CN105287406A - 一种丙泊酚脂质体冻干制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙泊酚脂质体冻干制剂及其制备方法，所述制剂由丙泊酚，人工合成磷脂，胆固醇，冻干保护剂制备而成，该制剂采用人工合成磷脂替代天然来源的卵磷脂，从而避免了天然来源的卵磷脂中微量蛋白易导致的过敏现象；而且不含脂肪乳制剂中常用的吐温-80、EDTA-2Na、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等辅料，进一步避免产生过敏现象；其平均粒径小于100nm，避免了传统丙泊酚脂肪乳因粒径大所产生的注射疼痛。

Description

一种丙泊酚脂质体冻干制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体地说涉及一种无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂及其制备方法。

背景技术

丙泊酚(Propofol)，又称为双丙泊酚、异丙酚、2，6-二异丙基苯酚，分子式：C₁₂H₁₈O，分子量：178.3，其化学结构式见图1。

丙泊酚是一种低分子的苯酚衍生物，是可注射的麻醉剂，可诱导和维持全身麻醉，具有起效快、消除迅速、安全性高等优点，今年来广泛用于门诊小手术、胃肠镜查、人工流产等无痛治疗。

由于丙泊酚亲脂性强，难溶于水，所以，目前上市产品主要为丙泊酚脂肪乳剂，所用辅料包括大豆油、中链甘油三酯、卵磷脂、油酸、甘油和注射用水。但是，此乳剂具有一些缺点：

①此乳剂为非均匀相液体制剂，属于热力学及动力学不稳定体系，因此乳剂在长期放置中，乳滴粒子容易合并以致粒径增大、或导致乳剂漂油、分层等不稳定现象；

②此制剂采用天然蛋黄卵磷脂和大豆油作为辅料，它们含有微量蛋黄蛋白和大豆蛋白，容易导致过敏反应；

③此乳剂在制备过程中的高温处理及在长期储存过程中，乳剂中的药物、大豆油及卵磷脂容易被氧化产生降解，从而引起过敏等副作用：丙泊酚结构中存在酚羟基，易被氧化生成2，6-二异丙基-1，4-苯醌或发生聚合反应生成3，3，5，5’-四异丙基联苯酚(化学结构见图2)，这两个杂质具有较大的毒性；

④为了防止丙泊酚被氧化，制剂中常加入EDTA-2Na、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等辅料，但是这些辅料也容易引起过敏反应，尤其是对特发性哮喘患者；

⑤此制剂中的脂肪、磷脂等物质在液态环境中是微生物生产良好的基质，因此在储存和使用中存在细菌和真菌感染的风险，如果使用不当，容易造成感染等后果；

⑥此制剂注射部位的疼痛发生率高达28％～90％，给患者造成了严重影响；

⑦此乳剂静脉给药后容易引起高甘油三酯血症，尤其对于长期接受输液的患者；

⑧此制剂应避免高低温保存，同时不能剧烈振摇，因此该产品不便于运输、存储。

因此，丙泊酚脂肪乳注射液在临床使用上产生了很多不良反应，其中过敏性休克的发生率较高，严重可导致死亡。在2010年，美国食品药品管理局(FDA)表示，由于生产方面的问题迫使梯瓦与HospiraInc(HSP)暂停生产，并召回部分产品。此外，由于丙泊酚注射疼痛高发生率给患者造成了严重影响，因此被美国麻醉界列为当代麻醉7大重要事件之一。所以，开发一种无刺激和无痛的丙泊酚制剂具有重要意义。

申请号为201510021939.0的专利制备了丙泊酚脂肪乳注射液，其克服了初乳粒径偏差过大、乳液易破乳、且高压均质后乳液粒径偏差过大的缺陷，但是它采用天然蛋黄卵磷脂和大豆油作为辅料，容易引起过敏反应。

申请号为201410819727.2的专利制备了丙泊酚脂肪乳注射液，其中不含防腐剂依地酸二钠，减小了制剂的毒副作用，但是它采用的天然蛋黄卵磷脂和大豆油仍会产生过敏现象。

