CN106053649A - 一种α‑甘草次酸含量的检测方法 - Google Patents

一种α‑甘草次酸含量的检测方法 Download PDF

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张宇
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Abstract

本发明公开了一种α‑甘草次酸含量的检测方法，包括（1）设定高效液相色谱条件；（2）制备对照品溶液；（3）制备供试品溶液；（4）含量测定：分别取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算α‑甘草次酸的含量。本发明实现了对α‑甘草次酸的质量检测，经过试验表明，该方法线性关系、重现性、精密度、稳定性、回收率均较好，且本发明所述方法准确、简便、快捷，能够更有效、全面的控制α‑甘草次酸的质量。

Description

一种α-甘草次酸含量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种α-甘草次酸含量的检测方法，属于医药化工技术领域。
背景技术
甘草为豆科植物甘草的干燥根及根茎，具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、调和诸药之功效，素有“十药九草”、“无草不药”之称。甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黄酮、生物碱、氨基酸等化学成分，具有广泛的生理活性。甘草酸是甘草中最为重要的化学成分，具有消毒、消炎、抗过敏、治疗溃疡、镇咳、抗肿瘤和防治病毒肝炎、高血脂症和抗癌症等疾病的作用，引起药理学家和化学家的极大重视。
天然甘草中的甘草酸存在两种差向异构体18α体和18β体，其中以18β体为主。由于构型上的差异，18α体的位阻效应，使其亲脂性大于18β体，在体内易与受体蛋白结合。甘草次酸是从天然植物药甘草（Glycyrrhiza Uralensis）的根中提取的甘草酸经过水解后精制而得。药理实验证明，甘草次酸作为甘草酸在体内代谢的产物，在血液中能够得到很好的吸收，其药理应用因而也比较广泛。甘草次酸通过诱导肿瘤细胞的凋亡和分化、阻滞细胞周期、抑制肿瘤多药耐药性以及抑制促癌剂的诱癌作用等方式，对肝癌、肺癌、胃癌及白血病等多种肿瘤细胞系的体外生长具有广泛的抑制作用，同时对正常体细胞的毒性较小。目前市场上的α构型的甘草酸类成分药品多以α-甘草酸二铵盐或异甘草酸镁等为主要成分，其疗效已经得到广泛的证实，而以甘草次酸，尤其是α-甘草次酸为主要成分的药品则未见上市或报道，因此，对于其进行的相关研究则显得更为重要。药品的研究必然需要有高效可行的检测方法来进行分析处理，因而，开发研究一种α-甘草次酸的检测方法则成为必然，也为其质量控制提供了保障。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种操作简单，具有良好的精密度、重现性和可靠性，可用于α-甘草次酸的质量控制的α-甘草次酸含量的检测方法。
本发明的技术方案为：
一种α-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
（1）设定高效液相色谱条件：色谱柱为Agilent TC-C18：4.6 mm×250 mm，5 um，以水为流动相 A，以乙腈为流动相 B，溶剂为甲醇，洗脱方式为梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，柱温为 30℃，检测波长为 244nm，进样量5μl；
所述的梯度洗脱中流动相A 和流动相B 在不同的时间段的浓度关系如下表所示：
。
（2）制备对照品溶液 ：称取α-甘草次酸对照品，置于容量瓶中，加入质量比为1:1的流动相A和流动相B，稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 0.980mg·ml-1 的溶液，得到对照品溶液；
（3）制备供试品溶液 ：称取α-甘草次酸供试品粉末，置于容量瓶中，加入甲醇溶解α-甘草次酸供试品粉末，超声提取30min，静置，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
（4）含量测定 ：分别取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算α-甘草次酸的含量。
上述的步骤（1）中，优选，洗脱时的流速为1.0mL·min-1，柱温为 30℃，检测波长为244nm。
此外，α-甘草次酸含量的检测方法还包括对α-甘草次酸对照品溶液浓度和峰面积积分值A进行线性回归的步骤。
具体方法为：取不同浓度的α-甘草次酸对照品溶液，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，得到线性回归方程为：A＝8.20×106C＋11350.2，R＝0.9999，且所述的A为峰面积积分值，而所述的C为α-甘草次酸对照品溶液浓度。
当然，还可以包括对高效液相色谱仪进行精密度检测的步骤、对供试品溶液的稳定性进行检测的步骤、检验α-甘草次酸的含量检测方法的重复性的步骤、进行加样回收率实验的步骤或进行α-甘草次酸最低检测浓度测定的步骤。
且所述的α-甘草次酸最低检测浓度为0.0261μg·mL-1。
本发明的有益效果为：本发明所述检测方法以纯的甲醇作提取溶剂，较之于稀乙醇、稀甲醇、流动相等其他溶剂，提取效率更高更完全；且本发明所述检测方法以乙腈和水的二元高压梯度为流动相，该方法简便，灵敏度高，重现性好，样品分离度、对称性及峰形均较好，且保留时间适中，更加适合于常规检测。
附图说明
图1为α-甘草次酸对照品溶液的高效液相色谱图；
图2为某一批次的α-甘草次酸对照品溶液的高效液相色谱图；
图3为另一批次的α-甘草次酸对照品溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1：设定高效液相色谱条件
色谱柱为Agilent TC-C18：4.6 mm×250 mm，5 um，以水为流动相 A，以乙腈为流动相B，溶剂为甲醇，洗脱方式为梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，柱温为 30℃，检测波长为244nm，进样量5μl，
所述的梯度洗脱中流动相A 和流动相B 在不同的时间段的浓度关系如下表所示：
。
实施例2：制备对照品溶液
称取α-甘草次酸对照品49.0mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.980mg·ml-1 的溶液，得到对照品溶液（储备液）。
实施例3：制备供试品溶液
称取α-甘草次酸供试品粉末30mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，加入甲醇溶解α-甘草次酸供试品粉末，超声提取30min，静置，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
实施例4：对α-甘草次酸对照品溶液浓度和峰面积积分值A进行线性回归
