CN106086157A - 过氧化氢酶活性测定仪及其使用方法 - Google Patents

Abstract

一种过氧化氢酶活性测定仪，呈有盖（11）的反应筒（4），盖中心有按转轴（14）、轴上和轴旁有凸栓（15）和卡口座（12），轴上套有弹簧（13），盖上还有气液进口（17），反应筒侧壁上有带启闭阀的测氧气孔（6）、通液气孔（5）和放液孔（1），且均有密封圈（18）。反应筒内有存液皿（10）、胶片（9）、小孔分流托片（8）和搅拌筛（2），圆面上均开有分流孔或筛孔（16、19、3），反应筒内侧壁上部有搁台（7）。使用步骤：一是使用前的预处理和检查，二是加料和关闭阀门，三是测原始氧气量，四是混合、反应和再测量，五是比较和计算，六是放废水和换气。本发明能测得反应全过程的数据，精度高，用产氧量反映酶活性，是一套全新的技术方案。

Description

过氧化氢酶活性测定仪及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种化学实验仪器，具体是用于酶促反应气体产生量的增减变化、间接显示酶活性的测定仪及其使用方法。

背景技术

过氧化氢酶活性的测定，一直以来是按过氧化氢与过氧化氢酶在酶促反应中过氧化氢量的减少，用紫外分光光度计240nm波长的紫外光照射，吸光度逐渐降低，测出吸光度的变化速度，测出过氧化氢酶的活性。具体做法是将过氧化氢酶与过氧化氢置于比色皿中，立即将分光光度计也置于比色皿内，开启光度计、盖上比色皿的盖，进行比色测定。这种比色仪进行测定时，投放过氧化氢酶与投放过氧化氢几乎是同时进行，因酶促反应中的酶具有高效性，两者一旦混合，反应就开始，过氧化氢的反应损耗也已经产生，即使立即投放分光光度计、开始实测，还是无法反映出这时间差中过氧化氢的损耗量，所测数据不甚准确，误差较大。本发明是将过氧化氢酶与过氧化氢反应中氧气产生量的增减来反映过氧化氢酶的活性，反应与实测同步进行，既没有时间差，又能显示出整个反应的全貌，为此，设计出一种专用的测定仪和提供一套配套的新的使用方法，经检索和市场调查，未见有相关资料报道和实物面市。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在酶促反应中将过氧化氢的减量改为氧气的增量来反映过氧化氢酶的活性，能使反应与实测同步进行且误差小的一种过氧化氢酶活性测定仪及其使用方法。

解决上述技术问题采用如下技术方案：本过氧化氢酶活性测定仪，包括反应和测定部件，呈圆筒体的反应筒上部有内衬密封圈的盖，盖上有带启闭阀的气液进口，该盖中心有轴孔并安装有上部带凸栓和套有复位弹簧的按转轴，盖上的轴孔两侧安装有卡口座，座上有卡口，按转轴的中上段和下端段有定位销孔；反应筒的侧壁上安装有测氧气孔、通液气孔和放液孔，这三孔均带有启闭阀，反应筒的上部内壁上有圆环形搁台，反应筒内由上至下有存液皿、胶片、小孔分流托片和搅拌筛，存液皿上和胶片上有轴孔和孔径相同、位置对应的大分流孔，小孔分流托片上有轴孔和小分流孔，搅拌筛上有轴孔和筛孔，存液皿和胶片搁放在搁台上，小孔分流托片和搅拌筛均有与按转轴的定位销孔位置对应的定位销，反应筒盖及侧壁上与外界的通孔周围均安装有密封圈。

所述的存液皿轴孔的孔径比按转轴直径大1-2mm，胶片轴孔的孔径比按转轴直径大0.1-0.2mm，小孔分流托片轴孔的孔径比按转轴直径大0.1-0.2mm。

所述的存液皿、胶片、小孔分流托片和搅拌筛上的大分流孔或小分流孔由外及内均呈同心圆排列，顺着放射线方向分布。

所述的反应筒的内径比存放皿的外径和胶片的直径大1-2mm；所述的小孔分流托片的直径大于存液皿或胶片最外周作同心圆排列的各大分流孔外侧弧线的切线连接圆的直径，且小于圆环形搁台的内径。