授权公告号为CN101006992B的专利制备了丙泊酚冻干乳，其增加了乳剂的稳定性，但是它采用天然蛋黄卵磷脂和大豆油作为辅料，容易引起过敏反应。

申请号为201410130319.6的专利制备了丙泊酚脂质体，其具有包封率高、载药量高、粒径小的优点，但是它采用乳化剂吐温-80以及天然的蛋黄卵磷脂，容易产生过敏反应。

授权公告号为CN102805728B的专利制备了一种丙泊酚脂肪乳注射液，解决了丙泊酚脂肪乳粒径大、易破乳的问题，同时减轻了注射疼痛，但是它采用吐温-80以及天然的蛋黄卵磷脂和大豆油，容易产生过敏反应。

申请号为201210419120.6的专利制备了一种稳定、高效的丙泊酚中/长链脂肪乳注射液，它比普通的丙泊酚脂肪乳更稳定，同时，能明显减少注射疼痛的发生率，改善了病人的顺应性，但是它含有的天然蛋黄卵磷脂容易产生过敏反应。

授权公告号为CN102552136B的专利制备了一种丙泊酚中/长链注射液，其中不含防腐剂依地酸二钠，减小了制剂的刺激性，但是它采用的天然蛋黄卵磷脂和大豆油仍会产生过敏现象。

申请号为CN104288130A的专利制备了一种注射用丙泊酚组合物，它通过添加助溶剂丙二醇、非离子表面活性剂吐温20、吐温80、聚氧乙烯蓖麻油等增加丙泊酚在制剂中的包封率，减少游离的丙泊酚所产生的注射疼痛，但是它添加的这些辅料会产生过敏刺激性现象。

为了解决丙泊酚注射液在临床所产生的过敏刺激反应和注射疼痛问题，本专利将采取以下措施，同时，对比以上专利，本专利具有以下优势：①将丙泊酚注射液的脂肪乳剂型改为脂质体剂型，此剂型不含市面上丙泊酚脂肪乳注射剂中的大豆油，从根源上避免了大豆油中的微量蛋白导致的过敏现象；②本发明制剂的制备处方中采用人工合成磷脂替代天然来源的卵磷脂，从根源上避免了天然来源的卵磷脂中微量蛋白所导致的过敏现象；③本制剂不含脂肪乳制剂中常用的吐温-80、EDTA-2Na、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等辅料，进一步避免产生过敏现象；④本专利将所得丙泊酚脂质体进一步冻干，在冻干后采用抽真空状态压盖，使得瓶中为负压，彻底避免了丙泊酚及制剂中辅料的氧化降解，同时也有效防止了制剂在保存过程中细菌的生长，从而杜绝了过敏现象；⑤本制剂采用特殊的制备处方和工艺，使得丙泊酚在脂质体中的包封率达到98％以上，以避免游离的丙泊酚所产生的注射疼痛；⑥本制剂制备的丙泊酚脂质体，其平均粒径小于100nm，避免了传统丙泊酚脂肪乳由粒径大所产生的注射疼痛；⑦本发明制剂静脉给药后不会引起高甘油三酯血症；⑧本制剂采用冻干保存，其含水量低，不易被氧化，稳定性好，利于制剂产品的长途运输和长期保存，并能充分发挥脂质体载药系统的优势，降低药物的毒副作用，提高生物利用度。

综上所述，本发明制备的一种无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂，解决了丙泊酚注射液在临床所产生的过敏刺激反应和注射疼痛问题，具有临床安全性高、顺应性好、制剂稳定性高、便于运输和储存等优点。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种无刺激过敏副作用的注射用丙泊酚脂质体冻干制剂；

