KR102167739B1 - Alk 또는 ros-1 인산화 효소 억제제 스크리닝을 위한 방법, 조성물 및 키트 및 방법 - Google Patents

Alk 또는 ros-1 인산화 효소 억제제 스크리닝을 위한 방법, 조성물 및 키트 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제 스크리닝을 위한 방법, 조성물 및 키트가 개시된다. 일 측면에서, 정량 및 정성이 동시에 분석이 가능하며, 기존의 분자생물학적 실험법과 비교하여 보다 신속하고 대량의 후보 물질에 대한 스크리닝이 가능하고, ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제 후보 물질에 대하여 다수개의 서로 다른 대사체를 이용한 세포주 내에서의 변화 수준을 전체적으로 파악할 수 있게 하는 바 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제 효과를 나타내는 약제에 대한 스크리닝 효율이 뛰어나다. 이에 따라, 본 발명은 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제 효과를 나타내는 신약 개발에서 다양하게 활용될 수 있다는 이점이 있다.

Description

ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제 스크리닝을 위한 방법, 조성물 및 키트 및 방법{Method, composition and kit for screening ALK or ROS-1 kinase inhibitor}
본 명세서에는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제 스크리닝을 위한 방법, 조성물 및 키트가 개시된다.
2014년 모든 암의 조발생률(조발생률(암발생률): 해당 관찰기간동안 특정 인구집단에서 새롭게 발생한 암환자수)은 인구 10만 명당 427.6명(남자 444.9명, 여자 410.3명)이었으며, 2000년 주민등록연앙인구(해당 연도의 중앙일인 7월 1일의 인구수)로 보정한 연령표준화발생률은 인구 10만 명당 289.1명(남자 312.4명, 여자 282.9명)이었다.
암 중 사망률 1위를 차지하는 폐암은 조기발견이 쉽지 않으며, 재발 및 전이가 다른 암보다 많다. 특히 폐암은 림프나 혈액을 통해 퍼지며 주로 다른 부위의 폐나, 뼈, 간, 뇌 등으로 전이된다. 실제로 비소세포폐암 환자의 55-80%가 처음 진단 당시 이미 암이 국소적으로 진행됐거나 전이를 동반한 채로 발견된다. 이 중 뇌 전이 환자들은 특이적 치료를 받지 않을 경우 생존기간이 평균 1-2개월에 불과할 정도다. 이에 최근에는 `표적항암제`가 잇따라 등장했고, 환자의 삶의 질 향상 및 생존기간의 연장 가능성이 높아지고 있다. 표적치료제 (target therapy)는 암세포가 자신의 성장, 분화, 증식을 유지하기 위해 필요한 단백질 경로의 특정 부위를 차단하여 항암 효과를 나타내기 때문에 정상세포에는 거의 영향을 주지 않는다.
비소세포폐암(Non small lung cancer cell)에서 필라델피아 염색체와 같이 혈액암에서 주로 발견되던 전좌(translocation)를 통한 융합 종양유전자가 등장했다. 폐암의 대표적인 융합 종양유전자(fusion oncogene)는 ALK, ROS1가 있으며, 이들 ALK 및 ROS-1 변이 비소세포폐암 저해제의 중요성이 대두됨에 따라, 비소세포폐암을 저해하는 신약개발을 위해 개발 초기단계에서 약물 후보군의 약효 평가는 성공적인 신약개발을 위한 필수 요건이 되었다.
신약개발 시 약효를 평가하기 위한 표적항암제 및 약물에 대한 전 임상 연구는 주로 생체 외의 세포 실험과 동물실험을 통하여 진행되고 있다. 이 중 본 발명에서 적용한 대사체학(metabolomics) 기법은 세포 과정(Cellular process) 중 발생하는 소분자 대사산물 전체(대사체; metabolome)에 대하여 종합적인 연구를 하는 학문으로, 약효와 관련된 바이오마커 도출과 더불어 전체적인 세포 상태, 체계와 관련된 대사 상태 및 거시적 생화학적 사건 관측을 가능하게 한다. 따라서 대사체학 기법을 신약 개발 스크리닝에 도입하여 약물이 세포 내에 투입되어 변하는 대사체들을 스크리닝 함으로써 후보 물질에 대한 평가를 대량 신속처리(High-throughput) 방식으로 평가할 수 있다. 또한 기존 분자생물학적 실험법보다 정량 및 정성이 동시 분석이 가능하다는 점과 대량 분석이 가능하다는 점에서 장점을 가지고 있다. 그러나, 현재의 바이오마커 시장은 유전체, 단백질체, 대사체 바이오마커를 포함하고 있지만 유전체에 집중되어 있다. 하지만 유전체 보다 유전자의 기능을 볼 수 있는 단백질체, 대사체를 이용한 오믹스(omics) 기반의 신약 개발 스크리닝의 가능성 및 개발이 대두 되고 있는 상황이다.
