CN108387701B

CN108387701B - 一种测定氧气产生速率的方法

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Publication number: CN108387701B
Application number: CN201810337922.XA
Authority: CN
Inventors: 童中华; 徐梦; 陈罕雯
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2038-04-16
Also published as: CN108387701A

Abstract

本发明属于生物领域，尤其涉及一种测定氧气产生速率的方法。该方法包括以下步骤：a)提供容器和溶解氧仪；b)在所述容器中充满底物溶液，对所述容器曝非氧气体，同时启动所述溶解氧仪，待所述溶解氧仪检测到的溶解氧浓度降至稳定后，停止曝气，密封曝气口；c)将密封好的容器至于反应环境中，向所述容器中注入新鲜提取的微生物蛋白粗提物，密闭反应，记录反应时间与对应的溶解氧浓度，计算得到微生物体内酶的氧气产生速率。或，将上述步骤中的底物溶液替换为含光合作用生物或其组织的营养液，且不再注入微生物蛋白粗提物，计算得到光合作用生物或其组织的氧气产生速率。本发明提供的方法可准确测定生物体系在检测全过程中的氧气产生速率。

Description

一种测定氧气产生速率的方法

技术领域

本发明属于生物领域，尤其涉及一种测定氧气产生速率的方法。

背景技术

在微生物和光合作用生物科学研究中，经常需要测定新陈代谢过程中的产氧量及其进程。在微生物中，以异化(高)氯酸盐还原菌为例，需要测定微生物体内酶的产氧速率，以此得到微生物中亚氯酸盐歧化酶的活性；在光合作用生物中，经常需要测定植物小型组织、细胞团、细胞悬浮系统、细胞器(如叶绿体)，或者完整有机体，如微藻的氧气产生速率，以此来评价：光合作用生物的供氧能力。因此，寻找到一种合适的测定生物系统中氧气产生速率的方法，成为众多研究者的目标。

目前测定微生物体内酶的产氧速率，主要采用美国YSI生物耗氧分析仪，通过测定不同时间溶液中的溶解氧量，计算得到产氧速率；测定植物小型组织、细胞团、细胞悬浮系统、细胞器(如叶绿体)，或微藻的氧气产生速率，主要是通过溶氧仪或者碘量法，通过测定不同时间溶液中的溶解氧量，计算得到产氧速率。但使用美国YSI生物耗氧分析仪测定微生物体内酶的产氧速率时，反应开始后的前5～10s的数据无法收集；而使用溶氧仪或者碘量法直接测定溶液中的溶解氧量时，整个测定过程溶液样品与空气接触，所测结果不是完全意义上的水样中的溶解氧量，从而影响氧气产生速率的准确性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种测定氧气产生速率的方法，本发明提供的方法可准确测定生物体系在检测全过程中的氧气产生速率。

本发明提供了一种测定微生物体内酶氧气产生速率的方法，包括以下步骤：

a1)提供容器和溶解氧仪；所述容器上设置有曝气口和检测口；所述溶解氧仪的溶氧探头通过所述检测口伸入到容器中；

b1)在所述容器中充满底物溶液，通过曝气口对所述容器曝非氧气体，同时启动所述溶解氧仪，待所述溶解氧仪检测到的溶解氧浓度降至稳定后，停止曝气，密封曝气口；

c1)将密封好的容器至于反应环境中，向所述容器中注入新鲜提取的微生物蛋白粗提物，密闭反应，记录反应时间与对应的溶解氧浓度，计算得到微生物体内酶的氧气产生速率。

本发明提供了一种测定光合作用生物或其组织氧气产生速率的方法，包括以下步骤：

a2)提供容器和溶解氧仪；所述容器上设置有曝气口和检测口；所述溶解氧仪的溶氧探头通过所述检测口伸入到容器中；

b2)避光条件下，在所述容器中充满含光合作用生物或其组织的营养液，通过曝气口对所述容器曝非氧气体，同时启动所述溶解氧仪，待所述溶解氧仪检测到的溶解氧浓度降至稳定后，停止曝气，密封曝气口；

