CN110997942A - Eml4-alk基因突变分析方法 - Google Patents

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Abstract

根据本发明的一实施例，提供能够以比起现有的方法更灵敏的检测限检测基于血中循环癌细胞的EML4‑ALK基因突变的定量逆转录‑聚合酶链式反应(qRT‑PCR)用引物。根据本发明的另一实施例，提供难以采集肺癌组织的固态活检，即使在无法执行ALK‑荧光原位杂交(ALK‑FISH)检查的肺癌患者身上也可利用血中循环肺癌细胞来检测EML4‑ALK基因突变，从而确认是否可在肺癌患者身上适用将EML4‑ALK基因突变作为靶的抗癌剂的肺癌患者筛选方法。

Description

EML4-ALK基因突变分析方法
技术领域
本发明涉及EML4-ALK突变的检测方法，更详细地，涉及基于血中循环癌细胞的EML4-ALK突变检测用聚合酶链式反应(PCR)引物对、利用巢式(nested)聚合酶链式反应的EML4-ALK突变的检测方法及利用来源于非小细胞肺癌患者的血液的癌细胞来对抗癌剂进行的非小细胞肺癌患者筛选方法。
背景技术
肺癌在2010年韩国国内产生癌症患者(202053名)中占第四位(10.3％)，是常见于韩国人的癌症。但是，5年生存率为19.7％，与其他癌症相比，预后差。肺癌根据通过显微镜的癌细胞的大小和形态区分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，如此区分非小细胞肺癌和小细胞肺癌时，临床经过和治疗不同。根据2011年发表的中央癌症登记总部资料，在2009年，韩国一年产生192561件癌症，其中的非小细胞肺癌一年男女共产生14300件，非小细胞肺癌占总肺癌产生19685件的72.6％。男女性别比为2.5：1，男性多见(保健福祉部中央癌症登记总部2011年12月29日发表资料)。ALK阳性非小细胞肺癌为通过ALK、EML4这2个基因的融合产生的肺癌，是具有相当于总肺癌患者的4～7％(东方人7％)的EML4-ALK基因突变的患者，据报告，167名的韩国非小细胞肺癌患者中的10名具有EML4-ALK突变(J.Korean Med.Sci.,27：228-230,2012)。
对于上述EML4-ALK突变引起的非小细胞肺癌的靶抗癌剂为辉瑞开发的赛可瑞(XALKORI)(克唑替尼，crizotinib)。2011年8月，通过美国食品药品监督管理局(FDA)由赛可瑞共同被承认雅培的伴随诊断(companion diagnostics)之后，广泛用于美国肿瘤学界而在临床上得到验证，并成为标准化的基因检查方法。在欧洲也通过CE-IVD检查被承认，并从2011年9月用于医疗现场中，主要用于支援学术研究和新的治疗法的评价。赛可瑞上市之后，非小细胞肺癌的治疗以表皮生长因子受体(EGFR)突变检查之后，根据有无突变，在将易瑞沙(Iressa)或常规的细胞毒性抗癌剂(治疗效果低，副作用大)投药的标准治疗方法中，表皮生长因子受体、EML4-ALK检查之后，选择易瑞沙/赛可瑞/常规的细胞毒性抗癌剂中的治疗方法的方式转换模式。ALK基因突变表示多种形态的基因融合，作为用于将其检测的方法，免疫组织化学(immunohistochemistry)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)等可用于临床中，当前，作为用于将克唑替尼(crizotinib)给药的标准伴随诊断测试，利用由美国食品药品监督管理局承认的雅培的Vysis ALK荧光原位杂交方法，但这种方法存在因难且复杂而测试很多患者时需要很多费用和时间的问题。并且，众所周知，达到解剖学特性(Lung Cancer 84：39-44,2014,Cancer Cytopathol.Epub ahead of print2014.4.10)，从而迫切寻求与其相关的对策。
另一方面，血中循环癌细胞(CTC，circulating tumor cell)是指从原发肿瘤组织中脱离出来并沿着血流而流动的少数的肿瘤细胞，根据癌症，每1mL的血液中一个存在有数千个血中循环癌细胞。利用血中循环癌细胞的检查法作为可代替现有的组织检查的强大的技术，具有因低廉的费用、组织检查而减少患者的痛苦和危险，且可通过快速选定靶药物来延长患者的寿命的优点。
对此，本发明人为了开发用于还可使难以采集肺癌组织的患者也将抗癌剂，例如，克唑替尼(crizotinib)进行投药的基因检查法而锐意努力，最终，开发捕捉以血中循环癌细胞形态存在的肺癌细胞来以高的准确度确认上述血中循环肺癌细胞的EML4-ALK突变的方法，并完成本发明。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于，提供用于以高的准确度确认基于血中循环癌细胞的EML4-ALK基因突变的EML4-ALK突变检测用聚合酶链式反应引物对。本发明的再一目的在于，提供以高的准确度检测EML4-ALK的V1型突变的方法。本发明的另一目的在于，提供以高的准确度检测EML4-ALK的V3型突变的方法。
本发明的还一目的在于，提供利用来源于非小细胞肺癌患者的血液的癌细胞来确认抗癌剂对癌症患者是否有效的癌症患者筛选方法。
本发明要实现的技术问题不局限于以上提及的技术问题，本发明所属技术领域的普通技术人员可从以下记载内容中明确地理解未提及的其他技术问题。
用于解决问题的方案
为了实现上述技术问题，本发明的一实施方式的EML4-ALK基因突变分析方法可包括：从癌症患者身上获取液态活检样品的步骤；从上述液态活检样品中利用生物芯片来分离血中循环癌细胞的步骤；从分离的上述血中循环癌细胞中分离核糖核酸(RNA)的步骤；将分离的上述核糖核酸作为模板，并利用2个定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)用引物来执行定量逆转录-聚合酶链式反应的步骤；将在上述定量逆转录-聚合酶链式反应中产生的产物作为模板，并利用对于上述2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物的2个巢式引物来执行巢式聚合酶链式反应的步骤；以及利用在上述巢式聚合酶链式反应中产生的产物来检测EML-ALK基因的突变类型的步骤。
在本发明的实施例中，上述液态活检样品可以为血液。
在本发明的实施例中，上述癌症可以为肺癌。
在本发明的实施例中，上述癌症可以为非小细胞肺癌。
在本发明的实施例中，分离上述血中循环癌细胞的步骤可在大气压1000至1020hPa下实现。
在本发明的实施例中，上述生物芯片可以为由牛血清白蛋白(BSA)溶液涂敷的高密度微芯片。
在本发明的实施例中，上述高密度微芯片可具有尺寸特异性。
在本发明的实施例中，上述牛血清白蛋白溶液能够以0.05至0.15％的浓度进行涂敷。
在本发明的实施例中，上述EML4-ALK基因的突变类型可以为V1型或V3型。
在本发明的实施例中，上述2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物中的一个可以为正向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物，另一个可以为反向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物。
在本发明的实施例中，上述正向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物可以为选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4组成的组中的一个。
在本发明的实施例中，上述反向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物可以为SEQID NO.2。
在本发明的实施例中，上述2个巢式引物中的一个可以为正向巢式引物，另一个可以为反向巢式引物。
在本发明的实施例中，上述正向巢式引物可以为选自由SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.10组成的组中的一个。
在本发明的实施例中，上述反向巢式引物可以为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9。
