KR102312845B1 - 아세트산 생산성 및 세포 생장성이 증대된 형질전환 유박테리움 속 균주 및 이의 제조방법 - Google Patents

아세트산 생산성 및 세포 생장성이 증대된 형질전환 유박테리움 속 균주 및 이의 제조방법 Download PDF

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강현수
오소영
정지영
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광주과학기술원
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Abstract

본 발명의 일 실시예는 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 작동 보조 효소들의 합동 과발현을 통하여 변이 전 균주와 비교하여 아세트산 생산성 및 세포 생장성이 증대된 형질전환 유박테리움 속 균주 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주를 이용하면, 저비용이면서도 반응 속도 및 반응 효율이 향상된 공정으로 C1 가스를 전환할 수 있다.

Description

아세트산 생산성 및 세포 생장성이 증대된 형질전환 유박테리움 속 균주 및 이의 제조방법{Transgenic Eubacterium genus strain with improved acetic acid productivity and cell growth, method for manufacturing the same}
본 발명은 아세트산 생산성 및 세포 생장성이 증대된 형질전환 유박테리움 속 균주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 작동 보조 효소들의 합동 과발현을 통하여 변이 전 균주와 비교하여 아세트산 생산성 및 세포 생장성을 증대시킨 형질전환 유박테리움 속 균주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
C1 가스란 합성가스, 천연가스 혹은 산업유래의 부생가스에 포함되는 탄소 수가 1개인 메탄(CH₄), 일산화탄소(CO), 이산화탄소(CO₂) 가스 등을 일컫는 말로, 전 세계적인 석유 의존도 및 온실가스 저감 요구의 증대와 더불어 새로운 산업 원료로 주목 받고 있다.
그 중에서도 특히 일산화탄소(CO)는 제철소나 화력발전소, 화학공장 등에서 주로 발생하는 부생가스로, 인체에 독성을 가지므로 이를 적절히 처리하는 공정이 필수적이다. 현재까지는 이러한 일산화탄소를 산화시켜 단순히 열에너지를 얻는 목적으로 가장 많이 활용 및 처리되고 있다. 그러나 이 과정에서 온실효과를 일으키는 이산화탄소(CO₂)가 발생되므로, 이를 전환하여 산업적으로 활용할 수 있도록 자원화하는 C1 가스 리파이너리(refinery) 공정에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.
C1 가스 리파이너리 공정은 크게 화학전환공정과 생물전환공정으로 나뉠 수 있다. 화학전환공정은 대부분 공정 과정에 고온·고압 조건을 요하며, 적절한 촉매의 사용이 요구되나, 현재까지 연구된 촉매는 활성이 낮고 고가이며 유해 산물 발생 등 경제적·환경적인 문제점이 있었다.
C1 가스 생물전환공정은 미생물 등의 바이오 촉매를 이용하여 C1 가스를 전환하는 기술로, 종래 C1 가스 화학적 전환공정과 달리 상온·상압 조건에서 공정이 진행되며, C1 가스를 전환하는 미생물의 형질변환을 통해 화학 촉매 대비 저렴한 비용으로 개량이 가능하다는 장점이 있다.
C1가스 생물전환공정 중에서도, 특히 일산화탄소의 전환 공정에는 아세토젠(Acetogen)으로 통칭되는 혐기성 아세트산 생성균이 주로 사용된다. 아세토젠은 일산화탄소를 탄소원으로 이용하는 우드-융달(Wood-Ljungdahl) 대사회로를 가진 미생물로, 일산화탄소 탈수소효소(carbon monoxide dehydrogenase, CODH)를 이용하여 일산화탄소를 아세트산 등의 유기산으로 전환함으로써 세포 생장 동력에 필요한 에너지를 얻는 것을 특징으로 한다.
그러나, 아세토젠을 이용한 생물전환공정은 미생물의 성장 속도가 느리고 기존의 화학전환공정과 비교하여 상대적으로 낮은 반응 속도 및 낮은 효율성을 가진다는 문제점이 있어, 이를 개선하기 위한 기술의 연구 개발이 시급한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-2072506호
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 작동 보조 효소들의 합동 과발현을 통하여 변이 전 균주와 비교하여 아세트산 생산성 및 세포 생장성을 증대시킨, 형질전환 유박테리움 속 균주 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 변이 전 균주의 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 작동 보조 효소들의 합동 과발현을 위한 형질전환용 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 메틸바이올로진 화학물을 이용하여 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소 활성도를 측정하는 측정방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 아세트산 비(比)생산성 측정을 통한 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성을 측정하는 측정방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 형질전환 유박테리움 속 균주를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주는, 일산화탄소 탈수소효소 유전자 발현량이 내재적 발현량에 비하여 증가; 조효소 cooC2 유전자 발현량이 내재적 발현량에 비하여 증가; 및 아세틸-CoA 합성효소 유전자 발현량이 내재적 발현량에 비하여 증가;된 것을 포함하는, 변이 전 균주와 비교하여 아세트산 생산능 및 세포 생장성이 증대된 형질전환 유박테리움 속 균주일 수 있다.
이때, 상기 변이 전 균주는, 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) 균주일 수 있다.
