KR102272947B1 - 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝을 위한 방법, 조성물 및 키트 - Google Patents

지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝을 위한 방법, 조성물 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 명세서에는 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝을 위한 방법, 조성물 및 키트가 개시된다. 일 측면에서, 정량 및 정성이 동시에 분석이 가능하며, 기존의 분자생물학적 실험법과 비교하여 보다 신속하게 대량의 후보 물질에 대한 스크리닝이 가능하고, N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이용하여 지방산 합성 효소 억제제 후보 물질이 세포주 내에서의 유의적인 발현 변화를 나타내는 지 여부를 파악할 수 있게 하는 바 지방산 합성 효소 억제제에 대한 스크리닝 효율이 뛰어나다. 이에 따라, 본 발명은 지방산 합성 효소 억제 효과를 나타내는 신약 개발에서 다양하게 활용될 수 있다는 이점이 있다.

Description

지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝을 위한 방법, 조성물 및 키트 {Method, composition and kit for screening fatty acid synthase inhibitor}
본 명세서에는 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝을 위한 방법, 조성물 및 키트가 개시된다.
지방산 합성 효소(Fatty acid synthase, FAS)를 비롯한 몇몇 지방대사효소가 암의 발생과 악성화를 촉진하는 것이 이미 알려져 있으며, 이들이 암 치료의 새로운 표적 분자가 될 가능성이 기대되고 있다. FAS는 아세틸-CoA(Acetyl-CoA), 말로닐-CoA(Malonyl-CoA)의 전구물질로부터 NADPH의 축합 반응에 의해 포화지방산인 팔미트산을 합성하는 효소이다. 정상세포에서는 간, 지방 조직, 분비유선에서 높은 발현을 볼 수 있지만, 그 이외의 조직에서는 거의 발현하지 않는다. FAS는 섭취하는 지방 및 호르몬 등에 의해 엄격하게 하향 조절되기 때문에 정상 조직에서는 낮은 수준으로 발현되는데 반해, 과증식 병변이나 진행성 암에서는 과발현 된다고 알려져 있다. 특히 유방암, 대장암, 위암, 갑상선암, 전립선암, 난소암 그리고 자궁내막암 등에서 높은 수준으로 발현된다고 보고되었다.
진행성 암 중에서 전립선암은 서구의 흔한 암종으로, 남성 암 발생률 및 암 사망률에 있어 2위를 차지한다. 최근 대한민국에서도 노인 인구의 증가와 식생활의 서구화로 인해 전립선암이 빠른 속도로 증가하고 있는 추세이다. 전립선암의 주된 조기 검진 도구는 혈중 전립선 특이 항원(PSA) 측정과 직장 수지 검사(digital rectal examination, DRE)이다. 임상적으로 유의한 전립선암 환자에서 혈중 PSA 수치가 높게 나오지만, PSA 수치가 높다고 모두 전립선암이라고 할 수는 없다. PSA 수치는 전립선암이 아니더라도 양성전립선비대증, 전립선염, 전립선 외상(자전거), 성관계 후 등에 의해서도 상승 될 수 있는 수치이기 때문이다. 그러나, PSA 수치가 낮다고 전립선암이 없다라고 단정지을 수도 없다는 문제점을 가지고 있다. 이렇듯, PSA 수치는 전립선암의 조기 검진에 가장 많이 사용됨에도 불구하고 전립선암 진단 및 이의 치료제의 스크리닝에 있어 PSA의 정확성(accuracy)을 논하기는 무척 어려운 상황이다.
FASNALL은 피리미딘계 FAS 억제제 혹은 다중 보조인자 결합(multiple cofactor binding) FAS 억제제, 보다 바람직하게는 싸이오펜 피리미딘(thiophene pyrimidine) 기반의 FAS 억제제로, 이전의 억제제들과는 다르게 퓨린 상호작용 부위(purine interaction site)를 대상으로 새로운 스캐폴드를 정의한 약물이다. 3가지의 FAS 활성부위인 KR(ketoacyl reductase), ER(enoyl reductase), MAT(Malonyl acetyl transferase)을 퓨린 함유 보조인자(purine-containing co-factor)로 사용하며 FASNALL은 FAS를 강력하게 선택적으로 억제하고 HER2+ 유방암 세포주에서 지질 프로파일의 변화를 유도하는 사실이 알려져 있다.
GSK2194069는 기질 중간체와 경쟁하며 KR 도메인을 대상으로 하는 강력한 FAS 억제제이다. TVB-3166은 가역적이고 선택적인 이미다조피리딘(imidazopyridine) 기반의 FAS 억제제이다. 지질 뗏목 구조를 파괴하고 세포 사멸을 유도하는 세포 신호 전달 경로의 변화를 일으킨다고 보고되었다.한편, 신약개발 시 약효를 평가하기 위한 표적항암제 및 약물에 대한 전 임상 연구는 주로 생체 외의 세포 실험과 동물실험을 통하여 진행되고 있다. 이 중 본 발명에서 적용한 대사체학(metabolomics) 기법은 세포 과정(Cellular process) 중 발생하는 소분자 대사산물 전체(대사체; metabolome)에 대하여 종합적인 연구를 하는 학문으로, 약효와 관련된 바이오마커 도출과 더불어 전체적인 세포 상태, 체계와 관련된 대사 상태 및 거시적 생화학적 사건 관측을 가능하게 한다. 따라서 대사체학 기법을 신약 개발 스크리닝에 도입하여 약물이 세포 내에 투입되어 변하는 대사체들을 스크리닝 함으로써 후보 물질에 대한 평가를 대량 신속처리(High-throughput) 방식으로 평가할 수 있다. 또한 기존 분자생물학적 실험법과 달리 정량 및 정성이 동시 분석이 가능하다는 점과 대량 분석이 가능하다는 점에서 장점을 가지고 있다. 비록 현재의 바이오마커 시장은 유전체 분야에 집중되어 있기는 하나, 최근 유전체 보다 유전자의 기능을 볼 수 있는 단백질체, 대사체를 이용한 오믹스(omics) 기반의 신약 개발 스크리닝의 가능성 및 개발이 대두 되고 있는 상황이다.
