CN101411690B - 2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂及其制备方法，可有效解决2-甲氧基雌二醇其水溶性差，半衰期短，口服生物利用度低的问题，其解决的技术方案是，本发明2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂是由以重量比计的：2-甲氧基雌二醇1份、磷脂3～100份、胆固醇1～30份，表面活性剂及冻干保护剂作原料制成，所说的冻干保护剂的加入量，按磷脂重量比计算，1份磷脂加入0.1～10份冻干保护剂，表面活性剂加入量为冻干粉针剂总量的0.2～5％。由上述组分作原料制成的冻干粉针剂，可由薄膜分散法、逆相蒸发法、注入法三种制备方法实现，含药物量高，适合静脉给药，具有缓释能力和体内靶向性等优点，可克服口服制剂的缺陷，安全可靠，具有巨大的经济效益和社会效益。

Description

2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂及其制备方法

一、技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种水难溶性抗肿瘤药物2-甲氧基雌二醇和其生理相容性好的辅料构成的纳米脂质体复合物：2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂及其制备方法。

二、背景技术

2-甲氧基雌二醇(1，3，5-三烯-2，3，17β-三羟基-2-甲醚甾醇)简称2-ME，是一种甾体激素类化合物，属于新型激素类抗肿瘤药物，是天然甾体化合物在体内的一生理代谢产物，研究表明其具有非常显著的抗肿瘤活性。可诱导肿瘤和内皮细胞凋亡(Lin H.L.等.Cancer.92(2001)：500-509)，具有抑制新生血管形成和肿瘤细胞生长的作用(Barchiesi F.等.Circ.Res.99(2006)：266-274)，研究表明其具有非常显著的抗肿瘤活性(骨髓瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌等)。文献报道其对骨髓瘤细胞的抑制存在着时间依赖性，10μmol/L时作用最强(Dingli D.等.Clin Cancer Res.8(2002)：3948-3954)，这要求2-甲氧基雌二醇在临床使用中达到有效的血药浓度，并能长时间持续一个有效浓度。2-甲氧基雌二醇水溶性差，半衰期短，口服生物利用度低(IresonCR，Br.J.Cancer 90(2004)：932-937)，且口服无规律，药代动力学表明与服用剂量间缺乏相关性(James J等，Invest New Drugs，25(2006)：41-48)。目前该药物在国外尚未上市，2-ME脂质体静脉给药可解决口服制剂的缺点，综合多方面的因素，开展该药的新剂型设计是必要。

2-甲氧基雌二醇在水中溶解度只有2μg/ml(Kashappa GH.等，Eur J PharmBiopharm.70(2008)：187-198)，属水中难溶性药物，常规单日给药剂量达400mg以上，若使用增溶剂增溶，易引起溶血和过敏反应，并缺乏缓释和靶向性。脂质体作为新型的纳米药物载体，具有天然的体内生物靶向性。静脉注射脂质体后，可迅速被网状内皮细胞摄取。因此，用脂质体包封该药物，可改变药物的体内分布，不仅能有效地抑制肿瘤生长，同时也可降低毒性。

三、发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明的目的就在于提供一种2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂及其制备方法，可有效解决2-甲氧基雌二醇其水溶性差，半衰期短，口服生物利用度低的问题，其解决的技术方案是，本发明2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂是由以重量比计的：2-甲氧基雌二醇1份、磷脂3～100份、胆固醇1～30份，表面活性剂及冻干保护剂作原料制成，所说的冻干保护剂的加入量，按磷脂重量比计算，1份磷脂加入0.1～10份冻干保护剂，表面活性剂加入量为冻干粉针剂总量的0.2～5％。

所说的磷脂可选择天然磷脂(卵磷脂，蛋黄磷脂，大豆磷脂)或合成、半合成磷脂(氢化大豆卵磷脂，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)。

胆固醇可以是普通胆固醇或聚乙二醇修饰的胆固醇。

表面活性剂可以是吐温-80、司盘、去氧胆酸钠、泊洛沙姆-188、泊洛沙姆-338、泊洛沙姆-407等。

冻干保护剂选自蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇或海藻糖任何中的一种或是两种以上的组合。