이때, 상기 형질전환 유박테리움 속 균주는, 균주 내로 재조합 발현 벡터가 도입됨으로써 상기 일산화탄소 탈수소효소 유전자, 상기 조효소 cooC2 유전자 및 상기 아세틸-CoA 합성효소 유전자의 발현량이 증가된 것일 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터는, 서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 일산화탄소 탈수소효소 유전자(KEGG No. ELI_3603); 서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 조효소 cooC2 유전자(KEGG No. ELI_3602); 및 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 아세틸 CoA 유전자(KEGG No. ELI_3601);를 포함하는 것일 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터는, pELM 벡터를 백본(backbone) 벡터로 하는 것일 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터는, 서열번호 4의 염기 서열로 구성되는 H2 프로모터를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 형질전환용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환용 재조합 발현 벡터는, 서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 일산화탄소 탈수소효소 유전자(KEGG No. ELI_3603); 서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 조효소 cooC2 유전자(KEGG No. ELI_3602); 및 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 아세틸 CoA 유전자(KEGG No. ELI_3601);를 포함할 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터는, pELM 벡터를 백본(backbone) 벡터로 하는 것일 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터는, 서열번호 4의 염기 서열로 구성되는 H2 프로모터를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 형질전환 유박테리움 속 균주의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 제조방법은, 형질전환 대상 균주에 재조합 발현 벡터를 도입하는 단계; 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 균주를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 균주를 배양하여 형질전환 된 유박테리움 속 균주를 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터는, 서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 일산화탄소 탈수소효소 유전자(KEGG No. ELI_3603); 서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 조효소 cooC2 유전자(KEGG No. ELI_3602); 및 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 아세틸 CoA 유전자(KEGG No. ELI_3601);를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 형질전환 유박테리움 속 균주를 이용하여 아세트산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주를 이용하여 아세트산을 생산하는 방법은, 일산화탄소 함유 가스 존재 하에서 제1항에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주를 배양하여 아세트산을 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 아세트산을 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소의 활성도를 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소 활성도 측정방법은, 측정 대상 균주를 배양하는 단계; 상기 배양된 균주로부터 단백질을 추출하는 단계; 상기 추출된 단백질에 메틸바이올로진 화학물을 첨가하는 단계; 상기 메틸바이올로진 화학물이 첨가된 단백질의 흡광도 측정 단계; 및 상기 측정된 흡광도를 이용하여 일산화탄소 탈수소효소 발현량 비(比)활성도를 산출하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성 측정방법은, 일산화탄소 가스 존재하에서 측정 대상 균주를 배양하여 아세트산을 생성시키는 단계; 상기 아세트산의 생산량을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 아세트산의 생산량으로 상기 균주의 아세트산 비(比)생산성을 산출하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 작동 보조 효소들의 합동 과발현을 통하여 변이 전 균주와 비교하여 아세트산 생산성 및 세포 생장성을 증대시킨, 형질전환 유박테리움 속 균주 및 이의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 형질전환 유박테리움 속 균주를 이용하면, 저비용이면서도 반응 속도 및 반응 효율이 향상된 공정으로 C1 가스를 전환할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 변이 전 균주의 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 작동 보조 효소들의 합동 과발현을 위한 형질전환용 재조합 발현 벡터를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 메틸바이올로진 화학물을 이용하여 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소 활성도를 측정하는 측정방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 아세트산 비(比)활성도 측정을 통한 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성을 측정하는 측정방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일산화탄소 탈수소효소 유전자(KEGG No. ELI_3603)의 염기 서열(서열번호 1)을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 조효소 cooC2 유전자(KEGG No. ELI_3602)의 염기 서열(서열번호 2)을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 아세틸 CoA 합성효소 유전자(KEGG No. ELI_3601)의 염기 서열(서열번호 3)을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환용 재조합 발현 벡터를 나타낸 개열지도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소 활성도 측정방법을 나타낸 흐름도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성 측정방법을 나타낸 흐름도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 발현 벡터 구축 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 발현 벡터 제조에 사용된 H2 프로모터의 염기 서열(서열번호 4)을 나타내는 도면이다.
도 9는 시간에 따른 일산화탄소 탈수소효소의 반응속도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 야생형 유박테리움 리모숨 균주(ELM001) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 균주(ELM031)의 일산화탄소 탈수소효소의 발현량 비(比)활성도 값을 비교하여 나타낸 표이다.
도 11은 야생형 유박테리움 리모숨 균주(ELM001) 및 형질전환 균주(ELM031)의 시간에 따른 아세트산 비(比)생산성을 산출한 그래프이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 실시예의 설명에 앞서, 본 발명에서 사용되는 용어들에 대하여 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “유전자 발현량의 증가”는 특정 단백질을 코딩하는 유전자가 과발현 된 것을 의미한다. 이때, 상기 유전자의 과발현은, 1) 해당하는 유전자의 카피수의 증가, 2) 해당하는 유전자의 발현 조절 부위에 발현을 유도하는 서열을 삽입, 3) 해당하는 유전자 염기 서열을 변형 및 4) 이들의 조합에 의해 유전자 발현량이 증가되도록 변형 시키는 방법 중 어느 하나를 통해 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 유전자 발현량이 내재적 발현량에 비해 증가될 수 공지의 방법은 제한 없이 포함된다.
