CN104515851A - 一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置 - Google Patents

一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶活性测定领域，公开一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置。先向反应体系内连续通气至少2min，测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳，然后将0.5mL待测厌氧微生物的菌液注射入反应体系内，再连续通气至少2min，接着于37℃条件下保持6min，反应过程结束时冰浴终止反应，取0.2mL反应液测定吸光度值，经换算即得酶活。装置包括气体供给装置、酶活反应装置和酶标仪。本发明步骤简单，操作简便，无需对样品进行处理，检测时间短，取样量小，酶活稳定有效，设备要求较低，避免酶活必须在厌氧操作箱内操作，减少氮气耗用量，灵活性好，适用于对厌氧微生物样品中的氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性测定。

Description

一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置
技术领域
本发明属于氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性测定技术领域，具体涉及一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置。
背景技术
厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的微生物，且不能直接暴露在含氧量大于或等于18%的空气里，对氧气敏感，一般可分为绝对厌氧菌和兼性厌氧菌两类。厌氧菌属于较为古老的原核菌进化而来，目前不断发现较多的厌氧菌特别是绝对厌氧菌具有很大的发酵应用和工业生产价值，如Clostridium carboxidivorans P7、Clostridium strain P11、Clostridium ljungdahlii和Clostridium autoethanogenum DSM10061等。此类厌氧菌能够利用乙酰CoA/Wood-Ljungdahl代谢途径行使生命活动进行生长繁殖，另外研究证明该类菌的代谢物还可作为人类所需要的生物燃料或原料，如乙醇、丁醇和脂类等。
氢化酶(hydrogenase，简称H2ase)是一类存在于微生物尤其是厌氧菌体内的重要生物酶，是一种催化伴有氢分子释放或分子氢转化质子的氧化还原反应酶，它通过控制微生物体内氢的代谢来调节细菌的其他生理活动。
一氧化碳脱氢酶(CO dehydrogenase,简称CODH)是一类存在于能够利用CO或CO2的绝对厌氧菌内，是该类菌利用CO或CO2作为碳源进行生命活动的关键性酶，它可催化CO氧化为CO2，也可还原CO2为CO，在CO氧化过程中不仅为厌氧菌提供了碳源还提供了代谢所必需的还原力。
氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性测定均对环境氧含量要求严格，如Peters在研究H2ase结构和性质时发现极微量的氧气都会对该酶活性产生抑制作用。Diekert和Thauer首先在厌氧乙酸菌中发现CO脱氢酶，但由于CODH对氧极端敏感，几年之后才得以纯化此酶。同样，因为两种酶对环境的要求较高而使得目前该两种酶的活性测定方法较少，主要包括：超声波法、酶法和全细胞法，而不同测定方法优缺点不同，已有的测定方法报道如下：
超声波法：该方法测定酶活的主要原理是利用超声波对厌氧菌菌体细胞的作用使得细胞膜破裂进而释放细胞内的氢化酶和一氧化碳脱氢酶，再将破碎液高速离心得到上清液（含粗酶溶液），最后进行酶活体系反应获取酶活大小。该法应用较为广泛，但存在许多缺点：首先是超声波法对酶活性损失大，其次是超声过程易于产热且时间较长，一般全过程需要15～20min，均不利于酶的稳定性，最后是该法的超声对象体系内的还原环境难以控制。
酶法：该方法原理为使用溶菌酶分解厌氧菌细胞壁使之形成原生质体，然后经高速离心作用获取粗酶液，进而同反应体系反应获得酶活。该方法中溶菌酶缓冲液处理样品时需于37℃下操作12～24h。虽然处理条件较为柔和，但酶活反应时间长，中间还需多次补加溶菌酶缓冲液弥补因蒸发作用对实验的影响。同样，该方法不适于多样品甚至大批量样品酶活测定。