이를 바탕으로 본 발명자들은 ALK/ROS-1 표적 치료제를 스크리닝 할 수 있는 바이오마커를 대사체학 연구를 통해 도출하고, 이의 기능을 검증하고자 다양한 연구를 수행한 끝에, 아데노신(adenosine), AMP(adenosine monophosphate), cAMP(cyclic adenosine monophosphate)가 ALK/ROS-1 표적 치료제로 알려진 크리조티닙과 세리티닙의 처리에 따라 공통적으로 변화하는 특정 바이오마커임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
KR 공개특허공보 10-2016-0096931호 KR 공개특허공보 10-2014-0033282호 KR 공개특허공보 10-2018-0010135호
일 측면에서, 본 발명의 목적은 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝 방법, 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
일 측면에서, 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 후보 물질을 처리한 세포주 내 아데노신, AMP 및 cAMP 중 하나 이상의 대사체의 레벨을 측정하는 단계; 및 측정한 아데노신, AMP 및 cAMP 중 하나 이상의 대사체의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하는 단계;를 포함하는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 과제를 달성하기 위하여, 일 측면에서 본 발명은 아데노신, AMP 및 cAMP 중 하나 이상의 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
일 측면에서 본 발명은 아데노신, AMP 및 cAMP 중 하나 이상의 대사체의 레벨(level) 측정부를 포함하는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝 키트를 제공한다.
일 측면에서, 정량 및 정성이 동시에 분석이 가능하며, 기존의 분자생물학적 실험법과 비교하여 보다 신속하고 대량의 후보 물질에 대한 스크리닝이 가능하고, ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제 후보 물질에 대하여 다수개의 서로 다른 대사체를 이용한 세포주 내에서의 변화 수준을 전체적으로 파악할 수 있게 하는 바 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제 효과를 나타내는 약제에 대한 스크리닝 효율이 뛰어나다. 이에 따라, 본 발명은 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제 효과를 나타내는 신약 개발에서 다양하게 활용될 수 있다는 이점이 있다.
도 1은 WST-1 분석을 통한 폐암종 세포주(HCC-78)에 대한 세포 성장 저해 효과 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 WST-1 분석을 통한 A549 세포주에 대한 세포 성장 저해 효과 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 MTT 분석을 통한 유방암종 세포주(MCF-7)의 세포생존률 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 폐암종 세포주(HCC-78)에 ALK/ROS-1 인산화 효소 활성 억제제를 처리한 후 대사체 변화를 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry, UHPLC-MS)를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 유방암종 세포주(MCF-7)에 ALK/ROS-1 인산화 효소 활성 억제제를 처리한 후 대사체 변화를 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 도 4에 나타낸 결과값을 크로마토그램 데이터 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 도 5에 나타낸 결과값을 크로마토그램 데이터 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 도 6에 나타낸 결과값을 보정한 데이터에 대하여 t-검증을 수행한 결과를 heat map으로 나타낸 도이다.
도 9는 도 7에 나타낸 결과값을 보정한 데이터에 대하여 t-검증을 수행한 결과를 heat map으로 나타낸 도이다.
도 10은 도 6에 나타낸 결과값을 보정한 데이터에 대하여 t-검증을 수행한 결과를 상자 수염 그림으로 나타낸 도이다.
도 11은 도 7에 나타낸 결과값을 보정한 데이터에 대하여 t-검증을 수행한 결과를 상자 수염 그림으로 나타낸 도이다.
이하, 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 후보 물질을 처리한 세포주 내 아데노신, AMP 및 cAMP 중 하나 이상의 대사체의 레벨을 측정하는 단계; 및 측정한 아데노신, AMP 및 cAMP 중 하나 이상의 대사체의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하는 단계;를 포함하는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다. 일 구현예에서 상기 방법은 후보 물질을 처리하기 전 세포주 내 아데노신, AMP 및 cAMP 중 하나 이상의 대사체의 레벨을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, '스크리닝'은 특정한 대사체를 선별 및/또는 검출하는 조작에 관한 것이다.