为了实现上述技术问题，在本发明的另一实施方式的癌症患者筛选方法中，当通过本发明的EML4-ALK基因突变分析方法得到的癌症患者的基因突变与选自由如下组成的组中的一个一致时，抗癌剂可对上述癌症患者呈现有效性：(i)EML4基因的外显子1-13+ALK基因的外显子20-29；(ii)EML4基因的外显子1-20+ALK基因的外显子20-29；(iii)EML4基因的外显子1-6a+ALK基因的外显子20-29；(iv)EML4基因的外显子1-6b+ALK基因的外显子20-29；(v)EML4基因的外显子15+ALK基因的外显子20-29；(vi)EML4基因的外显子14+由11bp大小的寡核苷酸组成的连接子+ALK基因的外显子20-29；(vii)EML4基因的外显子2+ALK基因的外显子20-29；以及(viii)EML4基因的外显子2+ALK基因的内含子19+ALK基因的外显子20-29。
在本发明的实施例中，上述癌症可以为肺癌。
在本发明的实施例中，上述癌症可以为非小细胞肺癌。
在本发明的实施例中，上述抗癌剂可以为克唑替尼。
发明效果
根据本发明的实施例，难以采集肺癌组织，即使在无法执行ALK-荧光原位杂交检查的肺癌患者身上也可利用血中循环癌细胞来检测EML4-ALK突变，从而可容易确认是否适合将EML4-ALK突变作为靶的抗癌剂进行投药。
本发明的效果不局限于上述的效果，应被理解为包括可从本发明的发明内容或权利要求书中记载的发明的结构推论的所有效果。
附图说明
图1表示分离血中循环癌细胞的过程。
图2为拍摄利用高密度微芯片来分离的血中循环癌细胞的照片。
图3为表示在本发明的培养液中培养的血中循环癌细胞的生长及分裂和在一般的培养液中培养的血中循环癌细胞的生长及分裂的曲线图。
图4为表示利用本发明的培养液在由本发明中使用的水凝胶涂敷的培养板中培养的血中循环癌细胞的生长及分裂和在一般的培养板中培养的血中循环癌细胞的生长及分裂的曲线图。
图5表示通过公知的EML4-ALK的V1型基因突变检测方法得到的V1型基因突变的检测结果。
图6表示利用本发明的EML4-ALK的V1型基因突变检测用引物的V1型基因突变的检测结果。
图7表示利用本发明的EML4-ALK的V1型基因突变检测用引物来执行巢式聚合酶链式反应而得到的V1型基因突变的检测结果。
图8表示通过公知的EML4-ALK的V3型基因突变检测方法得到的V3基因突变的检测结果。
图9表示利用本发明的EML4-ALK的V3型基因突变检测用引物的V3型基因突变的检测结果。
图10表示利用本发明的EML4-ALK的V3型基因突变检测用引物来执行巢式聚合酶链式反应而得到的V3型基因突变的检测结果。
图11表示利用本发明的EML4-ALK的V1型基因突变检测用引物来适用于实际患者样品的结果。
图12表示在H3122细胞株中EML4-ALK的V1型基因突变的定量逆转录-聚合酶链式反应曲线图。
图13表示在H2228细胞株中EML4-ALK的V3型基因突变的定量逆转录-聚合酶链式反应曲线图。
具体实施方式
以下，详细说明本发明的实施例，可使本发明所属技术领域的普通技术人员容易实施。但是，本发明能够以多种不同的形态实现，不局限于在此说明的实施例。
实施例1：高密度微芯片的制备
对于实验中使用的高密度微芯片而言，气孔的大小(pore-size)以5.5～8.5μm形成，小于5.5μm的大小的白细胞(WBC，white blood cell)及红细胞(RBC，red blood cell)使芯片通过来去除，大于5.5μm的尺寸的靶细胞为以制备成卡在芯片来可选择性地回收特定尺寸的方式研究出的微芯片。
作为参考，为了确认高密度微芯片的细胞回收率，将癌症患者的癌细胞尖刺(spiking)10个、100个、1000个来利用芯片使其通过，从而执行察看芯片上的癌细胞的回收率的实验。将其的结果示于下列表1中。
表1
试样 尖刺细胞数 回收的细胞数 细胞回收率(％)
1 10 9 90
2 100 86 86
3 1000 850 85
计算芯片的细胞回收率，其结果，呈现约80％以上的高的细胞回收率，为了再次确认回收的细胞为癌细胞，将在现有的癌症检查中使用的细胞角蛋白(CK)抗体染色来进行确认，其结果，确认到均为细胞角蛋白阳性，是癌症细胞。
实施例2：血中循环癌细胞(CTC)分离过程
1.在5ml的血液中放入250μl的抗体聚合物之后，混合3秒左右之后，在常温条件下反应20分钟。
2.加入装有1％胎牛血清(FBS)的5ml的磷酸盐缓冲液(PBS)。
3.在装有15ml的Ficoll溶液的50ml的管(tube)中小心翼翼地放入10ml的反应溶液。
4.在1200g中将溶液离心分离20分钟，第一次去除血球细胞。
5.为了防止无需的细胞的吸附，利用0.1％牛血清白蛋白溶液将高密度微芯片(HDMicroporous chip，滤网)处理10分钟并涂敷之后，利用磷酸盐缓冲液进行冲洗。
6.将Ficoll的上清溶液放在滤网上，并以重力过滤微量存在的红细胞来第二次分离纯度高的血中循环癌细胞。其不进行离心分离或免疫珠(immunobead)之类的处理，从而防止血中循环癌细胞受损。
7.分离的血中循环癌细胞通过染色进行鉴定。
实施例3：分离的血中循环癌细胞的短期培养
将利用本发明的高密度微芯片来分离的血中循环癌细胞接种(seeding)于由具有中性电荷且带有亲水性的水凝胶涂敷的超低附着度(Ultra low attachment)培养板。上述培养板装有包含11ng/ml的胰岛素、22ng/ml的转铁蛋白、2ng/ml的EGF及8μm的罗氏激酶抑制剂的培养液，就上述短期培养而言，从培养的时间点到14天期间，在细胞培养箱中，在37℃及5～10％CO2条件下进行培养。
实施例4：血中循环癌细胞的确认
根据上述实施例3短期培养的血中循环癌细胞为了通过染色方法被确认为癌症细胞，利用以下方法执行细胞染色过程。
1.执行作为细胞离心分离法的细胞离心涂片法(cytospin)过程来将回收的细胞固定于染色用载玻片。
2.执行渗透(permeabilization)过程，以便于可使抗体进入细胞内部。
3.利用磷酸盐缓冲液来执行冲洗(washing)过程。
4.利用磷酸盐缓冲液来制备1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin)，为了减少非特异性反应(non-specific binding)和内源性过氧化物酶活性(endogenousperoxidase activity)，执行阻断(blocking)过程。
5.利用第一抗体使上皮细胞粘附分子(EpCAM，epithelial cell adhesionmolecule)、细胞角蛋白(CK，cytokeratin)及分化簇(CD，cluster of differentiation)45在常温下反应60分钟。
6.使与上述第一抗体相结合的荧光标记的第二抗体在常温下反应60分钟。
7.利用磷酸盐缓冲液执行冲洗过程。
8.最终，为了对细胞核进行染色，放入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，4′,6-diamidino-2-phenylindole)溶液(solution)之后，盖上盖玻片，并在常温下反应10分钟。
9.一边观察染色的细胞一边手动计算染色的比率及回收率。
比较例1：根据培养液的血中循环癌细胞的培养的细胞数变化
在通常使用于细胞培养的细胞培养液和本发明的培养液中对血中循环癌细胞的分裂及生长程度进行比较实验。通常使用于细胞培养的培养液包含25nM的亚硒酸钠(sodium selenite)、50nM的氢化可的松(Hydrocortisone)、0.01mM的乙醇胺(ethanolamine)、0.01mM的磷酸乙醇胺(phosphorylethanolamine)、100pM的三碘甲状腺素(triiodothyronine)、0.5％(w/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin)、10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5mM的丙酮酸钠(sodium pyruvate)、4.5mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine)及1X的抗生素-抗真菌(antibiotic-antimycotic)，本发明的培养液与上述实施例3相同。并且，培养条件除了利用一般的板之外与实施例3相同。
参照图3可知，分化簇45-为对于培养的血中循环癌细胞的生物标记，正常生长培养基(Normal growth media)是指一般的细胞培养液，CG生长培养基(CG growth media)是指本发明的培养液。图3表示在本发明的培养液中培养出更多血中循环癌细胞，由此可知本发明的培养液与常规的培养液相比，对血中循环癌细胞的分裂及培养更有效。
比较例2：涂敷有水凝胶的培养板中根据培养液的血中循环癌细胞的培养的细胞 数变化
在使用本发明的培养液的情况下，为了测定对于血中循环癌细胞的细胞生长及分裂的涂敷有水凝胶的培养板效果，与一般的培养板实施比较培养。本发明的培养液与上述实施例3相同。