全细胞法：该方法的主要原理是利用厌氧菌细胞直接参与酶活体系内进行酶活反应，然后将反应液利用比色皿比色法获得酶活大小。该方法酶活测定过程中需要在厌氧环境内进行，目前主要选择在厌氧箱内操作或者利用4.5mL带盖比色皿内进行，厌氧箱内酶活反应不仅需要大量氮气，同时因为箱体空间的局限性而致使反应的样品量受到限制并且操作灵活性低；利用比色皿进行酶活反应及测定较厌氧箱简化了操作环节甚至增加了操作灵活性，但仍然存在一些缺陷，如密封性差和所需样品量较大，且一般需要样品进行前处理。同样，无论为哪种途径，最终酶活测定均在分光光度计内测定，因分光光度计内最多设置4个插孔并人工手动操作，则不利于数量稍多的样品酶活测定作业。因而有必要来根据厌氧菌实际情况，通过实验研究建立一种有针对性的、快速、灵活、简便、可靠、酶活损失小和样品使用量少的测定方法。这将对测定和评价厌氧微生物内H2ase和CODH酶活性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵活、简便、可靠、酶活损失小和样品使用量少的直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置。
为实现以上目的，本发明采取以下的技术方案：
一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法：先向反应体系内连续通气至少2min，测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳，然后将0.5mL待测厌氧微生物的菌液注射入反应体系内，再连续通气至少2min，接着于37℃条件下保持6min，反应过程结束时冰浴终止反应，取0.2mL反应液测定吸光度值，经换算即得酶活。
进一步，测定氢化酶活性时，对应的反应体系组成为：0.4mL 1M、 pH=7.5的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液，0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，2mL脱气去离子水；测定一氧化碳脱氢酶活性时，对应的反应体系组成为：0.8mL 0.5M、pH=6.8的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液，0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，1.2mL脱气去离子水；以上反应体系中，Tris-HCl缓冲液、甲基紫精溶液、二硫苏糖醇溶液、Triton-X100溶液配制时采用的水均为脱气去离子水。
较好地，涉及的两处通气，其流速范围均控制在1-10mL/min。
较好地，采用酶标仪测定反应液的吸光度值，测定波长为578nm，同时以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照液。
较好地，所述待测厌氧微生物的菌液为待测厌氧微生物的种子液或发酵液。种子液或发酵液按本领域常规培养基培养方法获得。
一种实现所述方法的装置：该装置包括气体供给装置、酶活反应装置和酶标仪；所述气体供给装置的结构构造为：包括气体储罐、带铁夹的铁架台、多通管，多通管固定在铁夹上，气体储罐的罐顶设有气罐阀，气体储罐的气体出管上依次设有安全阀和流量调节阀，安全阀上连接有低压表和高压表，流量调节阀上连接有气体流量计，气体出管的末端通过第一输气管路连接至多通管其中的一个管口，多通管的剩余管口则分别各连接一个第二输气管路，第二输气管路又与连接导管连接；所述酶活反应装置的结构构造为：包括固定座板，固定座板上设有至少一个反应管，反应管顶部设有密封垫，密封垫上针头朝下插入有进气针头和出气针头，并且进气针头插入密封垫直至反应管底部，出气针头插入密封垫直至漏出部分的长度为0.5-2cm；气体供给装置和酶活反应装置之间通过连接导管连接至进气针头的尾部实现连接，酶标仪则相对气体供给装置和酶活反应装置独立设置。
较好地，所述酶标仪为进口全波长酶标仪，如Multisuan Go 1510，酶标仪采用96孔板，每孔上样量均为0.2mL，扫描震动10s。
较好地，所述反应管为5m LEP管；所述密封垫为一次性医用10mL注射器橡胶活塞且凸面朝下放置；所述进气针头和出气针头的规格型号分别优选为0.5×100SB（麻醉用）与0.45×16RWLB（通用型）。
较好地，在测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时，为方便在两者之间以及与对照试验之间来回切换，所述多通管优选为四通管，所述反应管的数量优选为三个，一个反应管用于测定氢化酶活性，一个反应管用于测定一氧化碳脱氢酶活性，一个反应管用于测定对照液活性。
较好地，所述第一输气管路和第二输气管路优选为橡胶管；所述连接导管优选由1mL无菌医用注射器切除尾部制成。
本发明的有益效果是：步骤简单，操作简便，无需对样品进行处理，检测时间短，取样量小，酶活稳定有效，设备要求较低，避免酶活必须在厌氧操作箱内操作，减少氮气耗用量，灵活性好，适用于对厌氧微生物样品中的氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性测定。