本发明的第二个目的是提供无注射疼痛的注射用丙泊酚脂质体冻干制剂；

本发明的第三个目的是提供无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂的制备方法。

本发明为了得到一种无刺激和无注射疼痛的丙泊酚脂质体冻干制剂，将从制剂处方和制剂工艺上严格控制：首先，为了减少刺激，本制剂从处方上杜绝使用一些可能引起刺激的原料及辅料，同时，冻干后使所得产品瓶中为负压，从而杜绝外界空气进入，彻底避免了丙泊酚及制剂中辅料的氧化降解，也有效防止了制剂在保存过程中细菌的生长，进一步杜绝了过敏现象；其次，为了减少注射疼痛，本制剂提高了丙泊酚在脂质体中的包封率，以减少丙泊酚的泄露，同时减小制剂的粒径，从而减轻注射疼痛。

对于大多数的脂质体药物制剂，被包裹的药物的药学性质主要由脂类包裹物的组成和浓度所控制。为了形成包封率高的丙泊酚脂质体注射剂，重要的是寻找能与丙泊酚相容性良好、包封率高不渗漏、同时提供适当释放性能的成膜材料，以及寻找能使丙泊酚脂质体稳定的赋形剂成分。

本发明人通过大量的试验研究发现：针对丙泊酚的特点，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻磷脂酰甘油(DMPG)和胆固醇组合应用特别适于作为基础磷脂成膜材料，可以形成品质良好的丙泊酚脂质体注射剂，从而达到本发明的目的。

二棕榈酰磷脂酰胆碱价格相对较低，容易得到，其相变温度较高，易于形成稳定的脂质体膜。为了增加丙泊酚在脂质体中的包封率，增加丙泊酚脂质体的稳定性，本发明人在大量的筛选试验时意外发现：当使用二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻磷脂酰甘油和胆固醇组合时，制备出的丙泊酚脂质体包封率高、稳定性好；而使用除之外的任何磷脂和或胆固醇组合时，均没有获得包封率高的脂质体，所得脂质体在高温40℃、相对湿度75％±5％的加速试验下，粒径、包封率和稳定性等性质较差。

本发明的丙泊酚脂质体注射剂中，相对于1重量份的丙泊酚，二棕榈酰磷脂酰胆碱的用量为2～60重量份。如果二棕榈酰磷脂酰胆碱的用量低于2重量份，则无法形成稳定的脂质体；反之，如果二棕榈酰磷脂酰胆碱的用量高于60重量份，则形成的丙泊酚脂质体粘稠，不易冻干。

本发明的脂质体中，二肉豆蔻磷脂酰甘油为本发明优选的负电荷磷脂，二肉豆蔻磷脂酰甘油与二棕榈酰磷脂酰胆碱相结合使用特别适用于作为丙泊酚脂质体的基础成膜材料，二肉豆蔻磷脂酰甘油有效地增大了脂质体表面的Zeta电位绝对值，使脂质体表面的静电斥力增大，能有效抑制脂质体的聚集。在冻干粉针制备过程中，预冻阶段随着脂质体外水相冰析出，脂质体不断被浓缩，聚集的趋势增大，而加入负电荷磷脂可以有效地阻止此时脂质体的聚集，保证丙泊酚脂质体冻干粉针复溶后的粒径稳定在一定范围内。

本发明的丙泊酚脂质体注射剂中，胆固醇用于调节脂质体的膜稳定性和通透性，以获得稳定的丙泊酚脂质体注射剂和适当的丙泊酚释放。胆固醇是一种很好的脂质膜稳定剂，胆固醇可阻止其凝聚成晶体结构。胆固醇掺入二棕榈酰磷脂酰胆碱和二肉豆蔻磷脂酰甘油的双层，能提高该双层膜之间的化学能，从而提高脂质体的化学稳定性。所以，胆固醇能使脂质体双分子膜固化，从而减少自由基的生成，降低氧化水平，使脂质体稳定性显著增强。

本发明人研究发现，在本发明的丙泊酚脂质体注射剂中，相对于1重量份的丙泊酚，胆固醇的用量为0～30重量份，优选为2-10重量份，所形成的丙泊酚脂质体注射剂的稳定性最好。