参照图4可知，正常培养类型(Normal culture type)表示一般的细胞培养板(细胞附着于培养板表面)，低附着类型(Low attachment type)为本发明中使用的涂敷有水凝胶的培养板。图4表示利用本发明的培养液在涂敷有水凝胶的培养板中培养更多的血中循环癌细胞，其表示涂敷有水凝胶的培养板中的培养对血中循环癌细胞的分裂及培养更有效。
实施例5：利用定量逆转录-聚合酶链式反应的EML4-ALK的V1型突变的检测方法
培养具有EML4-ALK的V1型的突变的作为肺癌细胞株的H3122细胞株(MatthewMeyerson Department of Medical Oncology,Dana-Farber Cancer Institute,Boston,MA 02115)之后，提取RNA。从上述提取的RNA中合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，并依次稀释合成的互补脱氧核糖核酸来用作EML4-ALK的V1型检测用定量逆转录-聚合酶链式反应的模板。
作为阴性对照组，使用外周血单个核细胞(PBMC)和A549细胞(ATCC，CCL-185)。将定量逆转录-聚合酶链式反应用混合物的组成示于表2中。
表2
Figure BDA0002373428260000091
作为聚合酶链式反应周期，在95℃下改性10分钟之后，以95℃下30秒钟、60℃下30秒钟、72℃下40秒钟作为1周期来执行40周期，并在72℃下伸张10分钟。
使用的聚合酶链式反应引物如下。
EML4(E12)-FP：5’-CACACCTGGGAAAGGACCTA-3’(V1正向引物)(SEQ ID NO.1)
ALK(E20)-RP：5’-ACTACTGCTTTGCTGGCAAGACCT-3’(V1反向引物)(SEQ ID NO.2)
对照组引物序列(FP)：5’-GTGCAGTGTTTAGCATTCTTGGGG-3’(正向引物)(SEQ IDNO.5)
对照组引物序列(RP)：5’-ATCCAGTTCGTCCTGTTCAGAGC-3’(反向引物)(SEQ IDNO.6)
扩增的定量逆转录-聚合酶链式反应产物在琼脂糖凝胶中进行电泳来确认条带，并分离确认的条带(band)来执行测序。
其结果，在利用现有的公知的引物的聚合酶链式反应方法(图5)和利用本发明的引物的定量逆转录-聚合酶链式反应方法(图6)中均能够以检测限0.1％～1％检测V1突变，在本实施例的方法中，可确认更干净的条带。其中，0.1％是指可在每1000个白细胞的一个血中循环癌细胞中进行检测。
实施例6：利用定量逆转录-聚合酶链式反应的EML4-ALK的V3型突变的检测方法
培养具有EML4-ALK的V3型的突变的作为肺癌细胞株的H2228细胞株(ATCC，CRL-5935)之后，提取核糖核酸。从提取的上述核糖核酸中合成互补脱氧核糖核酸，并依次稀释合成的互补脱氧核糖核酸来用作EML4-ALK的V3型检测用定量逆转录-聚合酶链式反应的模板。除了使用的引物之外，以与实施例5相同的方法执行定量逆转录-聚合酶链式反应。
当使用EML4(E1E2)-FP引物(SEQ ID NO.3)和ALK(E20)-RP引物(SEQ ID NO.2)来执行定量逆转录-聚合酶链式反应时，789bp(V3a型)或822bp(V3b型)的聚合酶链式反应产物被扩增，当使用EML4(E4)-FP引物(SEQ ID NO.4)和ALK(E20)-RP引物(SEQ ID NO.2)来执行定量逆转录-聚合酶链式反应时，387bp(V3a型)或420bp(V3b型)的定量逆转录-聚合酶链式反应产物被扩增。
使用的定量逆转录-聚合酶链式反应引物如下。
EML4(E1E2)-FP：5’-CCAAAACTGCAGACAAGCAT-3’(V3正向引物)(SEQ ID NO.3)
EML4(E4)-FP：5’-CACAAATTCGAGCATCACCTTCTC-3’(V3正向引物)(SEQ ID NO.4)
ALK(E20)-RP：5’-ACTACTGCTTTGCTGGCAAGACCT-3’(V3反向引物)(SEQ ID NO.2)
对照组引物序列(FP)：5’-GTCAGCTCITGAGTCACGAGIT-3’(正向引物)(SEQ IDNO.7)
对照组引物序列(RP)：5’-ATCCAGITCGTCCTGITCAGAGC-3’(反向引物)(SEQ IDNO.8)
扩增的定量逆转录-聚合酶链式反应产物在琼脂糖凝胶中进行电泳来确认条带，并分离确认的条带来执行测序。
其结果，在利用现有的公知的引物的聚合酶链式反应方法(图8)中，能够以检测限1％～10％检测V3突变，在利用本发明的引物的聚合酶链式反应方法(图9)中，当使用EML4(E1E2)-FP引物时，表示1～10％的检测限，当使用EML4(E4)-FP引物时，表示0.1～1％的检测限。
实施例7：利用巢式聚合酶链式反应的V1及V3型突变的检测
在用于V1突变检测的巢式聚合酶链式反应中，1st聚合酶链式反应使用EML4(E12)-FP(SEQ ID NO.1)和3078RR引物(SEQ ID NO.9)，2nd聚合酶链式反应使用fusion RT-S引物(SEQ ID NO.10)和ALK(E20)-RP(SEQ ID NO.2)。
3078RR引物序列：5'-ATCCAGTTCGTCCTGTTCAGAGC-3’(SEQ ID NO.9)
Fusion RT-S引物序列：5’-GTGCAGTGTTTAGCATTCTTGGGG-3'(SEQ ID NO.10)
其结果，如图7所示，在V1型突变中，可在检测限0.001％检测突变类型，从而确认到与公知的技术相比，将灵敏度提高1000倍。
在用于V3突变检测的巢式聚合酶链式反应中，1st聚合酶链式反应使用EML4(E1E2)-FP(SEQ ID NO.3)和ALK(E20)-RP(SEQ ID NO.2)，2nd聚合酶链式反应使用EML4(E4)-FP(SEQ ID NO.4)和ALK(E20)-RP(SEQ ID NO.2)。
其结果，如图10所示，在V3型突变中，能够以检测限0.1％检测突变类型，从而确认到以10倍改善灵敏度。
实施例8：利用巢式聚合酶链式反应的临床样品中的EMI.A-ALK突变检测
使用实施例6及实施例7的聚合酶链式反应及巢式聚合酶链式反应方法来检测临床样品中的EML4-ALK突变。
将核糖核酸提取自从组织学上得到确诊的非小细胞肺癌患者中通过癌症组织的荧光原位杂交结果确认为EML4-ALK阳性的患者(首尔大学医院IRB1209-029-424，2012.9.12)的血液中分离的血中循环癌细胞。从提取的上述核糖核酸中合成互补脱氧核糖核酸，并将合成的互补脱氧核糖核酸用作模板来通过实施例7的方法执行巢式聚合酶链式反应。
其结果，如图11所示，确认到V1型突变的检测，从而确认到在实际具有EML4-ALK突变的患者的血中癌细胞中可检测EML4-ALK突变。
上述的本发明的说明用于例示，本发明所属技术领域的普通技术人员应当理解，在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下，能够以其他具体的形态容易变形。因此，应理解为以上记述的多个实施例在所有方面是例示性的，而非限定。例如，以单一型说明的各个结构要素能够以分散的方式实施，同样，说明分散的多个结构要素也能够以结合的形态实施。
本发明的范围由所附的发明要求保护范围表示，应解释为从发明要求保护范围的含义及范围以及其等同概念导出的所有变更或变形的形态包括在本发明的范围。
以下，参照附图，说明本发明。但是，本发明能够以多种不同的形态实现，因此不局限于在此说明的实施例。并且，在图中，为了明确说明本发明，省略与说明无关的部分，在说明书全文中，对于类似的部分，标注类似的附图标记。
在说明书全文中，当一个部分与另一部分相“连接(相连、接触、结合)”时，其不仅包括“直接连接”的情况，还包括在其中隔着其他部件“间接连接”的情况。并且，当一个部分“包括”另一结构要素时，除非有特别反对的记载，则不排除其他结构要素，而是指还可具有其他结构要素。
在本说明书中使用的术语仅用于说明特定的实施例，并无限定本发明的意图。单数的表现除非文脉上有明确不同的含义，则包括复数的表现。应当理解，在本说明书中，“包括”或“具有”等的术语用于指定说明书上记载的特征、数字、步骤、动作、结构要素、部件或组合这些的组合物的存在，而不预先排除一个或其以上的其他特征或数字、步骤、动作、结构要素、部件或组合这些的组合物的存在或附加可能性。
以下，参照附图，详细说明本发明的实施例。