이를 바탕으로 본 발명자들은 지방산 합성 효소 억제제를 스크리닝 할 수 있는 바이오마커를 대사체학 연구를 통해 도출하고, 이의 기능을 검증하고자 다양한 연구를 수행한 끝에, N1-아세틸스퍼미딘(N1-acetylspermidine), 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine), L-트립토판(L-tryptophan), 8,11,14-에이코사트리엔산(8,11,14-eicosatrienoic acid), 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid), 리소PC(16:1)(LysoPC(16:1)), 리소PC(20:2)(LysoPC(20:2)), 리소PC(18:0)(LysoPC(18:0)), 리소PC(20:1)(LysoPC(20:1)), 리소PC(p-16:0)(LysoPC(p-16:0)), 팔미토일-L-카르니틴(palmitoyl-L-carnitine), PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2(prostaglandin A2), 스테아르산(stearic acid) 및 박센산(vaccenic acid)이 지방산 합성 효소 억제제의 처리에 따라 암세포 내에서 유의적인 변화를 나타내는 바이오마커임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
KR 등록특허공보 10-2016-0096931호 KR 등록특허공보 10-2018-0010135호
일 측면에서, 본 발명의 목적은 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 활용하여 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝을 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
상기 과제를 달성하기 위하여, 일 측면에서 본 발명은 암 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 후보 물질을 처리한 암 세포주 내 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨(level)을 측정하는 단계; 및 측정한 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하는 단계;를 포함하는 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 일 측면에서 본 발명은 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하는 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한, 일 측면에서 본 발명은 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨(level) 측정부를 포함하는 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝 키트를 제공한다.
또한, 일 측면에서 본 발명은 지방산 합성 효소 억제제로 치료 받은 또는 지방산 합성 효소 억제제로 치료 중인 암 환자로부터 분리된 시료 내에서 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨을 측정하는 단계; 및 측정한 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨로 암 환자의 상태를 결정하는 단계;를 포함하는 암 환자의 상태 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
일 측면에서, 정량 및 정성이 동시에 분석이 가능하며, 기존의 분자생물학적 실험법과 비교하여 보다 신속하게 대량의 후보 물질에 대한 스크리닝이 가능하고, N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이용하여 지방산 합성 효소 억제제 후보 물질이 세포주 내에서의 유의적인 발현 변화를 나타내는 지 여부를 파악할 수 있게 하는 바 지방산 합성 효소 억제제에 대한 스크리닝 효율이 뛰어나다. 이에 따라, 본 발명은 지방산 합성 효소 억제 효과를 나타내는 신약 개발에서 다양하게 활용될 수 있다는 이점이 있다.
도 1은 WST-1 분석 또는 CCK-8 분석을 통하여 LNCaP-ln3 세포주 및 MCF-7 세포주 각각에 대한 세포 성장 저해 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 전립선암 세포주(LNCaP-ln3)에 FAS 억제제를 처리한 후의 대사체 변화를 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기를 이용하여 분석한 결과를 크로마토그램으로 나타낸 도이다.
도 3은 유방암 세포주(MCF-7)에 FAS 억제제를 처리한 후의 대사체 변화를 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기를 이용하여 분석한 결과를 크로마토그램으로 나타낸 도이다.
도 4는 도 2에 나타낸 결과값에 대하여 PCA(principal component analysis) 통계 처리한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 도 3에 나타낸 결과값에 대하여 PCA 통계 처리한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 도 4에 나타낸 결과값을 보정한 데이터 중 N1-아세틸스퍼미딘에 대하여 t-검증을 수행한 결과를 상자 수염 그림으로 나타낸 도이다.
도 7은 도 5에 나타낸 결과값을 보정한 데이터 중 N1-아세틸스퍼미딘에 대하여 t-검증을 수행한 결과를 상자 수염 그림으로 나타낸 도이다.
도 8은 도 4에 나타낸 결과값을 보정한 데이터 중 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판에 대하여 t-검증을 수행한 결과를 상자 수염 그림으로 나타낸 도이다.
도 9은 도 2에 나타낸 결과값을 보정한 데이터 중 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산에 대하여 t-검증을 수행한 결과를 heat map으로 나타낸 도이다.
도 10은 도 3에 나타낸 결과값을 보정한 데이터 중 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산에 대하여 t-검증을 수행한 결과를 heat map으로 나타낸 도이다.
도 11은 도 4 및 5에 나타낸 결과값을 보정한 데이터 중 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산에 대하여 t-검증을 수행한 결과를 표로 나타낸 도이다.
도 12는 MCF-7 세포에서 N1-아세틸스퍼미딘을 활용하여 FAS 억제제 스크리닝의 정확도를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 13은 MCF-7 세포에서 스퍼민을 활용하여 FAS 억제제 스크리닝의 정확도를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 14는 MCF-7 세포에서 스퍼미딘을 활용하여 FAS 억제제 스크리닝의 정확도를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 15는 MCF-7 세포에서 N-트립토판을 활용하여 FAS 억제제 스크리닝의 정확도를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 16은 LNCaP-ln3 세포에서 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민 또는 N-트립토판을 활용하여 FAS 억제제 스크리닝의 정확도를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 17은 MCF-7 세포 또는 LNCaP-ln3 세포에서 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민 및 L-트립토판의 조합을 활용하여 FAS 억제제 스크리닝의 정확도를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
이하, 상세히 설명한다.