c2)将密封好的容器至于光照环境中培养，记录培养时间与对应的溶解氧浓度，计算得到光合作用生物或其组织的氧气产生速率。

优选的，所述溶解氧仪为哈希HQ30d便携式溶解氧仪；

所述溶氧探头为LDO溶氧探头。

优选的，所述曝气口通过橡胶塞密封。

优选的，所述氧气产生速率按照式(I)进行计算：

式(I)中，v为氧气产生速率，单位为mmol/min；ΔDO为溶解氧浓度增量，单位为mg/L；V为容器的体积，单位为L；t为ΔDO对应的实验时间，单位为min。

优选的，所述微生物蛋白粗提物为氯酸盐还原菌蛋白粗提物和/或高氯酸盐还原菌蛋白粗提物；

所述底物溶液中的底物包括亚氯酸盐。

优选的，所述底物溶液的pH值为7～7.5。

优选的，所述底物溶液的pH值通过磷酸调节。

优选的，所述反应的温度为20～35℃。

与现有技术相比，本发明提供了一种测定氧气产生速率的方法。本发明提供的方法包括以下步骤：a1)提供容器和溶解氧仪；所述容器上设置有曝气口和检测口；所述溶解氧仪的溶氧探头通过所述检测口伸入到容器中；b1)在所述容器中充满底物溶液，通过曝气口对所述容器曝非氧气体，同时启动所述溶解氧仪，待所述溶解氧仪检测到的溶解氧浓度降至稳定后，停止曝气，密封曝气口；c1)将密封好的容器至于反应环境中，向所述容器中注入新鲜提取的微生物蛋白粗提物，密闭反应，记录反应时间与对应的溶解氧浓度，计算得到微生物体内酶的氧气产生速率。或，a2)提供容器和溶解氧仪；所述容器上设置有曝气口和检测口；所述溶解氧仪的溶氧探头通过所述检测口伸入到容器中；b2)避光条件下，在所述容器中充满含光合作用生物或其组织的营养液，通过曝气口对所述容器曝非氧气体，同时启动所述溶解氧仪，待所述溶解氧仪检测到的溶解氧浓度降至稳定后，停止曝气，密封曝气口；c2)将密封好的容器至于光照环境中培养，记录培养时间与对应的溶解氧浓度，计算得到光合作用生物或其组织的氧气产生速率。在本发明中，由于容器被溶液充满，容器内几乎无顶空，溶液释放的氧气完全溶解于溶液中，且溶液中溶解氧浓度被溶氧仪记录，因此通过记录溶氧仪读数随时间变化曲线，可以计算得到生物体系的氧气产生速率。本发明提供的方法可自反应开始时刻起实时测定溶液中溶解氧数值，不存在收集数据的延迟，因此可测定生物体系在检测全过程中的氧气产生速率；而且检测过程中待测物不与空气接触，所测结果真实反映生物体系的氧气产生速率。采用本发明提供的方法进行两次平行实验，实验结果表明实验重复性良好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的哈希HQ30d便携式溶解氧仪的数码照片；

图2是本发明实施例提供的玻璃小瓶的数码照片；

图3是本发明实施例提供的溶解氧仪和玻璃小瓶的连接示意图；

图4本发明实施例提供的溶解氧浓度随时间变化图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明提供的微生物体内酶氧气产生速率的测定方法中，首先将容器和溶解氧仪组装到一起。其中，所述容器上设置有曝气口和检测口；所述溶解氧仪包括主机和与主机相连的溶氧探头，所述溶解氧仪的溶氧探头通过所述检测口伸入到容器中。在本发明提供的一个实施例中，所述容器为设置有两个口的透明玻璃瓶。在本发明提供的一个实施例中，所述溶解氧仪为哈希HQ30d便携式溶解氧仪；所述溶氧探头为LDO溶氧探头。在本发明中，为保证容器的密封性，所述溶解氧仪与检测口之间的空隙可使用封口膜缠绕密封。

然后，在所述容器中充满底物溶液。在本发明提供的一个实施例中，所述底物溶液中的底物包括亚氯酸盐，所述亚氯酸盐具体可为亚氯酸钠；所述亚氯酸盐在培养液中的浓度优选为0.2～0.3mmol/L，具体可为0.2475mmol/L。在本发明提供的一个实施例中，所述底物溶液的pH值优选为7～7.5，具体可为7.2；所述底物溶液的pH值可通过磷酸调节。

之后，通过曝气口对所述容器曝非氧气体，同时启动所述溶解氧仪。在本发明提供的一个实施例中，所述非氧气体包括但不限于氮气、二氧化碳和稀有气体中的一种或多种。曝气过程中，溶解氧仪检测到的溶解氧浓度不断下降，待溶解氧浓度降至趋近于零且稳定不变化后，停止曝气，密封曝气口。在本发明中，所述曝气口优选通过橡胶塞密封，更优选在塞住橡胶塞后再盖上铝盖并使用压盖钳压紧铝盖。

