)의 발현을 확인하였다(도 7 참조).
실시예 7
SLC34A2 - ROS 융합 단백질은 변형된 포유류 세포주의 성장 및 생존을 유도한다.
SLC34A2-ROS 융합 단백질의 발현이 정상 세포를 암 표현형으로 변형시키는 것을 확인하기 위하여, 3T3 세포가 전술한 cDNA 구조물에 의해 변형되었다. 세포는 우태아혈청(FCS)(Invitrogen, Carslbad, CA)를 갖는 DMEM 배지(Invitrogen)에서 유지된다.
레트로바이러스 상청액의 제조 및 형질도입은 전술한 바와 같이 수행된다. Schwaller et al., Embo J. 17(18): 5321-33(1998) 참조. 3T3 세포는 각각 MSCV-Neo 또는 MSCV-Neo/SLC34A2-ROS(긴) 또는 MSCV-Neo/ROS(짧은t) 벡터를 함유하는 레트로바이러스 상청액에 의해 형질도입되고, G418(500 ug/ml)에 대하여 선택된다. SLC34A2-ROS가 3T3 세포를 변형시키는 것을 확인하기 위하여, 안정적으로 형질도입된 세포는 연한천 분석에 이용된다.
그러한 분석은, SLC34A2-ROS 융합 단백질이 3T3 세포를 변형시켜, 세포 성장이 부착물 독립적으로 되는지 여부를 확인한다. 웨스턴 블롯 분석은 ROS, SLC34A2, SHP-1 및 다른 가능한 ROS 다운스트림 타겟의 인산화 상태를 확인하기 위하여 수행된다.
실시예 8
CD74 - ROS 융합 유전자의 분리 및 시퀀싱
몇몇 인간 NSCLC 종양(환자 CD042로부터의 종양을 포함함)으로부터의 두 번째 배치는 실시예 1 및 2에 기재된 방법을 이용하는 글로벌 포스포펩타이드 프로파일링의 IAP 기술을 이용하여 스크리닝되었다. 인산화 ROS 키나아제는 환자 CD042에서 검출되었다. 이 ROS 키나아제가 이 환자에 존재하는 여부를 결정하기 위하여, ROS의 키나아제 도메인을 코딩하는 서열의 cDNA 말단의 5' 급속한 증폭이 키메라 ROS 전사물이 이 환자에 존재하는지 여부를 결정하기 위하여 수행되었다. 흥미롭게도, 전술한 바와 같이, 다른 ROS 융합 유전자가 이 방법을 이용하여 발견되었다. 즉 CD74와 ROS 사이의 융합.
실시예 4에 기재된 바와 같이, 종양 조직으로부터 RNA를 추출하기 위하여 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA)가 이용되었다. 5' RACE 시스템(Invitrogen(part of Life Technologies, Inc.), Carlsbad, CA로부터 상업적으로 이용가능한)이 cDNA 합성을 위한 프라이머 ROS-GSP1, 및 네스티드 PCR 반응을 위한 ROS-GSP2 and ROS-GSP3와 함께 이용되었다.
PCR 분석
RT-PCR에 있어서, 처음 가닥 cDNA는 oligo(dT)20(Invitrogen Cat. No. 18080)에 의해 SuperScript™III 처음 가닥 합성 시스템(Invitrogen)을 이용하여 2.5 ㎍의 총 RNA로부터 합성되었다. 이어서, CD74-ROS 융합 유전자가 프라이머쌍 CD74-F1 및 ROS-GSP3을 이용하여 증폭되었다:
ROS-GSP1: ACCCTTCTCGGTTCTTCGTTTCCA (SEQ ID NO: 9)
ROS-GSP2: GCAGCTCAGCCAACTCTTTGTCTT (SEQ ID NO:10)
ROS-GSP3: TGCCAGACAAAGGTCAGTGGGATT (SEQ ID NO:11)
CD74-F1: GCAGAATGCCACCAAGTATGGCAA (SEQ ID NO: 26)
수득된 생성물의 서열 분석은, ROS의 c-말단이 CD74 유전자 N-말단과 융합되어 있음을 나타내었다(도 8, 패널 B 및 C 참조). CD74-ROS 융합 유전자는 인-프레임(in-frame)이었고, CD74의 처음 208개 아미노산을 ROS의 마지막 495개 아미노산에 융합하여(도 8, 패널 B 참조), 융합 단백질에 이르렀다. CD74는 염색체 5q32에 위치한 반면, ROS는 염색체 6q22에 위치하였다(도 8, 패널 A 참조). 따라서, 융합 유전자는 t(5;6)(q32;q22)에 의해 생성되었다.
CD74-ROS의 서열은 도 9에 나타내어진다(상부는 아미노산 서열; 하부는 뉴클레오타이드 서열). 도 9에 도시된 바와 같이, CD74로부터의 잔기는 밑줄쳐지고, ROS 키나아제 도메인의 잔기는 볼드체 활자로 나타내어진다.
도 10은 인간 CD74의 서열(상부는 아미노산 서열, 하부는 핵산 서열)을 나타내며, 여기에서, CD74-ROS 융합에 존재하는 잔기는 밑줄쳐진다. 유사하게, 도 11a 및 11b는 인간 ROS의 아미노산 및 핵산 서열을 나타내며, CD74-ROS 융합에 존재하는 잔기는 밑줄쳐진다.
CD74와 ROS의 융합은 RNA에서의 역전사효소-PCR에 의해 확인되었다. 도 12는 표시된 프라이머에 의해 PCR로부터 얻어진 RT-PCR 생성물을 나타내는 아가로스 겔이다.
실시예 9
면역조직화학( IHC )에 의한 ROS 키나아제 단백질의 검출
NSCLC에서 발견된 ROS 융합 단백질이 면역조직화학에 의해 검출될 수 있는지 아닌지를 결정하기 위하여, ROS-특이적 토끼 모노클로날 항체가 이용되었다. 이 연구에 이용된 ROS-특이적 항체(즉, 토끼 모노클로날 항체 ROS1 D4D6)는 이전에 기술되어 있으며(PCT Publication No. WO2010/093928 참조), ROS 단백질의 키나아아제 영역에 대하여 C-말단인 인간 ROS 키나아제 단백질 상의 영역에 특이적으로 결합한다. D4D6 항체가 아직 상업적으로 이용가능하지 않으나, 유사한 ROS-특이적 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc., (Santa Cruz, CA)로부터 Ros(C-20) 항체, Catalog No. sc-6347 및 Cell Signaling Technology, Inc.(Danvers, MA)로부터 ROS(69D6) 항체, Catalog No #3266를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 다수의 공급자로부터 상업적으로 이용가능하다.
이러한 연구에서, NSCLC 종양의 556 인간 샘플의 집단(cohort)은 파라핀 블록으로서 제조되었다. 모든 종양 샘플은 독립적인 2명의 병리학자에 의해 평가되었으며, 246개 선암종, 64개 bronchioaveolar 암종, 226개 편평 및 20개 대세포 암종 사례를 포함하는 것으로 발견되었다.
면역조직화학: 4-6 ㎛ 조직 박편의 파라핀을 제거하고, 크실렌 및 등급화된 에탄올 각각을 통하여 재수화하였다(예를 들어, 각 5분 동안 크실렌의 3회 변화를 통하여, 및 이어서 각 5분 동안 100 에탄올의 3회 변화 및 95% 에탄올의 2회 변화를 통하여 재수화하였다). 슬라이드를 diH2O로 헹구고, 이어서, 1.0 mM EDTA, pH 8.0 및 제조자의 세팅: 30초 동안 SP1 125℃, 및 10초 동안 SP2 90℃)을 이용하여 Decloaking Chamber(Biocare Medical, Concord, CA)에서 항원 회수하였다(retrieval). 슬라이드는 10분 동안 3% H2O2에서 켄치(quench)한 후, diH2O에서 세척하였다. 습윤 챔버에서 Tris buffered saline 포지티브 0.5% Tween-20(TBST)/5% 염소 혈청에서 블로킹 후에, 슬라이드는 SignalStain®항체 Diluent(#8112 Cell Signaling Technology, Danvers, MA)에서 희석된 0.19 ㎍/ml의 ROS1(D4D6) XP™ 토끼 mAb로 4℃에서 하룻밤동안 배양되었다. TBST로 세척한 후에, 검출은 Envisionpositive(Dako, Carpinteria, CA) 또는 SignalStain® Boost IHC 검출 시약(HRP, 토끼)(catalog #8114 Cell Signaling Technology, Danvers, MA)을 이용하여, 습윤 챔버에서 실온에서 30분 동안 배양함으로써 수행되었다. 슬라이드를 세척한 후에(예를 들어, TBST에서 3회), 슬라이드는 제조자의 지시에 따라 제조된 NovaRed(Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 노출되었다.
슬라이드는 1분 동안 전개되었고, 이어서 diH2O로 헹궈졌다. 슬라이드는 1분 동안 헤마톡실린(Invitrogen(Carlsbad, CA) Catalog #00-8011으로부터 상업적으로 구입가능한 바로 이용될 수 있음)에서 배양됨으로써 대비염색되었고, 30초 동안 diH2O에서 헹궈지고, 20초 동안 bluing 시약(Richard AllScientific, Kalamazoo, MI(a Thermo Scientific company), Catalog #7301)에서 배양된 후, 마지막으로 30초 동안 diH2O에서 세척되었다. 슬라이드는 각각 20초 동안 95% 에탄올의 2회 변화, 및 각각 2분 동안 100% 에탄올의 2회 변화에서 탈수되었다. 슬라이드는 각각 20초 동안 크실렌의 2회 변화에서 맑게 되었고, 공기 건조되었다. 커버슬립은 VectaMount(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 이용하여 탑재되었다. 슬라이드는공기 건조된 후, 현미경 하에서 평가되었다. 이미지(20x)는 Olympus DP70 카메라 및 DP Controller 소프트웨어를 구비한 Olympus CX41 현미경을 이용하여 얻어졌다.