本过氧化氢酶活性测定仪的使用方法按如下步骤进行：

（1）使用前的预处理和检查：

①：选购好合适浓度的过氧化氢溶液和配制好待测的过氧化氢酶溶液；

②：清洗与安装好反应筒及其内外各部件，盖上盖体并至密封，将上下重合的存液皿与胶片一起架搁在圆环形搁台上，将测氧气孔与测氧仪连接好；

③检查各阀门的开与闭，关闭放液孔上的阀门，开启气液进口、测氧气孔和通液气孔上的阀门；

④将按转轴向上提并作小角度的反时针转动，使搅拌筛和小孔分流托片上行，后者紧贴胶片，在大分流孔与小分流孔不贯通时，凸栓搁在卡口座上定位；

（2）加料和关闭阀门：从通液气孔向反应筒内加入经称量的过氧化氢溶液，从气液进口向存液皿加入经称量的过氧化氢酶溶液，再关闭上述两孔或口上的阀门；

（3）测量、读取并记录反应筒内原始的氧气含量；

（4）放料、使两溶液混合、反应和测量：顺时针拧动按转轴，使凸栓脱离卡口座，进一步按下按转轴，使小孔分流托片与胶片脱离，存液皿内的过氧化氢酶液快速从大分流孔直接下流，与过氧化氢溶液混合并快速反应，上下多次按动按转轴，使混合液在该筛的上下搅动中更快速、充分反应；按每隔30秒测一次含氧量，并读取和记录相关数据；

（5）根据实测的单位时间的增氧量、按公式计算和比较过氧化氢酶的活性；

（6）放水、换气，准备再测：一次测定结束，从放液孔放掉反应生成的废液，打开通液气孔和气液进口的阀门，将反应筒内反应生成的气体换成大气，再重复上述步骤，进行下一次测定。

本发明的有益效果是：本测定仪及其使用方法，能使反应与实测同步进行，所测数据，能反映出整个反应的全貌，精度高、误差小，且提供了一种酶活性测定的新仪器、新思路和新的使用方法。

附图说明

图1为本测定仪结构示意图。

图2为本测定仪存液皿和托片上的大分流孔布局状态示意（俯视）图。

图3为本测定仪小孔分流托片上的小分流孔布局状态示意（俯视）图。

具体实施方式

本发明下面结合实施例并参照附图予以详述：参见图1-3，本过氧化氢酶活性测定仪，包括反应和测定部件，呈圆筒体的反应筒4上部有内衬密封圈的盖11，盖上有带启闭阀的气液进口17，该盖中心有轴孔a并安装有上部带凸栓15和套有复位弹簧13的按转轴14，盖上的轴孔两侧安装有卡口座12，座上有卡口，按转轴的中上段和下端段有定位销孔；反应筒的侧壁上安装有测氧气孔6、通液气孔5和放液孔1，这三孔均带有启闭阀，反应筒的上部内壁上有圆环形搁台7，反应筒内由上至下有存液皿10、胶片9、小孔分流托片8和搅拌筛2，存液皿上和胶片上有轴孔和孔径相同、位置对应的大分流孔16，小孔分流托片上有轴孔和小分流孔19，搅拌筛上有轴孔和筛孔，存液皿和胶片搁放在搁台上，小孔分流托片和搅拌筛均有与按转轴的定位销孔位置对应的定位销20，反应筒盖及侧壁上与外界的通孔周围均安装有密封圈18。

所述的存液皿轴孔a的孔径比按转轴直径大1-2mm，胶片轴孔的孔径比按转轴直径大0.1-0.2mm，小孔分流托片轴孔的孔径比按转轴直径大0.1-0.2mm。

所述的存液皿、胶片、小孔分流托片和搅拌筛上的大分流孔16或小分流孔19由外及内均呈同心圆排列，顺着放射线方向分布。

所述的反应筒4的内径比存放皿10的外径和胶片9的直径大1-2mm；所述的小孔分流托片8的直径大于存液皿或胶片最外周作同心圆排列的各大分流孔16外侧弧线的切线连接圆b的直径，且小于圆环形搁台7的内径。

使用权利要求1的过氧化氢酶活性测定仪的方法按如下步骤进行：

（1）使用前的预处理和检查：

①：选购好合适浓度的过氧化氢溶液和配制好待测的过氧化氢酶溶液；

②：清洗与安装好反应筒及其内外各部件，盖上盖体并至密封，将上下重合的存液皿与胶片一起架搁在圆环形搁台上，将测氧气孔与测氧仪连接好；

③检查各阀门的开与闭，关闭放液孔上的阀门，开启气液进口、测氧气孔和通液气孔上的阀门；

④将按转轴向上提并作小角度的反时针转动，使搅拌筛和小孔分流托片上行，后者紧贴胶片，在大分流孔与小分流孔不贯通时，凸栓搁在卡口座上定位；

（2）加料和关闭阀门：从通液气孔向反应筒内加入经称量的过氧化氢溶液，从气液进口向存液皿加入经称量的过氧化氢酶溶液，再关闭上述两孔或口上的阀门；

（3）测量、读取并记录反应筒内原始的氧气含量；

（4）放料、使两溶液混合、反应和测量：顺时针拧动按转轴，使凸栓脱离卡口座，进一步按下按转轴，使小孔分流托片与胶片脱离，存液皿内的过氧化氢酶液快速从大分流孔直接下流，与过氧化氢溶液混合并快速反应，上下多次按动按转轴，使混合液在该筛的上下搅动中更快速、充分反应；按每隔30秒测一次含氧量，并读取和记录相关数据；