接着，将密封好的容器至于反应环境中，并向所述容器中注入新鲜提取的微生物蛋白粗提物，密闭反应。其中，所述微生物蛋白粗提物优选为氯酸盐还原菌蛋白粗提物和/或高氯酸盐还原菌蛋白粗提物；所述氯酸盐还原菌包括但不限于人苍白杆菌；所述反应的温度优选为20～35℃，具体可为30℃。反应过程中，记录反应时间与对应的溶解氧浓度。在本发明中，由于容器被溶液充满，容器内几乎无顶空，溶液释放的氧气完全溶解于溶液中，且溶液中溶解氧浓度被溶氧仪记录，因此通过记录溶氧仪读数随时间变化曲线，可以计算得到微生物体内酶的氧气产生速率。在本发明中，微生物体内酶的氧气产生速率可按照式(I)进行计算：

在本发明中，式(I)可进一步换算为式(I’)：

式(I’)中，v为氧气产生速率，单位为mmol/min；k为溶解氧随时间变化曲线的斜率，单位为mg/(L·min)；V为容器的体积，单位为L。

在本发明提供的一个实施例中，还可以根据测定的氧气产生速率进一步计算微生物体内酶的活性(1单位酶活定义为每min每mg蛋白所释放的mmol氧气量)，计算公式如下：

式(II)中，e为单位酶活性，单位为mmol/(min·mg)；c为蛋白粗提物的终浓度，单位为mg/L；V为容器的体积，单位为L。

在本发明提供的光合作用生物或其组织氧气产生速率的测定方法中，首先将容器和溶解氧仪组装到一起。所述容器和所述溶解氧仪以及二者的组装方式与上文测定微生物体内酶氧气产生速率方法中介绍的一致，在此不再赘述。

然后，在避光条件下，在所述容器中充满含光合作用生物或其组织的营养液。在本发明提供的一个实施例中，所述光合作用生物或其组织包括但不限于植物小型组织、细胞团、细胞悬浮系统、细胞器或完整有机体；所述细胞器包括但不限于叶绿体，所述完整有机体包括但不限于微藻。

之后，在避光条件下，通过曝气口对所述容器曝非氧气体，同时启动所述溶解氧仪。在本发明提供的一个实施例中，所述非氧气体包括但不限于氮气、二氧化碳和稀有气体中的一种或多种。曝气过程中，溶解氧仪检测到的溶解氧浓度不断下降，待溶解氧浓度降至趋近于零且稳定不变化后，停止曝气，密封曝气口。在本发明中，所述曝气口优选通过橡胶塞密封，更优选在塞住橡胶塞后再盖上铝盖并使用压盖钳压紧铝盖。

接着，将密封好的容器至于光照环境中培养。培养过程中，记录培养时间与对应的溶解氧浓度。在本发明中，由于容器被溶液充满，容器内几乎无顶空，溶液释放的氧气完全溶解于溶液中，且溶液中溶解氧浓度被溶氧仪记录，因此通过记录溶氧仪读数随时间变化曲线，可以计算得到光合作用生物或其组织的氧气产生速率。在本发明中，光合作用生物或其组织的氧气产生速率也可按照式(I)进行计算。

本发明通过拓展溶解氧仪的功能，提供了一种新的测定微生物体内酶和光合作用生物或其组织中氧气产生速率的方法，其优点和有益效果包括：

(1)本发明中所采用的系统为一般实验室常规配备的仪器设备的组合，不需要额外购置专门的仪器来测定此指标。

(2)本发明可以自反应开始时刻起，实时测定溶液中溶解氧数值，不存在收集数据的延迟。

(3)本发明利用密封的容器测定样品中的溶解氧值，检测过程中所测样品不与空气接触，所测结果真实反映溶液中溶解氧值，计算得到的生物氧释放速率真实可靠。

(4)本发明提供的方法所需样品量少，操作简单，可靠性好。采用本发明提供的方法进行两次平行实验，实验结果表明实验重复性良好。

为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。

实施例

1)搭建试验台：

本实施例搭建的试验台包括：数据采集单元、反应单元、曝气单元、温度控制单元。所述数据采集单元包含便携式溶解氧仪，所述反应单元为加工的上端和侧端开口的玻璃小瓶，所述曝气单元包含高纯氮气钢瓶、减压阀、曝气针头，所述温度控制单元包含电热恒温水槽。

所述便携式溶解氧仪为哈希HQ30d便携式溶解氧仪，包含主机和LDO溶氧探头。具体结构如图1所示，图1是本发明实施例提供的哈希HQ30d便携式溶解氧仪的数码照片。

所述玻璃小瓶分为上端和下端两部分，彼此相连。上端为瓶口，内直径2.4cm，外直径3.1cm，高3cm；下端直径3.8cm，高5cm，中部偏下位置开口；下端开口部分距离底部1cm，向外伸出2.2cm，内直径1.3cm，外直径1.8cm。具体结构如图2所示，图2是本发明实施例提供的玻璃小瓶的数码照片。