ROS-특이적 Rmab ROS1 D4D6에 의한 면역조직화학에 의해 스크리닝된 556개 NSCLC 종양 중에서, 9개의 ROS1-포지티브 종양이 확인되었다. 브레이크다운(breakdown)은 하기와 같았다:
246개 선암종 중에서, 8개(또는 3.3%)가 ROS1 키나아제에 대하여 포지티브하였다..
20개의 대세포 암종 중에서, 1개(또는 5.0%)가 ROS1 키나아제에 대하여 포지티브하였다.
약한 세포질로부터 강한 핵 주위 응집체에 이르는 다양한 ROS IHC 스테이닝 패턴이 관찰되었다(도 13A 내지 F 참조). 5/9(55%) 사례에서, ROS는 세포질에 분산적으로 국부화되었다(도 13A). 강한 세포질 스테이닝은 1개의 대세포 암종에서 관찰되었다(도 13C). 2개의 사례는 서로 구별되는 특유한 표현을 가졌으며, 하나는 반점이 있는 세포막 스테이닝의 영역을 갖는 분산 세포질이며(도 13D), 다른 하나는 전체적으로 소낭성 스테이닝이었다(도 13F). 드문 경우, 마크로파지 및 기관지 상피 세포와 같은 비-신생 세포가 ROS D4D6로 스테이닝되었음을 주의하여야 한다. ROS 발현은 주위 기질 조직에서는 없었다.
실시예 10
FISH 분석을 이용하는 인간 암 샘플에서 ROS 융합의 검출
인간 NSCLC 종양 샘플에서 SLC34A2-ROS 융합 단백질 및/또는 CD74-ROS 단백질(또는 다른 ROS 융합 단백질)의 존재는 이전에 기술된 형광 인시츄 하이브리다이제이션(FISH) 분석을 이용하여 검출되었다. 예를 들어, Verma et al. Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y. (1988) 참조. 200개 이상의 파라핀-삽입된 인간 NSCLC 종양 샘플이 시험되었다.
ROS를 포함하는 재배열을 분석하기 위하여, 이중 컬러 브레이크-어파트(dual color break-apart probe) 프로브가 설계되었다. 근위부(proximal) 프로브(BAC clone RP1-179P9) 및 2개의 원위부(distal) 프로브(BAC clone RP11-323O17, RP1-94G16)(이들은 모두 예를 들어, Invitrogen Inc., Carlsbad, CA으로부터, Catalog Nos. RPCI1.C 및 RPCI11.C로 상업적으로 이용가능함)가 얻어졌다. 이들 프로브가 ROS 유전자에 결합하는 위치는 도 14에 개략적으로 나타내어진다. 도 19A에 도시된 바와 같이, 근위부 프로브는 Spectrum Orange dUTP로 표지되고, 원위 프로브는 Spectrum Green dUTP로 표지된다. 프로브의 표지는 제조자의 지시에 따라 Nick Translation DNA Labeling Kit에 의해 수행되었다(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY). FISH는 표준 방법에 따라 4-mm 두께 FFPE 조직 박편에서 수행되었다. 예를 들어, 파라핀 삽입된 조직 박편은 재수화되고, 11분 동안 0.01M Citrate buffer(pH 6.0)에서 마이크로웨이브 항원 회수되었다. 박편은 37℃에서 25분 동안 프로테아제(4mg/ml 펩신, 2000-3000U/mg)로 소화되었고, 18시간 동안 37℃에서 FISH 프로브 세트에 의해 탈수 및 하이브리다이즈되었다. 세척 후에, Vectashield mounting medium(Vector Laboratories, Burlingame, CA) 중의 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; mg/ml)이 핵 대비염색을 위하여 적용되었다.
ROS에 대한 FISH-포지티브 사례는 >15%인 종양 세포에서 스플릿 신호(split signals)로 정의되었다. Nikon C1 Confocal microscope, 60 X objective and trifilter(dapi, TRITC, FITC)가 각 사례의 스코어를 정하기 위하여 이용되었다. 이미지 획득을 위하여, 40 X objective and Metamorph 소프트웨어를 갖는 Olympus BX-51 광시야 형광 현미경이 3색 이미지를 생성하는데 이용되었다.
따라서, ROS 재배열 프로브는 야생형(WT) 서열에서 ROS 유전자의 브레이크포인트(breakpoint)의 맞은편에 2개의 상이하게 표지된 프로브를 함유한다(도 14A 참조). 하이브리다이즈된 경우, 네이티브 ROS 영역은 오렌지색/녹색 융합 신호로 나타날 것이며, 이 위치에서의 재배열(SLC34A2-ROS 융합 단백질에 존재하는 것과 같은)은 분리된 오렌지색 및 녹색 신호에 이를 것이다.
도 14B에 도시된 바와 같이, 재배열된 ROS 유전자는 전술한 바와 같이, SLC34A2-ROS 융합에 이르는 유전자 재배열을 함유하는 HCC78에서 발견되었다(도 14B, 왼쪽 패널). 인간 폐 샘플의 하나에서, 즉 폐 306에서, SLC34A2-ROS 또는 CD74-ROS일 수 있는 유사한 ROS 유전자 재배열이 발견되었다.
FISH 분석은, 연구된 샘플 집단에서 이 ROS 돌연변이가 낮은 발생을 나타내었다. 스크리닝된 초기 123개 종양 중에서, 123개 중 2개의 종양 또는 1.6%의 종양이 ROS 융합 돌연변이를 함유하였다. 그러나, 전세계적으로 NSCLC의 높은 발생을 고려하여(연간 미국에서만 151,00 이상의 새로운 사례), 이 돌연변이 ROS를 갖는 상당히 많은 환자가 있을 것으로 예측되며, 이러한 환자는 ROS-억제 치료 계획으로부터 이로울 수 있다.
실시예 11
FIG - ROS 포지티브 NSCLC 종양의 발견
실시예 9로부터, 종양 샘플의 하나, 즉 종양 749가 소낭성 구획으로 국재화되는 ROS1 스테이닝을 나타내었다(도 13F 참조). 이 스테이닝 패턴은 다른 모든 ROS1 포지티브 종양으로부터 구별되며, 이는 상이한 ROS1 융합 파트너의 가능성을 나타내는 것이다.
이 종양 749의 FISH 패턴이 무엇인지를 결정하기 위하여, 제3 원위 프로브 RP11-213A17가 Invitrogen으로부터 얻어져, 이 종양에서 ROS 돌연변이가 FIG-ROS 융합에 기인하는 것인지 여부를 더 조사하였다. FIG 유전자와 ROS 유전자의 융합은 교모세포종, 담관암, 및 간암에서 기술되었으나(Charest et al., Genes Chromosomes Cancer 37: 58-71, 2003; Charest et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 916-921, 2003; 및 PCT Publica NO. WO2010/093928 참조), 이 융합이 폐에서는 이전에 기술되지 않았다. FIG 유전자와 ROS 유전자 사이의 융합이 전자 또는 역위가 아니라, 240 킬로베이스의 염색 6에서의 염색체내 결실(intrachromosomal deletion)로부터 야기되므로, 세로운 세트의 FISH 프로브가 설계되었다.
이전에 기술된 IHC 확인 시험(실시예 11 참조)에 이용된 FISH 프로브는 SLC34A2-ROS 융합 단백질 또는 CD74-ROS 융합 단백질의 하나의 존재에 기인할 수 있는 ROS 균형 전좌를 갖는 이러한 종양 및 세포를 확인하였다. 폐 749에서 FISH 패턴은 재배열이 이러한 2개의 융합의 하나가 아니라, 잠재적으로 FIG-ROS의 것이었음을 시사하였다. 폐 ID 749가 실제 FIG-ROS 포지티브인지를 결정하기 위하여, 다른 FISH 프로브 세트가 설계되었다(도 15). 실시예 11에 기재된 바와 같이, 179P9 및 323O17 BACs를 함유하는 프로브 세트 1은 본 명세서에 개시된 ROS 융합 단백질의 양 측면에 배치되었다(예를 들어, ROS의 엑손 34, 35, 또는 36 다음에)(도 15 및 도 14A 참조). SLC34A-ROS 포지티브 HCC78 세포(도 14B, 왼쪽 패널 및 도 16A 참조)에서, 프로브 세트 1은 균형 전좌에 이르렀다. FIG-ROS 포지티브 인간 U118MG 교모세포종 세포주에서, 염색체 6의 이 섹션이 결실되므로, 323O17 BAC는 하이브리다이즈되지 않아, 단지 오렌지색 신호만 나타내었다(도 16C 참조). 프로브 세트 2는 ROS에 위치한 179P9 및 FIG 유전자에 위치한 213A7을 함유하였고, 따라서 U118MG가 이 프로브 세트 내에서 오렌지색 및 녹색 신호를 모두 나타낸다(도 16D 참조). HCC78 세포는 균형 전좌를 갖는 1개의 염색체를 나타내었고(예를 들어, SLC34A2-ROS 융합으로부터; 도 16B의 2개 황색 화살표 참조), FIG 유전자 및 ROS 유전자는 실제 동일한 염색체 상에 서로 근접하여 있으므로, 도 16B의 백색 화살표는 서로 근접한 녹색 및 오렌지색 신호를 갖는 정상 염색체를 나타낸다. 야생형 염색체는 프로브 사이의 거리에 기인하여 분리된 신호를 디스플레이한다. 프로브 세트 1(도 16E 참조) 또는 프로브 세트 2(도 16F 참조)로 검사되는 경우, 폐 ID 749는 U118MG 세포의 것을 모방하였다(도 16C D). 이러한 데이터는 NSCLC에서 염색체 6에서의 염색체내 결실(intrachromosomal deletion)로사 FIG-ROS 융합을 처음으로 나타내는 것이다.