일 측면에서 본 발명은 암 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 후보 물질을 처리한 암 세포주 내 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨(level)을 측정하는 단계; 및 측정한 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하는 단계;를 포함하는 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
일 구현예에서, '스크리닝'은 특정한 대사체를 선별 및/또는 검출하는 조작에 관한 것이다.
일 구현예에서 상기 스크리닝은 대사체의 레벨 변화를 측정하는 기기, 일례로 UHPLC-MS, LC-MS 등을 이용하여 수행하는 것을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, '지방산 합성 효소 억제제'는 FAS 억제제로도 지칭되는 것으로 지방산 합성 효소의 발현 또는 활성을 억제하는 물질이라면 제한 없이 포함하는 개념이다. 지방산 합성 효소는 각종 암에서 과발현되어 있는 것으로 알려진 물질로, 이에 일례로 상기 지방산 합성 효소 억제제는 암 치료제를 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 유방암 치료제, 대장암 치료제, 위암 치료제, 갑상선암 치료제, 전립선암 치료제, 난소암 치료제 및 자궁내막암 치료제 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 유방암 세포주, 대장암 세포주, 위암 세포주, 갑상선암 세포주, 전립선암 세포주, 난소암 세포주 및 자궁내막암 세포주 중 하나 이상의 세포주를 유효성분으로 더 포함할 수 있고, 상기 각 세포들은 FAS 과발현 세포주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 상기 '과발현'은 FAS의 발현 수준이 각 조직의 정상 세포와 비교하여 1.1 배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.5배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2.0배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 4배 이상, 4.5배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 35배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 50배 이상 더 높은 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 전립선암 세포주는 LNCaP-ln3 세포주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용한 LNCaP-ln3 세포주는 기탁번호 KCTC 13846BP로 기탁된 세포주이다.
일 구현예에서, 유방암 세포주는 유방상피내암 세포주일 수 있고, 보다 바람직하게는 MCF-7 세포주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 유방상피내암 세포주는 유방암상피세포주로 지칭될 수도 있으며, 본 발명에서 사용한 MCF-7 세포주는 기탁번호 KCTC 13643BP로 기탁된 세포주이다.
일 구현예에서, 상기 방법은 상기 세포주에서 상기 N1-아세틸스퍼미딘, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 높아지면, 바람직하게는 바람직하게는 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 31% 이상, 32% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 500% 이상, 600% 이하로 높아지면 후보 물질이 지방산 합성 효소 억제제로 적합하다고 판단하고, 후보물질 처리 전과 비교하여 낮아지거나 동일하면 후보 물질이 지방산 합성 효소 억제제로 부적합하다고 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은 상기 세포주에서 상기 스퍼미딘, 스퍼민 및 L-트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 낮아지면, 바람직하게는 바람직하게는 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 31% 이상, 32% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 500% 이상, 600% 이하로 낮아지면 후보 물질이 지방산 합성 효소 억제제로 적합하다고 판단하고, 후보물질 처리 전과 비교하여 높아지거나 동일하면 후보 물질이 지방산 합성 효소 억제제로 부적합하다고 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 후보 물질 처리 전 후의 대사체의 레벨 변화값에 대하여 t-검증을 수행한 후 p값이 0.15 이하, 0.14 이하, 0.13 이하, 0.12 이하, 0.11 이하, 0.1 이하, 0.09 이하, 0.08 이하, 0.07 이하, 0.06 이하, 0.05 이하, 0.04 이하, 0.03 이하, 0.02, 0.01 이하의 값을 나타낼 때 그 물질을 유의적인 변화를 나타내는 대사체로 분류할 수 있고, 바람직하게는 0.05 이하의 값을 나타낼 때 그 물질을 유의적인 변화를 나타내는 대사체로 분류할 수 있다.
일 측면에서 본 발명은 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하는 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 'N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산 중 하나 이상을 검출하는 물질'은 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 검출할 수 있는 물질이라면 어느 것이든 제한 없이 포함된다. 일례로 상기 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 을 검출하는 물질은 항체, ELISA 키트 내 효소 등일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 유방암 세포주, 대장암 세포주, 위암 세포주, 갑상선암 세포주, 전립선암 세포주, 난소암 세포주 및 자궁내막암 세포주 중 하나 이상의 세포주를 더 포함할 수 있다.
일 측면에서 본 발명은 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨(level) 측정부를 포함하는 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝 키트를 제공한다.
일 구현예에서, 'N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨'은 시료 내에 포함되는 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 농도, 질량 등 객관적인 수치 및 해당 물질의 타 물질에 대한 상대량을 모두 포함하는 최광의의 의미이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 유방암 세포주, 대장암 세포주, 위암 세포주, 갑상선암 세포주, 전립선암 세포주, 난소암 세포주 및 자궁내막암 세포주 중 하나 이상의 세포주를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트의 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨 측정부는 상기 기술한 스크리닝용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 FAS 억제제를 스크리닝할 수 있는 방법, 또는 스크리닝 대상이 되는 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 대한 설명을 포함하는 지시서를 더 포함할 수 있다. 일례로 상기 지시서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있으며, 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함하는 안내서 등을 더 포함할 수 있다.