本发明通过下述技术方案实现：

一种无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂，其特征在于：由以下组分制成：

本发明所述的人工合成磷脂是：人工合成的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)和聚乙二醇衍生化磷脂(如：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000；二软脂酰胆磷脂-聚乙二醇2000、)二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、人工合成鞘磷脂、磷脂酰酰丝氨酸或磷脂酰甘油中的一种或几种。

所述的冻干保护剂是：甘露醇、山梨酸、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、明胶、单糖(如：葡萄糖、果糖等)或者多糖(如：淀粉、纤维素等)、氨基酸类(如甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、精氨酸等)或者寡肽中的一种或多种。

优选地，本发明的丙泊酚脂质体，其主要由以下重量配比的成分制成：

进一步优选地，本发明的丙泊酚脂质体，其主要由以下重量配比的成分制成：

所述的二棕榈酰磷脂酰胆碱与二肉豆蔻酰磷脂酰甘油之间的重量比优选为1∶1～8∶1，更优选地，二棕榈酰磷脂酰胆碱与二肉豆蔻酰磷脂酰甘油之间的重量比优选为3∶1。

本发明进一步提供所述冻干制剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将处方量的丙泊酚、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、胆固醇溶于有机溶剂中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液加热减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在5000～50000r/min条件下高速分散5～30min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至6.0～9.0，再进行过膜挤压或在压力为400～1500Bar条件下均质1～16次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将处方量的冻干保护剂溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，分装在西林瓶中，-20～-60℃下预冻1～18h，-10～-45℃下一次升华4～260h，0～40℃二次升华1～30h，取出，通氮气封瓶，即得。

所述的有机溶剂是：氯仿、无水乙醇、异丙醇、DMSO、叔丁醇、甲醇、二氯甲烷、丙酮、乙醚中的一种或几种。

本发明的有益效果，主要表现在：本发明的丙泊酚脂质体无注射疼痛和刺激，减少了丙泊酚的毒副作用，提高了制剂的质量和稳定性，冷冻过程中脂质体不会因脱水、融合、冰晶等发生破裂，长期贮存后，丙泊酚脂质体同样保持良好的包封率和稳定性；并且，本发明制备方法简单，适合于工业化大生产。

附图说明

图1是丙泊酚的化学结构

图2是丙泊酚氧化和聚合杂质(A：2,6-二异丙基-1,4-苯醌；B:3,3,5,5’-四异丙基联苯酚)

图3是实施例1.1冻干粉复溶后的粒径及分布图

图4是实施例2.2冻干粉复溶后的粒径及分布图

图5是实施例3.3冻干粉复溶后的粒径及分布图

图6是无刺激和无痛的丙泊酚脂质体的Zeta电位检测结果

图7是无刺激和无痛的丙泊酚脂质体的洗脱曲线

具体实施方式

本发明对无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂的制剂配方中各种辅料的用量范围及制备工艺进行了筛选和验证。下面结合实施例对本发明作详细说明，但不仅限于下列实例。

1、无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂的制备实施例

(1)不同配比人工合成磷脂制备的无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂

例1.1处方：

制备方法：

步骤1：将1g丙泊酚、21g二棕榈酰磷脂酰胆碱、7g二棕榈酰磷脂酰甘油和5g胆固醇溶于无水乙醇中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液60℃水浴减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在10000r/min条件下高速分散5min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至7.0，再进行过膜挤压或在压力为800Bar条件下均质6次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将10g甘露醇溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，每瓶10mL分装在西林瓶中，-40℃下预冻3h，-20℃下一次升华26h，30℃二次升华10h，取出，通氮气封瓶，即得。

例1.2处方：

制备方法：

步骤1：将1g丙泊酚、32g二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、8g二肉豆蔻酰磷脂酰甘油和5g胆固醇溶于氯仿中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液60℃水浴减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在10000r/min条件下高速分散5min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至7.0，再进行过膜挤压或在压力为800Bar条件下均质6次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将10g甘露醇溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，每瓶10mL分装在西林瓶中，-40℃下预冻3h，-20℃下一次升华26h，30℃二次升华10h，取出，通氮气封瓶，即得。