本发明的一实施方式的EML4-ALK基因突变分析方法可包括：步骤(a)，从癌症患者身上获取液态活检样品；步骤(b)，从上述液态活检样品中利用生物芯片来分离血中循环癌细胞；步骤(c)，从分离的上述血中循环癌细胞中分离核糖核酸；步骤(d)，将分离的上述核糖核酸作为模板，并利用2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物来执行定量逆转录-聚合酶链式反应；步骤(e)，将在上述定量逆转录-聚合酶链式反应中产生的产物作为模板，并利用对于上述2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物的2个巢式引物来执行巢式聚合酶链式反应；步骤(f)，利用在上述巢式聚合酶链式反应中产生的产物来检测EML-ALK基因的突变类型。
上述液态活检是指无穿刺或剖开等的浸湿性手术而采集血液或腹水等体液中的癌症的基因碎片的检查。即，上述液态活检可仅通过血液等的体液检查分析存在于身体每个部位血液或腹水内的来源于癌细胞的脱氧核糖核酸(DNA)来详细观察癌症产生及转移等。根据本发明的一实施例，用于上述液态活检的样品可包含血液、滑液、腹水、胸膜液、脑脊液、腹膜液。根据本发明的优选一实施例，上述液态活检样品可以为血液。
上述血中循环癌细胞(CTC，Circulating Tumor Cells)是指在恶性肿瘤患者的外周血中发现的肿瘤细胞。血中循环癌细胞非常稀少，可求的标本的量非常受限。血中循环癌细胞的检测及特性分析中的技术包括多重逆转录定量聚合酶链式反应方法、基于影像化的接近法、微细过滤法及微芯片装置，不局限于此。血中循环癌细胞可作用为以液态活检试样个别化的治疗和治疗之后可必然地提供经过观察的肿瘤生物学标记物。并且，血中循环癌细胞可用作用于理解肿瘤的生物学特性及肿瘤细胞的播种的靶，但不局限于此。根据本发明的一实施例，上述血中循环癌细胞可以为来源于肺癌的细胞。根据本发明的优选一实施例，上述血中循环癌细胞可以为来源于非小细胞肺癌的细胞。
上述生物芯片是指对由半导体之类的无机物形成的固态底物将来源于生物的脱氧核糖核酸、蛋白质、酶、抗体、微生物、动植物细胞及器官、神经细胞等的物质以高密度进行集成化并进行组合来制备成现有的半导体芯片形态的混合器件，指利用生物分子的固有的功能，并得到基因表达形态、基因结合、蛋白质分布等的生物学信息或提高生化工序及反应速度或信息处理速度的道具或装置。
上述高密度微芯片是指可基于生物芯片的作用原理分离特定尺寸的物质的生物芯片。
上述高密度微芯片可基于血液细胞的大小差异，并在10分钟以内以约90％的回收率捕捉血中循环癌细胞。
在本发明的实施例中，上述高密度微芯片的气孔大小(pore size)可优选为5.5至8.5μm，可更优选为6.5至7.5μm。当气孔的大小小于5.5μm时，红细胞及白细胞无法通过芯片而卡在芯片上，从而无法被去除，当气孔的大小大于8.5μm时，气孔的大小大于血中循环癌细胞及免疫细胞的大小，致使血中循环癌细胞及免疫细胞通过芯片，从而无法选择性地回收血中循环癌细胞及免疫细胞。在本发明的一实施例中，上述高密度微芯片的气孔形状可以为圆形、四角形或椭圆形状，优选为四角形。
在本发明的一实施例中，上述高密度微芯片的气孔能够以规则性的图案进行排列。在本发明的另一实施例中，具体地，上述高密度微芯片可将不锈钢、镍、铝或铜作为原材料来进行制备。上述气孔可通过利用微机电系统(MEMS，Micro-electro MechanicalSystems)技术的蚀刻(etching)形成。
气孔中的相邻的两个气孔之间的间隔窄于血中循环癌细胞及免疫细胞的直径。根据本发明的一实施例，两个气孔之间的间隔可相对于血中循环癌细胞及免疫细胞的直径以45～65％形成。上述高密度微芯片不因在通道流动的血液或溶液的压力而发生变形。
血液通过气孔之后，向外排出，血液中的血中循环癌细胞无法通过气孔而残留于表面。根据本发明的一实施例，上述血中循环癌细胞可以为来源于肺癌的细胞。根据本发明的优选一实施例，上述血中循环癌细胞可以为来源于非小细胞肺癌的细胞。
变形率比起非靶细胞，即，比起血中循环癌细胞高的红细胞容易通过气孔。
血中循环癌细胞进行过滤之后，血中循环癌细胞可反向或正向供给溶液来将其向外排出。根据本发明的一实施例，可反向供给溶液，以便于可将血中循环癌细胞的受损最小化。上述溶液可利用注射器、注射泵、柱塞泵等来进行供给。根据本发明的一实施例，上述溶液可由稀释血液的稀释剂、水(Water)及稀释用酸形成。可将通过上述溶液的供给向外排出的血中循环癌细胞及免疫细胞回收于容器(Container)，例如，试管、培养皿等来简便地进行采集。
另一方面，当被施加约100mmHg的压力时，直径为7.5～15μm的血中循环癌细胞通过直径为8μm的管。通过直径为8μm的管的直径为15μm的血中循环癌细胞具有约53％的变形率。当反冲洗(Back washing)，即，与血液的流动相反的方向使溶液流动来使直径为7.5μm的血中循环癌细胞向外排出时，若考虑血中循环癌细胞的变形率，则两个气孔之间的间隔优选为4μm以下。例如，众所周知，非小细胞肺癌和乳腺癌的癌细胞的直径达到40μm左右。当进行反冲洗时，若考虑直径为40μm的血中循环癌细胞的变形率，则优选地，将两个气孔之间的间隔设定为21μm以下。当直径为7.5μm的血中循环癌细胞存在于间隔大于4μm的两个气孔之间时，血中循环癌细胞可不因溶液的流动而发生变形，从而从表面中脱落。并且，直径为40μm的癌细胞也可不从间隔大于21μm的两个气孔之间的表面中脱落。在本发明的高密度微芯片中，考虑到溶液的压力，两个气孔之间的间隔相对于血中循环癌细胞的直径以45～65％形成。当间隔大于65％，即，大于约4.9μm时，直径为7.5μm的血中循环癌细胞可不因反冲洗而从两个气孔之间的表面中脱落。当间隔大于65％，即，大于26μm时，直径为40μm的血中循环癌细胞可不因反冲洗而从两个气孔之间的表面中脱落。当为了使附着于两个气孔之间的表面的血中循环癌细胞强制性地脱落而提高溶液的压力时，发生血中循环癌细胞的受损，从而降低生存的血中循环癌细胞的采集率。当对于直径为7.5μm的血中循环癌细胞的间隔小于45％，即，小于约3.375μm时，上述高密度微芯片因血液和溶液的流动而破损的担忧高。
在本发明的一实施例中，可使上述试样反复通过上述高密度微芯片。具体地，血中循环癌细胞在上述高密度微芯片中分离一次之后，可重新将分离的上述血中循环癌细胞装载于上述高密度微芯片来进行分离，可反复上述分离过程。
在本发明的一实施例中，通过上述高密度微芯片的血中循环癌细胞分离并不以将包含血中循环癌细胞的溶液装载于高密度微芯片之后，施加特定的人为压力的方式实现，而是可利用重力来实现血中循环癌细胞分离。通过本发明的高密度微芯片的血中循环癌细胞分离可将人为压力对血中循环癌细胞的损伤最小化来将存在于患者体内的状态维持不变。
在本发明的一实施例中，为了当血中循环癌细胞分离时，将上述高密度微芯片引起的血中循环癌细胞损伤最小化或更有效地反复使用上述高密度微芯片，或使血中循环癌细胞回收率更加有效，上述高密度微芯片可由特定物质进行涂敷。上述特定物质具体地可以为可与血中循环癌细胞特异性地相结合的抗体，只要是不对细胞带来物理或化学损伤的生物材料即可。根据本发明的一实施例，上述特定物质可以为牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin)或抗体。上述抗体例如可由抗上皮细胞粘附分子抗体(Anti-Epithelial CellAdhesion Molecule antibody，Anti-EpCAM antibody)、抗细胞角蛋白抗体(Anti-Cytokeratin antibody，Anti-CKantibody)等形成。根据本发明的优选一实施例，上述特定物质可以为牛血清白蛋白(BSA，Bovine Serum Albumin)。
上述BSA(Bovine Serum Albumin)溶液是指牛血清白蛋白。分子量为约66.4kDa左右的蛋白质，是多存在于大部分动物的蛋白质。牛血清白蛋白在生物化学/生物学中当进行细胞培养时可作为细胞的营养成分进行添加，并且，多用于蛋白质的定量中用于获得检查曲线的标准物，当使用限制酶时，应使用少量的酶(蛋白质)，因而还可为了补充溶液内的蛋白质浓度而进行添加。并且，还可用于多种生化实验(免疫印迹(Western blot)、免疫细胞化学(Immunocytochemistry)、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)等)中附着要检测特定抗体的蛋白质之前，以防止非特异性结合(nonspecific binding)，即，抗体附着于无需的蛋白质或无需的位置的非特异性结合。
根据本发明的一实施例，可利用离心分离法来使外周血反应于由上述牛血清白蛋白溶液涂敷的高密度微芯片，以去除除了血中循环癌细胞之外的其他生物高分子。根据本发明的一实施例，利用上述高密度微芯片的分离可借助重力实现，具体地，可在大气压为1000至1020hPa的条件下实现。优选地，可在大气压为1000至1015hPa的条件下实现。更优选地，可在大气压为1000至1013hPa的条件下实现。