일 측면에서 본 발명은 지방산 합성 효소 억제제로 치료 받은 또는 지방산 합성 효소 억제제로 치료 중인 암 환자로부터 분리된 시료의 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨을 측정하는 단계; 및 측정한 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨로 암 환자의 상태를 결정하는 단계;를 포함하는 암 환자의 상태 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 암 환자는 유방암, 대장암, 위암, 갑상선암, 전립선암, 난소암 및 자궁내막암 중 하나 이상의 암에 대한 환자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 시료는 암 환자로부터 채취한 시료일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 생체 시료는 암 환자로부터 채취한 혈액, 혈청, 혈장, 뇨 등을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은 상기 암 환자에서 분리된 시료 내에 상기 N1-아세틸스퍼미딘, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨이 암 치료 전과 비교하여 높아지면, 바람직하게는 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 31% 이상, 32% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 500% 이상, 600% 이하로 높아지면 암 환자의 상태가 개선되었다 판단하고, 암 치료 후와 비교하여 낮아지거나 동일하면 암 치료 상태가 나빠졌다고 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은 상기 암 환자에서 분리된 시료 내에 상기 스퍼미딘, 스퍼민 및 L-트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 낮아지면, 바람직하게는 바람직하게는 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 31% 이상, 32% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 500% 이상, 600% 이하로 낮아지면 후보 물질이 지방산 합성 효소 억제제로 적합하다고 판단하고, 암 치료 후와 비교하여 낮아지거나 동일하면 암 치료 상태가 나빠졌다고 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다. 또한, 본 명세서에 기재된 '또는' 이라는 표현은, 별도의 언급이 없다면, '및'을 포함하는 개념으로 이해하여야 할 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 인간 유래 암 세포주의 지방산 합성 효소 억제제(FAS 억제제, Fatty acid synthase inhibitor) 처리에 따른 세포 생존률 변화 확인
인간 유래 세포주인 LNCaP-ln3 및 MCF-7가 FAS 억제제의 스크리닝에 적합한 세포주로 활용될 수 있을지 여부를 확인하기 위하여, 상기 각 세포주에 공지된 FAS 억제제를 처리한 후 각각 WST-1 분석 및 CCK-8 분석을 수행하여 세포 생존률 변화를 확인하였다.
1-1. WST-1 assay을 통한 FAS 억제제 처리에 따른 인간 유래 세포주(LNCaP-ln3)의 세포 생존률 확인
LNCaP-ln3 세포주가 FAS 효소 억제제 평가 실험에 유용한 세포주인지 판단하기 위해 이 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 세포 성장률 검사인 WST-1 검사를 시행하여 FASNALL, GSK2194069 및 TVB-3166의 농도별 LNCaP-ln3 세포주의 성장 저해율을 확인하였다.
우선, 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 13846BP로 기탁된 LNCaP-ln3 암 세포를 37℃ 온도의 5% 이산화탄소 세포배양기에 10 %의 소태아혈청과 1 %의 항생제가 포함된 RPMI 배지를 사용하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 세포수가 7.4 x 103개가 되도록 배양한다. 그리고 나서 세포의 성장이 안정화된 이후에, 대조군에는 실험군 대신에 총 배지의 0.01%가 되는 량의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 24시간 배양한다. 그리고 실험군으로는 총 배지의 0.01 %이자 농도는 0, 1, 5, 10, 50 μM이 되도록 FASNALL, GSK2194069 및 TVB-3166 각각을 처리하고, 양성 대조군으로는 10 μM의 paclitaxel을 첨가한 뒤 24시간 동안 배양한다. 약물 처리 시간이 지난 후 WST-1 시약을 배지의 10%가 되도록 넣어준다. WST-1 시약을 처리한 배지에 2시간 배양 후, ELISA 기기를 이용하여 470 nm에서 측정한다. 그 결과로서 세포 성장 그래프를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, FAS 억제제인 FASNALL, GSK2194069 및 TVB-3166 각각을 5 내지 50 μM 농도로 처리하였을 때 세포 성장을 유의하게 저해하는 것을 확인하였다(student’s t-test, p value <0.05).
또한, FASNALL 처리 후 24시간 배양시 0, 1, 5, 10, 50 μM 농도를 처리한 각각의 경우에 대조군과 비교하여 각각 74.53, 47.20, 36.88, 32.32 %의 세포 성장률을 나타내었다. 양성 대조군인 paclitaxel 처리시 세포 성장률은 1.83 % 였다.
GSK2194069 처리 후 24시간 배양시 0, 1, 5, 10, 50 μM 농도를 처리한 각각의 경우에 대조군과 비교하여 각각 100, 103.3, 104.83, 89.80, 64.24 %의 세포 성장률을 나타내었다. 양성 대조군인 paclitaxel 처리시 세포 성장률은 46.08 % 였다.
TVB-3166 처리 후 24시간 배양시 0, 1, 5, 10, 50 μM 농도를 처리한 각각의 경우에 대조군과 비교하여 각각 100, 91.03, 71.95, 64.67, 32.48 %의 세포 성장률을 나타내었다. 양성 대조군인 paclitaxel 처리시 세포 성장률은 55.84 % 였다.
FASNALL 이외의 총 3가지의 FAS 억제제 모두 양성 대조군인 paclitaxel과 함께 유의적인 (student’s t-test, p value <0.001) 시간 의존적 세포 성장 저해능을 보였다. 따라서 FAS 과발현 세포주인 LNCaP-ln3 세포를 FAS 저해 약물 스크리닝 대상 세포주로 적합하다고 평가하였다.
1-2. CCK-8 assay을 통한 FAS 억제제 처리에 따른 인간 유래 세포주(MCF-7)의 세포 생존률 확인
MCF-7 세포주가 FAS 억제제 평가 실험에 유용한 세포주인지 판단하기 위해 이 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 세포 성장률 검사인 CCK-8 검사를 시행하여 FASNALL, GSK2194069 및 TVB-3166의 MCF-7 유방암세포의 성장 저해율을 확인하였다.
