CN106038490A - 一种红景天提取物类脂质体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种红景天提取物类脂质体及其制备方法，采用改良薄膜分散结合高压均质法制备红景天提取物类脂质体混悬液，采用冷冻干燥法制备类脂质体冻干粉末。其原料由如下重量份的组分组成：红景天提取物1～10重量份，非离子表面活性剂4～60重量份，胆固醇3～50重量份，冻干保护剂5～20重量份。本发明红景天提取物类脂质体制剂具有延长体内的滞留时间，避免被肝组织网状内皮系统的吞噬，协助红景天有效成分通过血脑屏障的能力。本发明制备的红景天提取物类脂质体稳定性好，工艺简单，适合大工业生产。

Description

一种红景天提取物类脂质体及其制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种红景天提取物类脂质体及其制备方法，属于生物医药技术领域。
技术背景
红景天为多年生草本植物，可作药用，能够补气清肺，益智养心，是一味作用广泛的中药。亦有很大的美容效果，可作护肤品，也可食用。红景天提取物，气香甜、味苦涩。主要成份为红景天苷和红景天苷元，红景天曾被用于中国，西伯利亚和乌克兰的喀尔巴阡山地区的传统草药中。红景天提取物具有增强免疫力的功效，可提升机体对感染逐渐发展所积聚成的毒的抵抗能力；研究表明红景天提取物可缓和压力所致心血管组织损伤和功能紊乱，防止在急冻状态下因周围环境压力继发的心脏收缩力下降和有助于稳定收缩性；红景天提取物具有美白、抗辐射功效，在长白山地区，当地居民称其为“长生不老草”。
类脂质体是在脂质体基础上发展起来的一种新型微粒给药系统。以非离子表面活性剂代替两性表面活性剂磷脂为主要膜材所构成的一种脂质双分子层微型囊泡，可将药物包封于双分子层中制成单室或多室超微型载体给药系统。类脂质体是一种很有发展前途的新型药物载体，具有双分子层结构，既可以包封水溶性药物，又可以包封于脂溶性药物，正日益引起人们的关注。
类脂质体粒径较小，不容易被巨噬细胞吞噬，可以延长在体内的循环时间，同时具有优良的组织渗透性，尤其可在有渗漏性血管组织(肿瘤、炎症区或梗死区等)聚集；类脂质体不易被肾排泄，粒径大的类脂质体也可在肝、脾浓集，而有被动靶向作用。同时类脂质体中的非离子表面活性剂的聚氧乙烯基可在其表面生成立体位阻屏障，在血液中不易被血浆蛋白识别、摄取，从而在血液中的驻留时间较普通脂质体有显著延长。
本发明所制备的红景天提取物类脂质体制剂，能够延长红景天提取物有效成分在体内循环组织的停留时间，协助其通过血脑屏障，降低被肝组织巨噬细胞的吞噬，降低其在应用中出现的毒副作用，从而扩大中药提取物制剂的应用范围。
发明内容
本发明提供了一种红景天提取物类脂质体及其制备方法，本发明制备的红景天提取物类脂质体具有包封率高、毒性小、稳定性高便等优势。
本发明所述红景天提取物类脂质体制剂，其原料由如下重量份的组分组成如下：
优选的，
所述红景天提取物为购买或制备得到。制备方法可以为乙醇回流提取等。
所述非离子表面活性剂的HLB值为2～20；所述非离子表面活性剂优选为吐温80、鲸蜡醇硫酸酯钠和司盘80中的一种或多种，进一步优选为鲸蜡醇硫酸酯钠和司盘80质量比1:3～3:1的混合物。
所述冻干保护剂选自甘露醇、山梨醇、蔗糖和棉籽糖等中的一种或多种的混合物，优选为山梨醇或甘露醇、山梨醇、棉籽糖三者的混合物；更优选为甘露醇、山梨醇、棉籽糖三者的混合物，三者的质量比为(1～3)：(1～3)：(1～3)。
本发明中，
甘露醇，CAS号：87-78-5。
棉籽糖：CAS号：17629-30-0。
山梨醇：CAS号：50-70-4。
蔗糖，CAS号：512-69-6。
吐温80，CAS号：9005-65-6。
司盘80，CAS号：1338-43-8。
鲸蜡醇硫酸酯钠，CAS号：1120-01-0。
本发明涉及到的红景天提取物类脂质体制剂制备方法如下：
(1)将4～60重量份的非离子型表面活性剂和3～50重量份的胆固醇，加入50～1000重量份的有机溶剂使其溶解，旋转蒸发形成干燥的薄膜；
(2)将干燥的薄膜溶于10～400重量份的乙醚中，加入红景天提取物1～10重量份，再加入50～1000重量份磷酸盐缓冲液，超声20min，将超声后的溶液中再加入50～200重量份的磷酸盐缓冲液水合，温度控制在60℃，水合后置于40℃恒温水浴振荡器中振荡过夜，制备成红景天类脂质体混悬液；