일 측면에서, 'ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제'는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 발현 억제제, ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 활성 억제제를 포함할 수 있고, ALK 또는 ROS-1 단백질 티로신 인산화 효소 억제제 또한 포함할 수 있는 개념으로, 일례로 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제는 암 치료제를 포함할 수 있고, 바람직하게는 폐암 치료제, 유방암 치료제, 뇌암 치료제, 췌장암 치료제 및 대장암 치료제 중 하나 이상일 수 있으며, 일례로 상기 암 치료제는 ALK 또는 ROS-1 변이 암 치료제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 폐암 치료제는 일반적으로 폐에서 기원한 악성 종양인 원발성 폐암의 치료제를 의미하며, 일례로 비소세포폐암 치료제 또는 소세포폐암 치료제, ALK 또는 ROS-1 변이 폐암일 수 있다. 일례로 상기 비소세폐암은 폐선암(adenocarcinoma), 폐편평상피세포암(squamous cell carcinoma), 페대세포암(large cell carcinoma)일 수 있다. 일례로 ALK 또는 ROS-1 변이는 ALK 단백질의 N-말단으부터 1604번째 티로신이 인산화된 것, 또는 ROS-1 단백질의 N-말단으로부터 2274번째 티로신이 인산화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 폐암종 세포주, 유방암종 세포주, 뇌암 세포주, 췌장암 세포주 및 대장암 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포주를 유효성분으로 더 포함할 수 있고, 상기 각 세포주들은 일 구현예에서 폐암종 세포주, 유방암종 세포주, 뇌암 세포주, 췌장암 세포주 또는 대장암 세포주일 수 있고, 다른 구현예에서 상기 세포주들은 ALK 또는 ROS-1 과발현 세포주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 상기 '과발현'은 ALK 또는 ROS-1의 발현 수준이 각 조직의 정상 세포와 비교하여 1.1 배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.5배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2.0배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 4배 이상, 4.5배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 35배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 50배 이상 더 높은 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일례로 상기 폐암종 세포주는 비소세포폐암종 세포주 또는 소세포폐암종일 수 있고, 또는 상기 폐암종 세포주는 ROS-1 또는 ALK 과발현 폐암 세포주일 수 있다. 보다 바람직한 예로 상기 폐암종 세포주는 ALK 과발현 폐암 세포주인 H3122 세포주, 또는 ROS-1 과발현 폐암 세포주인 HCC-78 세포주일 수 있으며, 가장 바람직하게는 HCC-78 세포주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용한 HCC-78 세포주는 기탁번호 KCTC 13642BP로 기탁하였다.
일례로 상기 유방암종 세포주는 유방상피내암 세포주일 수 있고, 보다 바람직하게는 MCF-7 세포주, MDA-MB-231 세포주 및 SK-BR-3 세포주일 수 있고 가장 바람직하게는 MCF-7 세포주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. MCF-7 세포는 ALK와 ROS-1가 발현되어 있는 세포이기는 하나 이들을 과발현하는 세포는 아니나 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제 스크리닝에 활용할 수 있다는 점에 기술적 특이성이 존재한다. 상기 유방상피내암 세포주는 유방암상피세포주로 지칭될 수도 있으며, 본 발명에서 사용한 MCF-7 세포주는 기탁번호 KCTC 13643BP로 기탁하였다.
일 구현예에서, 상기 방법은 측정한 대사체의 레벨을 다변량 분석(multivariate analysis)하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 다변량 분석이란 일례로 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제에 효과가 있는 후보 물질에 의하여 대상이 되는 세포주에서 특이적으로 변화하는 3종 이상의 대사체들 중 둘 이상의 체내 레벨 변화를 동시에 분석하는 통계적 분석 방식을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 세포주에서 상기 아데노신 또는 cAMP의 함량이 후보 물질 처리 전보다 높아지면 후보 물질이 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제로 적합하다고 판단하고, 물질 처리 전보다 낮아지거나 동일하면 후보 물질이 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제로 부적합하다고 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포주에서 상기 AMP의 함량이 물질 처리 전보다 낮아지면 후보 물질이 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제로 적합하다고 판단하고, 물질 처리 전보다 높거나 동일하면 후보 물질이 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제로 부적합하다고 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 후보 물질 처리 전 후의 대사체의 함량 변화값에 대하여 t-검증을 수행한 후 p값이 0.15 이하, 0.14 이하, 0.13 이하, 0.12 이하, 0.11 이하, 0.1 이하, 0.09 이하, 0.08 이하, 0.07 이하, 0.06 이하, 0.05 이하, 0.04 이하, 0.03 이하, 0.02, 0.01 이하의 값을 나타낼 때 그 물질을 유의적인 변화를 나타내는 대사체로 분류하였고, 바람직하게는 0.05 이하의 값을 나타낼 때 그 물질을 유의적인 변화를 나타내는 대사체로 분류하였다. 혹은, 일 구현예에서, 상기 후보 물질 처리 전 후의 각 대사체의 함량 변화에 대하여 백분율 차이가 ±28 이하, ±27 이하, ±26 이하, ±25 이하, ±24 이하, ±23 이하, ±22 이하, ±21 이하, ±20 이하, ±19 이하, ±18 이하, ±17 이하, ±16 이하, ±15 이하, ±14 이하, ±13 이하, ±12 이하, ±11 이하, ±10 이하, ±9 이하, ±8 이하, ±7 이하, ±6 이하, ±5 이하, ±4 이하, ±3 이하, ±2 이하, ±1 이하일 때 유의적인 차이가 존재하지 않는 것으로 분류할 수 있으나, 이에 본 발명이 제한되지 않는다.