상기 특정 유전자 서열의 카피수를 증가시키는 방법은, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 특정 유전자가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 상기 유전자가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 유전자를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 유전자의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.
상기 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 특정 유전자를 함유하는 DNA 제조물로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환 된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “내재적 발현량”은, 본래의 미생물이 비 변형 상태, 즉 천연의 상태에서 가지고 있는 발현량을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "형질전환"은, 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 의미하며, 특히 본 발명에서는 특정 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 유전자가 발현될 수 있도록 하는 것을 의미한다.
본 발명의 효소들을 코딩하는 유전자는 각 서열번호로 기재한 염기 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 각 서열번호로 기재한 염기 서열과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자 서열이라면 제한 없이 포함된다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "상동성"이란, 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열의 유사한 정도를 의미하는데, 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주를 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주는, 일산화탄소 탈수소효소 유전자, 조효소 cooC2 유전자 및 아세틸-CoA 합성효소 유전자 발현량이 내재적 발현량에 비하여 증가된 것을 포함하는, 변이 전 균주와 비교하여 아세트산 생산능 및 세포 생장성이 증대된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어, 형질전환에 이용할 변이 전 균주로는 KCTC에 기탁된, 기탁번호 KCTC13263BP의 아세토젠인 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) 균주를 이용하였다(이하, “야생형 균주” 혹은 “모델 균주” 혹은 “ELM001”로 칭한다).
상기 모델 균주의 전체 염기 서열은 NCBI GenBank에 accession number CP002273으로 제공되었다.
상기 모델 균주는, 일산화탄소 자화 기전에 일산화탄소 탈수소효소 및 상기 일산화탄소 탈수소효소를 작동 보조하는 조효소 cooC2 및 아세틸-CoA 합성효소를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 발명자들은, 모델 균주의 유전체 전체 서열을 분석해 본 결과 상기 효소들을 코딩하는 유전자 서열의 배열이 일산화탄소 탈수소효소 유전자가 선행하고 그에 이어 조효소 cooC2 유전자 및 아세틸 CoA 합성효소 유전자가 이어진다는 것을 확인하였다. 그런데, 상기 유전자들 간 간격에는 단백질 복제에 필수적인 RNA 유전 정보를 전사하는 RNA 전사 효소를 도입하는 컨센선스 시퀀스가 존재하지 않는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 발명자들은 상기 유전자들이 연쇄된 RNA 전사를 진행한다는 것을 유추하였고, 이에 착안하여 상기 일산화탄소 탈수소효소 유전자, 조효소 cooC2 유전자 및 아세틸 CoA 합성효소 유전자 세 가지를 동시에 합동 과발현 함으로써, 일산화탄소 탈수소효소 발현량을 증가시킨 형질전환 유박테리움 속 균주를 발명하기에 이르렀다.
이때, 상기 형질전환 유박테리움 속 균주는, 재조합 발현 벡터가 균주 내로 도입됨으로써 상기 유전자들의 발현량이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터는, 변이 전 균주가 가지는 일산화탄소 탈수소효소 유전자, 조효소 cooC2 유전자 및 아세틸 CoA 합성효소 유전자를 포함할 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터는, 서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 일산화탄소 탈수소효소 유전자(KEGG No. ELI_3603), 서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 조효소 cooC2 유전자(KEGG No. ELI_3602) 및 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 아세틸 CoA 합성효소 유전자(KEGG No. ELI_3601)를 포함할 수 있다.
도 1은 상기 일산화탄소 탈수소효소 유전자(KEGG No. ELI_3603)의 염기 서열(서열번호 1)을 나타내는 도면이다.
도 2는 상기 조효소 cooC2 유전자(KEGG No. ELI_3602)의 염기 서열(서열번호 2)을 나타내는 도면이다.
도 3은 상기 아세틸 CoA 합성효소 유전자(KEGG No. ELI_3601)의 염기 서열(서열번호 3)을 나타내는 도면이다.
도 1 내지 도 3을 참조하면, 상기 재조합 발현 벡터가 포함하는 상기 일산화탄소 탈수소효소 유전자(KEGG No. ELI_3603), 상기 조효소 cooC2 유전자(KEGG No. ELI_3602) 및 상기 아세틸 CoA 합성효소 유전자(KEGG No. ELI_3601)의 염기 서열을 확인할 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터는, 도 4의 개열 지도로 표시되는 재조합 발현 벡터 pOSC009일 수 있다.
상기와 같은 구성적 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 변이 전 균주와 비교하여 일산화탄소 탈수소효소 발현량이 증대된 형질전환 유박테리움 속 균주를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 변이 전 균주와 비교하여 일산화탄소 탈수소효소 발현량이 증대됨으로써 이에 따른 아세트산 생산성 및 세포 생장성이 증대된 형질전환 유박테리움 속 균주를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주를 이용하면, 저비용이면서도 반응 속도 및 반응 효율이 증대된 공정으로 C1 가스를 전환할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 형질전환용 재조합 발현 벡터를 설명한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환용 재조합 발현 벡터를 나타낸 개열지도이다.