例1.3处方：

制备方法：

步骤1：将1g丙泊酚、18g二棕榈酰磷脂酰胆碱、6g二肉豆蔻酰磷脂酰甘油和5g胆固醇溶于无水乙醇中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液60℃水浴减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在10000r/min条件下高速分散5min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至7.0，再进行过膜挤压或在压力为800Bar条件下均质6次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将10g甘露醇溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，每瓶10mL分装在西林瓶中，-40℃下预冻3h，-20℃下一次升华26h，30℃二次升华10h，取出，通氮气封瓶，即得。

(2)不同配比胆固醇制备的无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂

例2.1处方：

制备方法：

步骤1：将1g丙泊酚、30g二棕榈酰磷脂酰胆碱、8g二棕榈酰磷脂酰甘油溶于异丙醇中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液60℃水浴减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在8000r/min条件下高速分散5min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至7.0，再进行过膜挤压或在压力为800Bar条件下均质6次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将10g甘露醇溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，每瓶10mL分装在西林瓶中，-45℃下预冻2h，-25℃下一次升华30h，30℃二次升华10h，取出，通氮气封瓶，即得。

例2.2处方：

制备方法：

步骤1：将1g丙泊酚、20g二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、5g二肉豆蔻酰磷脂酰甘油和5g胆固醇溶于氯仿中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液60℃水浴减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在12000r/min条件下高速分散5min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至7.0，再进行过膜挤压或在压力为800Bar条件下均质6次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将10g甘露醇溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，每瓶10mL分装在西林瓶中，-45℃下预冻3h，-25℃下一次升华32h，30℃二次升华8h，取出，通氮气封瓶，即得。

例2.3处方：

制备方法：

步骤1：将1g丙泊酚、18g二棕榈酰磷脂酰胆碱、6g二肉豆蔻酰磷脂酰甘油和8g胆固醇溶于无水乙醇中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液60℃水浴减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在10000r/min条件下高速分散8min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至7.0，再进行过膜挤压或在压力为800Bar条件下均质5次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将10g甘露醇溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，每瓶10mL分装在西林瓶中，-40℃下预冻3h，-20℃下一次升华26h，30℃二次升华10h，取出，通氮气封瓶，即得。

(3)不同配比冻干保护剂制备的无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂

例3.1处方：

制备方法：

步骤1：将1g丙泊酚、30g二棕榈酰磷脂酰胆碱、8g二棕榈酰磷脂酰甘油溶于异丙醇中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液60℃水浴减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在8000r/min条件下高速分散5min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至7.0，再进行过膜挤压或在压力为800Bar条件下均质6次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将10g蔗糖溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，每瓶10mL分装在西林瓶中，-45℃下预冻2h，-25℃下一次升华30h，30℃二次升华10h，取出，通氮气封瓶，即得。

例3.2处方：

制备方法：

步骤1：将1g丙泊酚、20g二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、5g二肉豆蔻酰磷脂酰甘油和5g胆固醇溶于氯仿中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液60℃水浴减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在12000r/min条件下高速分散5min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至7.0，再进行过膜挤压或在压力为800Bar条件下均质6次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将8g海藻糖溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，每瓶10mL分装在西林瓶中，-45℃下预冻3h，-25℃下一次升华32h，30℃二次升华8h，取出，通氮气封瓶，即得。

例3.3处方：

制备方法：

步骤1：将1g丙泊酚、18g二棕榈酰磷脂酰胆碱、6g二肉豆蔻酰磷脂酰甘油和8g胆固醇溶于无水乙醇中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液60℃水浴减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在10000r/min条件下高速分散8min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至7.0，再进行过膜挤压或在压力为800Bar条件下均质5次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将10g甘露醇和5g蔗糖溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，每瓶10mL分装在西林瓶中，-40℃下预冻3h，-20℃下一次升华26h，30℃二次升华10h，取出，通氮气封瓶，即得。

2、无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂的质量研究

(1)无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂的粒径及电位检测

采用动态光闪射粒径/电位仪检测以上3个实施例制备出的无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂在冻干前后粒径的变化情况，结果见表1。