(3)将步骤(2)所得类脂质体混悬液通过高压均质机整粒，期间通过冷却循环水(4～10℃)降温；
(4)在室温将步骤(3)所得类脂质体与5～20份的冻干保护剂混合，-80℃预冻24h，冷冻干燥48h，即得。
其中，
步骤(1)所述有机溶剂优选为二氯甲烷和甲醇中的一种或两种的混合物，进一步优选为二氯甲烷和甲醇体积比2：3的混合物。
步骤(2)所述磷酸盐缓冲液为Na2HPO4与NaH2PO4摩尔比3:2～2:3的混合物。
步骤(3)所述的高压均质机压力为500bar～1000bar。
本发明所得的红景天提取物类脂质体粒径为50～200nm，采用冻干法制备冻干制剂粉末，具有较好的稳定性，到的样品经过加速稳定性实验6个月，长期稳定性24个月呈现良好的稳定性。
附图说明：
图1：实施例2所得红景天提取物类脂质体粒径分布图；
图2：实施例2所得红景天提取物类脂质体体外释放曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。
实施例中所述磷酸盐缓冲液为Na2HPO4与NaH2PO4摩尔比3:2的混合物。
实施例中所述红景天提取物是根据中国专利CN201310282877.X的具体实施方式中所述方法制备。
实施例中所述高压均质机压力为500bar。
实施例1
本实施例为红景天提取物类脂质体的制备实验，按照以下实施方案制备：
将1.0g的鲸蜡醇硫酸酯钠、1.0g的司盘80和5.0g的胆固醇，加入二氯甲烷40mL、甲醇60mL使其溶解，旋转蒸发形成薄膜；将干燥的薄膜溶于乙醚20mL中，加入红景天提取物1.0g，再加入80mL磷酸盐缓冲液，超声20min，将超声后的溶液中再加入20mL的磷酸盐缓冲液水合，温度控制在60℃，水合后置于40℃恒温水浴振荡器中振荡过夜，制备成红景天类脂质体混悬液；将步骤所得类脂质体混悬液通过高压均质机整粒，期间通过冷却循环水(4℃)降温；在室温将所得类脂质体与2.0g的棉籽糖混合，-80℃预冻24h，冷冻干燥48h，即得。复溶后本例产物的平均粒径为136.42nm。
实施例2
本实施例为红景天提取物类脂质体的制备实验，按照以下实施方案制备：
将0.5g的鲸蜡醇硫酸酯钠、0.5g的司盘80和2.5g的胆固醇，加入二氯甲烷40mL、甲醇60mL使其溶解，旋转蒸发形成薄膜；将干燥的薄膜溶于乙醚20mL中，加入红景天提取物0.5g，再加入80mL磷酸盐缓冲液，超声20min，将超声后的溶液中再加入20mL的磷酸盐缓冲液水合，温度控制在60℃，水合后置于40℃恒温水浴振荡器中振荡过夜，制备成红景天类脂质体混悬液；将步骤所得类脂质体混悬液通过高压均质机整粒，期间通过冷却循环水(4℃)降温；在室温将所得类脂质体与1.0g的棉籽糖混合，-80℃预冻24h，冷冻干燥48h，即得。复溶后本例产物的平均粒径为85.40nm。
实施例3
本实施例为红景天提取物类脂质体的制备实验，按照以下实施方案制备：
将0.6g的鲸蜡醇硫酸酯钠、0.6g的司盘80和3.0g的胆固醇，加入二氯甲烷40mL、甲醇60mL使其溶解，旋转蒸发形成薄膜；将干燥的薄膜溶于乙醚20mL中，加入红景天提取物0.8g，再加入50mL磷酸盐缓冲液，超声20min，将超声后的溶液中再加入50mL的磷酸盐缓冲液水合，温度控制在60℃，水合后置于40℃恒温水浴振荡器中振荡过夜，制备成红景天类脂质体混悬液；将步骤所得类脂质体混悬液通过高压均质机整粒，期间通过冷却循环水(4℃)降温；在室温将所得类脂质体与1.5g的棉籽糖混合，-80℃预冻24h，冷冻干燥48h，即得。复溶后本例产物的平均粒径为108.58nm。
实施例4
本实施例为红景天提取物类脂质体的制备实验，按照以下实施方案制备：
将0.5g的鲸蜡醇硫酸酯钠、0.5g的司盘80和2.5g的胆固醇，加入二氯甲烷40mL、甲醇60mL使其溶解，旋转蒸发形成薄膜；将干燥的薄膜溶于乙醚20mL中，加入红景天提取物0.5g，再加入80mL磷酸盐缓冲液，超声20min，将超声后的溶液中再加入20mL的磷酸盐缓冲液水合，温度控制在60℃，水合后置于40℃恒温水浴振荡器中振荡过夜，制备成红景天类脂质体混悬液；将步骤所得类脂质体混悬液通过高压均质机整粒，期间通过冷却循环水(4℃)降温；在室温将所得类脂质体与1.0g的甘露醇混合，-80℃预冻24h，冷冻干燥48h，即得。复溶后本例产物的平均粒径为113.75nm。