도 4를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 형질전환용 재조합 발현 벡터는, 서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 일산화탄소 탈수소효소 유전자(KEGG No. ELI_3603), 서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 조효소 cooC2 유전자(KEGG No. ELI_3602) 및 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 아세틸 CoA 합성효소 유전자(KEGG No. ELI_3601)를 포함할 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터는, pELM 벡터를 백본(backbone) 벡터로 하는 것일 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터는, 서열번호 4의 염기 서열로 구성되는 H2 프로모터를 더 포함할 수 있다.
상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 변이 전 균주의 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 작동 보조 효소들의 합동 과발현을 위한 형질전환용 재조합 발현 벡터를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 제조방법에 대해 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 제조방법은, 유박테리움 속 균주에 재조합 발현 벡터를 도입하는 단계, 상기 균주 중 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 유박테리움 속 균주를 선별하는 단계 및 상기 선별된 균주를 배양하여 형질전환 유박테리움 속 균주를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터를 도입하는 방법은, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전, 염화칼슘 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법 및 초산 리튬-DMSO법이 이용될 수 있다.
이때, 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 균주의 선별은, 상기 재조합 발현 벡터 내 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함하도록 함으로써, 상기 선별 마커에 상응하는 선택제(selective agent)를 처리하는 방법을 통해 이루어 질 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환 세포를 선별, 즉 벡터의 균주 내 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주를 이용한 아세트산 생산방법에 대해 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주를 이용한 아세트산을 생산방법은, 일산화탄소 함유 가스 존재하에서 형질전환 유박테리움 속 균주를 배양하여 아세트산을 생성시키는 단계 및 상기 생성된 아세트산을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소 활성도를 측정하는 방법에 대해 설명한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “효소 활성도”는, 효소의 활성부위에서 일어나는 효소 반응의 정도를 의미한다. 본 발명에서는, 일산화탄소 탈수소효소가 일산화탄소를 산화시키는 효소 반응을 수행하는 정도를 의미할 것이다. 본 발명에서의 일산화탄소 탈수소효소의 활성도는, 일산화탄소 탈수소효소 유전자의 발현량 증가로 인하여 일산화탄소 탈수소효소의 수가 증가함으로써 그 활성도가 증가한 것일 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소 활성도 측정방법을 나타낸 흐름도이다.
도 5를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소 활성도 측정방법은, 균주를 배양하는 단계(S100), 상기 배양된 균주로부터 단백질을 추출하는 단계(S200), 상기 추출된 단백질에 메틸바이올로진 화학물을 첨가하는 단계(S300), 상기 메틸바이올로진 화학물이 첨가된 단백질의 분광 광도계를 이용한 흡광도 측정 단계(S400) 및 상기 측정된 흡광도를 이용하여 일산화탄소 탈수소효소 비(比)활성도를 산출하는 단계(S500)를 포함할 수 있다.
본 발명의 형질전환 유박테리움 속 균주는, 이중기능 일산화탄소 탈수소효소(Bi-functional CO Dehydrogenase)를 전사하는 특징을 가진다. 상기 일산화탄소 탈수소효소는, 일산화탄소의 산화를 위해 페레독신(ferredoxin)에 전자를 전달하는 것을 특징으로 한다.
이에 착안하여, 본 발명의 발명자들은, 상기 페레독신 전자 전달 과정을 모사 할 수 있는 메틸바이올로진(Methyl Viologen) 화학물을 이용하여 상기 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소의 활성도를 측정할 수 있는 측정방법을 발명하기에 이르렀다.
상기 메틸바이올로진 화학물은, 생체 내 페레독신 역할을 대신할 수 있는 화학물로, 전자를 받으면 색상이 변화하는 특징을 가진다.
따라서, 상기 형질전환 유박테리움 속 균주로부터 단백질을 추출하여, 상기 추출된 단백질에 메틸바이올로진 화학물을 첨가하면, 상기 메틸바이올로진 화학물이 일산화탄소 탈수소효소로부터 전자를 전달받아 색상이 변화할 것이므로, 이를 통해 일산화탄소 탈수소효소의 활성도, 예를 들면 일산화탄소 탈수소효소의 과발현 여부를 정성적, 정량적으로 측정할 수 있다.
이때, 상기 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소 활성도 측정방법은, 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주 뿐만 아니라 이중기능 일산화탄소 탈수소효소(Bi-functional CO Dehydrogenase)를 전사하는 혐기성 균주에 대해 활용 가능할 것이다.
예를 들어, 상기 혐기성 균주는, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium carboxidivorans, Rhodospirillum rubrum, Moorella thermoacetica 및 Eubacterium limosum으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있을 것이다.
상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소 활성도를 정성적·정량적으로 측정할 수 있는 측정방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성 측정방법에 대해 설명한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성 측정방법을 나타낸 흐름도이다.
도 6을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성 측정방법은, 형질전환 유박테리움 속 균주를 배양하여 아세트산을 생성시키는 단계(S100), 상기 아세트산 생산량을 측정하는 단계(S200) 및 상기 측정된 아세트산 생산량 이용하여 상기 균주의 아세트산 비(比)생산성을 산출하는 단계(S300)를 포함할 수 있다.
본 발명의 형질전환 유박테리움 속 균주는, Rnf Complex 등의 세포막 발현 효소군을 전자전달 및 ATP 생성을 위한 세포막간 화학적 삼투압 형성에 활용하며 아세트산을 CO 전환 과정의 마지막 산물로 생성하는 것을 특징으로 한다. 즉, 일산화탄소를 아세트산으로 변환하는 반응이 cell의 생장에 필요한 모든 생장 에너지, 즉 ATP를 생산하는데 매우 직접적으로 연계되는 것을 특징으로 한다.