表1无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂在冻干前后的粒径变化

*PdI:Polydispersionindex多分散指数(用于衡量粒径分布范围)

由表1可知：以上3个处方和制备工艺得到的粒径均符合要求，且冻干前后平均粒径大小和粒径分布范围均没有明显变化，另外冻干品外观性状、复溶情况均较理想，但是，实施例3.3制备出的丙泊酚脂质体粒径较小，有利于减轻注射疼痛。

本发明继续检测了实施例3.3的电位。测试结果见附图6所示，无刺激和无痛的丙泊酚脂质体的Zeta电位平均值为-32.7mV，见图6，复合要求。

(2)无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂的包封率检测

2.1洗脱曲线的建立

采用葡聚糖凝胶柱层析法分离载药纳米脂质载体，HPLC法测定游离药物的含量。称取葡聚糖凝胶(G50)2.5g，加纯化水水浴加热煮沸溶胀2h，静置溶胀12h。装柱平衡，精密吸取丙泊酚脂质体冻干粉复溶后溶液1mL上样，用纯化水洗脱，流速1.5mL·min^-1，每管1mL，收集洗脱液40管后，改用50％的甲醇洗脱，收集洗脱液40管。洗脱下来的溶液每毫升加无水甲醇2mL，加流动相2mL，涡旋15s，用0.22μm的有机膜过滤后，HPLC法测定，结果在前40mL无游离药物被洗脱出来。洗脱曲线见图7，结果表明，游离药物与包封药物能有效分离。

2.2回收率试验

精密吸取丙泊酚脂质体冻干粉复溶后溶液1mL，按上述方法过柱分离，取全部80mL洗脱液，旋转蒸发浓缩至干，甲醇清洗旋蒸瓶并定容至10mL，超声5min后，HPLC法检测。另取丙泊酚脂质体冻干粉复溶后溶液1mL，甲醇定容至10mL，超声5min后，同法测定，计算柱回收率。结果丙泊酚平均柱回收率为99.62％(n＝3)。

2.3包封率的测定

取丙泊酚脂质体冻干粉复溶后溶液1mL，加无水甲醇2mL，加流动相2mL，涡旋15s用0.22μm的有机膜过滤，HPLC法检测，计算含量，得到丙泊酚脂质体溶液中药物总量＝C总，按上述方法，用纯化水洗脱，收集洗脱液前40mL，旋转蒸发浓缩至干，甲醇清洗旋蒸瓶并定容至10mL，超声5min后，HPLC法检测，计算含量，得到丙泊酚脂质体包封药物的质量浓度C包。丙泊酚脂质体包封率＝C包/C总×100％。结果：上述实施例1.1、2.2、3.3产品的包封率分别为89.23％，78.65％，99.41％。此结果说明：脂质材料的组合选用对丙泊酚脂质体的包封率具有重要影响。并且，当使用本发明优选的成分以外的成分时，或当成分用量不在本发明限定的范围内时，所得的丙泊酚脂质体的包封率均低于本发明，将无法避免因丙泊酚泄露所引起的刺激现象。

(3)无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂的过敏反应检测

3.1试药与动物

试药：Diprivan^TM注射液(市售)，丙泊酚脂质体冻干制剂(自制)，生理盐水对照组(市售)，5％鸡蛋清生理盐水。

动物：供试用的豚鼠应健康合格，体重250-350g，雌鼠应无孕。

3.2检查方法

按《中华人民共和国药典》的方法规定进行试验：取上述豚鼠，随机分成6组，每组6只。每只鼠隔日每次腹腔注射供试品溶液1ml，共注射3次，分别于第1次注射后14日及21日再静脉注射供试品2ml/只，观察豚鼠在注射后15分钟内有否明显的竖毛、兴奋不安、呼吸困难、连续咳嗽、紫绀、呼吸困难、虚脱及窒息死亡等现象。