实施例5
本实施例为红景天提取物类脂质体的制备实验，按照以下实施方案制备：
将0.5g的鲸蜡醇硫酸酯钠、0.5g的司盘80和2.5g的胆固醇，加入二氯甲烷40mL、甲醇60mL使其溶解，旋转蒸发形成薄膜；将干燥的薄膜溶于乙醚20mL中，加入红景天提取物0.5g，再加入80mL磷酸盐缓冲液，超声20min，将超声后的溶液中再加入20mL的磷酸盐缓冲液水合，温度控制在60℃，水合后置于40℃恒温水浴振荡器中振荡过夜，制备成红景天类脂质体混悬液；将步骤所得类脂质体混悬液通过高压均质机整粒，期间通过冷却循环水(4℃)降温；在室温将所得类脂质体与1.0g的山梨醇混合，-80℃预冻24h，冷冻干燥48h，即得。复溶后本例产物的平均粒径为122.60nm。
实施例6
本实施例为红景天提取物类脂质体的制备实验，按照以下实施方案制备：
将0.2g的鲸蜡醇硫酸酯钠、0.2g的司盘80和0.3g的胆固醇，加入二氯甲烷40mL、甲醇60mL使其溶解，旋转蒸发形成薄膜；将干燥的薄膜溶于乙醚20mL中，加入红景天提取物0.1g，再加入80mL磷酸盐缓冲液，超声20min，将超声后的溶液中再加入20mL的磷酸盐缓冲液水合，温度控制在60℃，水合后置于40℃恒温水浴振荡器中振荡过夜，制备成红景天类脂质体混悬液；将所得类脂质体混悬液通过高压均质机整粒，期间通过冷却循环水(4℃)降温；在室温将所得类脂质体与0.5g的棉籽糖混合，-80℃预冻24h，冷冻干燥48h，即得。复溶后本例产物的平均粒径为98.59nm。
实施例7
按照实施例2的制备方法，将1.0g的棉籽糖替换为0.5g棉籽糖、0.25g甘露醇和0.25g山梨醇。
实施例8
按照实施例2的制备方法，将二氯甲烷40mL、甲醇60mL替换为二氯甲烷100mL。
实施例9
按照实施例2的制备方法，将二氯甲烷40mL、甲醇60mL替换为甲醇100mL。
测试例1
本测试例为实施例1～9制备所得红景天提取物类脂质体冻干复溶后产物粒径测定实验：
分别取所得溶液1mL，使用马尔文激光粒度分析仪对粒径分布进行测定，其中PDI值为粒径多分散指数，其值越小，代表粒径越均一。
表1粒径及粒度分布结果
如表1所示，实施例2和实施例6中得到类脂质体粒径相对较小，且分布均匀，在一定处方配比范围内，低浓度的药物和非离子表面活性剂有利于减少类脂质体的粒径。实施例2所得类脂质体粒径略小，其粒径分布图如图1所示，实施例2与实施例4和5相比较，在其他条件均相同的前提下，实施例2使用了棉籽糖作为冻干保护剂时，复溶后得到的粒径优于甘露醇组(实施例4)和山梨醇组(实施例5)。实施例7与实施例2、4、5相比较，实施例7使用了棉籽糖、甘露醇、山梨醇质量比2:1:1复配的冻干保护剂，其效果要优于同等条件下单独使用其中任一种。
实施例2与实施例8和实施例9相比较，实施例2使用了二氯甲烷和甲醇体积比2：3复配的混合溶剂，比单独使用其中任一种有机溶剂效果更佳。
测试例2
本测试例为实施例1～9制备所得红景天提取物类脂质体游离药物的测定：
将制备所得类脂质体经过稀释后装入250mL烧杯中。每个透析袋(分子量10000～14000)中装入2.6％(w/v)的甘油水溶液(等渗透析)5mL，搅拌透析24小时后取出透析袋，经离心后HPLC测定透析袋中红景天苷浓度，以红景天苷浓度为指标，计算类脂质体的包封率。色谱条件为：色谱柱KYAHIQ sil C18柱(4.6mm×25cm，5μm)；检测波长280nm；流动相：乙腈-水(体积比1∶9)；流速1mL/min；进样量10μL。实施例1～9组的包封率均在85％以上。
表2类脂质体包封率测定结果
测试例3
本测试例为实施例1～9制备所得红景天提取物类脂质体的溶血性实验：
将家兔背位固定麻醉后，分离颈总动脉插管取血约20mL于离心管中，除去纤维蛋白，加生理盐水摇匀，离心后倾去上清液，如此反复直至上清液不显红色且透明为止，用0.9％氯化钠注射液配成2％红细胞混悬液供溶血实验用。生理盐水作为空白对照，蒸馏水组作为阳性对照，置37℃水浴中，分别观察并记录0.5、1、2、3、4h的结果，观察有无溶血和红细胞凝集现象，并于室温下放置24h，继续观察有无溶血及红细胞凝集发生。溶血结果判断如表3所示，实验结果如下：