精密量取对照品贮备液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL，置于10 mL容量瓶中，加质量比为1:1的流动相A和流动相B稀释至刻度，摇匀，得到含α-甘草次酸分别为0.0196、0.0588、0.098、0.1372、0.1764 mg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取上述各对照品溶液5μL，按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值（A）对对照品溶液浓度（C）进行线性回归，得回归方程为A＝8.20×106C＋11350.2（R＝0.9999）。
图1为α-甘草次酸对照品溶液的高效液相色谱图。
如图1所示：α-甘草次酸检测浓度在0.0196-0.1764 mg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
实施例5：对高效液相色谱仪进行精密度检测
精密吸取浓度为0.098 mg·mL-1的对照品溶液5μL，按上述色谱条件连续进样6 次，测定峰面积积分值分别为：819797、818425、810797、823438、821032、819467。结果，RSD＝0.52％，表明仪器精密度良好。
实施例6：对供试品溶液的稳定性进行检测
精密量取同一供试品溶液5μL，分别在0、1、2、3、4、24h 进样测定，测得峰面积积分值分别为：1546674、1568425、1540797、1536771、1547698、1572801，均值为1552194.3，结果：RSD＝0.96％，表明供试品溶液在24 h内稳定。
实施例7：检验α-甘草次酸的含量检测方法的重复性
称取同一甘草样品粉末约30 mg，平行6份，精密称定，按实施例3所述方法制备供试品溶液，精密吸取5μL，按上述色谱条件测定，测得峰面积积分值分别为：787463、802338、799935、785958、780341、786885，均值为790486.7；结果，RSD＝1.10％，表明本发明所述方法重复性较好。
实施例8：加样回收率实验
取已知含量的α-甘草次酸供试品9 份，每份约30 mg，精密称定，加入相应量的对照品，按上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。
表1 加样回收率试验结果（n＝9）
。
实施例9：α-甘草次酸最低检测浓度测定
将对照品溶液稀释测定，测得信噪比为3∶1 时，甘草酸的最低检测浓度为0.0261 μg·mL-1。
实施例10：样品含量测定
取5个不同批次的α-甘草次酸样品各30 mg，精密称定，按照实施例3的方法制成供试品溶液，分别取供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算α-甘草次酸的含量。
图2为某一批次的α-甘草次酸对照品溶液的高效液相色谱图；图3为另一批次的α-甘草次酸对照品溶液的高效液相色谱图。
根据图2和图3的高效液相色谱图，得到各批次的α-甘草次酸样品含量测定结果如表2所示：
表2 不同批次的α-甘草次酸样品含量测定结果
上述α-甘草次酸含量测定方法实现了对α-甘草次酸的质量检测，经过试验表明，该方法线性关系、重现性、精密度、稳定性、回收率均较好，且本发明所述方法准确、 简便、快捷，能够更有效、全面的控制α-甘草次酸的质量。
以上具体实施方式不以任何形式限制本发明，凡是以等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种α-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
（1）设定高效液相色谱条件：色谱柱为Agilent TC-C18：4.6 mm×250 mm，5 um，以水为流动相 A，以乙腈为流动相 B，溶剂为甲醇，洗脱方式为梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，柱温为 30℃，检测波长为 244nm，进样量5μl，
所述的梯度洗脱中流动相A 和流动相B 在不同的时间段的浓度关系如下表所示：
；
（2）制备对照品溶液 ：称取α-甘草次酸对照品，置于容量瓶中，加入质量比为1:1的流动相A和流动相B，稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 0.980mg·ml-1 的溶液，得到对照品溶液；
（3）制备供试品溶液 ：称取α-甘草次酸供试品粉末，置于容量瓶中，加入甲醇溶解α-甘草次酸供试品粉末，超声提取30min，静置，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
（4）含量测定 ：分别取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算α-甘草次酸的含量。
2. 根据权利要求 1 所述的一种α-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，洗脱时的流速为1.0mL·min-1，柱温为 30℃，检测波长为244nm。
3.根据权利要求1所述的一种α-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，还包括对α-甘草次酸对照品溶液浓度和峰面积积分值A进行线性回归的步骤。
4.根据权利要求3所述的一种α-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，对α-甘草次酸对照品溶液浓度和峰面积积分值A进行线性回归的方法为：取不同浓度的α-甘草次酸对照品溶液，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，得到线性回归方程为：A＝8.20×106C＋11350.2，R＝0.9999，且所述的A为峰面积积分值，而所述的C为α-甘草次酸对照品溶液浓度。
5.根据权利要求1所述的一种α-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，还包括对高效液相色谱仪进行精密度检测的步骤。
6.根据权利要求1所述的一种α-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，还包括对供试品溶液的稳定性进行检测的步骤。
7.根据权利要求1所述的一种α-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，还包括检验α-甘草次酸的含量检测方法的重复性的步骤。
8.根据权利要求1所述的一种α-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，还包括进行加样回收率实验的步骤。
9.根据权利要求1所述的一种α-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，还包括进行α-甘草次酸最低检测浓度测定的步骤。
10.根据权利要求1所述的一种α-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，所述的α-甘草次酸最低检测浓度为0.0261μg·mL-1。
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