실시예 12
폐 종양 749로부터 FIG - ROS (S) 융합 유전자의 분리 및 시퀀싱
종양 749(포르말린-고정되고, 파라핀-삽입된 종양이었음)로부터 ROS 융합을 분리 및 시퀀싱하기 위하여, 하기 프로토콜이 이용되었다.
FFPE 종양 샘플로부터의 RT - PCT: 3 X 10 mm 박편으로부터 RNA가 하기 표준 프로토콜(RNeasy FFPE Kit, Qiagen)에 따라 추출되었다. 처음 가닥 cDNA는 유전자 특이적 프라이머에 의해 SuperScript III first strand synthesis system(Invitrogen)을 이용하여 500 ng의 총 RNA로부터 합성되었다. 이어서, FIG-ROS 융합 cDNA는 짧은 동형에 대하여 PCR 프라이머쌍 FIG-F3 및 ROS-GSP3.1, 및 긴 동형에 대하여 FIG-F7 및 ROS-GSP3.2를 이용하여 증폭되었다. GAPDH 프라이머는 Qiagen(Valencia, CA)로부터 구입하였다.
프라이머
ROS-GSP3.1: CAGCAAGAGACGCAGAGTCAGTTT(SEQ ID NO: 52)
ROS-GSP3.2: GCAGCTCAGCCAACTCTTTGTCTT(SEQ ID NO: 10)
FIG-F3: GCTGTTCTCCAGGCTGAAGTATATGG(SEQ ID NO: 53)
FIG-F7: GTAACCCTGGTGCTAGTTGCAAAG(SEQ ID NO: 54)
FIG에 대한 프라이머는 종양 749에서 관찰된 FISH 패턴 및 FIG-ROS 융합에 대한 공개된 정보에 기초하여 선택되었기 때문에, 종양 749는 FIG-ROS 융합인 것으로 예측되었다.
예측된 바와 같이, 종양 740에서 ROS 융합 단백질은 실제로 FIG-ROS 융합, 이전에 기술된 특이적인 FIG-ROS(S) 융합이었다(PCT Publication No. WO2010/0923828 참조). 도 17은 PCT Publication No. WO2010/0923828에 기재된 FIG-ROS(S)로부터의 서열("query" 라인)에 의한 종양 749로부터 FFPE 블록으로부터 서열("sbjct" 라인)의 배치를 나타낸다. 도 17에 도시된 바와 가팅, 동일성은 100%이었고, 갭은 0이었다. FIG-ROS(S)가 ROS 키나아제의 전체 키나아제 도메인을 함유하므로, 이 FIG-ROS(S)는 키나아제 활성을 보유하는 것으로 예측되며, 따라서 본 명세서에 기재된 ROS 키나아제 활성을 갖는 단백질이다.
FIG-ROS(S)의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 58에 제시되며, FIG-ROS(S)의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 57에 제시된다.
간암에서 FIG-ROS(L)도 기술되어 있다(PCT Publication No. WO2010/0923828 참조). FIG-ROS(L)의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 SEQ ID NOs 56 및 55에 제시된다. 또한, FIG 및 ROS 유전자의 유전자 구조 분석에 기초하여, 제3 FIG-ROS 변이체(즉, FIG-ROS(XL)이 제안되었다(PT Publication No. WO2010/0923828 참조). FIG-ROS(XL)의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 SEQ ID NOs 60 및 59에 제시된다. NSCLC에서 이러한 FIG-ROS(S) 발견을 고려하여, FIG-ROS 융합 단백질의 다른 변이체도 NSCLC에서 발견될 수 있다.
실시예 13
PCR 분석을 이용하여 인간 폐암 샘플에서 ROS 키나아제 발현의 검출
인간 폐암 샘플에서 비정상적으로 발현된 전장 ROS 단백질 또는 ROS 융합 단백질(예를 들어, SLC34A2-ROS 융합 단백질의 하나, CD74-ROS 융합 단백질, 또는 FIG-ROS 융합 단백질의 하나)는 이전에 기술된 게놈 또는 역전사효소(RT) 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, Cools et al., N. Engl. J. Med. 348: 1201-1214(2003) 참조.
간단하게 예로써, 종양 또는 흉막 삼출액 샘플은 표준 기술을 이용하여 NSCLC를 앓는 환자로부터 얻어질 수 있다. 말단이 잘린 ROS 키나아제, SLC34A2-ROS 융합 단백질, CD74-ROS, 또는 FIG-ROS에 대한 PCR 프로브가 구성된다. RNeasy Mini Kit(Qiagen)가 종양 또는 흉막 삼출액 샘플로부터 RNA를 추출하는데 이용될 수 있다. DNA는 DNeasy Tissue Kit(Qiagen)를 이용하여 추출될 수 있다. RT-PCR에 있어서, 처음 가닥 cDNA는 예를 들어, oligo(dT)20에 의한 SuperScriptTM III first-strand synthesis system(Invitrogen)을 이용하여, 예를 들어 2.5 mg의 총 RNA로부터 합성된다. 이어서, ROS 유전자 또는 ROS 융합 유전자(예를 들어, SLC34A2-ROS, CD74-ROS, 또는 FIG-ROS)는 프라이머쌍, 예를 들어 SLC34A2-F1 및 ROS-P3를 이용하여 증폭된다(실시예 5 참조). 게놈 PCR에 있어서, 융합 유전자의 증폭은 프라이머쌍, 예를 들어, SLC34A2-F1 및 ROS-R1, 또는 SLC34A2-F1 및 ROS-R2에 의해 Platinum Taq DNA polymerase high fidelity(Invitrogen)를 이용하여 수행될 수 있다.
그러한 분석은 말단이 잘린 ROS 키나아제(및/또는 ROS 융합 단백질 such as FIG-ROS, SLC34A2-ROS, 또는 CD74-ROS)의 발현에 의해 특성화되는 암을 앓는 환자를 확인할 것이며, 이러한 환자는 ROS-억제 치료제를 이용하는 치료에 대한 후보자이다.
실시예 14
TAE -684 및 크리조티닙에 대한 ROS 키나아제 융합의 민감성
소분자, TAE-684, 5-클로로-2,4-디아미노페닐피리미딘은 ALK 키나아제을 억제한다. TAE-684의 구조는 참조로 포함되는 Galkin, et al., Proc. National Acad. Sci 104(1) 270-275, 2007에 주어진다. 다른 소분자, 즉 크리조티닙은 ALK 키나아제, 및 MET 키나아제를 억제한다. 크리조티닙(PF-02341066로도 불림)의 구조는 참조로 포함되는 HY et al., Cancer Research 67: 4408-4417, 2007 및 U.S. Patent Publication No. 20080300273에 주어진다.
TAE-684 및/또는 크리조티닙이 ROS 융합 폴리펩타이드를 억제하는지 여부를 결정하였다.
BaF3 및 Karpas 299 세포는 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany)로부터 얻어졌다. 생존을 위하여 인터류킨-3를 필요로 하는 BaF3 세포는 10% 소태아혈청(FBS)(Sigma) 및 1.0 ng/ml 쥐 IL-3(R&D 시스템)을 갖는 RPMI-1640 배지(Invitrogen)에서 37℃로 유지되었다. Karpas 299 세포(림프종 세포주)는 10% FBS를 갖는 RPMI- 1640에서 성장되었다.
BaF3 세포는 FIG-ROS(S), FIG-ROS(L), 또는 FLT- 3ITD를 코딩하는 레트로바이러스에 의해 형질도입되었으며(FLT3에서 내부 순차 중복(tandem duplication) 돌연변이는 AML 백혈병을 야기한다), 및 IL3 독립적 성장을 위하여 선택되었다. NPM-ALK를 발현하는 Karpas 299 세포는 양성 대조군으로 이용되었다. 레트로바이러스는 이전에 기술된 바와 같이 생성되었다(참조로 포함되는 PCT Publication No. WO 2010/093928 참조).
MTS 분석은 CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent(Promega, Catalog No G3582)를 이용하여 수행되었다. 요약하면, 24웰 플레이트에서 1 x 105 세포/well가 0 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM 또는 1000 nM TAE-684를 포함하는 1 mL 배지에서 성장하였다. 72시간 후에, 20 ㎕의 CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent이 96 웰 분석 플레이트(플랫한 하부)에 첨가되고, 이어서, 처리된 또는 처리되지 않은 100 ㎕의 세포가 첨가되었다. 배지만 있는 웰이 대조군으로 사용되었다. 96 웰 플레이트는 37℃에서 1-4시간 동안 배양된 후, 96 웰 플레이트 리더를 이용하여 490 nm에서의 흡수도를 판독함으로써 생존가능한 세포가 계수되었다.
도 18에 도시된 바와 같이, BaF3 세포는, TAE-684의 존재하에 성장이 중단된, FIG-ROS 폴리펩타이드의 하나를 발현하는 레트로바이러스로 형질도입되었다. FIG-ROS(S)는 FIG-ROS(L)에 비하여 TAE-684에 대하여 민감하지 않았다. Karpas 299 세포도 TAE-684 존재 하에 반응하였다(즉, 성장이 중단됨). FLT3/ITD로 형질도입된 BaF3 세포는 TAE-684에 대하여 민감하지 않았다. 2개의 실험으로부터 IC50 값은 표 4에 나타내어지며, 최종 세포주, 즉 myc-tagged neomycin을 발현하는 BaF3 세포는 두 번째 실험에서만 이용가능하였다.