附图说明
图1：本发明直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置示意图；
附图标记说明：1-气体储罐，2-气罐阀，3-高压表，4-低压表，5-安全阀，6-流量调节阀，7-气体流量计，8-第一输气管路，9-铁夹，10-铁架台，11-四通管，12-第二输气管路，13-连接导管，14-进气针头，15-反应管，16-出气针头，17-固定座板，18-密封垫。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本范明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动，这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置，如图1所示，该装置包括气体供给装置、酶活反应装置和酶标仪；所述气体供给装置的结构构造为：包括气体储罐1、带铁夹9的铁架台10、四通管11，四通管11固定在铁夹9上，气体储罐1的罐顶设有气罐阀2，气体储罐1的气体出管上依次设有安全阀5和流量调节阀6，安全阀5上连接有低压表4和高压表3，流量调节阀6上连接有气体流量计7，气体出管的末端通过第一输气管路8连接至四通管11其中的一个管口，四通管11的剩余管口则分别各连接一个第二输气管路12，第二输气管路12又与连接导管13连接；所述酶活反应装置的结构构造为：包括固定座板17，固定座板17上设有三个反应管15（一个反应管15用于测定氢化酶活性，一个反应管15用于测定一氧化碳脱氢酶活性，一个反应管15用于测定对照液活性），反应管15顶部设有密封垫18，密封垫18上针头朝下插入有进气针头14和出气针头16，并且进气针头14插入密封垫18直至反应管15底部，出气针头16插入密封垫18直至漏出部分的长度为0.5-2cm；气体供给装置和酶活反应装置之间通过连接导管13连接至进气针头14的尾部实现连接，酶标仪则相对气体供给装置和酶活反应装置独立设置。其中，所述酶标仪为进口全波长酶标仪Multisuan Go 1510；所述反应管15为5m LEP管；所述密封垫18为一次性医用10mL注射器橡胶活塞且凸面朝下放置；所述进气针头14和出气针头16的规格型号分别为0.5×100SB（麻醉用）与0.45×16RWLB（通用型）；所述第一输气管路8和第二输气管路12为橡胶管；所述连接导管13由1mL无菌医用注射器切除尾部制成。
利用上述装置直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法：
（1）实例对象为绝对厌氧菌Clostridium autoethanogenum (菌种编号DSM 10061) (购自德国微生物菌种保藏中心，DSMZ)，将该厌氧菌接种于种子培养基中，37℃厌氧箱内静止培养。
（2）首先按照反应体系具体要求的试剂于厌氧箱内添加至反应管15内并盖入密封垫18；然后将反应管15取出到外部操作环境内，分别依次打开气罐阀2﹑安全阀5和流量调节阀6，调节通气（测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳）流速为1mL/min，待气体流量计7读数稳定后进行通气1min后再将进气针头14插入密封垫18直至反应管15底部，接着向密封垫18上插入出气针头16，插出长度（即漏出密封垫18部分的长度）约0.5cm，连续通气。使用一次性注射器（1mL无菌医用注射器）抽取步骤（1）厌氧菌对数期种子液（菌体干重y与OD x关系的回归方程：y=0.715x＋0.004，R2=0.992），取样量为0.5mL，待通气2min后立即插入密封垫18并注射进反应管15内的反应体系内，再通气2min，最后于37℃条件下保持6min，全部反应过程结束时立即进行冰浴终止反应，使用镊子将密封垫18取出并由微量移液枪取0.2mL反应液加入96孔板，扫描震动10s，在波长578nm下利用酶标仪测定吸光度值，获取数值并按下式计算并得出酶活（理论计算值）。上述测定试验过程中，以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照并且每个样品平行测定三次，为减小实验误差，厌氧菌酶活实际值=厌氧菌酶活理论计算值–对照酶活理论计算值；其中，测定氢化酶活性时，对应的反应体系组成为：0.4mL 1M、 pH=7.5的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液，0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，2mL脱气去离子水；测定一氧化碳脱氢酶活性时，对应的反应体系组成为：0.8mL 0.5M、pH=6.8的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液（现配现用），0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，1.2mL脱气去离子水；以上反应体系中，Tris-HCl缓冲液、甲基紫精溶液、二硫苏糖醇溶液、Triton-X100溶液配制时采用的水均为脱气去离子水。
氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性计算公式：
酶的比活力（U/mg菌体干重）= 
式中：
△OD—吸光度值每分钟降低的变化值，min-1；
V—测定中所加入反应体系和种子液/发酵液的总体积，mL；
ε—摩尔消光系数，9780 L/（mol·cm）；
0.56—96孔板的光程，cm；
C—测定中所加入菌体干重的量，g；
106—摩尔转化为微摩尔的系数；
酶活单位：单位干菌体每分钟还原1μmol 甲基紫精（1e-1还原）。
（3）测定结果：H2ase：35.623、37.360、37.201U/g DCW，酶活平均值36.728U/g DCW，标准差为0.960；CODH：34.232、32.759、32.896U/g DCW，酶活平均值为33.296U/g DCW，标准差为0.814。
实施例2
直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置同实施例1。
利用上述装置直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法：
（1）实例对象为绝对厌氧菌Clostridium autoethanogenum (菌种编号DSM 10061) (购自德国微生物菌种保藏中心，DSMZ)，将该厌氧菌接种于发酵培养基中，37℃，150 r/min摇床发酵培养。
（2）首先按照反应体系具体要求的试剂于厌氧箱内添加至反应管15内并盖入密封垫18；然后将反应管15取出到外部操作环境内，分别依次打开气罐阀2﹑安全阀5和流量调节阀6，调节通气（测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳）流速为3mL/min，待气体流量计7读数稳定后进行通气1min后再将进气针头14插入密封垫18直至反应管15底部，接着向密封垫18上插入出气针头16，插出长度（即漏出密封垫18部分的长度）约1cm，连续通气。使用一次性注射器（1mL无菌医用注射器）抽取步骤（1）厌氧菌对数期发酵液（菌体干重y与OD x关系的回归方程：y=0.810x +0.013，R 2 =0.990），取样量为0.5mL，待通气2min后立即插入密封垫18并注射进反应管15内的反应体系内，再通气2min，最后于37℃条件下保持6min，全部反应过程结束时立即进行冰浴终止反应，使用镊子将密封垫18取出并由微量移液枪取0.2mL反应液加入96孔板，扫描震动10s，在波长578nm下利用酶标仪测定吸光度值，获取数值并按实施例1的计算公式计算并得出酶活（理论计算值）。上述测定试验过程中，以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照，并且每个样品平行测定三次，为减小实验误差，厌氧菌酶活实际值=厌氧菌酶活理论计算值–对照酶活理论计算值；其中，测定氢化酶活性时，对应的反应体系组成为：0.4mL 1M、 pH=7.5的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液，0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，2mL脱气去离子水；测定一氧化碳脱氢酶活性时，对应的反应体系组成为：0.8mL 0.5M、pH=6.8的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液（现配现用），0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，1.2mL脱气去离子水；以上反应体系中，Tris-HCl缓冲液、甲基紫精溶液、二硫苏糖醇溶液、Triton-X100溶液配制时采用的水均为脱气去离子水。
（3）测定结果：H2ase：38.900、36.861、35.7437U/g DCW，酶活平均值为37.168U/g DCW，标准差为1.307；CODH：21.896、20.021、20.005U/g DCW，酶活平均值为20.641U/g DCW，标准差为0.888。
实施例3
直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置同实施例1。
利用上述装置直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法：
（1）实例对象为绝对厌氧菌Clostridium ljungdahlii(菌种编号DSM 13528) (购自德国微生物菌种保藏中心，DSMZ)，将该厌氧菌接种于种子培养基中，37℃厌氧箱内静止培养。
