CN105988003A - 一种全程c反应蛋白测定试剂盒及其应用 - Google Patents
一种全程c反应蛋白测定试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种全程C反应蛋白测定试剂盒及其应用,该试剂盒包括如下组分:M试剂、R1试剂、R2试剂、碱性预处理液、预激发液和激发液,M试剂含有0.5~1mg/mL的包被了第一抗体的磁性微粒、0.5~1%酪蛋白和0.5~1%牛血清白蛋白,溶剂为pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液,其中第一抗体的包被量为5~15μg/mg磁性微粒;R1试剂为浓度为10~20mM的HCl溶液;R2试剂含有包被了第二抗体的吖啶酯、0.5~1%酪蛋白和0.5~1%牛血清白蛋白,溶剂为pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液,其中第二抗体的包被量为5~15μg/mL吖啶酯;碱性预处理液为浓度为20~50mM的NaOH溶液;本发明的试剂盒在反应过程中加入强碱,对蛋白进行破坏,然后再加入强酸进行中和,可以试剂的检测范围达到0.02mg/L~100mg/L,使试剂能达到检测C反应蛋白全程的要求。
Description
技术领域
本发明属于化学发光免疫分析技术领域,具体涉及一种全程C反应蛋白测定试剂盒及其应用。
背景技术
免疫分析技术现在在生物医学领域内的应用非常广泛,并已经在临床诊断、环境及卫生检测、法医鉴定、食品安全等诸多领域中已经成为必备的常规技术手段,发挥着不可替代的作用,具有巨大的市场。而免疫分析试剂所采用的信号系统对于免疫分析试剂的性能起着决定性的作用,从放射免疫分析(RIA)到酶联免疫吸附分析(ELISA)再到化学发光免疫分析(CLIA),免疫分析技术的发展和进步,主要就是信号系统的进步和革命,免疫分析技术使用抗原和抗体以及它们的各种结合物这一免疫反应的基础并没有变化,因此如何获得更强、更灵敏以及更稳定的信号就显得致关重要。
C-反应蛋白(C-Reactive protein,CRP)是一种能与肺炎链球菌C多糖体反应形成复合物的急性时相反应蛋白,分子量为105500D,半衰期19小时;由含有五个相同的未糖基化的多肽亚单位组成,每个亚单位含有187个氨基酸,这些亚单位间通过非共价键连结成环状的五聚体,并有一个链间二硫键。血清CRP由肝脏合成,白细胞介素1b、6以及肿瘤坏死因子是其合成的最重要的调节因子;1930年,Tillett和Francis首次在急性大叶性肺炎患者的血清中发现一种能在Ca2+存在时与肺炎球菌细胞壁中的C多糖发生特异性沉淀反应的物质。1941年,Avery等测知它是一种蛋白质,故称为C反应蛋白(CRP)。
传统观点认为CRP是一种非特异的炎症标志物,但近十年的研究揭示了CRP直接参与了炎症与动脉粥样硬化等心血管疾病,并且是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。因此CRP含量就可以作为两种疾病的诊断标准,并且参考值范围不同,具体如下:
CRP在健康人血清中浓度很低(<3mg/L),而在细菌感染或组织损伤时,其浓度显著升高。
CRP值为10~50mg/L表示轻度炎症,例如局部细菌性感染(如膀胱炎、支气管炎、脓肿)、手术和意外创伤、心肌梗死、深静脉血栓、非活动性结缔组织病、许多恶性肿瘤和多数病毒感染。
CRP值升为100mg/L左右表示较严重的疾病,它的炎症程度必要时需静脉注射。
CRP值大于100mg/L,表示严重的疾病过程并常表示细菌感染的存在。
而现有技术中的试剂盒均不能同时囊括上述参考范围,造成了应用的限制,增加了诊断分析成本。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷提供一种全程C反应蛋白测定试剂盒。
本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的检测方法。
本发明的具体技术方案如下:
一种全程C反应蛋白测定试剂盒,包括如下组分:
M试剂,含有0.5~1mg/mL的包被了第一抗体的磁性微粒、0.5~1%酪蛋白和0.5~1%牛血清白蛋白,溶剂为pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液,其中第一抗体的包被量为5~15μg/mg磁性微粒;
R1试剂,浓度为10~20mM的HCl溶液;