根据本发明的一实施例，上述牛血清白蛋白溶液可涂敷于上述高密度微芯片的上面、下面或上述气孔的内侧面。优选地，可均涂敷于上述高密度微芯片的上面、下面及上述气孔的内侧面。
根据本发明的一实施例，上述牛血清白蛋白溶液能够以0.05至0.15％浓度进行涂敷。根据本发明的优选实施例，上述牛血清白蛋白溶液能够以0.08至0.012％浓度进行涂敷。
根据本发明的一实施例，上述牛血清白蛋白溶液可进行5至15分钟的涂敷处理。根据本发明的优选一实施例，上述牛血清白蛋白溶液可进行8至12分钟的涂敷处理。
参照图1，为了从患者的血液中优先去除血球细胞，在采集的患者的血液中放入抗体聚合物之后，均匀地进行混合，之后，在常温条件下发生反应。之后，加入含有1％胎牛血清的磷酸盐缓冲液溶液，并将Ficoll溶液放置于反应溶液之后，通过离心分离第一次去除血球细胞。像这样，第一次去除本发明中无需的血球细胞之后，利用由牛血清白蛋白溶液特别涂敷的高密度微芯片来过滤红细胞，从而分离纯度高的血中循环癌细胞。分离的血中循环癌细胞通过染色进行鉴定。当利用由上述牛血清白蛋白涂敷的高密度微芯片时，可在使本发明中要分离的血中循环癌细胞受损最小化的状态下进行分离，如此高的纯度的血中循环癌细胞可相当增大其效率，以便于使本发明的EML4-ALK基因突变分析方法起有效作用。
根据本发明的一实施例，在从上述液态活检样品中利用生物芯片来分离血中循环癌细胞的步骤之后，可追加执行将分离的血中循环癌细胞短期培养的步骤。
在本发明的一实施例中，上述短期培养中使用的培养液可由选自由胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子(EGF，Epidermal Growth Factor)及罗氏激酶(ROCK，Rho Kinase)抑制剂组成的组中的至少3个形成。
上述胰岛素为人类的物质代谢系统的激素中之一，在胰脏(器官)的朗格汉斯岛β细胞中分泌而起到规定地维持作为血液中的葡萄糖数值的血糖量的作用。当血糖量提高规定以上时，分泌胰岛素，并促进将血液内的葡萄糖流入至细胞内而重新以多糖类(糖原)的形态储存的作用。本发明的短期培养步骤中使用的培养液包含上述胰岛素，从而当培养血中癌细胞时，与以往的血中循环肿瘤细胞培养液相比，可更加促进细胞生长及分裂。根据本发明的一实施例，上述胰岛素可以为3～50ng/ml、3～45ng/ml、3～40ng/ml、3～30ng/ml、4～50ng/ml、4～45ng/ml、4～30ng/ml、5～50ng/ml、5～45ng/ml或5～30ng/ml。
上述转铁蛋白为β球蛋白的一种，是与吸收于血清中的二分子的三价铁离子相结合，从而介导转铁蛋白受体来向细胞内供给细胞增殖或血红蛋白生产所需的铁的铁转运蛋白。血清中的99％以上铁与转铁蛋白相结合，正常情况下，转铁蛋白的约1/3可与铁相结合。本发明的短期培养步骤中使用的培养液包含上述转铁蛋白，从而当培养血中癌细胞时，与以往的血中循环肿瘤细胞培养液相比，可更加促进细胞生长及分裂。根据本发明的一实施例，上述转铁蛋白可以为3～50ng/ml、3～45ng/ml、3～40ng/ml、3～30ng/ml、4～50ng/ml、4～45ng/ml、4～30ng/ml、5～50ng/ml、5～45ng/ml或5～30ng/ml。
上述表皮生长因子(EGF，Epidermal Growth Factor)为与表皮生长因子受体相结合来促进细胞的生长及分裂的多肽性生长因子。并且，上述表皮生长因子除了促进蛋白质合成或核糖核酸合成之外，可诱导鸟氨酸脱羧酶。本发明的短期培养步骤中使用的培养液包含上述表皮生长因子，从而当培养血中癌细胞时，与以往的血中循环肿瘤细胞培养液相比，可更加促进细胞生长及分裂。根据本发明的实施例，上述表皮生长因子可以为0.5～10ng/ml、0.5～9ng/ml、0.5～8ng/ml、0.5～7ng/ml、0.5～6ng/ml、0.5～5ng/ml、0.7～10ng/ml、0.7～9ng/ml、0.7～8ng/ml、0.7～7ng/ml、0.7～6ng/ml、0.7～5ng/ml、1～10ng/ml、1～9ng/ml、1～8ng/ml、1～7ng/ml、1～6ng/ml或1～5ng/ml。
上述Rho相关蛋白激酶(ROCK，Rho-associated protein kinase)抑制剂是指可将罗氏激酶(ROCK)作为靶来抑制或降低其功能的化合物。其中，罗氏激酶为属于丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC家族(PKA/PKG/PKC)的激酶。上述罗氏激酶与作用于细胞骨架来控制细胞的运动及形态的过程相关。具体地，上述罗氏激酶可作用为细胞的移动及肌动蛋白组织化的调节因子。上述罗氏激酶与糖尿病、出血性脑血管疾病、帕金森氏病之类的神经退行性疾病相关，上述罗氏激酶抑制剂可用于治疗及抑制上述罗氏激酶相关疾病。根据本发明的一实施例，上述罗氏激酶抑制剂可以为选自由法舒地尔(Fasudil)、利帕舒地尔(Ripasudil)、RKI-1447及Y27632组成的组中的至少一个。上述法舒地尔作为罗氏激酶抑制剂的一种，可用于治疗脑血管痉挛，还可对肺动脉高压治疗有效。上述利帕舒地尔作为上述法舒地尔的衍生物，可作用为罗氏激酶抑制剂，还可用于治疗青光眼或高眼压症。上述RKI-1447可抑制罗氏激酶1和罗氏激酶2。上述Y27632可通过细胞为了结合酶的催化剂部位而与腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)竞争，从而抑制罗氏激酶1和罗氏激酶2。根据本发明的一实施例，上述罗氏激酶抑制剂可以为3～30μm、3～27μm、3～24μm、3～21μm、4～20μm、4～30μm、4～27μm、4～24μm、4～21μm、4～20μm、5～30μm、5～27μm、5～24μm、5～21μm或5～20μm。
本发明的短期培养中使用的上述培养板可具有用于防止细胞粘附的表面。根据本发明的一实施例，血中癌细胞可在漂浮状态下进行培养，因而能够以使上述培养板的表面防止细胞粘附的方式进行涂敷。上述培养板的表面可由水凝胶进行涂敷。上述水凝胶是指将水作为分散介质的凝胶，水溶胶因冷却而丧失流动性或具有三维网络结构和微晶结构的亲水性高分子包含水来膨胀而形成。具体地，上述水凝胶作为借助共价键、氢键、范德华键或物理键等的凝聚力进行交联的亲水性高分子，是具有在水溶液上将大量的水含在内部而可进行膨润的三维高分子网络结构的物质。像这样，在吸收水的状态下，呈现与生物体的组织相似的动作。上述水凝胶以温度、pH等发生相变，从而可使膨胀比不连续地发生变化，可用于隐形眼镜、医疗用电极、细胞培养中。根据本发明的一实施例，上述水凝胶能够以共价键涂敷于上述培养板来防止血中癌细胞粘附于培养板表面。根据本发明的再一实施例，上述水凝胶可具有中性电荷的同时具有亲水性。上述具有中性电荷是指电荷处于非正非负的状态，上述亲水性是指对于水的强的亲和力，指可容易溶解于水中。
在本发明的一实施例中，上述短期培养的步骤可从开始培养的时间点进行到1至15天。在本发明的再一实施例中，可以为5至15天，优选地，可以为10至15天。更优选地，可以为12至15天。
根据本发明的一实施例，ALK阳性非小细胞肺癌为因基于ALK、EML4这2个基因的融合的EML4-ALK突变而产生的肺癌，EML4-ALK突变根据融合的EML4基因的外显子和/或内含子部位具有如下所示的多种突变类型。
变体(Variant)1：外显子1-13(EML4)+外显子20-29(ALK)
变体(Variant)2：外显子1-20(EML4)+外显子20-29(ALK)
变体(Variant)3a：外显子1-6a(EML4)+外显子20-29(ALK)
变体(Variant)3b：外显子1-6b(EML4)+外显子20-29(ALK)
变体(Variant)4a：外显子15(EML4)+外显子20-29(ALK)
变体(Variant)4b：外显子14(EML4)+由11bp大小的寡核苷酸组成的连接子+外显子20-29CALK)
变体(Variant)5a：外显子2(EML4)+外显子20-29(ALK)
变体(Variant)5b：外显子2(EML4)+内含子19(ALK)+外显子20-29(ALK)
据报告，确认到在这些变体中韩国有很多变体1(Variant1，V1)和变体3(Variant3，V3)这2个类型的突变患者，确认非小细胞肺癌患者167名，其结果，若确认到10名为EML4-ALK融合突变，则其中4名为V1型突变，2名为V3b型突变(J.Korean Med.Sci.,27：228-230,2012)。
V3型有2个亚型(isoform)，在V3b型中，EML4内含子6的33bp追加包含于融合部分中。因此，当检测V3型的聚合酶链式反应时，可产生2个大小的聚合酶链式反应产物。