3.3评价指标

按表2记录相应的反应级别。当反应级别为+、++、+++时，则供试品过敏性试验认为不合格，当反应级别为0，±时，则该供试品过敏试验认为合格。

表2全身过敏性评价实验

3.4结果

本实验设计的阴性对照：0.9％的氯化钠注射液对照组于末次给药10天后，豚鼠均正常，无任何过敏反应发生；本实验的阳性对照：5％的鸡蛋清生理盐水组于末次给药10天后，豚鼠首先出现抓鼻、颤抖、竖毛、呼吸困难、抽搐，最后死亡。本实验检测样品：市售丙泊酚脂肪乳注射液大剂量组出现一例+级反应，有抓鼻、颤抖、竖毛、咳嗽现象；而本发明自制的丙泊酚脂质体冻干制剂(实施例1.3、2.3、3.3)末次给药10天后，豚鼠均无任何症状，无过敏反应。表明本发明制备的丙泊酚脂质体的豚鼠全身过敏性试验结果为阴性，即无致敏性，并且，本发明制剂的安全性优于市售的丙泊酚脂肪乳注射液。

(4)无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂的注射疼痛检测

4.1仪器、试药与动物

仪器：肌电图记录仪(AB-621G)，恒温磁力搅拌器，十万分之一电子分析天平，肌电图同轴针式电极和参比电极(indifferentelectrode)，数显恒温水浴锅。

试药：Diprivan^TM注射液(市售)，丙泊酚脂质体冻干制剂(自制)。

动物：SD大鼠，体质量200～250g雄性。

4.2检测方法

将雄性SD大鼠分成6组，每组6只，乙醚麻醉，仰姿固定于鼠台，除右后腿手术区和电极插入部位，暴露股动脉，将聚乙烯导管插管于大鼠右股动脉，同时固定导管，肌电图用同轴针式电极和参比电极置于右后腿，并连接至肌电图记录仪。

对上述动物模型，本实验通过插管分别给予市售丙泊酚肪乳样品及自制的丙泊酚脂质体冻干样品至大鼠的股动脉，在给药之前开始记录肌电图，直到给药后1小时，肌电图学波形稳定后，分别记录肌电图，并计算肌电图中的峰下面积。以给药被测样品后测定的峰下面积与市售参照药测定的峰下面积的比(肌电图面积比)，来判断被测样品是否优于市售参照药，以(％)表示，当该指数小于100％时，这表明与市售丙泊酚脂肪乳注射剂相比血管疼痛减轻，且指数越小，血管疼痛减轻效果越好。

4.3结果

当给药本发明制备的丙泊酚脂质体冻干制剂时，其肌电图的峰下面积与市售丙泊酚脂肪乳给药后的肌电图峰下面积的比值＜0.5，这说明：对比市售的丙泊酚脂肪乳注射液，本发明制备的丙泊酚脂质体冻干制剂的注射疼痛明显减轻。

(5)无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂的稳定性检测

取上述实施例样品在高温60℃、光照4500Lx条件下放置10天进行影响因素试验考察，结果见表3；在高温40℃、相对湿度75％±5％条件下6个月，进行加速试验考察结果见表4；在温度25℃、相对湿度60％±10％条件下18个月，进行长期试验考察，检测各项质量指标的变化，结果见表5。

表3无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂的影响试验考察(高温60℃、光照4500Lx)

表4无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂的加速试验(高温40℃、相对湿度75％±5％)

表5无刺激和无痛的丙泊酚脂质体冻干制剂长期稳定性(温度25℃、相对湿度60％±10％)

结论：经影响因素10天、加速6个月和长期18个月后，本发明制得的产品质量符合标准要求，而且各项质量指标无明显变化，均符合质量标准，说明了本发明的产品质量稳定性很好。

综合上述结果，使用本发明制备的丙泊酚脂质体冻干制剂有效去除了可能的致敏源，无过敏反应；增加了丙泊酚脂质体的包封率，减少了复溶后水相游离的丙泊酚，降低对血管刺激，同时粒径小，能明显减轻血管注射疼痛。同时，制备方法简单，适合于工业化大生产。