R2试剂,含有包被了第二抗体的吖啶酯、0.5~1%酪蛋白和0.5~1%牛血清白蛋白,溶剂为pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液,其中第二抗体的包被量为5~15μg/mL吖啶酯;
碱性预处理液,浓度为20~50mM的NaOH溶液;
预激发液和激发液
上述第一抗体和第二抗体均为能与C反应蛋白特异性反应的单克隆抗体。
在本发明的一个优选实施方案中,所述R1试剂为浓度10mM的HCl溶液。
在本发明的一个优选实施方案中,所述碱性预处理液为浓度20mM的NaOH溶液。
在本发明的一个优选实施方案中,所述M试剂的制备方法为:将所述第一抗体与磁性微粒混合于pH=5.0~6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液中,于25℃~37℃包被1~3h,在加入pH=8.0~9.0的0.1%~0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液终止1~3h,将其中包被后的磁性微粒分离后分散于pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液中,再加入酪蛋白和牛血清白蛋白,即得M试剂。
在本发明的一个优选实施方案中,所述包被了抗体的吖啶酯的制备方法为:将所述第二抗体与吖啶酯混合于pH=8.0~9.0的磷酸盐缓冲液中,于25℃~37℃包被1~3h,在加入pH=8.0~9.0的含0.1%~0.5%牛血清白蛋白的Tris缓冲液终止1~3h,得母液,将该母液用pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液稀释至1:100~500,即得R2试剂。
在本发明的一个优选实施方案中,所述预激发液为1%(w/v)过氧化氢溶液。
在本发明的一个优选实施方案中,所述激发液为1mol/L氢氧化钠溶液。
一种应用上述全程C反应蛋白测定试剂盒进行检测的方法,包括如下步骤:
(1)用100~120μL碱性预处理液处理20~30μL样本;
(2)按1:2~3:5~7的体积比在反应孔中依次加入预处理后的样本、M试剂和R1试剂,孵育15~20min;
(3)步骤(2)的孵育结束后,用含0.05~0.08%的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤,再加入20~25μLR2试剂,孵育10~15min;
(4)步骤(3)的孵育结束后,用含0.05~0.08%的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤,加入预激发液100~200μL,进行预激发;
(5)去除预激发液,加入激发液100~200μL,进行激发和检测。
在本发明的一个优选实施方案中,所述步骤(2)中M试剂和R1试剂的加样间隔为0~4min。
本发明的有益效果是:本发明的试剂盒在反应过程中加入强碱,对蛋白进行破坏,然后再加入强酸进行中和,可以试剂的检测范围达到0.02mg/L~100mg/L,使试剂能达到检测C反应蛋白全程的要求。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
下述实施例中的全程C反应蛋白测定试剂盒,其特征在于:包括如下组分:
M试剂,含有0.5~1mg/mL的包被了第一抗体的磁性微粒、0.5~1%酪蛋白和0.5~1%牛血清白蛋白,溶剂为pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液,其中第一抗体的包被量为5~15μg/mg磁性微粒,上述磁性微粒购自Thermo,为纳米级的超顺磁颗粒,其核心为Fe3O4,该试剂制备方法为:将所述第一抗体与磁性微粒混合于pH=5.0~6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液中,于25℃~37℃包被1~3h,在加入pH=8.0~9.0的0.1%~0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液终止1~3h,将其中包被后的磁性微粒分离后分散于pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液中,再加入酪蛋白和牛血清白蛋白,即得;
R1试剂,浓度为10~20mM的HCl溶液;