根据本发明的一实施例，上述EML4-ALK基因的突变类型可以为V1型、V2型、V3a型、V3b型、V4a型、V4b型、V5a型或V5b型，优选地，可以为V1型或V3型。
分离上述核糖核酸的步骤可通过本领域中通常使用的方法执行，可利用以商业形式销售的核糖核酸提取试剂盒来执行。并且，在执行定量逆转录-聚合酶链式反应的上述步骤中，定量逆转录-聚合酶链式反应将分离的核糖核酸作为模板，将本发明的2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物中的反向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物作为引物，可利用逆转录酶通过逆转录反应合成互补性脱氧核糖核酸链之后，执行聚合酶链式反应。聚合酶链式反应可利用包含聚合酶链式反应所需的本领域中公知的多种成分的聚合酶链式反应混合液来执行。在上述聚合酶链式反应反应混合液中，除了通过逆转录反应合成的互补性脱氧核糖核酸和本发明中提供的定量逆转录-聚合酶链式反应用引物之外，包含适量的脱氧核糖核酸聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、聚合酶链式反应缓冲溶液及蒸馏水(dH2O)。上述聚合酶链式反应缓冲溶液包含Tris-HCl、MgCl2、KCl等。此时，MgCl2浓度对扩增的特异性和数量产生大的影响。通常，当Mg2+为过量时，作为非特异性的聚合酶链式反应扩增产物增加，当Mg2+不足时，聚合酶链式反应产物的产出率减少。上述聚合酶链式反应缓冲溶液还可包含适量的Triton X-100。并且，聚合酶链式反应可在使脱氧核糖核酸预变性之后，经过变性(denaturation)、退火(annealing)及扩增(extension)的周期，最终，在72℃下延伸(elongation)的常规的聚合酶链式反应反应条件下执行。在上述内容中，变性及扩增可分别在94～95℃及72℃温度下执行，结合时的温度可根据扩增的引物的种类而不同。根据本发明的一实施例，本发明的定量逆转录-聚合酶链式反应用引物可在55～64℃下执行。各个步骤的时间和循环数可根据本领域中通常进行的条件而确定。
用于检测EML4-ALK突变的公知的引物的检测限为0.1～1％，当试样为癌症组织时，检测突变没有问题，但为了使用分离血中循环癌细胞来检测的方法，应在0.1％以下也可进行确认，因而需要检测限低的引物。在本发明中，为了设计具有高的准确度和检测效率的引物，以如下的方法设计引物。当设计引物时，利用引物3(http://bioinfo.ut.ee/orimer3-0.4.O/)引物设计(primer design)程序来确定候选组之后，在NCBI主页(htto://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中通过基于局部比对算法的搜索工具(blastsearch)回避在非EML4-ALK部位的另一部分结合引物的可能性、产生发夹结构的可能性，直接比较引物对之间的同源性来防止相互不产生二聚体(dimer)，并确认气相色谱含量(GC content)来防止成为60％以上。将上述四种引物的Tm值调节成相似的值来设计成能够以任何引物组合也可容易执行聚合酶链式反应。回避反复或连续的序列出现，并将互补脱氧核糖核酸用作模板，因而为了防止引物与基因组脱氧核糖核酸相结合来产生多频段(multiple band)，尽可能设计在外显子间连接(junction)之间。
本发明的再一实施例，2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物中的一个为选自由以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4表示的引物组成的组中的一个正向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物，另一个可由以SEQ ID NO.2表示的反向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物形成。
根据本发明的一实施例，上述2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物可选自由以SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2表示的引物对、以SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.2表示的引物对及以SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.2表示的引物对组成的组中。
根据本发明的另一实施例，2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物以SEQ IDNO.1及SEQ ID NO.2表示的引物对可用于检测EML4-ALK的V1型基因突变，以SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.2表示的引物对及以SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.2表示的引物对可用于检测EML4-ALK的V3型基因突变。
在执行巢式聚合酶链式反应的上述步骤中，可通过本领域中广泛公知的方法按照各个大小分离聚合酶链式反应产物的脱氧核糖核酸。优选地，可利用琼脂糖凝胶(agarosegel)或聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)电泳或荧光分析装置(ABI棱镜3100遗传分析仪-电泳图，ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)来进行确认。此时，为了利用荧光分析装置，利用附着有本领域中公知的荧光染料(dye)的2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物来在执行定量逆转录-聚合酶链式反应的上述步骤中执行聚合酶链式反应。
当在巢式聚合酶链式反应步骤中追加检测PCV时，可将非特异性反应引起的错误最小化，从而当需要时，可有用地利用。
优选地，聚合酶链式反应扩增结果可通过琼脂糖凝胶电泳进行确认。电泳之后，可通过溴化乙锭(ethidium bromide)染色分析电泳结果。常规的逆转录反应、聚合酶链式反应执行及其结果的分析方法在本领域中是众所周知的。
根据本发明的一实施例，上述2个巢式引物中的一个可以为正向巢式引物，另一个可以为反向巢式引物。
根据本发明的再一实施例，2个巢式引物中的一个可以为选自由以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.10表示的引物组成的组中的一个正向巢式引物，另一个可以为选自由以SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9表示的引物组成的组中的一个反向巢式引物，但只要是可将上述定量逆转录-聚合酶链式反应产物扩增的引物对，就可以不受限制地使用。
根据本发明的再一实施例，上述2个巢式引物以SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.9表示的引物对及以SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.2表示的引物对可用于检测EML4-ALK的V1型基因突变，以SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.2表示的引物对及以SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.2表示的引物对可用于检测EML4-ALK的V3型基因突变。
本发明中使用的标准重组脱氧核糖核酸及分子克隆技术广泛公知于本领域中，并记载于以下文献中(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,Molecular Cloning:ALaboratoryManual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1989)；by Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.and Enquist,L.W.,Experiments with GeneFusions,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1984)；and byAusubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,published by GreenePublishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987))。