우선, KCTC 13643BP로 기탁된 MCF-7 유방암 세포를 37℃ 온도의 5% 이산화 탄소 세포배양기에 10 %의 소태아혈청과 1 %의 항생제가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 세포수가 1.3 x 103 이 되도록 배양한다. 그리고 나서 세포의 성장이 안정화된 이후에, 대조군에는 실험군 대신에 총 배지의 0.01%가 되는 량의 DMSO를 첨가하여 24시간 배양한다. 그리고 실험군으로는 총 배지의 0.01 %이자 농도는 0, 1, 5, 10, 50 μM이 되도록 FASNALL, GSK2194069 및 TVB-3166 각각을 처리하고, 양성 대조군을 위해 10 μM의 Paclitaxel 도 첨가한 뒤 24시간 동안 배양한다. 약물 처리 시간이 지난 후 CCK-8 시약을 배지의 10%가 되도록 넣어준다. CCK-8 시약을 처리한 배지에 2시간 배양 후, ELISA 기기를 이용하여 450 nm에서 측정한다. 그 결과로서 세포 성장 그래프를 도 1에 나타내었다.
그 결과로 FASNALL을 포함한 3종의 FAS　억제제가 MCF-7 세포주의 세포 성장을 유의하게 저해하는 것을 확인하였다 (student’s t-test, p value <0.05).
또한 FASNALL 처리 시에 대조군 대비 0, 1, 5, 10, 50 μM 농도 별 100, 91.86, 79.43, 79.04, 78.03 %의 세포 성장을 나타냄을 관측하였다. GSK2194069 처리 시에 대조군 대비 0, 1, 5, 10, 50 μM 농도 별 100, 102.2, 93.43, 93.61, 85.27 %의 세포 성장을 나타냄을 관측하였다. TVB-3166 처리 시에 대조군 대비 0, 1, 5, 10, 50 μM 농도 별 100, 102.2, 93.43, 93.61, 85.27 %의 세포 성장을 나타냄을 관측하였다. 양성 대조군으로 쓰인 paclitaxel 처리 시 세포 성장률이 86.06%로, 본 실험군들이 양성 대조군과 비슷하게 유의적인 (student’s t-test, p value <0.001) 세포 성장 저해능을 가짐을 확인할 수 있었다. 따라서 MCF-7 유방암 세포를 약물 스크리닝 대상 세포주로 적합하다고 평가하였다.
실시예 2. 인간 유래 암 세포주에서 FAS 억제제 처리에 따른 대사체 분리 및 분석
FAS 억제제 처리에 따라 변화하는 대사체, 즉 FAS 억제제의 스크리닝에 활용될 수 있는 대사체들을 도출하기 위하여 FAS 억제제의 스크리닝에 적합한 세포주인 인간 유래 암 세포주들에 공지의 FAS 억제제를 처리한 후 각 세포주 내 변화하는 대사체에 대한 분석을 수행하였다.
2-1. 인간유래 세포주(LNCaP-ln3, MCF-7) 배양 및 FAS 억제제 처리 후 세포 획득
2-1-1. LNCaP-ln3 배양 및 FAS 억제제 처리
LNCaP-ln3 전립선암 세포를 37℃온도의 5% 이산화탄소 세포배양기에서 10 %의 소태아혈청과 1 %의 항생제가 포함된 RPMI 배지를 사용하여 배양한다. 세포의 성장이 안정화된 이후에, 대조군에는 실험군 대신에 총 배지의 0.01%가 되는 량의 DMSO를 첨가하여 24시간 배양한다. 그리고 실험군으로는 총 배지의 0.01 %가 되는 양의 50 μM FASNALL, GSK2194069 및 TVB-3166 각각을 처리하여 24시간 동안 배양한다. 세포는 각 그룹별 5개의 세포 디쉬에서 배양하여 각 군의 총 실험 수가 5(n=5)이 되도록 하였다. 24시간 배양한 뒤에는 배지를 제거하고 인산완충생리식염수(PBS, phosphate buffered saline)를 이용하여 세포를 2차례 세척한 뒤에 셀 스크래퍼를 이용하여 세포를 배양 접시에서 획득하여 튜브에 담아 -80 ℃에서 보관한다.
2-1-2. MCF-7 배양 및 FAS 억제제 처리
MCF-7 유방암 세포를 37 ℃온도의 5% 이산화탄소 세포배양기에서 10 %의 소태아혈청과 1 %의 항생제가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 배양한다. 세포의 성장이 안정화된 이후에, 대조군에는 FASNALL 대신에 총 배지의 0.01%가 되는 량의 DMSO를 첨가하여 24시간 배양한다. 그리고 실험군으로는 총 배지의 0.01 %가 되는 양의 50 μM FASNALL, GSK2194069 및 TVB-3166 각각을 처리하여 24시간 동안 배양한다. 세포는 그룹 별 5개의 세포 디쉬에서 배양하여 각 군의 총 실험 수가 5(n=5)가 되도록 하였다. 24시간 배양한 뒤에는 배지를 PBS를 이용하여 세포를 2차례 세척해준 뒤에 셀 스크래퍼를 이용하여 세포를 배양 접시에서 획득하여 튜브에 담아 -80 ℃에서 보관한다.
2-2. 세포 내액 추출 및 DNA 정량
획득한 세포 시료에 대한 질량분석기 분석을 위하여 내부 표준물질로 레저핀 2 μg/mL 이 들어있는 70 % 메탄올 용액을 100 μL씩 넣어준 뒤, 볼텍싱을 하여 추출액에 시료가 잘 섞이게 한다. 그 후 시료와 용액의 혼합액을 액체 질소를 사용하여 얼렸다가 상온의 물에 녹여준 뒤 30초간 음파처리 해 주는 과정을 총 3번 반복 시행함으로써 세포를 파괴하여 세포 내의 대사체를 추출하였다. 그리고 나서 원심분리기를 이용하여 14000 rpm으로 10분 동안 원심 분리를 진행한 뒤에 상층액만 획득하여 분석을 진행했다.