（5）根据实测的单位时间的增氧量、按公式计算和比较过氧化氢酶的活性；

（6）放水、换气，准备再测：一次测定结束，从放液孔放掉反应生成的废液，打开通液气孔和气液进口的阀门，将反应筒内反应生成的气体换成大气，再重复上述步骤，进行下一次测定。

使用本测定仪前，先检查测定仪，将存液皿10的底面与胶片9重合，一起架搁在圆环形搁台7上，向上提拉按转轴14，逆时针方向稍拧动该轴，顺势将按转轴上的凸栓15搁在卡口座12上定位，此时，小孔分流托片与上方的胶片紧贴，搅拌筛2上行，小孔分流托片8上各小孔与其上方的两层重合的大分流孔16不贯通，则存液皿即使存有液体也不会从小分流孔中向下流出；再拧动按转轴，使大分流孔与小分流孔贯通，则存液皿的液体就会由大分流孔至小分流孔向下流出，单位时间的流量较小。需流量大时，顺时针拧动按转轴，使凸栓从所搁的卡口座上脱离，再向下按动按转轴，使小孔分流托片和搅拌筛下行，则小孔分流托片与胶片分离，存液皿中的液体就会通过大分流孔向下流，不受小分流孔的阻挡，流量就大。对按转轴连续按动多次，复位弹簧13以相应的次数反弹，则搅拌筛上下多次活动，使反应筒4底部的反应液在充分搅动中更快速、均匀、彻底地完成反应。过氧化氢可从通液气孔5加入至反应筒底部，过氧化氢酶从气液进口10加入至存液皿内，测氧气孔6与测氧仪连接，放液孔1用于放掉实验用后的废液，为下一批实验作准备。盖11用于安装本测定仪的内外部零件，撤换内部零件、清洗反应筒内室。

使用时，将反应筒底部的放液孔1的启闭阀关闭、测氧气孔6与测氧仪连接，开启通液气孔5和气液进口17上的阀门，将按转轴14向上提和作逆时针的小角度拧动，使小孔分流托片紧贴其上的胶片，大分流孔16与小分流孔19不贯通，凸栓15搁在卡口座12上，将盖11关好、拧紧至密封。从通液气孔5中向反应筒4内加入经计量的过氧化氢液，从气液进口17向反应筒内的存液皿10加入经计量的过氧化氢酶液，分别关闭通液气孔5和气液进口17的阀门，此时，存液皿10中的过氧化氢酶液未曾向下与过氧化氢混合，酶促反应尚未开始，从测氧仪中读取并记录反应筒内原始的氧气含量。若要慢速反应，则上提按转轴并小角度顺时针拧动该轴，使大分流孔与小分流孔贯通，则存液皿中的过氧化氢酶液顺大分流孔、再至小分流孔向下流出，与反应筒底部的过氧化氢反应，不断地、逐步地消耗过氧化氢的同时，产生着氧气，分时间段分别读取并记录氧气的增量，直至反应结束，画出不同时间段的氧气含量变化曲线，根据公式计算出过氧化氢酶的活性。若需快速反应，则再继续顺时针拧动按转轴，使该轴上的凸栓脱离卡口座后，再将按转轴向下按，使小孔分流托片脱离了胶板，存液皿内的过氧化氢酶经大分流孔快速下流，下流过程中不受小分流孔的阻挡，直接流至反应筒底，与筒底内的过氧化氢混合，酶促反应开始，与前述过程一样记录各时间段的氧气含量变化并制定曲线。若使反应更快，则拧动按转轴，使小孔分流托板脱离胶片，过氧化氢酶液从大分流孔直接向下流至反应筒底与过氧化氢混合而反应，同时再连续上下多次按动按转轴，使搅拌筛急速上下搅动，将混合液搅拌均匀，则反应会更快、更彻底。作为过氧化氢酶的活性测定是要求反应一旦开始应快速，则宜采用上述第三种由大分流孔快速放液和搅拌同时进行的方法。在反应开始之初，氧气产生量较大，曲线斜率也大，反映酶的活性最好。

过氧化氢酶活性的计算公式为：

过氧化氢酶活性（U·μmol·min^-1·g^-1）=（2×ΔO₂×V_T）/（W×V_S×t）；

以每分钟内氧气增加的物质的量的2倍的酶量为1个酶活单位（U）；

式中：ΔO₂为待测过氧化氢酶溶液的放氧曲线的直线部分的氧气增加量（μmol），V_T为提取酶液总体积（mL），V_S为测定时取用酶液体积（mL），W为生物材料鲜重（g），t为待测过氧化氢酶溶液的放氧曲线的直线部分所消耗的时间（min）。