在本发明的另一实施方式的癌症患者筛选方法中，当通过上述EML4-ALK基因突变分析方法得到的基因突变与选自由如下组成的组中的一个一致时，抗癌剂可对癌症患者呈现有效性：(i)EML4基因的外显子1-13+ALK基因的外显子20-29；(ii)EML4基因的外显子1-20+ALK基因的外显子20-29；(iii)EML4基因的外显子1-6a+ALK基因的外显子20-29；(iv)EML4基因的外显子1-6b+ALK基因的外显子20-29；(v)EML4基因的外显子15+ALK基因的外显子20-29；(vi)EML4基因的外显子14+由11bp大小的寡核苷酸组成的连接子+ALK基因的外显子20-29；(vii)EML4基因的外显子2+ALK基因的外显子20-29；以及(viii)EML4基因的外显子2+ALK基因的内含子19+ALK基因的外显子20-29。
根据本发明的一实施例，上述癌症可以为肺癌，优选地，可以为非小细胞肺癌。
根据本发明的再一实施例，上述抗癌剂可以为克唑替尼。
对于因EML4-ALK突变而产生的非小细胞肺癌的靶抗癌剂为克唑替尼(产品名称：赛可瑞、辉瑞)，当前，非小细胞肺癌的治疗采用在表皮生长因子受体基因突变及EML4-ALK融合突变检查之后，选择易瑞沙/赛可瑞/常规的细胞毒性抗癌剂的治疗方法的方式。
但是，就无法进行对肺癌组织具有浸湿性的组织检查的患者而言，无法执行EML4-ALK融合突变的基因检查，从而无法确认将克唑替尼给药是否有效，因而无法进行投药治疗。
在本发明的癌症患者筛选方法中，可从非小细胞肺癌患者的血液中分离血中循环癌细胞，并确认上述血中循环癌细胞的EML4-ALK融合突变的存在来确定克唑替尼对非小细胞肺癌患者是否有效。
以下，详细说明本发明的实施例，可使本发明所属技术领域的普通技术人员容易实施。但是，本发明能够以多种不同的形态实现，不局限于在此说明的实施例。
<110> 西托根有限公司
<120> EML4-ALK基因突变分析方法
<130> P20170105KR
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EML4(E12)-正向引物序列
<400> 1
cacacctggg aaaggaccta 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ALK(E20)-反向引物序列
<400> 2
actactgctt tgctggcaag acct 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EML4(E1E2)-正向引物序列
<400> 3
ccaaaactgc agacaagcat 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EML4(E4)-正向引物序列
<400> 4
cacaaattcg agcatcacct tctc 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 控制正向引物序列
<400> 5
gtgcagtgtt tagcattctt gggg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 控制反向引物序列
<400> 6
gtgcagtgtt tagcattctt gggg 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 控制正向引物序列
<400> 7
gtcagctctt gagtcacgag tt 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 控制反向引物序列
<400> 8
atccagttcg tcctgttcag agc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3078RR 引物序列
<400> 9
atccagttcg tcctgttcag agc 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fusion RT-S 引物序列
<400> 10
gtgcagtgtt tagcattctt gggg 24

Claims (19)

1.一种EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，包括：
从癌症患者身上获取液态活检样品的步骤；
从所述液态活检样品中利用生物芯片来分离血中循环癌细胞的步骤；
从分离的所述血中循环癌细胞中分离RNA的步骤；
将分离的所述RNA作为模板，并利用2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物来执行定量逆转录-聚合酶链式反应的步骤；
将在所述定量逆转录-聚合酶链式反应中产生的产物作为模板，并利用对于所述2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物的2个巢式引物来执行巢式聚合酶链式反应的步骤；以及
利用在所述巢式聚合酶链式反应中产生的产物来检测EML-ALK基因的突变类型的步骤。
2.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述液态活检样品为血液。
3.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述癌症为肺癌。
4.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述癌症为非小细胞肺癌。
5.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，分离所述血中循环癌细胞的步骤在大气压1000至1020hPa下实现。
6.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述生物芯片为由牛血清白蛋白溶液涂敷的高密度微芯片。
7.根据权利要求6所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述高密度微芯片具有尺寸特异性。
8.根据权利要求6所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白溶液以0.05至0.15％的浓度进行涂敷。
9.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述EML4-ALK基因的突变类型为V1型或V3型。
10.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物中的一个为正向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物，另一个为反向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物。
11.根据权利要求10所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述正向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物为选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4组成的组中的一个。
12.根据权利要求10所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述反向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物为SEQ ID NO.2。
13.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述2个巢式引物中的一个为正向巢式引物，另一个为反向巢式引物。
14.根据权利要求13所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述正向巢式引物为选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.10组成的组中的一个。