획득한 추출액은 추후 세포량의 보정을 위하여 DNA 정량을 실시하였다. DNA정량은 신코 사의 분광광도계 Nano-MD를 사용하여, 추출액 5 μL를 큐벳에 넣어준 후 340 nm에서 정량하여 수행하였다.
2-3. 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry, UHPLC-MS)를 이용한 분석
초고성능 액체크로마토그래피질량분석기인 UPLC-Orbitrap-MS(Thermo Scientific™ Dionex™ UltiMate™ 3000과 Orbitrap Velos Pro™)를 이용하여 상기 실시예 2-2에 따라 전처리된 각 시료 내 대사체들의 분석을 수행하였다.
구체적으로, 획득한 시료 추출액을 바이알에 담은 뒤 10 μL를 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기에 주입한다. 주입기의 온도는 7℃로 유지하였다. 초고성능 액체크로마토그래피의 조건은 용액은 이동상 A로 0.1 % 포름산을 넣은 물을 사용하고 이동상 B로 0.1 % 포름산을 넣은 메탄올을 사용했다. 컬럼은 waters사의 ACQUITYⓡ HSS T3(2.1×100 mm, 1.7 μm)를 사용하고 컬럼의 온도는 40 ℃를 유지했다. 두 이동상을 UPLC 시스템 내에서 분석 시간에 따라 다른 비율로 혼합하여 흘려주는 기울기 용리(gradient elution)방법으로 진행하였고, 이때 액체크로마토그래피 이동상의 구배는 0분 A용액 99%로 2분, 14분에 B의 조성이 100%가 되도록 하고 이 후 15분까지 유지한 뒤 3분 동안 처음 조건으로 맞춰준다. 용액의 흐름은 0.4 mL로 유지했다. 질량분석기는 포지티브 모드(positive mode)와 네거티브 모드(negative mode) 분석 모두 진행되었다. 질량분석기의 소스(source)의 온도는 300 ℃, 용매 지연시간은 3분으로 하였다. 분석 도중에는 분석의 품질 관리를 위해 시퀀스에 quality control(QC)샘플을 넣어 전체 분석법의 진행에 기기의 문제가 없음을 확인하였다. QC샘플은 대조군 및 실험군 시료 추출액을 모두 풀링한 것으로 사용했다.
2-4. 크로마토그램 데이터 분석 및 통계 처리
분석 후 얻은 크로마토그램은 도 2 및 3에 나타내었다. LNCaP-ln3 세포주에 대하여 실험한 결과는 도 2에 나타내었고, MCF-7 세포주에 대하여 실험한 결과는 도 3에 나타내었다. 크로마토그램으로부터 써모피셔사이언티티픽 사의 compound discovery 소프트웨어를 사용하여 보정과 피크 정렬을 한 액셀 원본 데이터(raw data)를 추출하였다. 추출된 원본 데이터 의 개수는 총 1265개였다. 추출된 파일을 먼저 내부 표준물질로 나눠주고 세포의 DNA 정량을 이용하여 보정해준 뒤 SIMCA 소프트웨어를 이용하여 통계처리를 진행하였다. 그 결과는 도 4 및 5에 나타내었다. LNCaP-ln3 세포주에 대하여 실험한 결과는 도 4에 나타내었고, MCF-7 세포주에 대하여 실험한 결과는 도 5에 나타내었다.
도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, PCA 분석 결과 대조군과 실험군의 클러스터링(clustering)이 확연하게 나누어지는 것을 관찰 할 수 있었으며 이로써 약물 처리 후 세포 내 대사체의 변화가 있었음을 확인할 수 있었다.
이 후, 통계적 처리를 위하여, 상기 결과를 보정한 데이터에 대하여 t-검증을 수행하여 유의적으로 변한 데이터를 구분하였다. 통계처리 결과에 따라 p값이 0.05 이하인 물질들을 유의적인 변화를 나타내는 대사체로 분류하였다. 유의적인 변화를 나타내는 것으로 분류된 물질들은 크로마토그램의 m/z 값을 토대로 HMDB (Human Metabolome Database), 매스뱅크(massbank), 메틀린(metlin)과 같은 데이터베이스를 토대로 정성이 진행됐다.
그 결과, LNCaP-ln3 세포주에서 FASNALL, GSK2194069, TVB-3166 각각의 처리에 따라 유의적으로 변화한 검출 물질은 총 약 96개 정도였고, MCF-7 세포주에서 FASNALL 처리에 따라 유의적으로 변화한 검출 물질은 총 102개였다.
그 중 LNCaP-ln3 전립선암 세포주와 MCF-7 유방암 세포주 모두에서 FAS 억제제 처리에 따라 변화한 대사체 중 하나인 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판에 대한 변화값을 각각 도 6 내지 8 에 상자 수염 그림으로 나타내었다.
도 6 및 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 구체적으로, LNCaP-ln3 세포주의 경우 대조군과 비교하여 FASNALL, GSK2194069, TVB-3166 각각을 처리한 경우 N1-아세틸스퍼미딘이 각각 111.93배, 2.20배, 17.89배 증가되는 경향을 보였고, MCF-7 세포주의 경우 대조군과 비교하여 FASNALL, GSK2194069, TVB-3166 각각을 처리한 경우 N1-아세틸스퍼미딘이 각각 8.27배, 1.034배, 4.938배 증가됨을 확인하였다. 특히, FAS 과발현 세포인 LNCaP-ln3 세포주에서 약물 처리 시 대사체의 배수 변화(fold change)가 더 확연하게 나타나는 것을 볼 수 있었다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, LNCaP-ln3 전립선암 세포주에서 FAS 억제제 처리에 따라 변화한 대사체 중 일부인 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판과 관련해서는, LNCaP-ln3 세포주의 경우 대조군과 비교하여 FASNALL, GSK2194069, TVB-3166 처리시 스퍼미딘이 0.062배 0.022배, 0.009배 감소되는 경향을 보였고, 스퍼민이 0.321배, 0.167배, 0.223배 감소되는 경향을 보였으며, L-트립토판은 0.771배, 0.417배, 0.430배 감소함을 확인하였다.