TAE-684
 IC50 IC50
FIG-ROS(L) 1.78 nM 2.84 nM
FIG-ROS(S) 10.16 nM 15.01 nM
FLT3/ITD 419.35 nM 316.44 nM
Neo-Myc NA 1641.84 nM
Karpas-299 4.85 nM 4.36 nM
다음으로, 아포토시스에 대한 마커로 절단된 카르파제(caspase)-3를 이용하여 유세포분석에 의해 절단된-카르파제 3 포지티브 세포를 측정함으로써 평가되었다. 이 결과는 Cell Signaling Technology, Inc.(Danvers, MA)로부터 공개적으로 이용가능한 프로토콜을 이용하여 얻어졌다. 도 19에 도시된 바와 같이, TAE-684의 존재는 FIG-ROS(S) 또는 FIG-ROS(L)를 발현하는 BaF3 세포가 아포토시스에 의해 죽도록 야기하였다. TAE-684 존재하에 성장이 중단된 Karpas 299 세포는 아포토시스에 의해 죽지 않았고, 그들은 단지 세포 주기 억제(cell cycle arrest)를 겪었다. 따라서, TAE-684가 FIG-ROS 융합 폴리펩타이드를 억제하는 메커니즘은 TAE-684가 ALK 키나아제를 억제하는 메커니즘과 상이하다.
FIG-ROS 융합 폴리펩타이드에 대한 TAE-684의 작용의 메커니즘을 더 확인하기 위하여, 모든 4개의 세포주(즉, FIG-ROS(S), FIG-ROS(L), 및 FLT-3ITD를 코딩하는 레트로바이러스로 형질도입된 Karpas 299 세포 및 BaF3 세포)는 3시간 동안 0, 10, 50, 또는 100 nM TAE-684에 의한 치료 후에, 웨스턴 블롯팅되었다. 모든 항체는 Cell Signaling Technology, Inc.(Danvers, MA)로부터 얻어졌다.
도 20에 도시된 바와 같이, BaF3 세포를 발현하는 FIG-ROS(S) 및 FIG-ROS(L)에서 FIG-ROS(S) 및 FIG-ROS(L)의 인산화는 TAE-684에 의해 억제되었다. STAT3, AKT, 및 ERK, 및 Shp2의 인산화는 FIG-ROS(S) 및 FIG-ROS(L)를 발현하는 BaF3 세포에서 억제되었다. STAT3, AKT, 및 ERK, 및 Shp2의 인산화는 FLT-3ITD 레트로바이러스에 의해 형질도입된 BaF3 세포에서 영향받지 않았다. TAE-684는 또한 Karpas 299 세포에서 ALK 및 ERK 인산화를 억제하였다. ROS, ALK, LTK, InsR, 및 IGFlR이 티로신 키나아제의 동일한 패밀리에 속하기 때문에, 이들은 키나아제 도메인에서 유사한 구조를 공융할 수 있다. ALK, LTK, InsR, 및 IGFlR에 대하여 설계된 키나아제 억제제 또는 항체는 ROS 키나아제에 대한 치료 효과를 가질 수 있다.
2종의 ALK 치료제, 즉, TAE-684 및 크리조티닙을 비교하기 위하여, 유사한 세트의 실험이 동일한 프로토콜을 이용하여, 다른 음성 대조군, 즉 neo-myc tag으로 형질도입된 BaF3 세포에 의해 동일한 세포에 대하여 수행되었다.
도 21A(TAE-684) 및 도 21B(크리조티닙)에 도시된 바와 같이, FIG-ROS 융합 단백질-함유 BaF3 세포는 각 치료제의 동일한 농도에서 크리조티닙에 비하여, TAE-684에 더 민감하였다. 양성 대조군, 즉 NPM-ALK 융합 단백질-발현 Karpas 299 세포는 동일한 농도에서 TAE-684에 비하여 크리조티닙에 대하여 민감하지 않기 때문에, 크리조티닙은 유사한 용약의 TAE-984만큼 효과적이지 않을 수 있다. 음성 대조군(즉, FLT3-ITD로 형질도입된 BaF3 또는 neo-myc으로 형질도입된 BaF3)은 FIG-ROS 단백질-발현 BaF3 세포 및 NPM-ALK 단백질-발현 Karpas 299에 비하여 크리조티닙 및 TAE-684에 대하여 덜 민감하였다.
3시간 동안 0, 0.1, 0.3, 또는 1.0 uM 크리조티닙에 의한 치료 후, 웨스턴 블롯팅 분석이 Cell Signaling Technology, Inc로부터 이용가능한 항체를 이용하여 수행되었다. 도 22에 도시된 바와 같이, FIG-ROS(S) 및 FIG-ROS(L) 발현 BaF3 세포에서 FIG-ROS(S) 및 FIG-ROS(L)의 인산화는 크로조티닙에 의해 억제되었다. 또한, STAT3 및 ERK의 인산화는 FIG-ROS(S) 및 FIG-ROS(L) 발현 BaF3 세포에서 크리조티닙에 의해 억제되었다. STAT3 및 ERK의 인산화는 크리조티닙 치료 후에 FLT-3ITD 레트로바이러스에 의해 형질도입된 BaF3 세포에서 영향받지 않았다. 크리조티닙은 Karpas 299 세포에서 ALK, STAT3 및 ERK 인산화를 억제하였다. ROS, ALK, LTK, InsR, 및 IGFlR이 티로신 키나아제의 동일한 패밀레 속하므로, 이들은 키나아제 도메인에서 유사한 구조를 공유할 수 있다. ALK, LTK, InsR, 및 IGFlR에 대해 설계된 키나아제 억제제 또는 항체는 ROS 키나아제에 대해 치료 효과를 가질 수 있다.
실시예 15
ALK 및/또는 ROS 를 발현하는 NSCLC 의 조사.
ROS 키나아제에 더하여, ALK 활성을 갖는 단백질을 함유하는 NSCLC가 기술되었다(예를 들어, US Patent Nos. 7,700,339; 7,605,131; 7,728,120 참조). 실시예 9에 기재된 IHC 방법을 이용하여, 인간 NSCLC 종양으로부터 다수의 FFPE 샘플이 항-ROS 또는 항-ALK 항체에 의한 특이적 결합에 대해 스크리닝되었다.
동일한 샘플이 또한 표준 방법을 이용하여 ROS 유전자 또는 ALK 유전자에 대해 FISH에 의해 스크리닝되었다. 예를 들어, ROS 유전자에 대한 FISH 프로토콜은 전술한 실시예에 기재된다. ALK에 대한 FISH 프로토콜은 참조로 본 명세서에 포함되는 U.S. Patent No. 7,700,339에 기재된다. 유사하게, 다른 FISH 분석은 참조로 본 명세서에 포함되는 US Patent Publication No. 20110110923에 기재된다. 스크리닝의 결과는 표 5(ROS 포지티브 샘플) 및 6(ALK 포지티브 샘플)에 나타내어진다.
ROS1 포지티브 샘플의 조직병리학
환자 No . 종양 ID 진단 조직 패턴(%) ROS1 FISH
1 147 선암종 BAC(40), papillary(30), Acinar(20), Solid(10) +
2 306 선암종 Acinar(70), papillary(20), solid(10) +
3 570 선암종 Acinar(90), BAC(5), micropapillary(5) +
4 400037 선암종 Acinar +
5 668 선암종 Solid(80), Acinar(10), BAC(10) +
6 702 선암종 Papillary(40), Acinar(30), Solid(30) +
7 749 선암종 Solid(80), Acinar(20) +, 녹색
결실
8 760 선암종 Signet 세포 +
9 575 대세포 스코어 매길 수 없음
ALK 포지티브 사례의 조직병리학
환자 No . 종양 ID 진단 조직 패턴(%) ALK FISH
1 187 선암종 Solid
Focal signet 세포 ring features		 +
2 307 선암종 BAC(30), Acinar(10), papillary(10), solid(50)
clear 세포 and mucinous features		 +
3 587 선암종 Acinar(85), solid(10), papillary(5) 스코어 매길 수 없음
4 618 선암종 Solid +
5 645 선암종 Solid(70), BAC(30) +
6 652 선암종 Papillary(60), Micropapillary(40) +
7 663 선암종 Papillary(50) BAC(50) +
8 664 선암종 Acinar +
9 666 선암종 Solid(90), Papillary(10) +
10 670 선암종 Solid(60), Papillary(40) +
11 680 선암종 Solid(70) and acinar(30) with signet ring 세포 features +
12 759 선암종 Solid with signet ring 세포 +
13 580 선암종(불확실함) +
14 70 선암종 Solid +
15 383 선암종 BAC(40), papillary(30), Acinar(30) +
16 395 선암종 Solid +
17 278 편평; 대세포암종(uncertain) +
18 330 대세포 신경내분비암종 +
19 503 편평 +
20 615 편평 +
21 644 편평 +
22 691 편평 +
IHC 및 FISH에 의한 인간 NSCLC의 스크리닝에 기초하여, 이러한 종양에서 ALK 및 ROS 발현은 서로 배타적이다. 다시 말하여, NSCLC 종양이 ALK에 의해 유도되는 경우, 이는 ROS를 발현하지 않는다. 유사하게, NSCLC 종양이 ROS에 의해 유도되는 경우, 이는 ALK를 발현하지 않는다. ROS 활성 및 ALK 활성을 모두 억제하는 크리조티닙 또는 TAE-684와 같은 치료제는 NSCLC를 치료하는데 특히 효과적이다.
균등물
본 개시가 그 상세한 설명과 함께 기재되었으나, 전술한 기재는 설명을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아님을 이해하여야 하며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 범위에 의해 정의된다. 다른 측면, 이점 및 변형도 하기 청구항의 범위 내에 속한다.