이에 착안하여, 본 발명의 발명자들은, 아세트산 생산량 측정을 통한 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성 측정방법을 발명하기에 이르렀다.
따라서, 상기 아세트산 생산량 측정을 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주들의 세포 활성도(cell activity)를 측정함으로써, 이를 통한 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성을 정량적으로 측정할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
이때, 상기 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성 측정방법은, 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주뿐만 아니라 Rnf Complex 등의 세포막 발현 효소군을 전자전달 및 ATP 생성을 위한 세포막간 화학적 삼투압 형성에 활용하는 균주 중, 아세트산을 CO 전환 과정의 마지막 산물로 생성하는 아세토젠 균주에 활용 가능할 것이다.
예를 들어, 상기 아세토젠 균주는, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium carboxidivorans, Clostridium aceticum 및 Eubacterium limosum으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있을 것이다.
상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성을 정량적으로 측정할 수 있는 측정방법을 제공할 수 있다.
이하에서는 제조예, 비교예 및 실험예를 통해 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명한다. 하지만 본 발명이 하기 제조예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 형질전환용 재조합 발현 벡터 pOSC009의 제조
본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 발현 벡터를 제조하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 발현 벡터 구축 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 발현 벡터 제조에 사용된 H2 프로모터의 염기 서열(서열번호 4)을 나타내는 도면이다.
도 7 및 도 8을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 발현 벡터의 제조 과정을 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 발현 벡터는, 국제공개번호 WO 2019/045416로 공개된 pELM 벡터를 이용하여 제조하였다. 상기 pELM 벡터의 pMB1 origin 서열과 pIP404 origin 서열 사이에, 서열번호 4의 염기 서열로 구성되는 H2 프로모터와 GUS reporter gene을 삽입하여 pECPH2::uidA 벡터를 제조하였다. 상기와 같이 제조된 pECPH2::uidA 벡터 및 서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 일산화탄소 탈수소효소 유전자(KEGG No. ELI_3603), 서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 조효소 cooC2 유전자(KEGG No. ELI_3602), 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 아세틸 CoA 합성효소 유전자(KEGG No. ELI_3601)를 각각 OS04-OS32 및 OS33-OS34 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 증폭된 DNA 단편들을 제한효소 SphI 및 NcoI를 이용하여 37 ℃에서 1 시간 동안 절단 및 접합 시켰다.
상기와 같이 제조된 재조합 발현 벡터를 pOSC009로 명명하였다.
<제조예 2> 형질전환 유박테리움 속 균주 ELM031의 제조
본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주를 제조하였다.
이를 위하여, 먼저 모델 균주가 될 기탁번호 KCTC13263BP 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) 균주를 mid-exponential phase까지 배양하였다. 상기 배양된 균주를 4°C에서 20분간 5,000 rpm으로 수득하고 혐기성 조건에서 10% (w/v) sucrose로 2회 세척하였다. 상기 세척한 세포를 10% (w/v) sucrose로 재현탁시켰다. 상기 과정을 거친 세포와 상기 제조예 1에 따라 제조된 재조합 발현 벡터 pOSC009 500ng를 혼합하여 0.2 cm Gene Pulser®™electroporation cuvette (Bio-Rad, USA)로 옮긴 후 Bio-Rad gene Pulser(Bio-Rad, USA)로 3.0kV, 25μF, and 400Ω에서 전기 천공 하였다. 상기 과정을 거친 세포를 HBBM(HEPES 완충 기초 배지)로 옮기고 overnight 인큐베이션 하였다. 상기 배양한 세포를 erythromycin(150μg/ml)을 함유하는 HBBM배지에서 배양하였다. 상기 배양은, pOSC009 벡터의 도입 확인을 위하여 여러 번 transfer되어 수행되었다.
상기와 같이 제조된 형질전환 균주를 ELM031이라 명명하였다.
<실험예 1> ELM031 균주의 일산화탄소 탈수소효소 발현량 비(比)활성도 측정
상기 제조예 2에 따라 제조된 ELM031 균주의 일산화탄소 탈수소효소 발현량 비(比)활성도를 측정해보는 실험을 진행하였다.
이를 위하여, 먼저 야생형 유박테리움 리모숨 균주(ELM001) 및 상기 형질전환 균주(ELM031) 배양액으로부터 세포를 수확하여 단백질을 추출한 후, 메틸바이올로진(Methyl Viologen) 화학물을 처리하고, OD578nm 하에서의 흡광도를 측정하여 단위 시간당 산화되는(소모되는) 일산화탄소의 몰농도(M)를 산출하였다.
상기와 같이 산출된 단위 시간당 산화되는 일산화탄소의 몰농도(M)를 이용하여, 하기 식 (1)과 같이 일산화탄소 탈수소효소의 반응속도를 계산하였다.
Figure 112020054621699-pat00001
도 9는 시간에 따른 일산화탄소 탈수소효소의 반응속도를 나타낸 그래프이다.