일 측면에서, 본 발명은 아데노신, AMP 및 cAMP 중 하나 이상의 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, '대사체를 검출하는 물질'은 아데노산, AMP, cAMP를 포함하는 대사체들을 검출할 수 있는 물질이라면 어느 것이든 제한 없이 포함된다. 일례로 상기 대사체를 검출하는 물질은 항체, ELISA 키트 내 효소 등일 수 있으며, 보다 구체적으로는 항-cAMP (LifeSpan BioSciences사, #LS-C121425-50) 등의 항체, AMP ELISA 키트(#ABIN2051817) 등일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 아데노신, AMP 및 cAMP 중 하나 이상의 대사체의 레벨(level) 측정부를 포함하는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝 키트를 제공한다.
일 구현예에서, '대사체의 레벨'은 시료 내에 포함되는 대사체의 농도, 질량 등 객관적인 수치 및 해당 물질의 타 물질에 대한 상대량을 모두 포함하는 최광의의 의미이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 폐암종 세포주, 유방암종 세포주, 뇌암 세포주, 췌장암 세포주 또는 대장암 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포주를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트의 대사체의 레벨 측정부는 상기 기술한 스크리닝용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 대사체 레벨 측정부에서 측정된 대사체들의 레벨을 분석하는 다변량 분석(multivariate analysis) 시스템을 더 포함할 수 있으며, 상기 다변량 분석 시스템은 일례로 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제에 효과가 있는 후보 물질에 의하여 대상이 되는 세포주에서 특이적으로 변화하는 3종 이상의 대사체들 중 둘 이상의 체내 레벨 변화를 동시에 분석하는 통계적 시스템을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 키트는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제를 스크리닝할 수 있는 방법, 또는 스크리닝 대상이 되는 대사체에 대한 설명을 포함하는 지시서를 더 포함할 수 있다. 일례로 상기 지시서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있으며, 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함하는 안내서 등을 더 포함할 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다. 또한, 본 명세서에 기재된 '또는' 이라는 표현은, 별도의 언급이 없다면, '및'을 포함하는 개념으로 이해하여야 할 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 폐암종 세포주 또는 유방암종 세포주의 ALK/ROS-1 특이적 인산화 효소 억제제에 대한 세포 생존률 확인
폐암종 세포주 또는 유방암종 세포주가 ALK/ROS-1 특이적 인산화 효소 억제제의 스크리닝에 적합한 세포주로 활용될 수 있을지 여부를 확인하기 위하여, 상기 각 세포주에 공지된 ALK/ROS-1 특이적 인산화 효소 억제제를 처리한 후 각각 WST-1 분석 및 MTT 분석을 수행하여 세포 생존률 변화를 확인하였다.
1-1. WST-1 분석을 통한 폐암종 세포주(HCC-78)에 대한 세포 성장 저해 효과 확인
이 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 방식에 따라 WST-1 분석을 수행하여 ALK 특이적 효소 저해제이자 ROS-1 특이적 효소 저해제인 크리조티닙(crizotinib)과 세리티닙(ceritinib)에 의한 HCC-78 세포주의 성장 저해율을 확인하였다. 구체적으로, 2018.9.17일자로 기탁번호 KCTC13642BP로 기탁된 HCC-78 폐암 세포를 37℃ 온도의 5% 이산화탄소 세포배양기에서 10 %의 소태아혈청과 1 %의 항생제가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 세포수가 5.2 x 103 개가 되도록 배양하였다. 이 후 세포의 성장이 안정화되면, 총 배지의 0.01 %이자 1 μM 농도가 되도록 ALK 및 ROS-1 인산화 효소 저해제인 크리조티닙과 세리티닙을 각각 처리한 후, 각각 24, 48, 및 72시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군에는 총 배지의 0.01%가 되는 양의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하고, 양성대조군에는 1 μM의 독소루비신(doxorubicin)을 첨가한 뒤 각각 24, 48, 및 72시간 동안 배양하였다. 아울러, 음성 대조군에는 HCC 세포주 대신 A549 세포주를 사용하여 실험을 수행하였다. A549 세포주는 kRAS 돌연변이 세포주로 ALK 및 ROS-1의 과발현과 무관한 세포주이다.
약물 처리 후 상기 각 배양시간이 경과하면, 각 배지에 WST-1 시약을 배지의 10%가 되도록 넣어준 후, 1시간 배양하고, 이 후 470 nm에서 ELISA 기기를 이용하여 세포의 흡광도를 측정한다. 그 결과 수득한 HCC-78 세포주에 대한 세포의 성장 그래프는 도 1에 나타내었고, 음성 대조군인 A549 세포주에 대한 세포의 성장 그래프는 도 2에 나타내었다.