由上述组分作原料制成的冻干粉针剂，可由以下制备方法实现：

1、薄膜分散法：具体是，取以重量比计的：2-甲氧基雌二醇1份、磷脂3～100份、胆固醇1～30份，表面活性剂及冻干保护剂作原料，其中首先取处方量磷脂、胆固醇和2-甲氧基雌二醇用2～50ml有机溶剂溶解，在旋转蒸发仪上减压蒸馏除尽有机溶剂成均匀薄膜，然后在30～50℃条件下加入处方量的表面活性剂溶解于1～40ml 0.01～0.30mol/L的pH4.0～8.0缓冲溶液，继续旋转至脂膜水化成乳白色脂质体悬液，加入冻干保护剂，再通过高压乳匀机三次以上(通过高压乳匀机的次数和脂质体的粒径和均匀性有关)，操作压力5～20kpsi，或超声粉碎机超声三次以上(超声次数、时间、功率和脂质体粒径大小及均匀性有关)，操作功率300～700W，超声时间2～10s，Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥，得冻干粉针剂。

2、逆相蒸发法：具体是，取以重量比计的：2-甲氧基雌二醇1份、磷脂3～100份、胆固醇1～30份，表面活性剂及冻干保护剂作原料，其中首先取处方量磷脂、胆固醇和2-甲氧基雌二醇用2～50ml有机溶剂溶解，组成有机相，在30～50℃条件下，另将处方量的表面活性剂溶解于1～40ml 0.01～0.30mol/L的pH4.0～8.0缓冲溶液，构成水相，将有机相与水相混合成乳液，在旋转蒸发仪上减压蒸馏除尽有机溶剂，得乳白色脂质体悬液，加入冻干保护剂，再通过高压乳匀机三次以上(通过高压乳匀机的次数和脂质体的粒径和均匀性有关)，操作压力5～20k psi，或超声粉碎机超声三次以上(超声次数、时间、功率和脂质体粒径大小及均匀性有关)，操作功率300～700W，超声时间2～10s，Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥，得冻干粉针剂。

3、注入法：具体是，取以重量比计的：2-甲氧基雌二醇1份、磷脂3～100份、胆固醇1～30份，表面活性剂及冻干保护剂作原料，其中首先取处方量磷脂、胆固醇和2-甲氧基雌二醇用2～50ml有机溶剂溶解，组成有机相，在30～50℃条件下，另将处方量的表面活性剂溶解于1～40ml 0.01～0.30mol/L的pH4.0～8.0缓冲溶液，构成水相；将有机相缓慢注入到水相，在100～3000rpm磁力搅拌下除尽有机溶剂，得乳白色脂质体悬液，加入冻干保护剂，再通过高压乳匀机三次以上(通过高压乳匀机的次数和脂质体的粒径和均匀性有关)，操作压力5～20k psi，或超声粉碎机超声三次以上(超声次数、时间、功率和脂质体粒径大小及均匀性有关)，操作功率300～700W，超声时间2～10s，Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥，得冻干粉针剂。

通过薄膜分散法、逆相蒸发法、注入法制备得冻干粉针剂，再加入注射用水复溶，能以任意比例与注射用水稀释给药，测得包封率50～90％，粒径50nm～1μm。

有机溶剂可以是氯仿、乙醇、丙酮、乙醚等。

所说的缓冲溶液可以是碳酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液，如磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲溶液)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、碳酸-碳酸钠缓冲溶液。

要指出的是，按上述组分比及制备方法可以生产任意量的本发明冻干粉针剂，还可按上述组分比及制备方法由工业化生产任意量的本发明冻干粉针剂。

本发明所得的2-甲氧基雌二醇脂质体单位体积内含药物量高，表明本发明的配方和工艺可使脂质体达到高的包封率，稳定的载药量，制备的冻干粉针剂既能提高药物贮存的稳定性，加入注射溶剂后又能快速分散而不发生聚沉，适合静脉给药，具有缓释能力和体内靶向性等优点，可克服口服制剂的缺陷，安全可靠，具有巨大的经济效益和社会效益。

四、具体实施方式

以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1：

称取2-甲氧基雌二醇20mg、蛋黄卵磷脂500mg和胆固醇250mg，用20ml乙醚溶解，15mg泊洛沙姆-188溶解在20ml PBS缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液)中，然后在30～50℃条件下把乙醚相匀速缓慢注射到缓冲溶液中，磁力搅拌挥尽乙醚，得乳白色脂质体悬液，将1000mg海藻糖溶解在脂质体悬液中，再通过高压乳匀机三次或超声粉碎处理得到脂质体，Co-60灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥，得冻干粉针剂，将冻干粉针剂用注射用水复溶，测得包封率为85％，平均粒径为200nm，Zeta电位-25mV。