<110> Cell Signaling Technology, Inc. <120> ROS KINASE IN LUNG CANCER <130> P13CS098 <150> 13/113676 <151> 2011-05-23 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2347 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Met Lys Asn Ile Tyr Cys Leu Ile Pro Lys Leu Val Asn Phe Ala Thr 1 5 10 15 Leu Gly Cys Leu Trp Ile Ser Val Val Gln Cys Thr Val Leu Asn Ser 20 25 30 Cys Leu Lys Ser Cys Val Thr Asn Leu Gly Gln Gln Leu Asp Leu Gly 35 40 45 Thr Pro His Asn Leu Ser Glu Pro Cys Ile Gln Gly Cys His Phe Trp 50 55 60 Asn Ser Val Asp Gln Lys Asn Cys Ala Leu Lys Cys Arg Glu Ser Cys 65 70 75 80 Glu Val Gly Cys Ser Ser Ala Glu Gly Ala Tyr Glu Glu Glu Val Leu 85 90 95 Glu Asn Ala Asp Leu Pro Thr Ala Pro Phe Ala Ser Ser Ile Gly Ser 100 105 110 His Asn Met Thr Leu Arg Trp Lys Ser Ala Asn Phe Ser Gly Val Lys 115 120 125 Tyr Ile Ile Gln Trp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Gly Ser Trp Thr Tyr 130 135 140 Thr Lys Thr Val Ser Arg Pro Ser Tyr Val Val Lys Pro Leu His Pro 145 150 155 160 Phe Thr Glu Tyr Ile Phe Arg Val Val Trp Ile Phe Thr Ala Gln Leu 165 170 175 Gln Leu Tyr Ser Pro Pro Ser Pro Ser Tyr Arg Thr His Pro His Gly 180 185 190 Val Pro Glu Thr Ala Pro Leu Ile Arg Asn Ile Glu Ser Ser Ser Pro 195 200 205 Asp Thr Val Glu Val Ser Trp Asp Pro Pro Gln Phe Pro Gly Gly Pro 210 215 220 Ile Leu Gly Tyr Asn Leu Arg Leu Ile Ser Lys Asn Gln Lys Leu Asp 225 230 235 240 Ala Gly Thr Gln Arg Thr Ser Phe Gln Phe Tyr Ser Thr Leu Pro Asn 245 250 255 Thr Ile Tyr Arg Phe Ser Ile Ala Ala Val Asn Glu Val Gly Glu Gly 260 265 270 Pro Glu Ala Glu Ser Ser Ile Thr Thr Ser Ser Ser Ala Val Gln Gln 275 280 285 Glu Glu Gln Trp Leu Phe Leu Ser Arg Lys Thr Ser Leu Arg Lys Arg 290 295 300 Ser Leu Lys His Leu Val Asp Glu Ala His Cys Leu Arg Leu Asp Ala 305 310 315 320 Ile Tyr His Asn Ile Thr Gly Ile Ser Val Asp Val His Gln Gln Ile 325 330 335 Val Tyr Phe Ser Glu Gly Thr Leu Ile Trp Ala Lys Lys Ala Ala Asn 340 345 350 Met Ser Asp Val Ser Asp Leu Arg Ile Phe Tyr Arg Gly Ser Gly Leu 355 360 365 Ile Ser 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accaaatact atctacaggt tttctattgc agcagtaaat gaagttggtg agggtccaga 1020 agcagaatct agtattacca cttcatcttc agcagttcaa caagaggaac agtggctctt 1080 tttatccaga aaaacttctc taagaaagag atctttaaaa catttagtag atgaagcaca 1140 ttgccttcgg ttggatgcta tataccataa tattacagga atatctgttg atgtccacca 1200 gcaaattgtt tatttctctg aaggaactct catatgggcg aagaaggctg ccaacatgtc 1260 tgatgtatct gacctgagaa ttttttacag aggttcagga ttaatttctt ctatctccat 1320 agattggctt tatcaaagaa tgtatttcat catggatgaa ctggtatgtg tctgtgattt 1380 agagaactgc tcaaacatcg aggaaattac tccaccctct attagtgcac ctcaaaaaat 1440 tgtggctgat tcatacaatg ggtatgtctt ttacctcctg agagatggca tttatagagc 1500 agaccttcct gtaccatctg gccggtgtgc agaagctgtg cgtattgtgg agagttgcac 1560 gttaaaggac tttgcaatca agccacaagc caagcgaatc atttacttca atgacactgc 1620 ccaagtcttc atgtcaacat ttctggatgg ctctgcttcc catctcatcc tacctcgcat 1680 cccctttgct gatgtgaaaa gttttgcttg tgaaaacaat gactttcttg tcacagatgg 1740 caaggtcatt ttccaacagg atgctttgtc ttttaatgaa ttcatcgtgg gatgtgacct 1800 gagtcacata gaagaatttg ggtttggtaa cttggtcatc tttggctcat cctcccagct 1860 gcaccctctg ccaggccgcc cgcaggagct ttcggtgctg tttggctctc accaggctct 1920 tgttcaatgg aagcctcctg cccttgccat aggagccaat gtcatcctga tcagtgatat 1980 tattgaactc tttgaattag gcccttctgc ctggcagaac tggacctatg aggtgaaagt 2040 atccacccaa gaccctcctg aagtcactca tattttcttg aacataagtg gaaccatgct 2100 gaatgtacct gagctgcaga gtgctatgaa atacaaggtt tctgtgagag caagttctcc 2160 aaagaggcca ggcccctggt cagagccctc agtgggtact accctggtgc cagctagtga 2220 accaccattt atcatggctg tgaaagaaga tgggctttgg agtaaaccat taaatagctt 2280 tggcccagga gagttcttat cctctgatat aggaaatgtg tcagacatgg attggtataa 2340 caacagcctc tactacagtg acacgaaagg cgacgttttt gtgtggctgc tgaatgggac 2400 ggatatctca gagaattatc acctacccag cattgcagga gcaggggctt tagcttttga 2460 gtggctgggt cactttctct actgggctgg aaagacatat gtgatacaaa ggcagtctgt 2520 gttgacggga cacacagaca ttgttaccca cgtgaagcta ttggtgaatg acatggtggt 2580 ggattcagtt ggtggatatc tctactggac cacactctat tcagtggaaa gcaccagact 2640 aaatggggaa agttcccttg tactacagac acagccttgg ttttctggga aaaaggtaat 2700 tgctctaact ttagacctca gtgatgggct cctgtattgg ttggttcaag acagtcaatg 2760 tattcacctg tacacagctg ttcttcgggg acagagcact ggggatacca ccatcacaga 2820 atttgcagcc tggagtactt ctgaaatttc ccagaatgca ctgatgtact atagtggtcg 2880 gctgttctgg atcaatggct ttaggattat cacaactcaa gaaataggtc agaaaaccag 2940 tgtctctgtt ttggaaccag ccagatttaa tcagttcaca attattcaga catcccttaa 3000 gcccctgcca gggaactttt cctttacccc taaggttatt ccagattctg ttcaagagtc 3060 ttcatttagg attgaaggaa atgcttcaag ttttcaaatc ctgtggaatg gtccccctgc 3120 ggtagactgg ggtgtagttt tctacagtgt agaatttagt gctcattcta agttcttggc 3180 tagtgaacaa cactctttac ctgtatttac tgtggaagga ctggaacctt atgccttatt 3240 taatctttct gtcactcctt atacctactg gggaaagggc cccaaaacat ctctgtcact 3300 tcgagcacct gaaacagttc catcagcacc agagaacccc agaatattta tattaccaag 3360 tggaaaatgc tgcaacaaga atgaagttgt ggtggaattt aggtggaaca aacctaagca 3420 tgaaaatggg gtgttaacaa aatttgaaat tttctacaat atatccaatc aaagtattac 3480 aaacaaaaca tgtgaagact ggattgctgt caatgtcact ccctcagtga tgtcttttca 3540 acttgaaggc atgagtccca gatgctttat tgccttccag gttagggcct ttacatctaa 3600 ggggccagga ccatatgctg acgttgtaaa gtctacaaca tcagaaatca acccatttcc 3660 tcacctcata actcttcttg gtaacaagat agttttttta gatatggatc aaaatcaagt 3720 tgtgtggacg ttttcagcag aaagagttat cagtgccgtt tgctacacag ctgataatga 3780 gatgggatat tatgctgaag gggactcact ctttcttctg cacttgcaca atcgctctag 3840 ctctgagctt ttccaagatt cactggtttt tgatatcaca gttattacaa ttgactggat 3900 ttcaaggcac ctctactttg cactgaaaga atcacaaaat ggaatgcaag tatttgatgt 3960 tgatcttgaa cacaaggtga aatatcccag agaggtgaag attcacaata ggaattcaac 4020 aataatttct ttttctgtat atcctctttt aagtcgcttg tattggacag aagtttccaa 4080 ttttggctac cagatgttct actacagtat tatcagtcac accttgcacc gaattctgca 4140 acccacagct acaaaccaac aaaacaaaag gaatcaatgt tcttgtaatg tgactgaatt 4200 tgagttaagt ggagcaatgg ctattgatac ctctaaccta gagaaaccat tgatatactt 4260 tgccaaagca caagagatct gggcaatgga tctggaaggc tgtcagtgtt ggagagttat 4320 cacagtacct gctatgctcg caggaaaaac ccttgttagc ttaactgtgg atggagatct 4380 tatatactgg atcatcacag caaaggacag cacacagatt tatcaggcaa agaaaggaaa 4440 tggggccatc gtttcccagg tgaaggccct aaggagtagg catatcttgg cttacagttc 4500 agttatgcag ccttttccag ataaagcgtt tctgtctcta gcttcagaca ctgtggaacc 4560 aactatactt aatgccacta acactagcct cacaatcaga ttacctctgg ccaagacaaa 4620 cctcacatgg tatggcatca ccagccctac tccaacatac ctggtttatt atgcagaagt 4680 taatgacagg aaaaacagct ctgacttgaa atatagaatt ctggaatttc aggacagtat 4740 agctcttatt gaagatttac aaccattttc aacatacatg atacagatag ctgtaaaaaa 4800 ttattattca gatcctttgg aacatttacc accaggaaaa gagatttggg gaaaaactaa 4860 aaatggagta ccagaggcag tgcagctcat taatacaact gtgcggtcag acaccagcct 4920 cattatatct tggagagaat ctcacaagcc aaatggacct aaagaatcag tccgttatca 4980 gttggcaatc tcacacctgg ccctaattcc tgaaactcct ctaagacaaa gtgaatttcc 5040 aaatggaagg ctcactctcc ttgttactag actgtctggt ggaaatattt atgtgttaaa 5100 ggttcttgcc tgccactctg aggaaatgtg gtgtacagag agtcatcctg tcactgtgga 5160 aatgtttaac