CN103529151A - 一种甘草酸衍生物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种甘草酸衍生物的检测方法，属于物理分析检测领域范畴。本发明所建立的高效液相色谱梯度洗脱法同时检测甘草次酸、乙酰甘草次酸、甘草酸酯等，具有良好的精密度、重现性、可靠性，方法先进简单，可以同时测定多种甘草酸衍生物的纯度，能够安全、有效、全面的控制甘草酸衍生物的质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种甘草酸衍生物多种成分的高效液相色谱检测方法，属于物理分析检测领域范畴。
背景技术
甘草为多年生草本植物甘草(Glycyrrhiza urlensis Fisch.)的根及根茎，性味甘平，归心、肺、脾、胃经，是临床上常用的药材之一，具有“十方九草”的美称。药理研究表明甘草具有补脾益气、润肺止咳、通经脉、利气血、清热解毒、止血祛痰润肺的功效，临床上被广泛地用于治疗胃溃疡和十二指肠溃疡、咽喉肿痛、支气管炎、咳嗽、关节炎、过敏等疾病及用于保肝、降血脂、抗癌、抗干扰素诱生及增强细胞免疫调节等。甘草酸(glycyrrhizic acid，GA)是甘草中最重要的有效成分之一，具有解毒、消炎、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤以及增强免疫等多种药理活性。但游离GA的水溶性较差，需制成有关衍生物后药用。而由GA制得的衍生物主要包括甘草甜素(glycyrrhizic，GL)、甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GAS)以及酰化甘草次酸(acyl glycyrrhetinic acid，AGA)。
本实验室在研究过程中，对甘草酸进行处理，获得了甘草酸衍生物：甘草酸单糖苷、甘草次酸、乙酰甘草次酸以及甘草酸酯。本发明在甘草酸甜素的液相色谱条件的基础上进行改进，建立的一种甘草酸衍生物通用的高效液相色谱检测方法，用于检测区别不同的甘草酸衍生物和含量。本方法简便快捷，精密度好，重现性好，具有很强的实用性。
在已经公开的文献与专利中，都是关于甘草酸及其衍生物的制备与应用、研究进展和药理活性研究的描述，未发现与本发明相关或类似的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定多种甘草酸衍生物纯度的方法，本方法相对简单，具有良好的精密度、重现性和可靠性，通用于测定多种甘草酸衍生物成分的纯度及含量，可用于甘草酸衍生物的质量控制。
本发明提供一种甘草酸衍生物的高效液相检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)色谱条件：室温，相对湿度25～40％；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以30～90％乙腈溶液为流动相A，以0.01mol/L磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：0.8～1.2ml/min，柱温25～40℃，检测波长250～257nm。
(2)对照品溶液的制备：精密称取甘草次酸等对照品适量，加适量甲醇溶解制成对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：称取甘草酸衍生物适量，加入适量甲醇，超声溶解5～20，放冷，即得。
(4)测定法：精密吸取供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
上述步骤(1)中所述的室温优选为20℃；相对湿度优选为35％；流动相流速范围为0.8～1.2ml/min，优选为1ml/min；柱温为25～40℃优选为30℃；检测波长优选为254nm。
上述步骤(1)中检测方法优选采用如下梯度：
步骤(2)中对照品溶液可以配制成哦0.5～1mg/ml的溶液，优选为每1ml含0.5mg的溶液作为对照品溶液。
步骤(3)中所取甘草酸衍生物可以配制成每1ml含0.5～2mg的溶液，优选为1mg/ml的浓度，超声时间优选为10分钟。
步骤(4)中供试品的进样量可以为10或20μl，优选为20μl；记录色谱图的时间为60min。
本方法通过高效液相色谱，实现了对多种甘草酸衍生物的同时测定。经过试验表明，所测的多种成分分离度好，线性关系、重现性、精密度、稳定性、回收率均较好。本方法准确、简便、快捷，能够更有效、更全面的控制甘草酸衍生物的质量。
具体实施方式
下述实施例中检测仪器：岛津高效液相色谱仪，包括LC 10ATvp plus二元泵、SPD 10Avpplus紫外检测器、LC-solution色谱工作站。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。各种甘草酸衍生物由江苏天晟药业有限公司提供，甘草次酸、乙酰甘草次酸和甘草酸酯对照品由江苏天晟药业有限公司研发中心提供。
下述实施例是为了对本发明权利要求的技术特征给予说明，用于进一步说明本发明的实用性，不应理解为对本发明范围的限制。
实施例1
1.色谱条件与系统适应性
色谱柱：C18色谱柱(Agilent TC-C18(2)4.6×250mm，5μm)；以30～90％乙腈溶液为流动相A，以0.01mol/L磷酸水为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：1ml/min，柱温30℃，检测波长254nm。
2.实验方法与结果
2.1对照品溶液的制备
精密称取甘草次酸对照品5.26mg，置10ml量瓶中，加适量甲醇溶解稀释定容，作为对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备：
精密称取甘草次酸样品50.14mg，置50ml量瓶中，加一定量的甲醇溶解，超声10分钟后，放冷，再用甲醇定容至刻度，即得。
2.3测定结果
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定。
供试品在和对照品的相同保留时间上出现相同的峰，同时计算得甘草次酸含量为93％。
实施例2
1.色谱条件与系统适应性
色谱柱：C18色谱柱(Agilent TC-C18(2)4.6×250mm，5μm)；以30～90％乙腈溶液为流动相A，以0.01mol/L磷酸水为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：1.2ml/min，柱温35℃，检测波长252nm。
2.实验方法与结果
2.1对照品溶液的制备：
精密称取自制乙酰甘草次酸对照品10.08mg，置10ml量瓶中，加适量甲醇溶解后定容至刻度，即得。
2.2供试品溶液的制备：
精密称取乙酰甘草次酸样品25.78mg，置50ml量瓶中，加一定量的甲醇溶解，超声20分钟后，放冷，再用甲醇定容至刻度，即得。