本实施例产品体外释放结果见表1，结果表明该制剂具有缓释能力。大鼠体内分布结果见表2，表明具有较好的靶向能力。

实施例2：

称取2-甲氧基雌二醇20mg、蛋黄卵磷脂500mg和胆固醇150mg，用20ml乙醚溶解，37-45℃旋转蒸发除去乙醚，成膜后，加入20mlpH6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(含15mg泊洛沙姆-188)水化，将500mg蔗糖和500mg乳糖溶解在脂质体悬液中，超声即得脂质体，Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥，得冻干粉针剂，将冻干粉针剂用注射用水复溶，测得包封率为80％，平均粒径为340nm，Zeta电位-30mV。

本实施例产品体外释放结果见表1，结果表明该制剂具有缓释能力。大鼠体内分布结果见表2，表明具有较好的靶向能力。

实施例3：

称取2-甲氧基雌二醇20mg、蛋黄卵磷脂1000mg和胆固醇200mg，用30ml乙醚溶解，20ml pH6.0的碳酸-碳酸钠缓冲溶液(含25mg泊洛沙姆-188)，超声成乳，于旋转薄膜上减压蒸发除去有机溶剂，使成胶态，继续旋转蒸发形成乳白色悬液。将1000mg葡萄糖溶解在脂质体悬液中，通过高压乳匀机三次或超声粉碎处理减小粒径，即得脂质体，Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥得冻干粉针剂，将冻干粉针剂用注射用水复溶，测得包封率为55％，平均粒径为208nm，Zeta电位-35mV。

本实施例产品体外释放结果见表1，结果表明该制剂具有缓释能力。大鼠体内分布结果见表2，表明具有较好的靶向能力。

实施例4：

称取2-甲氧基雌二醇20mg、二棕榈酰磷脂酰胆碱420mg和胆固醇100mg，用20ml乙醚溶解，5mg泊洛沙姆溶解在30ml PBS缓冲溶液中，然后在40-50℃条件下把乙醚相均速缓慢注射到缓冲溶液中，磁力搅拌挥尽乙醚，得乳白色脂质体悬液，将1000mg乳糖溶解在脂质体悬液中，再通过高压乳匀机三次或超声粉碎处理减小粒径，得到脂质体，Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥得冻干粉针剂，将冻干粉针剂用注射用水复溶，测得包封率为65％，平均粒径为280nm，Zeta电位-18mV。

本实施例产品体外释放结果见表1，结果表明该制剂具有缓释能力。大鼠体内分布结果见表2，表明具有较好的靶向能力。

上述实施例列表如下：

表1  各实施例体外释放结果(％)

表2  各实施例大鼠体内分布靶向性评价

实施例5：

称取2-甲氧基雌二醇20mg、大豆卵磷脂500mg和胆固醇100mg，用10ml乙醚溶解，37-45℃旋转蒸发除去乙醚，成膜后，加入20ml pH6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液20ml(含15mg泊洛沙姆)水化，将400mg蔗糖和600mg乳糖溶解在脂质体悬液中，超声即得脂质体，Co-60灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥得冻干粉针剂，将冻干粉针剂用注射用水复溶，测得包封率为50％，平均粒径为140nm，Zeta电位-20mV。

实施例6：

称取2-甲氧基雌二醇20mg、大豆卵磷脂1000mg和胆固醇150mg，用30ml乙醚溶解，20mlpH6.0的碳酸-碳酸钠缓冲溶液(含25mg泊洛沙姆)，超声成乳，于旋转薄膜上减压蒸发除去有机溶剂，使成胶态，继续旋转蒸发形成乳白色悬液，将1000mg葡萄糖溶解在脂质体悬液中，经微射流减小粒径，即得脂质体，Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥得冻干粉针剂，将冻干粉针剂用注射用水复溶，测得包封率为50％，平均粒径为278nm，Zeta电位-24mV。