（2）首先按照反应体系具体要求的试剂于厌氧箱内添加至反应管15内并盖入密封垫18；然后将反应管15取出到外部操作环境内，分别依次打开气罐阀2﹑安全阀5和流量调节阀6，调节通气（测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳）流速为5mL/min，待气体流量计7读数稳定后进行通气1min后再将进气针头14插入密封垫18直至反应管15底部，接着向密封垫18上插入出气针头16，插出长度（即漏出密封垫18部分的长度）约1cm，连续通气。使用一次性注射器（1mL无菌医用注射器）抽取步骤（1）厌氧菌对数期种子液（菌体干重y与OD x关系的回归方程：y=0.810x +0.013，R 2 =0.990），取样量为0.5mL，待通气2min后立即插入密封垫18并注射进反应管15内的反应体系内，再通气2min，最后于37℃条件下保持6min，全部反应过程结束时立即进行冰浴终止反应，使用镊子将密封垫18取出并由微量移液枪取0.2mL反应液加入96孔板，扫描震动10s，在波长578nm下利用酶标仪测定吸光度值，获取数值并按实施例1的计算公式计算并得出酶活（理论计算值）。上述测定试验过程中，以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照，并且每个样品平行测定三次，为减小实验误差，厌氧菌酶活实际值=厌氧菌酶活理论计算值–对照酶活理论计算值；其中，测定氢化酶活性时，对应的反应体系组成为：0.4mL 1M、 pH=7.5的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液，0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，2mL脱气去离子水；测定一氧化碳脱氢酶活性时，对应的反应体系组成为：0.8mL 0.5M、pH=6.8的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液（现配现用），0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，1.2mL脱气去离子水；以上反应体系中，Tris-HCl缓冲液、甲基紫精溶液、二硫苏糖醇溶液、Triton-X100溶液配制时采用的水均为脱气去离子水。
（3）测定结果：H2ase：10.534、10.868、11.537U/g DCW，酶活平均值为10.980U/g DCW，标准差为0.511；CODH，10.749、11.323、10.865U/g DCW，酶活平均值为10.979U/g DCW，标准差为0.303。
实施例4
直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置同实施例1。
利用上述装置直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法：
（1）实例对象为绝对厌氧菌Clostridium carboxidivoransP7 (菌种编号DSM 15243) (购自德国微生物菌种保藏中心，DSMZ)，将该厌氧菌接种于种子培养基中，37℃，厌氧箱内静止培养。
（2）首先按照反应体系具体要求的试剂于厌氧箱内添加至反应管15内并盖入密封垫18；然后将反应管15取出到外部操作环境内，分别依次打开气罐阀2﹑安全阀5和流量调节阀6，调节通气（测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳）流速为5mL/min，待气体流量计7读数稳定后进行通气1min后再将进气针头14插入密封垫18直至反应管15底部，接着向密封垫18上插入出气针头16，插出长度（即漏出密封垫18部分的长度）约1.5cm，连续通气。使用一次性注射器（1mL无菌医用注射器）抽取步骤（1）厌氧菌对数期种子液（菌体干重y与OD x关系的回归方程：y=0.783x－0.002，R 2 =0.998），取样量为0.5mL，待通气2min后立即插入密封垫18并注射进反应管15内的反应体系内，再通气2min，最后于37℃条件下保持6min，全部反应过程结束时立即进行冰浴终止反应，使用镊子将密封垫18取出并由微量移液枪取0.2mL反应液加入96孔板，扫描震动10s，在波长578nm下利用酶标仪测定吸光度值，获取数值并按实施例1的计算公式计算并得出酶活（理论计算值）。上述测定试验过程中，以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照，并且每个样品平行测定三次，为减小实验误差，厌氧菌酶活实际值=厌氧菌酶活理论计算值–对照酶活理论计算值；其中，测定氢化酶活性时，对应的反应体系组成为：0.4mL 1M、 pH=7.5的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液，0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，2mL脱气去离子水；测定一氧化碳脱氢酶活性时，对应的反应体系组成为：0.8mL 0.5M、pH=6.8的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液（现配现用），0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，1.2mL脱气去离子水；以上反应体系中，Tris-HCl缓冲液、甲基紫精溶液、二硫苏糖醇溶液、Triton-X100溶液配制时采用的水均为脱气去离子水。