도 1 및 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, ALK/ROS-1 특이적 인산화 효소 저해제인 크리조티닙과 세리티닙 모두 HCC-78 세포의 성장을 유의하게 저해, 특히 시간 의존적으로 저해하나 음성 대조군인 A549 세포의 성장은 유의적으로 저해하지 못함을 확인하였다(student’s t-test, p<0.05). 구체적으로, 대조군이 100%의 성장률을 나타낸다고 가정하는 경우, 각 물질 처리 후 24시간이 경과하였을 때 크리조티닙 및 세리티닙 처리군은 각각 77.13 %및 73.73 %의 HCC-78 세포 성장률을 나타내었고, 양성대조군인 독소루비딘 처리군은 57.65 %의 HCC-78 세포 성장률을 나타내었다. 각 물질 처리 후 48시간 및 72시간이 경과하였을 때, 크리조티닙 처리군은 각각 37.63 %, 16.04 %의 HCC-78 세포 성장률을 나타내었고, 세리티닙 처리군 또한 37.17 %, 17.99 % 수준의 HCC-78 세포 성장률을 나타내었다. 이는 HCC-78 세포를 ALK/ROS-1 인산화 효소 저해제의 스크리닝시에 활용할 수 있음을 나타낸다.
1-2. MTT 분석을 통한 유방암 세포주(MCF-7)의 세포생존률 확인
이 기술분야에서 일반적으로 사용되는 방식에 따라 MTT 분석을 수행하여 크리조티닙에 의한 MCF-7 유방암세포의 성장 저해율을 확인하였다. 구체적으로, 2018.9.17일자로 기탁번호 KCTC13643BP로 기탁된 MCF-7 유방암 세포를 37℃ 온도의 5% 이산화탄소 세포배양기에서 10 %의 소태아혈청과 1 %의 항생제가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 세포수가 1.3 x 103 개가 되도록 배양하였다. 이 후 세포의 성장이 안정화되면, 총 배지의 0.01 %이자 1 μM 농도가 되도록 크리조티닙, 6종의 인산화효소 저해제(다브라페닙, 데팍티닙, 라파티닙, 레고라페닙, 제피티닙, 크리조티닙) 각각을 각 웰(well)에 처리한 후 72시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군에는 총 배지의 0.01%가 되는 양의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하고, 양성대조군에는 1 μM의 파클리탁셀(Paclitaxel)를 첨가한 뒤 72시간 동안 배양하였다.
각 약물 처리 후 각 배양시간이 경과하면, 각 배지의 상층액을 제거하고 MTT 시약이 0.5 mg/ml가 되도록 새 배지에 첨가한 후, 3시간 배양하고, 이 후 다시 상층액을 제거한 후 DMSO 100 μL으로 재편성(reconstitution)하였다. 그리고 나서, ELISA 기기를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정한다. 그 결과 수득한 세포의 성장 그래프는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 다브라페닙(dabrafenib)을 제외한 5종의 인산화효소 저해제가 MCF-7 세포주의 세포 성장을 유의하게 저해하는 것을 확인하였다 (student’s t-test, p value <0.05). 또한, 크리조티닙 처리 시에 대조군 대비 48.45%의 세포 성장을 하는 것을 관측하였다. 양성 대조군으로 쓰인 파클리탁셀 처리군은 세포 성장률이 46.86%으로, 크리조티닙 처리군과 양성 대조군은 서로 비슷한 수준의 유의적인 세포 성장 저해능을 가진다(student’s t-test, p<0.001). 따라서 MCF-7에서 여러 인산화효소 저해제가 세포 성장을 저해하고, 동시에 크리조티닙에서 유의적인 세포 성장 저해율을 가지는 MCF-7 세포주는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝 대상 세포주로 적합함을 알 수 있다.
실시예 2. 폐암종 세포주 또는 유방암종 세포주에서 ALK/ROS-1 인산화 효소 저해제 처리에 따른 질량분석기를 이용한 대사체 분리 및 분석
ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제 처리에 따라 변화하는 대사체, 즉 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝에 활용될 수 있는 대사체들을 도출하기 위하여 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝에 적합한 세포주인 폐암종 세포주 또는 유방암종 세포주에 공지의 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제를 처리한 후 각 세포주 내 변화하는 대사체에 대한 분석을 수행하였다.
2-1. 폐암종(HCC-78) 및 유방암종(MCF-7) 배양 및 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제 처리 후 세포 획득
2-1-1. HCC-78 배양 및 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제인 크리조티닙 및 세리티닙 각각 처리
HCC-78 폐암 세포를 37℃온도의 5% 이산화탄소 세포배양기에서 10 %의 소태아혈청과 1 %의 항생제가 포함된 RPMI 배지를 사용하여 배양하였다. 이 후 세포의 성장이 안정화되면, 크리조티닙 및 세리티닙 각각이 총 배지의 0.01 %이 되도록 1 μM 농도로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군으로 총 배지의 0.01 %가 되는 양의 DMSO를 첨가하여 24시간 배양하였으며, 각 세포는 그룹별 5개의 세포 디쉬에서 배양하여 각 군의 총 실험 수가 5(n=5)가 되도록 하였다.
상기 24시간의 배양시간이 경과한 후에는 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 세포를 2차례 세척하였고, 이 후 셀 스크래퍼를 이용하여 세포를 배양 접시에서 획득한 후 튜브에 담아 -80 ℃에서 보관하였다.