상기와 같이 산출된 일산화탄소 탈수소효소의 Vmax 값을 이용하여, 본 발명에서는 일산화탄소 탈수소효소의 발현량을 의미하게 될, 일산화탄소 탈수소효소 비(比)활성도(
Figure 112020054621699-pat00002
를 산출하였다.
상기와 같이 산출된 일산화탄소 탈수소효소 비(比)활성도는, 동일한 단백질 무게 및 동일 시간당 소모하는 일산화탄소의 농도를 의미하므로, 야생형 균주와 형질전환 균주의 일산화탄소 활성도를 비교할 수 있는 지표가 될 수 있을 것이다.
도 10은 상기와 같이 산출된 야생형 유박테리움 리모숨 균주(ELM001) 및 상기 형질전환 균주(ELM031)의 일산화탄소 탈수소효소의 발현량 비(比)활성도 값을 비교하여 나타낸 표이다.
도 9 및 도 10을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주는, 야생형과 비교하여 약 3.1배 강화된 일산화탄소 탈수소효소 활성을 가지는 것을 확인할 수 있다.
<실험예 2> ELM031 균주의 아세트산 비(比)생산성 측정
상기 제조예 2에 따라 제조된 ELM031 균주의 실제 아세트산 생산 효율 증대를 검증해보기 위하여, 아세트산 비(比)생산성을 측정하는 실험을 진행하였다.
이를 위하여, ELM031 균주를 CO 가스 존재하에서 배양하며 아세트산 생산량을 측정하였다.
이때, 상기 아세트산 생산량은 생산된 아세트산의 무게를 측정하여 측정되었다.
상기 측정된 아세트산 생산량을 이용하여, 단위 CDW(세포건조중량) 및 단위 시간당 생성되는 아세트산 생산량인, 아세트산 비(比)생산성(
Figure 112020054621699-pat00003
)을 산출하였다.
도 11은 야생형 유박테리움 리모숨 균주(ELM001) 및 형질전환 균주(ELM031)의 시간에 따른 아세트산 비(比)생산성을 산출한 그래프이다.
도 11을 참조하면, 본 발명에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주는, 기존의 변이 전 균주보다 아세트산 비(比)생산성이 약 1.5배 증가한 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 유박테리움 속 균주는 아세트산을 cell의 생장에 필요한 ATP 생산에 직접 이용하므로, 본 발명에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주는 기존의 변이 균주보다 세포 생장성이 증대된 것을 확인할 수 있다.
상기의 제조예 및 실험예에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주는, 기존의 변이 전 균주와 비교하여 약 3.1배 강화된 일산화탄소 탈수소효소 활성을 가지며, 약 1.5배 증가된 아세트산 생산성을 가진다는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 변이 전 균주와 비교하여 아세트산 생산성 및 세포 생장성이 증대된 형질전환 유박테리움 속 균주를 제공할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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<110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> Transgenic Eubacterium genus strain with improved acetic acid productivity and cell growth, method for manufacturing the same <130> P-200099 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1896 <212> DNA <213> Eubacterium limosum <400> 1 atgagcaatg aattgttaga atttgatgtt atagctgaag ctttaatcga aaaagctcaa 60 aaagatggcg ctgaaaccat gtgggacaga aaagcagctt taaaaaccca gtgtggtttt 120 ggtgaagctg gtatttgctg tcgtatctgt gttatgggac cttgccgtgt aagcccatca 180 ccggataaag gcgctcagag aggtatctgt ggtgcagaca gagacaccat cgttgccaga 240 aactttgcaa gaatgtgttg tgccggtaca tccgctcact ctgaccatgt gcgcgatatc 300 gtacatgcaa tgtatcattc ttctgaagat ggtcctttca aaatcagaga agaaggcaaa 360 ttaagaaaaa tcgctgcaga atggggaatt gaagaagcag ataccaaaga aacttacgct 420 ttggcccatg aacttgcaga aatggcttta atggaattcg gtaaaccctt cggaacacag 480 aatttcttaa agagagcgcc agaatcccgt caggaaatct gggaaaaaga aaacattgcg 540 ccaagagcga ttgaccagga agttgttacc ttaatgcact ccacacatat gggttgtgca 600 agtgatcctg 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tgctaaagct ggtctcttaa aactggaagc aaaagaactt 1500 tgcggccgtg gtttgaaaga agcctgcgaa agagcgaata ttcctccagt attacatatg 1560 ggttcctgtg ttgatatcag ccgtatcctc catctggtta ctttagtagc taacgaaaga 1620 ggcgttgata ttgcagaact tccagttgta ggtgccgcac ctgaatatat gtctgaaaag 1680 gctgttgcta tcgcatctta cgtagtatca agtggtttaa atacttatct tggtgttatg 1740 ccttatgttt ccggaagtga aaacttcatg aagctgatga ccgaaggtgt taaagaatgg 1800 actggcgctg cttatgtctt tgaatcagat ccaatcaagg ctgctgaatt aatcatggca 1860 gatattgaag acaagagaac aaaactggga atttaa 1896 <210> 2 <211> 783 <212> DNA <213> Eubacterium limosum <400> 2 atgaaaatag cattaactgg aaaaggtggc gttgggaaaa cgacaattac agcctgcctc 60 agccgttatt acgccgataa aggttttaac gtattggccg ttgatgctga ccccgatgca 120 aatctaggcc tggcactggg tatgagcgaa gaaatgattg acagcatcac acctatttct 180 gaaatgaaag acttggccga agagagaaca aatgcaaaaa aaggaaccta tggcgccttt 240 ttcacaatga atccggaagt tgcggatatt cctgaaaaat tttgccgcga gtttaacggt 300 gttaagctct