（3）测定结果：H2ase：15.837、17.260、15.996 U/g DCW，酶活平均值为16.364U/g DCW，标准差为0.779；CODH，14.490、14.794、14.432 U/g DCW，酶活平均值为14.572U/g DCW，标准差为0.193。
实施例5
直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的装置同实施例1。
利用上述装置直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法：
（1）实例对象为绝对厌氧菌Clostridium strain P11 (菌种编号DSM 15248) (购自德国微生物菌种保藏中心，DSMZ)，将该厌氧菌接种于种子培养基中，37℃厌氧箱内静止培养。
（2）首先按照反应体系具体要求的试剂于厌氧箱内添加至反应管15内并盖入密封垫18；然后将反应管15取出到外部操作环境内，分别依次打开气罐阀2﹑安全阀5和流量调节阀6，调节通气（测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳）流速为10mL/min，待气体流量计7读数稳定后进行通气1min后再将进气针头14插入密封垫18直至反应管15底部，接着向密封垫18上插入出气针头16，插出长度（即漏出密封垫18部分的长度）约2cm，连续通气。使用一次性注射器（1mL无菌医用注射器）抽取步骤（1）厌氧菌对数期种子液（菌体干重y与OD x关系的回归方程：y=0.660x+0.001，R 2 =0.999），取样量为0.5mL，待通气2min后立即插入密封垫18并注射进反应管15内的反应体系内，再通气2min，最后于37℃条件下保持6min，全部反应过程结束时立即进行冰浴终止反应，使用镊子将密封垫18取出并由微量移液枪取0.2mL反应液加入96孔板，扫描震动10s，在波长578nm下利用酶标仪测定吸光度值，获取数值并按实施例1的计算公式计算并得出酶活（理论计算值）。上述测定试验过程中，以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照，并且每个样品平行测定三次，为减小实验误差，厌氧菌酶活实际值=厌氧菌酶活理论计算值–对照酶活理论计算值；其中，测定氢化酶活性时，对应的反应体系组成为：0.4mL 1M、 pH=7.5的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液，0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，2mL脱气去离子水；测定一氧化碳脱氢酶活性时，对应的反应体系组成为：0.8mL 0.5M、pH=6.8的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液（现配现用），0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，1.2mL脱气去离子水；以上反应体系中，Tris-HCl缓冲液、甲基紫精溶液、二硫苏糖醇溶液、Triton-X100溶液配制时采用的水均为脱气去离子水。
（3）测定结果： H2ase：35.249、33.418、33.597U/g DCW，酶活平均值为34.088U/g DCW，标准差为1.010；CODH，31.783、32.568、32.210U/g DCW，酶活平均值为32.187U/g DCW，标准差为0.393。
以上实施例1-5中：
A、1L种子培养基成分如下：NaCl 0.80 g，NH4Cl 1.00 g，KCl 0.10 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，CaCl2 0.04 g，KH2PO4 0.20 g，NaHCO3 1.00 g，酵母膏1.00 g，MES 5.00 g，L-盐酸半胱氨酸0.40 g，木糖5.00 g，矿质元素溶液10mL，维生素溶液10mL，pH =5.75。