2-1-2. MCF-7 배양 및 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제인 크리조티닙 처리
MCF-7 유방암 세포를 37 ℃의 5% 이산화탄소 세포배양기에서 10 %의 소태아혈청과 1 %의 항생제가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다. 이 후 세포의 성장이 안정화되면, ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제로 사용되는 크리조티닙이 총 배지의 0.01 %이 되도록 1 μM 농도로 처리한 후 12시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군으로 총 배지의 0.01 %가 되는 양의 DMSO를 첨가하여 12시간 배양하였으며, 각 세포는 그룹별 5개의 세포 디쉬에서 배양하여 각 군의 총 실험 수가 5(n=5)가 되도록 하였다.
상기 12시간의 배양시간이 경과한 후에는 배지를 제거하고 PBS를 이용하여 세포를 2차례 세척하였고, 이 후 셀 스크래퍼를 이용하여 세포를 배양 접시에서 획득한 후 튜브에 담아 -80 ℃에서 보관하였다.
2-2. 세포 내액 추출 및 DNA 정량
질량분석을 위하여 상기 실시예 2-1에서 획득한 세포에 내부 표준물질로 레저핀 2 μg/mL 이 들어있는 70 % 메탄올 용액을 120 μL씩 넣어준 뒤, 볼텍싱을 하여 세포가 잘 섞일 수 있도록 하였다. 그리고 나서, 액체 질소를 이용하여 상기 혼합액을 얼렸다가 상온의 물에 녹여준 뒤 이어서 30초간 음파처리 해주는 과정을 총 3번 반복 시행하여 세포를 파괴하였다. 이 후 10분 동안 14000 rpm으로 원심 분리하였고, 이로부터 상층액만을 분리하였다. 이때, 상기 일련의 과정에 따라 수득한 세포 내액 추출물에 대한 세포량 보정을 위하여 DNA 정량을 수행하였으며, DNA 정량은 상기 추출물과 물을 1:3으로 혼합한 뒤 5 μL를 큐벳에 넣어주고 260 nm에서 정량에서 신코社의 분광광도계 Nano-MD를 사용하여 수행하였다.
2-3. 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry, UHPLC-MS)를 이용한 분석
상기 실시예 2-2에 따라 전처리된 각 시료는 초고성능 액체크로마토그래피질량분석기(한국과학기술연구원 분자인식연구센터 Thermo사의 Ultimate 300 UPHLC system-Orbitrap velos pro system mass spectrometry)를 이용하여 시료 내 대사체들의 분석을 수행하였다.
구체적으로 상기 수득한 시료 10 μL를 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기에 주입하였고, 주입기의 온도는 4℃로 유지하였다. 초고성능 액체크로마토그래피의 조건은 용액은 0.1 % 포름산을 넣은 물(이동상 A) 및 0.1 % 포름산을 넣은 메탄올(이동상 B)을 사용했다. 컬럼은 waters사의 ACQUITY® HSS T3 (2.1×100 mm, 1.7 μm)를 사용하고 컬럼의 온도는 40 ℃를 유지했다. 두 이동상을 UPLC 시스템 내에서 분석 시간에 따라 다른 비율로 혼합하여 흘려주는 기울기 용리 (gradient elution)방법으로 진행하였고, 이때 액체크로마토그래피 이동상의 구배는 0분을 시작으로 2분이 될때까지 A 용액 99%으로 유지하고, 14분이 될 때까지 B 용액이 100%가 되도록 하고 이 후 15분이 될 때까지 유지하였으며, 이 후 3분 동안은 처음 조건으로 맞춰주었다. 용액의 흐름은 0.4 mL로 유지했다. 질량분석기는 포지티브 모드(positive mode)와 네거티브 모드(negative mode) 분석 모두 진행되었다. 질량분석기의 소스(source)의 온도는 300 ℃, 용매 지연시간은 3분으로 하였다. 분석 도중에는 분석의 품질 관리를 위해 시퀀스에 QC(quality control) 샘플을 넣어 전체 분석법의 진행에 기기의 문제가 없음을 확인하였다. 상기 QC 샘플은 대조군 및 실험군 시료 추출액을 모두 풀링한 것으로 사용했다. 그 결과 얻은 크로마토그램 중 HCC-78 세포주에 대하여 실험한 결과는 도 4에 나타내었고, MCF-7 세포주에 대하여 실험한 결과는 도 5에 나타내었다.