表3：溶血结果判断表
溶血程度 标记 现象
全部溶血 + 溶液澄明红色，管底无细胞残留
部分溶血 ± 溶液澄明红色或棕红色，管底有少量红细胞
无溶血 - 红细胞全部下沉，上层液乳白色
表4：体外溶血实验结果
实验结果表明：在37℃水浴中观察0.5-4h内，实施例1～9所得类脂质体组未出现溶血或部分溶血现象，表现为溶液中红细胞全部下沉，未见红细胞凝集。对照组蒸馏水组在各时间点呈明显粉红色，全溶血，未见红细胞凝集。在24h后观察发现，实施例1、实施例4和实施例8组呈现部分溶血现象，试管底部出现了细胞聚集现象。其他几组均未见溶血现象，充分证明了红景天提取物类脂质体对血管无明显刺激想象，同时药物浓度对血管刺激性有一定的影响。
测试例4
本测试例为按照实施例2制备方法所得类脂质体体外释放试验：
取一定量的复溶后的类脂质体混悬液于锥形瓶中，以磷酸盐缓冲液(pH＝6.8)为释放介质，温度为37±1℃，转速为75r/min。分别在10min，20min，30min，1h，2h，3h，6h，12h，24h，48h时测定红景天苷的累积释放量。按下式计算供试品的体外释放率。计算式：体外释放率(％)＝初始包封率(％)-释放试验后的包封率(％)，类脂质体体外释放曲线如附图2所示，结果显示，其在磷酸盐缓冲液(pH＝6.8)中12h内累计释放率达到80％以上，且可持续释放至48h。
测试例5
本测试例为实施例1～9制备所得类脂质体的稳定性实验：将恒温恒湿箱调节至(40±2)OC、相对湿度(75±5)％的考察条件后，将样品放入，并于0、1、2、3、6个月分别取样检测粒径分布及包封率，同时进行长期稳定性实验，于12、24个月取样进行测定。
表5稳定性实验结果

Claims (9)

1.一种红景天提取物类脂质体制剂，其特征在于，其原料由如下重量份的组分组成如下：
2.如权利要求1所述红景天提取物类脂质体制剂，其特征在于：所述冻干保护剂选自甘露醇、山梨醇、蔗糖和棉籽糖中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的所述的红景天提取物类脂质体制剂，其特征在于：所述冻干保护剂为山梨醇或甘露醇、山梨醇、棉籽糖三者的混合物。
4.如权利要求1所述的所述的红景天提取物类脂质体制剂，其特征在于：所述冻干保护剂为甘露醇、山梨醇、棉籽糖三者的混合物，三者的质量比为(1～3)：(1～3)：(1～3)。
5.如权利要求1所述的所述的红景天提取物类脂质体制剂，其特征在于：所述非离子表面活性剂为吐温80、鲸蜡醇硫酸酯钠和司盘80中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的所述的红景天提取物类脂质体制剂，其特征在于：所述非离子表面活性剂为鲸蜡醇硫酸酯钠和司盘80质量比1:3～3:1的混合物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的红景天提取物类脂质体制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将4～60重量份的非离子型表面活性剂和3～50重量份的胆固醇，加入50～1000重量份的有机溶剂使其溶解，旋转蒸发形成干燥的薄膜；
(2)将干燥的薄膜溶于10～400重量份的乙醚中，加入红景天提取物1～10重量份，再加入50～1000重量份磷酸盐缓冲液，超声20min，将超声后的溶液中再加入50～200重量份的磷酸盐缓冲液水合，温度控制在60℃，水合后置于40℃恒温水浴振荡器中振荡过夜，制备成红景天类脂质体混悬液；
(3)将步骤(2)所得类脂质体混悬液通过高压均质机整粒，期间通过冷却循环水降温；
(4)在室温将步骤(3)所得类脂质体与5～20份的冻干保护剂混合，-80℃预冻24h，冷冻干燥48h，即得。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述有机溶剂为二氯甲烷和甲醇中的一种或两种的混合物。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述有机溶剂为二氯甲烷和甲醇体积比2：3的混合物。
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