B、1L发酵培养基成分如下：NH4Cl 1.00 g，NaCl 1.00 g，MgSO4 0.15 g，KH2PO4 0.10 g，CaCl2 0.04 g，胰蛋白胨2.00 g，酵母膏0.30 g，L-盐酸半胱氨酸0.20 g，MES 10.00 g，矿质元素溶液10mL，维生素溶液10mL，pH =7.0。另外向每300mL发酵瓶（内装60ml发酵培养基）中补加240mL合成气，其组分为CO 85.5v%，H2 10v%，CO2 4.5v%。
C、种子培养基和发酵培养基中矿质元素溶液与维生素溶液成分分别为：
矿质元素溶液（mg/L）：氨三乙酸2.0×103，MgSO4 1.0×103，硫酸亚铁铵 0.8×103，氯化钴 0.2×103，硫酸锌 0.2×103，氯化铜 20，氯化镍 20，钼酸钠 20，硒酸钠 20，钨酸钠20。
维生素溶液（mg/L）：VB6 10，硫胺素 5.0，VB2 5，泛酸钙 5，硫辛酸5，对氨基苯甲酸 5，烟碱酸5，VB12 5，生物素2，叶酸2；配好后用0.22μm过滤器过滤除菌使用。

Claims (10)

1.一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法，其特征在于：先向反应体系内连续通气至少2min，测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳，然后将0.5mL待测厌氧微生物的菌液注射入反应体系内，再连续通气至少2min，接着于37℃条件下保持6min，反应过程结束时冰浴终止反应，取0.2mL反应液测定吸光度值，经换算即得酶活。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：测定氢化酶活性时，对应的反应体系组成为：0.4mL 1M、 pH=7.5的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液，0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，2mL脱气去离子水；测定一氧化碳脱氢酶活性时，对应的反应体系组成为：0.8mL 0.5M、pH=6.8的Tris-HCl缓冲液，0.2mL 0.04M的甲基紫精溶液，0.2mL 0.04M的二硫苏糖醇溶液，0.1mL 5v%的Triton-X100溶液，1.2mL脱气去离子水；以上反应体系中，Tris-HCl缓冲液、甲基紫精溶液、二硫苏糖醇溶液、Triton-X100溶液配制时采用的水均为脱气去离子水。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：涉及的两处通气，其流速范围均控制在1-10mL/min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：采用酶标仪测定反应液的吸光度值，测定波长为578nm，同时以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照液。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述待测厌氧微生物的菌液为待测厌氧微生物的种子液或发酵液。
6.一种实现如权利要求1-3任一所述方法的装置，其特征在于：该装置包括气体供给装置、酶活反应装置和酶标仪；所述气体供给装置的结构构造为：包括气体储罐、带铁夹的铁架台、多通管，多通管固定在铁夹上，气体储罐的罐顶设有气罐阀，气体储罐的气体出管上依次设有安全阀和流量调节阀，安全阀上连接有低压表和高压表，流量调节阀上连接有气体流量计，气体出管的末端通过第一输气管路连接至多通管其中的一个管口，多通管的剩余管口则分别各连接一个第二输气管路，第二输气管路又与连接导管连接；所述酶活反应装置的结构构造为：包括固定座板，固定座板上设有至少一个反应管，反应管顶部设有密封垫，密封垫上针头朝下插入有进气针头和出气针头，并且进气针头插入密封垫直至反应管底部，出气针头插入密封垫直至漏出部分的长度为0.5-2cm；气体供给装置和酶活反应装置之间通过连接导管连接至进气针头的尾部实现连接，酶标仪则相对气体供给装置和酶活反应装置独立设置。
7.如权利要求6所述的装置，其特征在于：所述酶标仪型号为Multisuan Go 1510，酶标仪采用96孔板，每孔上样量均为0.2mL，扫描震动10s。
8.如权利要求6所述的装置，其特征在于：所述反应管为5m LEP管；所述密封垫为一次性医用10mL注射器橡胶活塞且凸面朝下放置；所述进气针头和出气针头的规格型号分别为麻醉用0.5×100SB与0.45×16RWLB。
9.如权利要求6所述的装置，其特征在于：所述多通管为四通管，所述反应管的数量为三个。
10.如权利要求6所述的装置，其特征在于：所述第一输气管路和第二输气管路均为橡胶管；所述连接导管由1mL无菌医用注射器切除尾部制成。
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