15.根据权利要求13所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述反向巢式引物为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9。
16.一种癌症患者筛选方法，其特征在于，当通过权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法得到的癌症患者的基因突变与选自由如下组成的组中的一个一致时，抗癌剂对所述癌症患者呈现有效性：
(i)EML4基因的外显子1-13+ALK基因的外显子20-29；
(ii)EML4基因的外显子1-20+ALK基因的外显子20-29；
(iii)EML4基因的外显子1-6a+ALK基因的外显子20-29；
(iv)EML4基因的外显子1-6b+ALK基因的外显子20-29；
(v)EML4基因的外显子15+ALK基因的外显子20-29；
(vi)EML4基因的外显子14+由11bp大小的寡核苷酸组成的连接子+ALK基因的外显子20-29；
(vii)EML4基因的外显子2+ALK基因的外显子20-29；以及
(viii)EML4基因的外显子2+ALK基因的内含子19+ALK基因的外显子20-29。
17.根据权利要求16所述的癌症患者筛选方法，其特征在于，所述癌症为肺癌。
18.根据权利要求16所述的癌症患者筛选方法，其特征在于，所述癌症为非小细胞肺癌。
19.根据权利要求16所述的癌症患者筛选方法，其特征在于，所述抗癌剂为克唑替尼。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101466721A (zh) * 2007-04-13 2009-06-24 细胞信号技术公司 在人实体瘤中的基因缺损和突变体alk激酶
CN102719525A (zh) * 2012-04-12 2012-10-10 厦门艾德生物医药科技有限公司 用于检测eml4-alk融合基因突变的引物、探针及检测试剂盒
CN103397045A (zh) * 2007-04-13 2013-11-20 细胞信号技术公司 在人实体瘤中的基因缺损和突变体alk激酶
CN104685356A (zh) * 2012-05-24 2015-06-03 瑞儿塞尔斯公司 通过过滤从生物样品提取或分离的罕见细胞的多种分析方法
CN104818320A (zh) * 2014-12-03 2015-08-05 厦门艾德生物医药科技有限公司 一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒
KR20160001304A (ko) * 2014-06-27 2016-01-06 주식회사 싸이토젠 Rt-pcr 기반 eml4-alk 양성 판별방법
CN106148525A (zh) * 2011-05-23 2016-11-23 细胞信号科技公司 肺癌中的ros激酶

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2762108A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Insight Genetics, Inc. Methods and compositions relating to fusions of alk for diagnosing and treating cancer
WO2011087709A2 (en) * 2009-12-22 2011-07-21 Quest Diagnostics Investments Incorporated Eml4-alk translocations in lung cancer
KR20110115478A (ko) 2010-04-15 2011-10-21 주식회사 싸이토젠 미세유체장치 및 이것을 이용한 타깃의 분리방법
KR101254680B1 (ko) 2010-04-15 2013-04-23 주식회사 싸이토젠 미세유체장치
KR101226515B1 (ko) 2010-04-15 2013-01-25 주식회사 싸이토젠 미세유체장치
KR101254679B1 (ko) 2010-04-15 2013-04-23 주식회사 싸이토젠 미세유체장치 및 이것을 이용한 타깃의 분리방법
AR080913A1 (es) * 2010-04-16 2012-05-16 Response Genetics Cebadores, sondas, metodos y conjuntos de elementos para la deteccion de variantes de eml4- alk
JP5769952B2 (ja) * 2010-11-12 2015-08-26 株式会社Ｌｓｉメディエンス Ｅｍｌ４−ａｌｋ融合遺伝子の高感度検出方法
WO2017096232A1 (en) * 2015-12-02 2017-06-08 The Johns Hopkins University Use of an integrated microfluidic chip for analysis of cell motility and prediction and prognosis of patient survival
US20190093172A1 (en) 2016-04-15 2019-03-28 Exosome Diagnostics, Inc. Plasma-based detection of anaplastic lymphoma kinase (alk) nucleic acids and alk fusion transcripts and uses thereof in diagnosis and treatment of cancer

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101466721A (zh) * 2007-04-13 2009-06-24 细胞信号技术公司 在人实体瘤中的基因缺损和突变体alk激酶
CN103397045A (zh) * 2007-04-13 2013-11-20 细胞信号技术公司 在人实体瘤中的基因缺损和突变体alk激酶
CN106148525A (zh) * 2011-05-23 2016-11-23 细胞信号科技公司 肺癌中的ros激酶
CN102719525A (zh) * 2012-04-12 2012-10-10 厦门艾德生物医药科技有限公司 用于检测eml4-alk融合基因突变的引物、探针及检测试剂盒
CN104685356A (zh) * 2012-05-24 2015-06-03 瑞儿塞尔斯公司 通过过滤从生物样品提取或分离的罕见细胞的多种分析方法
KR20160001304A (ko) * 2014-06-27 2016-01-06 주식회사 싸이토젠 Rt-pcr 기반 eml4-alk 양성 판별방법
CN104818320A (zh) * 2014-12-03 2015-08-05 厦门艾德生物医药科技有限公司 一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EUN HYE KIM 等: "Enrichment of cancer cells from whole blood using a microfabricated porous filter" *
EUN HYE KIM 等: "Enrichment of cancer cells from whole blood using a microfabricated porous filter", 《ANAL BIOCHEM》, vol. 440, no. 1, pages 115 *
REZA RIAHI 等: "A novel microchannel-based device to capture and analyze circulating tumor cells (CTCs) of breast cance", 《INT J ONCOL》, vol. 44, no. 6, pages 1871 *
REZA RIAHI 等: "A novel microchannel-based device to capture and analyze circulating tumor cells (CTCs) of breast cancer", vol. 44, no. 6, pages 1871 *
杜萍 等: "EML4-ALK融合基因阳性分子靶向药物研究进展", vol. 24, no. 16 *

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