实施例7：

称取2-甲氧基雌二醇20mg、二硬脂酰磷脂酰胆碱420mg和胆固醇100mg，用15ml乙醇溶解，5mg泊洛沙姆溶解在30ml PBS缓冲溶液中，然后在40-50℃条件下把乙醚相均速缓慢注射到缓冲溶液中，磁力搅拌挥尽乙醇，得乳白色脂质体悬液，将1000mg乳糖溶解在脂质体悬液中，再超声粉碎处理得到脂质体。Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥得冻干粉针剂，将冻干粉针剂用注射用水复溶，测得包封率为55％，平均粒径为380nm，Zeta电位-20mV。

实施例8：

称取2-甲氧基雌二醇20mg、二硬脂酰磷脂酰胆碱500mg和胆固醇100mg，用20ml乙醇溶解，40℃旋转蒸发除去乙醇，成膜后，加入20ml pH6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液20ml(含15mg泊洛沙姆)水化，得乳白色脂质体悬液，将400mg蔗糖和600mg乳糖溶解在脂质体悬液中，超声即得脂质体。Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥得冻干粉针剂，将冻干粉针剂用注射用水复溶，测得包封率为60％，平均粒径为340nm，Zeta电位-18mV。

实施例9：

称取2-甲氧基雌二醇250mg、二硬脂酰磷脂酰胆碱1000mg和胆固醇150mg，用30ml乙醇溶解，20ml pH6.0的碳酸-碳酸钠缓冲溶液(含25mg泊洛沙姆)，超声成乳，于旋转薄膜上减压蒸发除去有机溶剂，使成胶态，继续旋转蒸发形成乳白色混悬液，将1000mg葡萄糖溶解在脂质体悬液中，再通过高压乳匀机三次或超声粉碎处理减小粒径，即得脂质体。Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥得冻干粉针剂，将冻干粉针剂用注射用水复溶，测得包封率为60％，平均粒径为378nm，Zeta电位-22mV。

实施例10：

称取2-甲氧基雌二醇20mg、氢化大豆磷脂420mg、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇50mg和胆固醇40mg，用10ml乙醇溶解，5mg泊洛沙姆溶解在30ml PBS缓冲溶液中，然后在40-50℃条件下把乙醇相均速缓慢注射到缓冲溶液中，磁力搅拌挥尽乙醚，得乳白色脂质体悬液，将1000mg乳糖溶解在脂质体悬液中，再超声粉碎处理得到脂质体。Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥得冻干粉针剂，将冻干粉针剂用注射用水复溶，测得包封率为53％，平均粒径为180nm，Zeta电位-23mV。

实施例11：

称取2-甲氧基雌二醇20mg、氢化大豆磷脂500mg、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇60mg和胆固醇100mg，用10ml乙醇溶解，37-45℃旋转蒸发除去乙醇，成膜后，加入20ml pH6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液20ml(含15mg泊洛沙姆)水化，得乳白色脂质体悬液，将600mg蔗糖和400mg乳糖溶解在脂质体悬液中，再通过高压乳匀机三次或超声粉碎处理减小粒径，即得脂质体。Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥得冻干粉针剂，将冻干粉针剂用注射用水复溶，测得包封率为65％，平均粒径为380nm，Zeta电位-27mV。

实施例12：

称取2-甲氧基雌二醇20mg、氢化大豆磷脂1000mg、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20mg和胆固醇150mg，用30ml乙醇溶解，20ml pH6.0的碳酸-碳酸钠缓冲溶液(含25mg泊洛沙姆)，超声成乳，于旋转薄膜上减压蒸发除去有机溶剂，使成胶态，继续旋转蒸发形成乳白色悬液，将1000mg葡萄糖溶解在脂质体悬液中，再通过高压乳匀机乳匀三次或超声粉碎处理减小粒径，即得脂质体。Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥。将冻干粉用注射用水复溶，测得包封率为70％，平均粒径为350nm，Zeta电位-27mV。

本发明冻干粉针剂用0.9％的生理盐水为释放介质，将供试品置于透析袋中，用中国药典的转篮法进行体外释药研究，结果表明体外释药具有缓释能力，刚好能满足2-甲氧基雌二醇的时间剂量动力学治疗需求。