taacaatggg aacagtcgat actggcggag gcggatgtgt ttgcccggaa 360 cacgtactgt taaaaatgct gacgacacat ttggttttat accaaaagga tattgtcatc 420 atggatatgg aagcagggat tgaacatctt ggccgaggca ccgcatcagc ggtcgacgca 480 tttatcgttg tcgtcgaacc gggtatccga agcatccaga cctttaaacg aatcagcaag 540 ctggcaggcg atatcggtgt taaacacgtt tacgccattg gcaataaaat tcgcaaaccg 600 gaagatattg actttttaaa tgaacggatc ggagcggaaa acatttttgg cttcttagat 660 tacagtgatc agatttccgg ttcagacaga aataacaagt caccgtacga tgttcctgaa 720 accagagaaa aaattgcagc tctcggggaa aaaattgaag cgactgtaaa aagcaataaa 780 tag 783 <210> 3 <211> 2148 <212> DNA <213> Eubacterium limosum <400> 3 atggaacgta agacttataa tctttttgat ataatttaca gtggtactgc taaatatctt 60 gaacgtgctg aaaaagatgt agcaaaggcc attgaagaaa aaggcagaga tgcagaggcg 120 aaactgccgg ataccgctta tggcttagcc acaatttacg caatcacagg cgaaaaatta 180 ttaacagtag gcgatctgga acgcggtatt gaaatggcaa aagaacacat caaccgcaca 240 aacatgctgg ctgacgcttt agaagccggt gttgctgctg caatgttatg tgaaattatc 300 caggcctgca aatacttaga tggcaaccca catccggaat gggtagacgg cgcattgacc 360 gatgcggttg tccgttcctt cggtgttgcc ctggttaccc aggatattcc tggtgttgct 420 gttatcatcg gtgaacacaa ggatcctgaa cagttagcaa aaacaatcaa atcttatcag 480 aataaaggtc ttcagactta tctggttggt aaatgtatcg atcaggcaag agaccagaaa 540 atcaaaatgg gcgttgatct tcgtgttatc ccatgcggtt acgaaatcga agatgttatc 600 aacgttgtat ctgttgctgt acgtgcttct atcatgttcg gtaacacacc agccggcgaa 660 tgggaaaaac acagaattta cacaagagac cgtgtattcg cttttgttaa tgtatttggc 720 gactgggatg ataagatcat cgctgctggc gcctgcgcaa tcgatatggg cttcccggca 780 atcacagaaa cctacattaa tgaagttcct accctgttat taaaccagcc agacctgaca 840 aaaacagacg ctacctctct tgaagcccgt ggcatcaaga tcaaggttac cgaaattgac 900 tgtccggtat ctgtatcctt cgctttcgaa ggcgaacgtg tccgtaaaga caacatgaaa 960 gctgagttcg gtggaaacag aacaaaagcc tgggaattag ttcacactgt agaattgggc 1020 gatattgaag atcataagat caccgttgtc ggcccggata tcgacgatcc acagtttgat 1080 ggcgttgacg ttgtccgtat cccatttggc ctggaaatca aagttgctgg taaagcaatg 1140 cagtccgact tcgaatctgt acttgaaaga agattacact acttcttaaa ctacattgaa 1200 ggttcaatgc acgttggaca gagaaatatc tgctgggttc gtttaaccaa agaagcgttt 1260 gacgctggct tcagactgcg tcacttcggt gaagtagttt acgctaagat gttagatgaa 1320 tttggtaaag tagttgataa ggttgaagtt accatctata ccaaagaaga agatgttgta 1380 cgtcttgaag aagaactggt tagaccaatc tacaacgtac gtgacgacag actgaactca 1440 ctgacagatg aaagtgtcga tgtattctac acctgtacac tgtgccagtc ctttgctcct 1500 tctcacgttt gtgttgtaac acctgaacgt ttaggcctct gcggtgctgt ttcctggtta 1560 gactccaaag caaccaaaga acttgaccca accggtcctg cacagccaat cgaaaagaac 1620 ggtgttatcg acgaacgctt aggcgcatgg gaagaagtca atgacgttgt tgccaagtgc 1680 tctcagggtg cagttgaaaa agtaaccttg tactctatcc tggaagatcc aatgacctcc 1740 tgcggttgct tcgaatgtat ctgcggtatt atgccagaag ccaacggtgt tgttattgtt 1800 aaccgtgaat ttggcggcat gacacctacc ggtatgacct tcagtgagtt agcttccatg 1860 acaggtggtg gggttcagac tcctggcttc atgggccacg gccgccgctt catcagctcc 1920 aagaaattca tggctgctga aggcggtatc gaaagaatcg tatggatgcc taaggaactg 1980 aaagacgacg ttgcagagag attaaacaaa tctgtacagg aattatacgg aattgaaaac 2040 ttcacagaca tggtttgtga tgaaacaatc gccgttgact ctgaagcagt attagaattc 2100 ttaacagaaa aaggccatcc agcactggaa atggatccaa ttatgtaa 2148 <210> 4 <211> 110 <212> DNA <213> Eubacterium limosum <400> 4 ttttccgttt aaagtttaaa aattgtggta taattaatta tatcattaag cggataagtg 60 ggttacacgg actgctcaaa attatatttg gactatagga ggtctttatt 110

Claims (14)

  1. 일산화탄소 탈수소효소 유전자 발현량이 내재적 발현량에 비하여 증가;
    조효소 cooC2 유전자 발현량이 내재적 발현량에 비하여 증가; 및
    아세틸-CoA 합성효소 유전자 발현량이 내재적 발현량에 비하여 증가;된 것을 포함하는, 변이 전 균주와 비교하여 아세트산 생산능 및 세포 생장성이 증대되고,