至于用一对卡口座，开有小分流孔是为增设挡位和调控放液速度留余地，以扩大本测定仪的通用性。不同零件的大小轴孔a、贯通与不贯通、是否需临时定位，是否兼顾密闭性等均应统筹考虑。大分流孔和小分流孔的孔径大小、密度、分布方式，可以多样化，不局限附图所示的几种方式，总之，是基于反应筒横截圆面的大小、反应液量的大小、大孔与小孔贯通与不贯通的转换方便与否等因素而定的。存液皿、胶片、小孔分流片，均可按需要制成排列方式、孔径大小、分布密度不同的系列产品，按不同反应的要求进行调换。配套应用的氧气测定仪如要求精度高的，则可选购英国Hansatech生产的Chlorolab2型的氧电极。

Claims (5)

1.一种过氧化氢酶活性测定仪，包括反应和测定部件，其特征是呈圆筒体的反应筒（4）上部有内衬密封圈的盖（11），盖上有带启闭阀的气液进口（17），该盖中心有轴孔（a）并安装有上部带凸栓（15）和套有复位弹簧（13）的按转轴（14），盖上的轴孔两侧安装有卡口座（12），座上有卡口，按转轴的中上段和下端段有定位销孔；反应筒的侧壁上安装有测氧气孔（6）、通液气孔（5）和放液孔（1），这三孔均带有启闭阀，反应筒的上部内壁上有圆环形搁台（7），反应筒内由上至下有存液皿（10）、胶片（9）、小孔分流托片（8）和搅拌筛（2），存液皿上和胶片上有轴孔和孔径相同、位置对应的大分流孔（16），小孔分流托片上有轴孔和小分流孔（19），搅拌筛上有轴孔和筛孔，存液皿和胶片搁放在搁台上，小孔分流托片和搅拌筛均有与按转轴的定位销孔位置对应的定位销（20），反应筒盖及侧壁上与外界的通孔周围均安装有密封圈（18）。

2.如权利要求1所述的过氧化氢酶活性测定仪，其特征是所述的存液皿轴孔（a）的孔径比按转轴直径大1-2mm，胶片轴孔的孔径比按转轴直径大0.1-0.2mm，小孔分流托片轴孔的孔径比按转轴直径大0.1-0.2mm。

3.如权利要求1所述的过氧化氢酶活性测定仪，其特征是所述的存液皿、胶片、小孔分流托片和搅拌筛上的大分流孔（16）或小分流孔（19）由外及内均呈同心圆排列，顺着放射线方向分布。

4.如权利要求1所述的过氧化氢酶活性测定仪，其特征是所述的反应筒（4）的内径比存放皿（10）的外径和胶片（9）的直径大1-2mm；所述的小孔分流托片（8）的直径大于存液皿或胶片最外周作同心圆排列的各大分流孔（16）外侧弧线的切线连接圆（b）的直径，且小于圆环形搁台（7）的内径。

5.一种使用权利要求1的过氧化氢酶活性测定仪的方法，其特征是按如下步骤进行：

（1）使用前的预处理和检查：

①：选购好合适浓度的过氧化氢溶液和配制好待测的过氧化氢酶溶液；

②：清洗与安装好反应筒及其内外各部件，盖上盖体并至密封，将上下重合的存液皿与胶片一起架搁在圆环形搁台上，将测氧气孔与测氧仪连接好；

③检查各阀门的开与闭，关闭放液孔上的阀门，开启气液进口、测氧气孔和通液气孔上的阀门；

④将按转轴向上提并作小角度的反时针转动，使搅拌筛和小孔分流托片上行，后者紧贴胶片，在大分流孔与小分流孔不贯通时，凸栓搁在卡口座上定位；

（2）加料和关闭阀门：从通液气孔向反应筒内加入经称量的过氧化氢溶液，从气液进口向存液皿加入经称量的过氧化氢酶溶液，再关闭上述两孔或口上的阀门；

（3）测量、读取并记录反应筒内原始的氧气含量；

（4）放料、使两溶液混合、反应和测量：顺时针拧动按转轴，使凸栓脱离卡口座，进一步按下按转轴，使小孔分流托片与胶片脱离，存液皿内的过氧化氢酶液快速从大分流孔直接下流，与过氧化氢溶液混合并快速反应，上下多次按动按转轴，使混合液在该筛的上下搅动中更快速、充分反应；按每隔30秒测一次含氧量，并读取和记录相关数据；

（5）根据实测的单位时间的增氧量、按公式计算和比较过氧化氢酶的活性；

（6）放水、换气，准备再测：一次测定结束，从放液孔放掉反应生成的废液，打开通液气孔和气液进口的阀门，将反应筒内反应生成的气体换成大气，再重复上述步骤，进行下一次测定。