acaccagaga aaccttattc cttggttcca gagaacacta gtttgcaatt 5220 taattggaag gctccattga atgttaacct catcagattt tgggttgagc tacagaagtg 5280 gaaatacaat gagttttacc atgttaaaac ttcatgcagc caaggtcctg cttatgtctg 5340 taatatcaca aatctacaac cttatacttc atataatgtc agagtagtgg tggtttataa 5400 gacgggagaa aatagcacct cacttccaga aagctttaag acaaaagctg gagtcccaaa 5460 taaaccaggc attcccaaat tactagaagg gagtaaaaat tcaatacagt gggagaaagc 5520 tgaagataat ggatgtagaa ttacatacta tatccttgag ataagaaaga gcacttcaaa 5580 taatttacag aaccagaatt taaggtggaa gatgacattt aatggatcct gcagtagtgt 5640 ttgcacatgg aagtccaaaa acctgaaagg aatatttcag ttcagagtag tagctgcaaa 5700 taatctaggg tttggtgaat atagtggaat cagtgagaat attatattag ttggagatga 5760 tttttggata ccagaaacaa gtttcatact tactattata gttggaatat ttctggttgt 5820 tacaatccca ctgacctttg tctggcatag aagattaaag aatcaaaaaa gtgccaagga 5880 aggggtgaca gtgcttataa acgaagacaa agagttggct gagctgcgag gtctggcagc 5940 cggagtaggc ctggctaatg cctgctatgc aatacatact cttccaaccc aagaggagat 6000 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tttcttaaat agcatttata agtccagaga tgaagcaaac 1440 aacagtggag tcataaatga aagctttgaa ggtgaagatg gcgatgtgat ttgtttgaat 1500 tcagatgaca ttatgccagt tgctttaatg gaaacgaaga accgagaagg gttaaactat 1560 atggtacttg ctacagaatg tggccaaggt gaagaaaagt ctgagggtcc tctaggctcc 1620 caggaatctg aatcttgtgg tctgaggaaa gaagagaagg aaccacatgc agacaaagat 1680 ttctgccaag aaaaacaagt ggcttactgc ccttctggca agcctgaagg cctgaactat 1740 gcctgtctca ctcacagtgg atatggagat gggtctgatt aa 1782 <210> 30 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 30 Phe Glu Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro 1 5 10 15 Pro Lys Asp Asp Phe Trp Ile Pro Glu Thr Ser Phe Ile Leu Thr Ile 20 25 30 Ile Val <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 31 aagcccggag gcaacgtt 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 32 aagccgaagg ccgaactt 18 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial 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aacgttttat ggtcctttac tcaccttggt tgaccttgta 1020 gacctgtgtg tagatatttc aaaaggctgt gtctacttgg aacggatgca tttcattcac 1080 agggatctgg cagctagaaa ttgccttgtt tccgtgaaag actataccag tccacggata 1140 gtgaagattg gagactttgg actcgccaga gacatctata aaaatgatta ctatagaaag 1200 agaggggaag gcctgctccc agttcggtgg atggctccag aaagtttgat ggatggaatc 1260 ttcactactc aatctgatgt atggtctttt ggaattctga tttgggagat tttaactctt 1320 ggtcatcagc cttatccagc tcattccaac cttgatgtgt taaactatgt gcaaacagga 1380 gggagactgg agccaccaag aaattgtcct gatgatctgt ggaatttaat gacccagtgc 1440 tgggctcaag aacccgacca aagacctact tttcatagaa ttcaggacca acttcagtta 1500 ttcagaaatt ttttcttaaa tagcatttat aagtccagag atgaagcaaa caacagtgga 1560 gtcataaatg aaagctttga aggtgaagat ggcgatgtga tttgtttgaa ttcagatgac 1620 attatgccag ttgctttaat ggaaacgaag aaccgagaag ggttaaacta tatggtactt 1680 gctacagaat gtggccaagg tgaagaaaag tctgagggtc ctctaggctc ccaggaatct 1740 gaatcttgtg gtctgaggaa agaagagaag gaaccacatg cagacaaaga tttctgccaa 1800 gaaaaacaag tggcttactg cccttctggc aagcctgaag gcctgaacta tgcctgtctc 1860 actcacagtg gatatggaga tgggtctgat taa 1893 <210> 58 <211> 630 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 58 Met Ser Ala Gly Gly Pro Cys Pro Ala Ala Ala Gly Gly Gly Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ala Ser Cys Ser Val Gly Ala Pro Gly Gly Val Ser Met Phe Arg 20 25 30 Trp Leu Glu Val Leu Glu Lys Glu Phe Asp Lys Ala Phe Val Asp Val 35 40 45 Asp Leu Leu Leu Gly Glu Ile Asp Pro Asp Gln Ala Asp Ile Thr Tyr 50 55 60 Glu Gly Arg Gln Lys Met Thr Ser Leu Ser Ser Cys Phe Ala Gln Leu 65 70 75 80 Cys His Lys Ala Gln Ser Val Ser Gln Ile Asn His Lys Leu Glu Ala 85 90 95 Gln Leu Val Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Glu Thr Gln Ala Glu Lys 100 105 110 Val Val Leu Glu Lys Glu Val His Asp Gln Leu Leu Gln Leu His Ser 115 120 125 Ile Gln Leu Gln Leu His Ala Lys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Ser Gly 130 135 140 Thr Ile Lys Ala Lys Leu Glu Arg Glu Leu Glu Ala Asn Lys Lys Glu 145 150 155 160 Lys Met Lys Glu Ala Gln Leu Glu Ala Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys 165 170 175 Glu Asn Glu Ala Leu Arg Arg His Ile Ala Val Leu Gln Ala Glu Val 180 185 190 Tyr Gly Ala Arg Leu Ala Ala Lys Tyr Leu Asp Lys Glu Leu Ala Gly 195 200 205 Ser Thr Leu Pro Thr Gln Glu Glu Ile Glu Asn Leu Pro Ala Phe Pro 210 215 220 Arg Glu Lys Leu Thr Leu Arg Leu Leu Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly 225 230 235 240 Glu Val Tyr Glu Gly Thr Ala Val Asp Ile Leu Gly Val Gly Ser Gly 245 250 255 Glu Ile Lys Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Lys Gly Ser Thr Asp Gln 260 265 270 Glu Lys Ile Glu Phe Leu Lys Glu Ala His Leu Met Ser Lys Phe Asn 275 280 285 His Pro Asn Ile Leu Lys Gln Leu Gly Val Cys Leu Leu Asn Glu Pro 290 295 300 Gln Tyr Ile Ile Leu Glu Leu Met Glu Gly Gly Asp Leu Leu Thr Tyr 305 310 315 320 Leu Arg Lys Ala Arg Met Ala Thr Phe Tyr Gly Pro Leu Leu Thr Leu 325 330 335 Val Asp Leu Val Asp Leu Cys Val Asp Ile Ser Lys Gly Cys Val Tyr 340 345 350 Leu Glu Arg Met His Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys 355 360 365 Leu Val Ser Val Lys Asp Tyr Thr Ser Pro Arg Ile Val Lys Ile Gly 370 375 380 Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg Lys 385 390 395 400 Arg Gly Glu Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu 405 410 415 Met Asp Gly Ile Phe Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile 420 425 430 Leu Ile Trp Glu Ile Leu Thr Leu Gly His Gln Pro Tyr Pro Ala His 435 440 445 Ser Asn Leu Asp Val Leu Asn Tyr Val Gln Thr Gly Gly Arg Leu Glu 450 455 460 Pro Pro Arg Asn Cys Pro Asp Asp Leu Trp Asn Leu Met Thr Gln Cys 465 470 475 480 Trp Ala Gln Glu Pro Asp Gln Arg Pro Thr Phe His Arg Ile Gln Asp 485 490 495 Gln Leu Gln Leu Phe Arg Asn Phe Phe Leu Asn Ser Ile Tyr Lys Ser 500 505 510 Arg Asp Glu Ala Asn Asn Ser Gly Val Ile Asn Glu Ser Phe Glu Gly 515 520 525 Glu Asp Gly Asp Val Ile Cys Leu Asn Ser Asp Asp Ile Met Pro Val 530 535 540 Ala Leu Met Glu Thr Lys Asn Arg Glu Gly Leu Asn Tyr Met Val Leu 545 550 555 560 Ala Thr Glu Cys Gly Gln Gly Glu Glu Lys Ser Glu Gly Pro Leu Gly 565 570 575 Ser Gln Glu Ser Glu Ser Cys Gly Leu Arg Lys Glu Glu Lys Glu Pro 580 585 590 His Ala Asp Lys Asp Phe Cys Gln Glu Lys Gln Val Ala Tyr Cys Pro 595 600 605 Ser Gly Lys Pro Glu Gly Leu Asn Tyr Ala Cys Leu Thr His Ser Gly 610 615 620 Tyr Gly Asp Gly Ser Asp 625 630 <210> 59 <211> 3030 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 59 atgtcggcgg gcggtccatg cccagcagca gccggagggg gcccaggggg cgcctcctgc 60 tccgtggggg cccctggcgg ggtatccatg ttccggtggc tggaggtgct ggagaaggag 120 ttcgacaaag cttttgtgga tgtggatctg ctcctgggag agatcgatcc agaccaagcg 180 gacatcactt atgaggggcg acagaagatg accagcctga gctcctgctt tgcacagctt 240 tgccacaaag cccagtctgt gtctcaaatc aaccacaagc tggaggcaca gttggtggat 300 ctgaaatctg aactgacaga aacccaagca gagaaagttg ttttggagaa agaagtacat 360 gatcagcttt tacagctgca ctctattcag ctgcagcttc atgctaaaac tggtcaaagt 420 gctgactctg gtaccattaa ggcaaaattg gaaagagagc ttgaggcaaa caaaaaagaa 480 aaaatgaaag aagcacaact tgaagctgaa gtgaaattgt tgagaaaaga gaatgaagcc 540 cttcgtagac atatagctgt