    상기 변이 전 균주는, 기탁번호 KCTC 13264BP의 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) 균주인 형질전환 유박테리움 속 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 형질전환 유박테리움 속 균주는, 균주 내로 재조합 발현 벡터가 도입됨으로써 상기 일산화탄소 탈수소효소 유전자, 상기 조효소 cooC2 유전자 및 상기 아세틸-CoA 합성효소 유전자의 발현량이 증가된 것을 특징으로 하는 형질전환 유박테리움 속 균주.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터는,
    서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 일산화탄소 탈수소효소 유전자(KEGG No. ELI_3603);
    서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 조효소 cooC2 유전자(KEGG No. ELI_3602); 및
    서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 아세틸 CoA 유전자(KEGG No. ELI_3601);를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 유박테리움 속 균주.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터는, pELM 벡터를 백본(backbone) 벡터로 하는 것을 특징으로 하는 형질전환 유박테리움 속 균주.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터는, 서열번호 4의 염기 서열로 구성되는 H2 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 유박테리움 속 균주.
  7. 서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 일산화탄소 탈수소효소 유전자(KEGG No. ELI_3603);
    서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 조효소 cooC2 유전자(KEGG No. ELI_3602); 및
    서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 아세틸 CoA 유전자(KEGG No. ELI_3601);를 포함하고,
    기탁번호 KCTC 13264BP의 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) 균주의 형질전환용 재조합 발현 벡터.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터는, pELM 벡터를 백본(backbone) 벡터로 하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 재조합 발현 벡터.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터는, 서열번호 4의 염기 서열로 구성되는 H2 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 재조합 발현 벡터.
  10. 제1항에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 제조방법에 있어서,
    형질전환 대상 균주에 재조합 발현 벡터를 도입하는 단계;
    상기 재조합 발현 벡터가 도입된 균주를 선별하는 단계; 및
    상기 선별된 균주를 배양하여 형질전환 된 유박테리움 속 균주를 수득하는 단계;를 포함하는 형질전환 유박테리움 속 균주의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터는,
    서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 일산화탄소 탈수소효소 유전자(KEGG No. ELI_3603);
    서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 조효소 cooC2 유전자(KEGG No. ELI_3602); 및
    서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 아세틸 CoA 유전자(KEGG No. ELI_3601);를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 유박테리움 속 균주의 제조방법.
  12. 제1항에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주를 이용하여 아세트산을 생산하는 방법에 있어서,
    일산화탄소 함유 가스 존재하에서 제1항에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주를 배양하여 아세트산을 생성시키는 단계; 및
    상기 생성된 아세트산을 수득하는 단계;를 포함하는 아세트산 생산방법.
  13. 제1항에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소의 활성도를 측정하는 방법에 있어서,
    측정 대상 균주를 배양하는 단계;
    상기 배양된 균주로부터 단백질을 추출하는 단계;
    상기 추출된 단백질에 메틸바이올로진 화학물을 첨가하는 단계;
    상기 메틸바이올로진 화학물이 첨가된 단백질의 흡광도 측정 단계; 및
    상기 측정된 흡광도를 이용하여 일산화탄소 탈수소효소 발현량 비(比)활성도를 산출하는 단계;를 포함하는 형질전환 유박테리움 속 균주의 일산화탄소 탈수소효소 활성도 측정방법.
  14. 제1항에 따른 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성을 측정하는 방법에 있어서,
    일산화탄소 가스 존재하에서 측정 대상 균주를 배양하여 아세트산을 생성시키는 단계;
    상기 아세트산의 생산량을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 아세트산의 생산량으로 상기 균주의 아세트산 비(比)생산성을 산출하는 단계;를 포함하는 형질전환 유박테리움 속 균주의 생장성 측정방법.
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US20120064587A1 (en) * 2010-09-10 2012-03-15 University Of Delaware Recombinant clostridia that fix co2 and co and uses thereof
CN104515851A (zh) * 2015-01-08 2015-04-15 河南农业大学 一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置
KR102072506B1 (ko) 2017-12-20 2020-02-03 재단법인 포항산업과학연구원 부생가스로부터 탄화수소 및 알코올 직접 합성용 촉매, 그 제조 방법 및 촉매를 이용한 탄화수소 및 알코올 직접 합성 방법

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Title
한국생물공학회 학술대회, PO730, 제517면(2019. 4. 10 공개)* *

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