Claims (10)

1.一种丙泊酚脂质体冻干制剂，其特征在于：由以下组分制成：

2.根据权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述的人工合成磷脂选自：人工合成的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)和聚乙二醇衍生化磷脂(如：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000；二软脂酰胆磷脂-聚乙二醇2000等)二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、人工合成鞘磷脂、磷脂酰酰丝氨酸或磷脂酰甘油中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述的冻干保护剂选自：甘露醇、山梨酸、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、明胶、单糖(如：葡萄糖、果糖等)或者多糖(如：淀粉、纤维素等)、氨基酸类(如甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、精氨酸等)或者寡肽中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，由以下组分制成：

5.根据权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，由以下组分制成：

6.根据权利要求2或3的任何一项冻干制剂，其特征在于，所述的二棕榈酰磷脂酰胆碱与二肉豆蔻酰磷脂酰甘油之间的重量比为1∶1～8∶1。

7.根据权利要求2或3的任何一项冻干制剂，其特征在于，所述的二棕榈酰磷脂酰胆碱与二肉豆蔻酰磷脂酰甘油之间的重量比为为3∶1。

8.权利要求1所述的冻干制剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将丙泊酚、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、胆固醇溶于有机溶剂中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液加热减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在5000～50000r/min条件下高速分散5～30min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至6.0～9.0，再进行过膜挤压或在压力为400～1500Bar条件下均质1～16次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将处方量的冻干保护剂溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，分装在西林瓶中，-20～-60℃下预冻1～18h，-10～-45℃下一次升华4～260h，0～40℃二次升华1～30h，取出，通氮气封瓶，即得。

9.权利要求8所述的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自：氯仿、无水乙醇、异丙醇、DMSO、叔丁醇、甲醇、二氯甲烷、丙酮、乙醚中的一种或几种。

10.根据权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，由以下组分制成：

制备方法：

步骤1：将1g丙泊酚、18g二棕榈酰磷脂酰胆碱、6g二肉豆蔻酰磷脂酰甘油和5g胆固醇溶于无水乙醇中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液60℃水浴减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在10000r/min条件下高速分散5min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至7.0，再进行过膜挤压或在压力为800Bar条件下均质6次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将10g甘露醇溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，每瓶10mL分装在西林瓶中，-40℃下预冻3h，-20℃下一次升华26h，30℃二次升华10h，取出，通氮气封瓶，即得；

或

制备方法：

步骤1：将1g丙泊酚、18g二棕榈酰磷脂酰胆碱、6g二肉豆蔻酰磷脂酰甘油和8g胆固醇溶于无水乙醇中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液60℃水浴减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在10000r/min条件下高速分散8min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至7.0，再进行过膜挤压或在压力为800Bar条件下均质5次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将10g甘露醇溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，每瓶10mL分装在西林瓶中，-40℃下预冻3h，-20℃下一次升华26h，30℃二次升华10h，取出，通氮气封瓶，即得；

或

制备方法：

步骤1：将1g丙泊酚、18g二棕榈酰磷脂酰胆碱、6g二肉豆蔻酰磷脂酰甘油和8g胆固醇溶于无水乙醇中，搅拌使其溶解，然后将形成的溶液60℃水浴减压去除有机溶剂，制备成含有丙泊酚的均匀脂质体薄膜；

步骤2：在氮气保护下缓慢滴加注射用水至步骤1所得的脂质体薄膜中，在10000r/min条件下高速分散8min，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，然后用0.1mol/LNaOH或HCL调节pH至7.0，再进行过膜挤压或在压力为800Bar条件下均质5次，得到均匀的丙泊酚脂质体溶液；

步骤3：无菌条件下，将10g甘露醇和5g蔗糖溶于注射用水中，然后加入到丙泊酚脂质体中，加注射用水定容，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，通氮气，每瓶10mL分装在西林瓶中，-40℃下预冻3h，-20℃下一次升华26h，30℃二次升华10h，取出，通氮气封瓶，即得。