2-4. 크로마토그램 데이터 분석 및 통계 처리
상기 실시예 2-3에서 얻은 크로마토그램 데이터를 분석하기 위하여 PLS-DA분석(Partial least squares discriminant analysis)을 수행하였다. 구체적으로 상기 크로마토그램으부터 써모피셔사이언티티픽 사의 compound discovery 소프트웨어를 사용하여 보정과 피크 정렬을 한 엑셀 원본 데이터(raw data)를 추출하였다. 추출된 원본 데이터의 개수는 총 765개였다. 추출된 파일을 먼저 내부 표준물질로 나눠주고 세포의 DNA 정량을 이용하여 보정해준 뒤 SIMCA 소프트웨어를 이용하여 통계처리를 진행하였다. 그 결과는 도 6 및 7에 나타내었다. HCC-78 세포주에 대하여 실험한 결과는 도 6에 나타내었고, MCF-7 세포주에 대하여 실험한 결과는 도 7에 나타내었다.
도 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 대조군과 각 실험군의 클러스터링(clustering)이 확연하게 나누어지는 것을 관찰 할 수 있었으며, 이로부터 각 세포주 내에서 약물 처리 후 대사체의 변화가 있었음을 확인할 수 있었다.
이 후, 상기 실험 도출 값들에 대한 통계 처리를 위하여, 상기 결과값을 보정한 데이터에 대하여 t-검증을 수행하여 유의적으로 변한 데이터를 구분하였다. 통계처리 결과에 따라 p값이 0.05 이하인 물질들을 유의적인 변화를 나타내는 대사체로 분류하었다. 분류된 물질들은 크로마토그램의 m/z 값을 토대로 HMDB(Human Metabolome Database), 매스뱅크(massbank), 메틀린(metlin)과 같은 데이터베이스를 토대로 정성을 진행하였다.
그 결과, HCC-78 세포주에서 크리조티닙 또는 세리티닙 처리에 따라 총 20개의 물질이 유의적으로 변화하였다: myristoylcarnitine, 2-furoylglycine, Lyso phosphatidylcholine(16:1(9Z), eicosatetraynoic acid, adenosine, L-prolyl-L-proline, cAMP, hexanoylcarnitine, phosphorylcholine, isobutyryl carnitine, L-glutathione, quinine, 5'-S-methyl-5'-thioadenosine, leucine-leucine, Coenzyme Q2, phosphatidylethanolamine(18:1(9Z)/0:0), LysoPC(18:1(11Z)), AMP, phosphatidylcholine(17:1), phosphatidylcholine(16:0/0:0).
MCF-7 세포주에서 크리조티닙과 처리에 따라 총 28개의 물질이 유의적으로 변화하였다: acetylcarnitine, L-carnitine, n-acetyl-DL-aspartic acid, n-acetyl-L-aspartate, L-glutamate, L-tryptophan, malic acid, succinic acid, sebacic acid, palmitoyl-L-carnitine, propionylcarnitine, azelaic acid, 2-arachidonylglycerol/monoachylglyceride, Monoglyceride(0:0/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0:0), phosphatidylcholine(34:2), phosphatidylethanolamine(16:0/18:1), AMP, cAMP, adenosine, guanosine, uridine, ketovaline, inosine, uridine monophosphate (UMP), guanidylic acid (guanosine monophosphate), 5'-deoxy-5'-methylthioadenosine, acetylcholine, phosphocholine, taurine. 이때, 상기 변화를 나타낸 일부 대사체들에 대한 변화값을 도 8 및 9에 heat map으로 나타내었고, 도 10 및 11에는 상자 수염 그림으로 나타내었다. 이때, 상기 도 8 및 10는 HCC-78 세포주에 대하여 실험한 결과이고, 도 9 및 11은 MCF-7 세포주에 대하여 실험한 결과를 나타낸 것이다.
상기 결과 및 도 8 내지 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 각 대사체 중 HCC-78 세포주와 MCF-7 세포주 내에서 AMP, cAMP, 아데노신이 공통적으로 유의적인 변화를 나타내었다. 그 외 대사체들은 HCC-7 세포주와 MCF-7 세포주 에서 공통적인 변화 양상을 나타내지 못하였다. 이때 HCC-78 세포주에서 상기 대사체의 증감이 더 확연하게 변화하였다. 구체적으로, HCC-78 세포주의 경우, 크리조티닙 처리 시 대조군 대비 AMP가 140.79% 증가하고, cAMP가 72.03% 감소하며, 아데노신이 93.43% 감소되었고 세리티닙 처리 시에 대조군 대비 AMP가 188.21% 증가, cAMP가 66.78% 감소, 아데노신이 95.31% 감소되는 경향을 보였다. MCF-7 세포주의 경우, 크리조티닙 처리 시 AMP가 82.91 % 증가하고, cAMP가 28.6% 감소하며, 아데노신이 32.07% 감소하였다. 상기 결과는 AMP, cAMP 및 아데노신을 크리조티닙을 포함하는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝에 활용할 수 있음을 나타낸다.