本发明冻干粉针剂用大鼠尾静脉给药进行体内分布研究，采用2-甲氧基雌二醇的聚氧乙烯氢化蓖麻油乙醇溶液为对照，用相对摄取率 $r_e=\frac{{\left({\mathrm{AUC}}_i\right)}_P}{{\left({\mathrm{AUC}}_i\right)}_S}$ 评价其靶向效率(r_e表示样品靶器官药时曲线下面积和对照样品靶器官药时曲线下面积的比值)，结果表明2-甲氧2基雌二醇易浓集于肝、脾、肺、脑、乳腺等器官。本发明是由2-甲氧基雌二醇和生理相容性好的药用辅料组成，其制剂组成及制备方法设计合理，载体选择面广、药物包封率高、稳定性好，是一种适合静脉给药并具有体内缓释、被动靶向能力的纳米药物，可克服口服吸收差、生物利用度低的缺点，安全、可靠，具有广阔的市场应用前景。

Claims (8)

1.一种2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂，其特征在于，由以重量比计的：2-甲氧基雌二醇1份、磷脂3～100份、胆固醇1～30份，表面活性剂及冻干保护剂作原料制成，所说的冻干保护剂的加入量，按磷脂重量比计算，1份磷脂加入0.1～10份冻干保护剂，表面活性剂加入量为冻干粉针剂总量的0.2～5％。

2.根据权利要求1所述的2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂，其特征在于：所说的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的一种。

3.根据权利要求1所述的2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂，其特征在于，所说的表面活性剂为吐温-80、司盘、去氧胆酸钠、泊洛沙姆-188、泊洛沙姆-338、泊洛沙姆-407中的一种；所说的冻干保护剂为蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇或海藻糖中的一种或是两种以上的组合。

4.权利要求1所述的2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，采用薄膜分散法：具体是，取以重量比计的：2-甲氧基雌二醇1份、磷脂3～100份、胆固醇1～30份，表面活性剂及冻干保护剂作原料，其中首先取磷脂、胆固醇和2-甲氧基雌二醇用2～50ml有机溶剂溶解，在旋转蒸发仪上减压蒸馏除尽有机溶剂成均匀薄膜，然后在30～50℃条件下加入表面活性剂溶解于1～40ml 0.01～0.30mol/L的pH4.0～8.0缓冲溶液，继续旋转至脂膜水化成乳白色脂质体悬液，加入冻干保护剂，再通过高压乳匀机三次以上，操作压力5～20k psi，或超声粉碎机超声三次以上，操作功率300～700W，超声时间2～10s，Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥，得冻干粉针剂。

5.权利要求1所述的2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，采用逆相蒸发法：具体是，取以重量比计的：2-甲氧基雌二醇1份、磷脂3～100份、胆固醇1～30份，表面活性剂及冻干保护剂作原料，其中首先取磷脂、胆固醇和2-甲氧基雌二醇用2～50ml有机溶剂溶解，组成有机相，在30～50℃条件下，另将表面活性剂溶解于1～40ml 0.01～0.30mol/L的pH4.0～8.0缓冲溶液，构成水相，将有机相与水相混合成乳液，在旋转蒸发仪上减压蒸馏除尽有机溶剂，得乳白色脂质体悬液，加入冻干保护剂，再通过高压乳匀机三次以上，操作压力5～20k psi，或超声粉碎机超声三次以上，操作功率300～700W，超声时间2～10s，Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥，得冻干粉针剂。

6.权利要求1所述的2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，采用注入法：具体是，取以重量比计的：2-甲氧基雌二醇1份、磷脂3～100份、胆固醇1～30份，表面活性剂及冻干保护剂作原料，其中首先取磷脂、胆固醇和2-甲氧基雌二醇用2～50ml有机溶剂溶解，组成有机相，在30～50℃条件下，另将表面活性剂溶解于1～40ml 0.01～0.30mol/L的pH4.0～8.0缓冲溶液，构成水相；将有机相缓慢注入到水相，在100～3000rpm磁力搅拌下除尽有机溶剂，得乳白色脂质体悬液，加入冻干保护剂，再通过高压乳匀机三次以上，操作压力5～20k psi，或超声粉碎机超声三次以上，操作功率300～700W，超声时间2～10s，Co-60辐照灭菌，用西林瓶进行分装，冷冻干燥，得冻干粉针剂。

7.根据权利要求4或5或6所述的2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，所说的冻干粉针剂，加入注射用水复溶，测得包封率50～90％，粒径50nm～1μm。

8.根据权利要求4或5或6所述的2-甲氧基雌二醇脂质体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，所说的有机溶剂为是氯仿、乙醇、丙酮、乙醚中的一种；所说的缓冲溶液为碳酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液中的一种。