2.3含量测定
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定。
在对照品出峰的相同保留时间，样品出现相同的峰，计算得乙酰甘草次酸含量为89.5％。
实施例3
1.色谱条件与系统适应性
色谱柱：C18色谱柱(Agilent TC-C18(2)4.6×250mm，5μm)；以30～90％乙腈溶液为流动相A，以0.01mol/L磷酸水为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：0.8ml/min，柱温25℃，检测波长257nm。
2.实验方法与结果
2.1对照品溶液的制备：
分别精密称取自制甘草酸二乙酯A7.86mg，甘草酸二乙酯B6.56mg，甘草酸二乙酯C9.25mg，置10ml量瓶中，加适量甲醇溶解，溶解并定容，作为对照品贮备液。
分别精密吸取一定量的的对照品贮备液，置量瓶中混合并加甲醇定容，形成混合对照品溶液。各对照品浓度为157.2μg/ml，131.2μg/ml和185μg/ml。
2.2供试品溶液的制备：
精密称取甘草酸酯样品30.21mg，置50ml量瓶中，加一定量的甲醇溶解，超声15分钟后，放冷，再用甲醇定容至刻度，即得。
2.3含量测定
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定。结果见表1。
表1甘草酸酯含量测定结果
| 成分 | 甘草酸二乙酯A | 甘草酸二乙酯B | 甘草酸二乙酯C |
| 含量(％) | 32.15 | 34.76 | 30.43 |
实施例4
1.色谱条件与系统适应性
色谱柱：C18色谱柱(Agilent TC-C18(2)4.6×250mm，5μm)；以30～90％乙腈溶液为流动相A，以0.01mol/L磷酸水为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：0.8ml/min，柱温25℃，检测波长257nm。
2.实验方法与结果
2.1对照品溶液的制备：
精密称取自制甘草酸三乙酯对照品5.89mg，置10ml量瓶中，加适量甲醇溶解并定容，作为对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备：
精密称取甘草酸三乙酯杨平30.47mg，置50ml量瓶中，加一定量的甲醇溶解，超声15分钟后，放冷，再用甲醇定容至刻度，即得。
2.3含量测定
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定。
在和对照品保留时间相同的位置，样品出现同样的峰，计算其含量为87.84％。
Claims (7)
1.一种甘草酸衍生物的检测方法，其特征在于该方法如下：
色谱条件：室温，相对湿度25～40％；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以30～90％乙腈溶液为流动相A，以0.01mol/L磷酸水为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：0.8～1.2ml/min，柱温25～40℃。
称取甘草酸衍生物适量，加入适量甲醇，制成每1ml含0.5～2mg的溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.根据权利要求1所述的的检测方法，其特征在于梯度洗脱过程为：第0.01分钟，流动相A乙腈为30～40％，流动相B0.01mol/L磷酸水溶液为60～70％；第10～15分钟，流动相A乙腈为40～50％，流动相B0.01mol/L磷酸水溶液为50～60％；第15～25分钟，流动相A乙腈为50～55％，流动相B0.01mol/L磷酸水溶液为45～50％；第25～35分钟，流动相A乙腈为55～65％，流动相B0.01mol/L磷酸水溶液为35～45％；第35～50分钟，流动相A乙腈为65～85％，流动相B0.01mol/L磷酸水溶液为15～35％；第50～60分钟，流动相A乙腈为85～90％，流动相B0.01mol/L磷酸水溶液为10～15％。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于供试品溶液的制备方法为：称取甘草酸衍生物适量，加入适量甲醇，超声溶解5～20分钟，放冷，配制成每1ml含0.5～2mg的溶液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于高效液相色谱的进样量为10或20μl，优选为20μl。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于色谱条件中室温优选为20℃，相对湿度优选为35％，柱温为30℃。
6.根据权利要求2所述的的检测方法，其特征在于梯度洗脱过程为：第0.01分钟，流动相A乙腈为35％，流动相B0.01mol/L磷酸水溶液为65％；第15分钟，流动相A乙腈为45％，流动相B0.01mol/L磷酸水溶液为55％；第25分钟，流动相A乙腈为55％，流动相B0.01mol/L磷酸水溶液为45％；第35分钟，流动相A乙腈为65％，流动相B0.01mol/L磷酸水溶液为35％；第50分钟，流动相A乙腈为85％，流动相B0.01mol/L磷酸水溶液为15％；第60分钟，流动相A乙腈为90％，流动相B0.01mol/L磷酸水溶液为10％。
7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于供试品溶液制备中的超声处理为10分钟，制成每1ml含1mg的溶液。
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| CN106053649A (zh) * | 2016-06-12 | 2016-10-26 | 江苏天晟药业股份有限公司 | 一种α‑甘草次酸含量的检测方法 |
| RU2603363C1 (ru) * | 2015-09-23 | 2016-11-27 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России) | Вольтамперометрический способ количественного определения глицирризиновой кислоты в фармацевтических субстанциях |
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- 2012-07-04 CN CN201210228702.6A patent/CN103529151A/zh active Pending
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