한국생명공학연구원 KCTC13642BP 20180917 한국생명공학연구원 KCTC13643BP 20180917

Claims (23)

  1. 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계;
    후보 물질을 처리한 세포주 내 아데노신(adenosine), AMP(adenosine monophosphate) 및 cAMP(cyclic adenosine monophosphate) 중 하나 이상의 대사체의 레벨(level)을 측정하는 단계; 및
    측정한 아데노신, AMP 및 cAMP 중 하나 이상의 대사체의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하는 단계;를 포함하는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제는 암 치료제인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제는 폐암 치료제, 유방암 치료제, 뇌암 치료제, 췌장암 치료제 및 대장암 치료제 중 하나 이상인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포주는 폐암종 세포주, 유방암종 세포주, 뇌암 세포주, 췌장암 세포주 및 대장암 세포주 중 하나 이상인 스크리닝 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 폐암종 세포주는 비소세포폐암종 세포주인 스크리닝 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 유방암종 세포주는 유방상피내암 세포주인 스크리닝 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 측정한 대사체의 레벨을 다변량 분석(multivariate analysis)하는 단계를 더 포함하는 스크리닝 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 상기 세포주에서 상기 아데노신 또는 cAMP의 함량이 후보물질 처리 전과 비교하여 높아지면 후보 물질이 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제로 적합하다고 판단하고, 후보물질 처리 전과 비교하여 낮아지거나 동일하면 후보 물질이 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제로 부적합하다고 판단하는 단계;를 더 포함하는 스크리닝 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 상기 세포주에서 상기 AMP의 함량이 후보물질 처리 전과 비교하여 낮아지면 후보 물질이 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제로 적합하다고 판단하고, 후보물질 처리 전과 비교하여 높거나 동일하면 후보 물질이 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제로 부적합하다고 판단하는 단계;를 더 포함하는 스크리닝 방법.
  10. 아데노신, AMP 및 cAMP 중 하나 이상의 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝용 조성물.
  11. 제10에 있어서,
    상기 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제는 암 치료제인 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제는 폐암 치료제, 유방암 치료제, 뇌암 치료제, 췌장암 치료제 및 대장암 치료제 중 하나 이상인 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 폐암종 세포주, 유방암종 세포주, 뇌암 세포주, 췌장암 세포주 및 대장암 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포주를 유효성분으로 더 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 폐암종 세포주는 비소세포폐암종 세포주인 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 유방암종 세포주는 유방상피내암 세포주인 조성물.
  16. 아데노신, AMP 및 cAMP 중 하나 이상의 대사체의 레벨(level) 측정부를 포함하는 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제의 스크리닝 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제는 암 치료제인 키트.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 ALK 또는 ROS-1 인산화 효소 억제제는 폐암 치료제, 유방암 치료제, 뇌암 치료제, 췌장암 치료제 및 대장암 치료제 중 하나 이상인 키트.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 키트는 폐암종 세포주, 유방암종 세포주, 뇌암 세포주, 췌장암 세포주 및 대장암 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포주를 더 포함하는 키트.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 폐암종 세포주는 비소세포폐암종 세포주인 키트.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 유방암종 세포주는 유방상피내암 세포주인 키트.
  22. 제16항에 있어서,
    상기 레벨 측정부는 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 스크리닝용 조성물을 포함하는 것인 키트.
  23. 제16항에 있어서,
    상기 키트는 상기 대사체의 레벨 측정부에서 측정된 대사체들의 레벨을 분석하는 다변량 분석(multivariate analysis) 시스템을 더 포함하는 키트.
KR1020180132169A 2018-10-31 2018-10-31 Alk 또는 ros-1 인산화 효소 억제제 스크리닝을 위한 방법, 조성물 및 키트 및 방법 KR102167739B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102408538B1 (ko) * 2020-10-29 2022-06-15 한국과학기술연구원 Fak 활성 억제제를 스크리닝하기 위한 조성물, 키트 및 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016166881A (ja) 2011-03-24 2016-09-15 学校法人慶應義塾 抗がん剤感受性の判定マーカー

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
KR20140033282A (ko) 2012-09-07 2014-03-18 주식회사 마크로젠 Ｒｏｓ1을 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 암 진단용 조성물
KR101856599B1 (ko) 2015-02-06 2018-05-11 한국과학기술원 분비 대사체 분석을 통한 간독성 약물 스크리닝 방법
KR20180010135A (ko) 2016-07-20 2018-01-30 연세대학교 산학협력단 암 치료용 약물 스크리닝을 위한 암 세포주 패널
KR101872624B1 (ko) 2016-12-27 2018-06-28 (주) 바이오인프라생명과학 Alk 표적 치료제에 대한 폐암의 치료 반응성을 예측하는 방법
KR101940450B1 (ko) * 2018-04-16 2019-01-18 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 비-소세포성 폐암 진단 융합 전사체 및 신규 전사체 마커

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016166881A (ja) 2011-03-24 2016-09-15 学校法人慶應義塾 抗がん剤感受性の判定マーカー

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
R. Ahmann et al., In Vitro Cellular & Developmental Biology, Vol. 23, No. 7, 1987, pp. 474-480.
안명주, Hanyang Medical Reviews, Vol. 34, 2014, pp. 37-44.

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