또한, LNCaP-ln3 전립선암 세포주와 MCF-7 유방암 세포주 모두에서 FAS 억제제 처리에 따라 변화한 대사체들 중 일부인 8,11,14-에이코사트리엔산(8,11,14-eicosatrienoic acid), 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid), 리소PC(16:1)(LysoPC(16:1)), 리소PC(20:2)(LysoPC(20:2)), 리소PC(18:0)(LysoPC(18:0)), 리소PC(20:1)(LysoPC(20:1)), 리소PC(p-16:0)(LysoPC(p-16:0)), 팔미토일-L-카르니틴(palmitoyl-L-carnitine), PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2(prostaglandin A2), 스테아르산(stearic acid), 박센산(vaccenic acid)과 관련해서는, 도 9 내지 11에 나타내었다.
도 9 내지 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, LNCaP-ln3 세포주의 경우 대조군과 비교하여 FASNALL, GSK2194069, TVB-3166 처리 시 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산, 박센산에 대하여 3가지 약물을 각각 처리한 샘플들이 모두 같은 경향을 가지고 유의적으로 증감하였다. 아울러, MCF-7 세포주의 경우 또한 상기 실험군 각각은 대조군과 비교하여 FASNALL, GSK2194069, TVB-3166 처리 시 LNCaP-ln3 세포주에서 확인한 결과와 동일한 경향을 갖는 것을 확인하였다.
따라서 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(18:1), PE(34:1), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산 중 하나 이상을 이용하여 FASNALL, GSK2194069, TVB-3166을 포함하는 다양한 FAS 억제제의 약효를 스크리닝하는 데 활용할 수 있다.
실시예 3. 대사체들을 활용한 FAS 억제제 스크리닝의 정확도 확인
상기 실시예 2-1 내지 2-4에 기술한 방법을 통하여, LNCaP-ln3 전립선암 세포 및 MCF-7 유방암 세포를 각각 배양한 후 각 FAS 억제제들(FASNALL, GSK2194069 및 TVB-3166)을 처리하고, 각 세포 내액 추출물의 DNA 정량으로 보정을 진행하였으며, 그 결과에 대해서는 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기를 이용하여 분석을 진행하였다.
그리고 나서, 크로마토그램 데이터 분석 및 통계 처리를 진행하여 각 대사체들 처리에 따른 ROC (receiver operating characteristic) curve를 확보하였다.
구체적으로, Thermo Xcalibur Qual Browser의 크로마토그램으로부터 양성자로 이온화된 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판의 MS1값으로 범위를 설정하고 'Toggle peak detection'을 통해 각 물질의 peak 영역(area) 값을 구해 원본 데이터(raw data)를 추출하였다. 그 뒤 써모피셔사이언티픽 사의 compound discovery 소프트웨어를 사용하여 보정과 피크 정렬을 한 내부 표준물질로 나눠주었다. 세포의 DNA 정량을 이용하여 보정해 준 뒤 IBM SPSS Statistics 소프트웨어를 이용하여 통계처리를 진행하였다. 3 종류의 FAS 억제제를 처리한 3개의 군과 1개의 대조군을 포함한 4개 그룹의 n수는, LNCaP-ln3, MCF-7 세포 별로 각 5개씩 나누어 각 대사체마다 10개의 variable data를 얻었다. ROC curve analysis에서 Test variable로 4개의 대사체(N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판)를 지정해주고 각 샘플의 FAS 억제제 처리 상태를 State variable으로 설정해 개별 ROC curve분석을 진행하였다. 그 결과 두 개의 세포주에서 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판 각각에 대한 ROC curve를 총 8개를 확보하였다. MCF-7 세포에서 확인한 결과는 도 12 내지 15에 나타내었고, LNCaP-ln3 세포에서 확인한 결과는 도 16에 나타내었다. AUC(Area under curve)가 1에 가까울수록 정확도가 높음을 의미한다.
그리고 나서 Multi-biomarker로서의 ROC curve를 얻기 위해서 이진 로지스틱 분석(Binary logistic analysis)을 먼저 진행하여 상기 4개의 대사체를 변수로 지정하였고 'probabilities'로 결합시켜 새로운 test variable을 SPSS 데이터베이스에서 구해낸 뒤, 상기에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 ROC curve를 얻었다. 해당 ROC curve는 도 17에 나타내었다. 도면 내 붉은색 선은 참조선이며, AUC가 1에 가까울수록 정확도가 높음을 의미한다.
도 11 내지 17에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판를 활용하면 FAS 억제제 스크리닝 정확도가 우수하며, 이들 대사체들을 조합하는 경우 그 정확도가 보다 높아진다.