将溶氧探头与主机相连，溶氧探头伸入到玻璃小瓶中部，瓶口通过橡胶塞密封，所述溶氧探头穿过橡胶塞插入玻璃小瓶中部，两者中间及外部可能的空隙部分使用封口膜缠绕密封。具体结构如图3所示，图3是本发明实施例提供的溶解氧仪和玻璃小瓶的连接示意图。

所述曝气针头在使用时通过玻璃小瓶侧端开口，置于玻璃小瓶中部，曝气针头的进口通过减压阀与纯氮气钢瓶相连。

所述电热恒温水槽为上海精宏DK-8D电热恒温水槽，包含三个独立的可控温水槽，使用时任选一个水槽进行控温。

2)测定过程：

将玻璃小瓶侧躺放置，从其侧端开口处注入54mL终浓度为15mM的磷酸缓冲溶液(pH＝7.2)与终浓度为0.2475mM的亚氯酸钠溶液的混合溶液，所述溶液充满玻璃小瓶；

将曝气针头通过玻璃小瓶侧端开口，置于玻璃小瓶中部，曝气针头的进口通过减压阀与纯氮气钢瓶相连，打开氮气钢瓶与减压阀，对玻璃小瓶中溶液曝气，同时打开溶解氧仪，曝气终点为溶氧仪的溶解氧(DO)读数趋近于零且稳定不变化；

用橡胶塞塞住玻璃小瓶侧端开口，盖上铝盖，使用压盖钳压紧铝盖；

将密封好的玻璃小瓶置于30℃的恒温水槽中，使得溶氧仪温度和DO读数均稳定；

使用注射器，通过玻璃小瓶侧端开口的橡胶塞，向小瓶中注入适量新鲜提取的人苍白杆菌这种氯酸盐还原菌的蛋白粗提物，反应开始；

记录时间与对应的溶氧仪的DO读数，绘制溶液中溶解氧随时间变化曲线，进行两次平行实验，结果如图4所示，图4本发明实施例提供的溶解氧浓度随时间变化图，左图和右图分别为平行实验1和平行实验2。

在本实施例中，可利用下式计算图4曲线在近似线性段的平均氧气产生速率：

上式中，v为氧气产生速率，单位为mmol/min；k为溶解氧随时间变化曲线在近似线性段的拟合斜率，图4左图的近似线性段对应的横坐标定为10～130s，右图的近线性段对应的横坐标定为20～100s，拟合斜率分别为1.9368mg/(L·min)，2.032mg/(L·min)；V为玻璃小瓶的体积，0.055L。计算得到平行实验1和平行实验2的氧气产生速率分别为3.329×10^- ³mmol/min和3.493×10^-3mmol/min。

进一步的，利用式(II)计算酶活性：

式(II)中，e为单位酶活性，单位为mmol/(min·mg)；c为蛋白粗提物的终浓度，54.54mg/L；V为容器的体积，0.055L。计算得到平行实验1和平行实验2的酶活性分别为1.110×10^-3mmol/(min·mg)和1.164×10^-3mmol/(min·mg)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种测定微生物体内酶氧气产生速率的方法，包括以下步骤：

所述溶解氧仪为哈希HQ30d便携式溶解氧仪，所述溶氧探头为LDO溶氧探头；

b1)在所述容器中充满底物溶液，通过曝气口对所述容器曝氮气，同时启动所述溶解氧仪，待所述溶解氧仪检测到的溶解氧浓度降至稳定后，停止曝气，密封曝气口；

c1)将密封好的容器置于反应环境中，向所述容器中注入新鲜提取的微生物蛋白粗提物，密闭反应，记录反应时间与对应的溶解氧浓度，计算得到微生物体内酶的氧气产生速率；

所述氧气产生速率按照式(I)进行计算：

2.一种测定光合作用生物或其组织氧气产生速率的方法，包括以下步骤：

b2)避光条件下，在所述容器中充满含光合作用生物或其组织的营养液，通过曝气口对所述容器曝氮气，同时启动所述溶解氧仪，待所述溶解氧仪检测到的溶解氧浓度降至稳定后，停止曝气，密封曝气口；

c2)将密封好的容器置于光照环境中培养，记录培养时间与对应的溶解氧浓度，计算得到光合作用生物或其组织的氧气产生速率；

所述氧气产生速率按照式(I)进行计算：

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述曝气口通过橡胶塞密封。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物蛋白粗提物为氯酸盐还原菌蛋白粗提物和/或高氯酸盐还原菌蛋白粗提物；

所述底物溶液中的底物包括亚氯酸盐。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述底物溶液的pH值为7～7.5。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述底物溶液的pH值通过磷酸调节。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为20～35℃。