tctccaggct gaagtatatg gggcgagact agctgccaag 600 tacttggata aggaactggc aggaagggtc caacagatac aattgctagg acgagatatg 660 aagggacctg ctcatgataa gctttggaac caattagaag ctgaaataca tttgcatcgt 720 cacaaaactg tgatccgagc ctgcagagga cgtaatgact tgaaacgacc aatgcaagca 780 ccaccaggcc atgatcaaga ttccctaaag aaaagccaag gtgttggtcc aattagaaaa 840 gttctcctcc ttaaggaaga tcatgaaggc cttggcattt caattacagg tgggaaagaa 900 catggtgttc caatcctcat ctctgagatc catccggggc aacctgctga tagatgcgga 960 gggctgcacg ttggggatgc tattttggca gtcaacggag ttaacctaag ggacacaaag 1020 cataaagaag ctgtaactat tctttctcag cagagaggag agattgaatt tgaagtagtt 1080 tatgtggctc ctgaagtgga ttctgatgat gaaaacgtag agtatgaaga tgagagtgga 1140 catcgttacc gtttgtacct tgatgagtta gaaggaggtg gtaaccctgg tgctagttgc 1200 aaagacacaa gtggggaaat caaagtatta caagctggag tcccaaataa accaggcatt 1260 cccaaattac tagaagggag taaaaattca atacagtggg agaaagctga agataatgga 1320 tgtagaatta catactatat ccttgagata agaaagagca cttcaaataa tttacagaac 1380 cagaatttaa ggtggaagat gacatttaat ggatcctgca gtagtgtttg cacatggaag 1440 tccaaaaacc tgaaaggaat atttcagttc agagtagtag ctgcaaataa tctagggttt 1500 ggtgaatata gtggaatcag tgagaatatt atattagttg gagatgattt ttggatacca 1560 gaaacaagtt tcatacttac tattatagtt ggaatatttc tggttgttac aatcccactg 1620 acctttgtct ggcatagaag attaaagaat caaaaaagtg ccaaggaagg ggtgacagtg 1680 cttataaacg aagacaaaga gttggctgag ctgcgaggtc tggcagccgg agtaggcctg 1740 gctaatgcct gctatgcaat acatactctt ccaacccaag aggagattga aaatcttcct 1800 gccttccctc gggaaaaact gactctgcgt ctcttgctgg gaagtggagc ctttggagaa 1860 gtgtatgaag gaacagcagt ggacatctta ggagttggaa gtggagaaat caaagtagca 1920 gtgaagactt tgaagaaggg ttccacagac caggagaaga ttgaattcct gaaggaggca 1980 catctgatga gcaaatttaa tcatcccaac attctgaagc agcttggagt ttgtctgctg 2040 aatgaacccc aatacattat cctggaactg atggagggag gagaccttct tacttatttg 2100 cgtaaagccc ggatggcaac gttttatggt cctttactca ccttggttga ccttgtagac 2160 ctgtgtgtag atatttcaaa aggctgtgtc tacttggaac ggatgcattt cattcacagg 2220 gatctggcag ctagaaattg ccttgtttcc gtgaaagact ataccagtcc acggatagtg 2280 aagattggag actttggact cgccagagac atctataaaa atgattacta tagaaagaga 2340 ggggaaggcc tgctcccagt tcggtggatg gctccagaaa gtttgatgga tggaatcttc 2400 actactcaat ctgatgtatg gtcttttgga attctgattt gggagatttt aactcttggt 2460 catcagcctt atccagctca ttccaacctt gatgtgttaa actatgtgca aacaggaggg 2520 agactggagc caccaagaaa ttgtcctgat gatctgtgga atttaatgac ccagtgctgg 2580 gctcaagaac ccgaccaaag acctactttt catagaattc aggaccaact tcagttattc 2640 agaaattttt tcttaaatag catttataag tccagagatg aagcaaacaa cagtggagtc 2700 ataaatgaaa gctttgaagg tgaagatggc gatgtgattt gtttgaattc agatgacatt 2760 atgccagttg ctttaatgga aacgaagaac cgagaagggt taaactatat ggtacttgct 2820 acagaatgtg gccaaggtga agaaaagtct gagggtcctc taggctccca ggaatctgaa 2880 tcttgtggtc tgaggaaaga agagaaggaa ccacatgcag acaaagattt ctgccaagaa 2940 aaacaagtgg cttactgccc ttctggcaag cctgaaggcc tgaactatgc ctgtctcact 3000 cacagtggat atggagatgg gtctgattaa 3030 <210> 60 <211> 1009 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 60 Met Ser Ala Gly Gly Pro Cys Pro Ala Ala Ala Gly Gly Gly Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ala Ser Cys Ser Val Gly Ala Pro Gly Gly Val Ser Met Phe Arg 20 25 30 Trp Leu Glu Val Leu Glu Lys Glu Phe Asp Lys Ala Phe Val Asp Val 35 40 45 Asp Leu Leu Leu Gly Glu Ile Asp Pro Asp Gln Ala Asp Ile Thr Tyr 50 55 60 Glu Gly Arg Gln Lys Met Thr Ser Leu Ser Ser Cys Phe Ala Gln Leu 65 70 75 80 Cys His Lys Ala Gln Ser Val Ser Gln Ile Asn His Lys Leu Glu Ala 85 90 95 Gln Leu Val Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Glu Thr Gln Ala Glu Lys 100 105 110 Val Val Leu Glu Lys Glu Val His Asp Gln Leu Leu Gln Leu His Ser 115 120 125 Ile Gln Leu Gln Leu His Ala Lys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Ser Gly 130 135 140 Thr Ile Lys Ala Lys Leu Glu Arg Glu Leu Glu Ala Asn Lys Lys Glu 145 150 155 160 Lys Met Lys Glu Ala Gln Leu Glu Ala Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys 165 170 175 Glu Asn Glu Ala Leu Arg Arg His Ile Ala Val Leu Gln Ala Glu Val 180 185 190 Tyr Gly Ala Arg Leu Ala Ala Lys Tyr Leu Asp Lys Glu Leu Ala Gly 195 200 205 Arg Val Gln Gln Ile Gln Leu Leu Gly Arg Asp Met Lys Gly Pro Ala 210 215 220 His Asp Lys Leu Trp Asn Gln Leu Glu Ala Glu Ile His Leu His Arg 225 230 235 240 His Lys Thr Val Ile Arg Ala Cys Arg Gly Arg Asn Asp Leu Lys Arg 245 250 255 Pro Met Gln Ala Pro Pro Gly His Asp Gln Asp Ser Leu Lys Lys Ser 260 265 270 Gln Gly Val Gly Pro Ile Arg Lys Val Leu Leu Leu Lys Glu Asp His 275 280 285 Glu Gly Leu Gly Ile Ser Ile Thr Gly Gly Lys Glu His Gly Val Pro 290 295 300 Ile Leu Ile Ser Glu Ile His Pro Gly Gln Pro Ala Asp Arg Cys Gly 305 310 315 320 Gly Leu His Val Gly Asp Ala Ile Leu Ala Val Asn Gly Val Asn Leu 325 330 335 Arg Asp Thr Lys His Lys Glu Ala Val Thr Ile Leu Ser Gln Gln Arg 340 345 350 Gly Glu Ile Glu Phe Glu Val Val Tyr Val Ala Pro Glu Val Asp Ser 355 360 365 Asp Asp Glu Asn Val Glu Tyr Glu Asp Glu Ser Gly His Arg Tyr Arg 370 375 380 Leu Tyr Leu Asp Glu Leu Glu Gly Gly Gly Asn Pro Gly Ala Ser Cys 385 390 395 400 Lys Asp Thr Ser Gly Glu Ile Lys Val Leu Gln Ala Gly Val Pro Asn 405 410 415 Lys Pro Gly Ile Pro Lys Leu Leu Glu Gly Ser Lys Asn Ser Ile Gln 420 425 430 Trp Glu Lys Ala Glu Asp Asn Gly Cys Arg Ile Thr Tyr Tyr Ile Leu 435 440 445 Glu Ile Arg Lys Ser Thr Ser Asn Asn Leu Gln Asn Gln Asn Leu Arg 450 455 460 Trp Lys Met Thr Phe Asn Gly Ser Cys Ser Ser Val Cys Thr Trp Lys 465 470 475 480 Ser Lys Asn Leu Lys Gly Ile Phe Gln Phe Arg Val Val Ala Ala Asn 485 490 495 Asn Leu Gly Phe Gly Glu Tyr Ser Gly Ile Ser Glu Asn Ile Ile Leu 500 505 510 Val Gly Asp Asp Phe Trp Ile Pro Glu Thr Ser Phe Ile Leu Thr Ile 515 520 525 Ile Val Gly Ile Phe Leu Val Val Thr Ile Pro Leu Thr Phe Val Trp 530 535 540 His Arg Arg Leu Lys Asn Gln Lys Ser Ala Lys Glu Gly Val Thr Val 545 550 555 560 Leu Ile Asn Glu Asp Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Gly Leu Ala Ala 565 570 575 Gly Val Gly Leu Ala Asn Ala Cys Tyr Ala Ile His Thr Leu Pro Thr 580 585 590 Gln Glu Glu Ile Glu Asn Leu Pro Ala Phe Pro Arg Glu Lys Leu Thr 595 600 605 Leu Arg Leu Leu Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Glu Val Tyr Glu Gly 610 615 620 Thr Ala Val Asp Ile Leu Gly Val Gly Ser Gly Glu Ile Lys Val Ala 625 630 635 640 Val Lys Thr Leu Lys Lys Gly Ser Thr Asp Gln Glu Lys Ile Glu Phe 645 650 655 Leu Lys Glu Ala His Leu Met Ser Lys Phe Asn His Pro Asn Ile Leu 660 665 670 Lys Gln Leu Gly Val Cys Leu Leu Asn Glu Pro Gln Tyr Ile Ile Leu 675 680 685 Glu Leu Met Glu Gly Gly Asp Leu Leu Thr Tyr Leu Arg Lys Ala Arg 690 695 700 Met Ala Thr Phe Tyr Gly Pro Leu Leu Thr Leu Val Asp Leu Val Asp 705 710 715 720 Leu Cys Val Asp Ile Ser Lys Gly Cys Val Tyr Leu Glu Arg Met His 725 730 735 Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu Val Ser Val Lys 740 745 750 Asp Tyr Thr Ser Pro Arg Ile Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala 755 760 765 Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg Lys Arg Gly Glu Gly Leu 770 775 780 Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Met Asp Gly Ile Phe 785 790 795 800 Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Ile Trp Glu Ile 805 810 815 Leu Thr Leu Gly His Gln Pro Tyr Pro Ala His Ser Asn Leu Asp Val 820 825 830 Leu Asn Tyr Val Gln Thr Gly Gly Arg Leu Glu Pro Pro Arg Asn Cys 835 840 845 Pro Asp Asp Leu Trp Asn Leu Met Thr Gln Cys Trp Ala Gln Glu Pro 850 855 860 Asp Gln Arg Pro Thr Phe His Arg Ile Gln Asp Gln Leu Gln Leu Phe 865 870 875 880 Arg Asn Phe Phe Leu Asn Ser Ile Tyr Lys Ser Arg Asp Glu Ala Asn 885 890 895 Asn Ser Gly Val Ile Asn Glu Ser Phe Glu Gly Glu Asp Gly Asp Val 900 905 910 Ile Cys Leu Asn Ser Asp Asp Ile Met Pro Val Ala Leu Met Glu Thr 915 920 925 Lys Asn Arg Glu Gly Leu Asn Tyr Met Val Leu Ala Thr Glu Cys Gly 930 935 940 Gln Gly Glu Glu Lys Ser Glu Gly Pro Leu Gly Ser Gln Glu Ser Glu 945 950 955 960 Ser Cys Gly Leu Arg Lys Glu Glu Lys Glu Pro His Ala Asp Lys Asp 965 970 975 Phe Cys Gln Glu Lys Gln Val Ala Tyr Cys Pro Ser Gly Lys Pro Glu 980 985 990 Gly Leu Asn Tyr Ala Cys Leu Thr His Ser Gly Tyr Gly Asp Gly Ser 995 1000 1005 Asp <210> 61 <211> 278 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 61 Leu Thr Leu Arg Leu Leu Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Glu Val Tyr 1 5 10 15 Glu Gly Thr Ala Val Asp Ile Leu Gly Val Gly Ser Gly Glu Ile Lys 20 25 30 Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Lys Gly Ser Thr Asp Gln Glu Lys Ile 35 40 45 Glu Phe Leu Lys Glu Ala His Leu Met Ser Lys Phe Asn His Pro Asn 50 55 60 Ile Leu Lys Gln Leu Gly Val Cys Leu Leu Asn Glu Pro Gln Tyr Ile 65 70 75 80 Ile Leu Glu Leu Met Glu Gly Gly Asp Leu Leu Thr Tyr Leu Arg Lys 85 90 95 Ala Arg Met Ala Thr Phe Tyr Gly Pro Leu Leu Thr Leu Val Asp Leu 100 105 110 Val Asp Leu Cys Val Asp Ile Ser Lys Gly Cys Val Tyr Leu Glu Arg 115 120 125 Met His Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu Val Ser 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Thr Ser Pro Arg Ile Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly 145 150 155 160 Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg Lys Arg Gly Glu 165 170 175 Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Met Asp Gly 180 185 190 Ile Phe Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Ile Trp 195 200 205 Glu Ile Leu Thr Leu Gly His Gln Pro Tyr Pro Ala His Ser Asn Leu 210 215 220 Asp Val Leu Asn Tyr Val Gln Thr Gly Gly Arg Leu Glu Pro Pro Arg 225 230 235 240 Asn Cys Pro Asp Asp Leu Trp Asn Leu Met Thr Gln Cys Trp Ala Gln 245 250 255 Glu Pro Asp Gln Arg Pro Thr Phe His Arg Ile Gln Asp Gln Leu Gln 260 265 270 Leu Phe Arg Asn Phe Phe 275 <210> 62 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 62 Val Gly Val Trp His Arg 1 5 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 63 Leu Val Gly Asp Asp Phe 1 5 <210> 64 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 64 Leu Val Gly Ala Gly Val 1 5 <210> 65 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 65 Pro Pro Lys Asp Asp Phe 1 5 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 66 Ala Gly Ser Thr Leu Pro 1 5 <210> 67 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 67 Leu Gln Val Trp His Arg 1 5 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 68 Val Leu Gln Ala Gly Val 1 5

Claims (27)

  1. 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암으로부터의 생물학적 샘플에서 FIG-ROS 융합 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    FIG-ROS 융합 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 시약을 이용하여 상기 폴리펩타이드가 상기 생물학적 샘플 내에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며,
    여기에서, 상기 생물학적 샘플에 대한 상기 시약의 특이적 결합의 검출은, 상기 폴리펩타이드가 상기 생물학적 샘플에 존재하는 것을 나타내는
    방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 폐 생검(lung biopsy), 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage), 종양 절제물(tumor resection), 미세바늘 흡입물(fine needle aspirate) 또는 흉수(pleural effusion)로부터 선택되는
    방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 포유류 폐암은 인간 폐암인
    방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 인간 폐암은 인간 비소세포암종(NSCLC)인
    방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FIG-ROS 융합 폴리펩타이드는 FIG-ROS(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 58), FIG-ROS(L) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 56) 및 FIG-ROS(VL) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 60)로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드와 95% 동일한
    방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약은 항체를 포함하는
    방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 방법은 유세포분석 분석, 면역조직화학(IHC) 분석, 면역형광(IF) 분석, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 분석, 및 웨스턴 블롯 분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포맷에서 수행되는
    방법.
  8. 포유류 폐암 또는 의심되는 포유류 폐암으로부터의 생물학적 샘플에서 FIG-ROS 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    FIG-ROS 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며,
    여기에서, 상기 생물학적 샘플에 대한 상기 시약의 특이적 결합의 검출은, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 생물학적 샘플에 존재하는 것을 나타내는
    방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 폐 생검(lung biopsy), 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage), 종양 절제물(tumor resection), 미세바늘 흡입물(fine needle aspirate) 또는 흉수(pleural effusion)로부터 선택되는
    방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 포유류 폐암은 인간 폐암인
    방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 인간 폐암은 인간 비소세포암종(NSCLC)인
    방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FIG-ROS 융합 폴리펩타이드는 FIG-ROS(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 58), FIG-ROS(L) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 56) 및 FIG-ROS(VL) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 60)로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드와 95% 동일한
    방법.
  13. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 55, 및 SEQ ID NO: 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는
    방법.
  14. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약은 핵산 프로브인
    방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 핵산 프로브는 형광 인시츄 하이브리다이제이션(FISH) 프로브이며, 상기 방법은 FISH 분석에서 수행되는
    방법.
  16. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머쌍을 포함하며, 상기 방법은 PCR 분석에서 수행되는
    방법.
  17. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    상기 시약은 검출가능하게 표지되는
    방법.
  18. FIG-ROS 융합 폴리펩타이드를 발현하는 인간 폐암의 진행을 억제하기 위한 ROS 억제 치료제를 포함하는 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 ROS 억제 치료제는 PF-02341066, NVT TAE-684, 및 AP26113로 이루어진 군으로부터 선택되는
    약학적 조성물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 인간 폐암은 인간 비소세포암종(NSCLC)인
    약학적 조성물.
  21. 폐암 또는 의심되는 폐암을 앓는 환자를 ROS-억제 치료제에 반응하기 쉬운 환자로 확인하는 방법으로서, 상기 방법은:
    상기 환자의 폐로부터의 생물학적 샘플을 FIG-ROS 융합 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시키는 단계, 및
    상기 시약이 상기 생물학적 샘플에 특이적으로 결합하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하며,
    여기에서, 상기 생물학적 샘플에 대한 상기 시약의 결합의 검출에 의해 상기 환자는 ROS-억제 치료제에 반응하기 쉬운 환자로 확인되는
    방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 ROS-억제 치료제는 PF-02341066, NVT TAE-684, 또는 AP26113인
    방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    상기 폐암은 비소세포암종(NSCLC)인
    방법.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
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