한국생명공학연구원 KCTC13643BP 20180917 한국생명공학연구원 KCTC13846BP 20190430

Claims (23)

  1. 암 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계;
    후보 물질을 처리한 암 세포주 내 N1-아세틸스퍼미딘(N1-acetylspermidine), 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine), L-트립토판(L-tryptophan), 8,11,14-에이코사트리엔산(8,11,14-eicosatrienoic acid), 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid), 리소PC(16:1)(LysoPC(16:1)), 리소PC(20:2)(LysoPC(20:2)), 리소PC(18:0)(LysoPC(18:0)), 리소PC(20:1)(LysoPC(20:1)), 리소PC(p-16:0)(LysoPC(p-16:0)), 팔미토일-L-카르니틴(palmitoyl-L-carnitine), PC(19:1), PC(35:4), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2(prostaglandin A2), 스테아르산(stearic acid) 및 박센산(vaccenic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨(level)을 측정하는 단계; 및
    측정한 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하는 단계;를 포함하는 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 합성 효소 억제제는 암 치료제인, 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 합성 효소 억제제는 유방암 치료제, 대장암 치료제, 위암 치료제, 갑상선암 치료제, 전립선암 치료제, 난소암 치료제 및 자궁내막암 치료제 중 하나 이상인, 스크리닝 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 암 세포주는 유방암 세포주, 대장암 세포주, 위암 세포주, 갑상선암 세포주, 전립선암 세포주, 난소암 세포주 및 자궁내막암 세포주 중 하나 이상인, 스크리닝 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 상기 암 세포주에서 상기 N1-아세틸스퍼미딘, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 높아지면 후보 물질이 지방산 합성 효소 억제제로 적합하다고 판단하고, 후보물질 처리 전과 비교하여 낮아지거나 동일하면 후보 물질이 지방산 합성 효소 억제제로 부적합하다고 판단하는 단계;를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 상기 암 세포주에서 상기 스퍼미딘, 스퍼민 및 L-트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 낮아지면 후보 물질이 지방산 합성 효소 억제제로 적합하다고 판단하고, 후보물질 처리 전과 비교하여 높아지거나 동일하면 후보 물질이 지방산 합성 효소 억제제로 부적합하다고 판단하는 단계;를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 상기 암 세포주에서 상기 N1-아세틸스퍼미딘, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 5% 이상 높아지면 후보 물질이 지방산 합성 효소 억제제로 적합하다고 판단하는 것인, 스크리닝 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 상기 암 세포주에서 상기 스퍼미딘, 스퍼민 및 L-트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 5% 이상 낮아지면 후보 물질이 지방산 합성 효소 억제제로 적합하다고 판단하는 것인, 스크리닝 방법.
  9. N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하는 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 지방산 합성 효소 억제제는 암 치료제인, 스크리닝용 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 지방산 합성 효소 억제제는 유방암 치료제, 대장암 치료제, 위암 치료제, 갑상선암 치료제, 전립선암 치료제, 난소암 치료제 및 자궁내막암 치료제 중 하나 이상인, 스크리닝용 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 유방암 세포주, 대장암 세포주, 위암 세포주, 갑상선암 세포주, 전립선암 세포주, 난소암 세포주 및 자궁내막암 세포주 중 하나 이상의 세포주를 더 포함하는, 스크리닝용 조성물.
  13. N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨 측정부를 포함하는 지방산 합성 효소 억제제의 스크리닝 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 지방산 합성 효소 억제제는 암 치료제인, 스크리닝 키트.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 지방산 합성 효소 억제제는 유방암 치료제, 대장암 치료제, 위암 치료제, 갑상선암 치료제, 전립선암 치료제, 난소암 치료제 및 자궁내막암 치료제 중 하나 이상인, 스크리닝 키트.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 키트는 유방암 세포주, 대장암 세포주, 위암 세포주, 갑상선암 세포주, 전립선암 세포주, 난소암 세포주 및 자궁내막암 세포주 중 하나 이상의 암 세포주를 더 포함하는, 스크리닝 키트.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 레벨 측정부는 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 스크리닝용 조성물을 포함하는 것인, 스크리닝 키트.
  18. 지방산 합성 효소 억제제로 치료 받은 또는 지방산 합성 효소 억제제로 치료 중인 암 환자로부터 분리된 시료 내에서 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨을 측정하는 단계; 및
    측정한 N1-아세틸스퍼미딘, 스퍼미딘, 스퍼민, L-트립토판 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨로 암 환자의 상태를 결정하는 단계;를 포함하는 암 환자의 상태 진단을 위한 정보 제공 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 암 환자는 유방암, 대장암, 위암, 갑상선암, 전립선암, 난소암 및 자궁내막암 중 하나 이상의 암에 대한 환자인, 정보 제공 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 방법은 상기 암 환자로부터 분리된 시료 내 상기 N1-아세틸스퍼미딘, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨이 암 치료 전과 비교하여 높아지면 암 환자의 상태가 개선되었다 판단하고, 암 치료 후와 비교하여 낮아지거나 동일하면 암 치료 상태가 나빠졌다고 판단하는 단계;를 더 포함하는, 정보 제공 방법.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 방법은 상기 암 환자로부터 분리된 시료 내 상기 스퍼미딘, 스퍼민 및 L-트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨이 암 치료 전과 비교하여 낮아지면 암 환자의 상태가 개선되었다 판단하고, 암 치료 후와 비교하여 높아지거나 동일하면 암 치료 상태가 나빠졌다고 판단하는 단계;를 더 포함하는, 정보 제공 방법.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 방법은 상기 암 환자에서 분리된 시료 내 상기 N1-아세틸스퍼미딘, 8,11,14-에이코사트리엔산, 도코사펜타엔산, 리소PC(16:1), 리소PC(20:2), 리소PC(18:0), 리소PC(20:1), 리소PC(p-16:0), 팔미토일-L-카르니틴, PC(19:1), PC(35:4), PE(37:6), 프로스타글란딘 A2, 스테아르산 및 박센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨이 암 치료 전과 비교하여 5% 이상 높아지면 암 환자의 상태가 개선되었다 판단하는 것인, 정보 제공 방법.
  23. 제18항에 있어서,
    상기 방법은 상기 암 환자에서 분리된 시료 내 상기 스퍼미딘, 스퍼민 및 L-트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 레벨이 암 치료 전과 비교하여 5% 이상 낮아지면 암 환자의 상태가 개선되었다 판단하는 것인, 정보 제공 방법.
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