R2试剂,含有包被了第二抗体的吖啶酯、0.5~1%酪蛋白和0.5~1%牛血清白蛋白,溶剂为pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液,其中第二抗体的包被量为5~15μg/mL吖啶酯,该试剂的制备方法为:将所述第二抗体与吖啶酯混合于pH=8.0~9.0的磷酸盐缓冲液中,于 25℃~37℃包被1~3h,在加入pH=8.0~9.0的含0.1%~0.5%牛血清白蛋白的Tris缓冲液终止1~3h,得母液,将该母液用pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液稀释至1:100~500,即得;
碱性预处理液,浓度为20~50mM的NaOH溶液;
预激发液,为1%(w/v)过氧化氢溶液
和激发液,为1mol/L氢氧化钠溶液
上述第一抗体和第二抗体均为能与C反应蛋白特异性反应的单克隆抗体,其中第一抗体为10C11,第二抗体为7D9,均购自厦门万泰沧海生物技术有限公司。
上述全程C反应蛋白测定试剂盒进行检测的方法,包括如下步骤:
(1)用100~120μL碱性预处理液处理20~30μL样本;
(2)按1:2~3:5~7的体积比在反应孔中依次加入预处理后的样本、M试剂和R1试剂,孵育15~20min;
(3)步骤(2)的孵育结束后,用含0.05~0.08%的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤,再加入20~25μLR2试剂,孵育10~15min;
(4)步骤(3)的孵育结束后,用含0.05~0.08%的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤,加入预激发液100~200μL,进行预激发;
(5)去除预激发液,加入激发液100~200μL,进行激发和检测。
实施例1
分别选用50mM NaOH、2%SDS、100mM EDTA及2M盐酸胍作为样本预处理液加入优化后的检测系统,评价梯度稀释的C反应蛋白抗原,相对发光强度如下表1所示:
表1 不同预处理液对C反应蛋白检测的影响
由表1可知,选用50mM NaOH作为样本预处理液时线性拟合r为0.9925,优于其他预处理液;且将M试剂加入2%SDS、100mM EDTA及2M盐酸胍作为预处理液处理的样本后,磁微粒出现非常明显的沉淀现象,而且不能再混匀,而50mM NaOH也有沉淀,但是较轻微且能再混匀,所以选用50mM NaOH作为样本预处理液。
实施例2
为了解决磁微粒的沉淀现象,所以需对碱预处理后的样本加入酸性的R1试剂进行中和。加入M试剂后分别加入20μL 100mM HCl、20mM HCl及10mM HCl,评价梯度稀释的C反应蛋白抗原,相对发光强度如下表2所示:
表2 不同浓度HCl对C反应蛋白检测的影响
在上述3个浓度中,选用20mM HCl及10mM HCl作为R1试剂时,线性拟合r较优,均大于0.9900;且由于使用10mM HCl作为R1试剂时可以使反应不出现磁微粒沉淀现象。
实施例3
加入M试剂后,分别间隔1min、2min、3min及4min加入R1试剂,以马上加入为对照组,分别评价梯度稀释的C反应蛋白抗原,相对发光强度如下表3所示:
表3 不同加样间隔对C反应蛋白检测的影响
表3结果显示,4min内完成R1试剂的加入对试剂的检测性能影响都不大,能满足实际操作的要求。
实施例4
使用优化后的检测体系检测稀释的C反应蛋白抗原,相对发光强度如下表4所示:
表4 C反应蛋白抗原的检测结果
分别以表4中样本浓度(以10为底的对数)为X轴,以测定结果均值(以10为底的对数)为Y轴进行多项回归分析,得到一级、二级与三级多项式,多项式方程如表5所示:
表5 多项式回归方程
对回归方程进行线性检验就是对每个非线性系数作t检验,判断回归系数与零是否有显著性差异。B0与B1不反映非线性,故不需对其进行检验。
4.1系数B3t检验
对3批试剂的B3做t检验,检验方法如下:
计算统计量t,计算公式为:
t=Bi/SEi
其中,SEi为每个非线性系数的斜率标准误,使用GraphPad Prism进行分析计算,结果如表6所示:
表6 B3检验结果
由公式df=L*R-Rdf计算自由度,L为样本数,R为每个样本的测定次数,Rdf为回归自由度,即回归方程中系数(包括B0)的个数。
根据以上公式对表6中的结果进行统计分析,|t|=5.362,当df=28时查表得,t( а= 0.05)=2.048,所以|t|>t( а= 0.05),表示试剂非线性系数B3与零有显著性差异,数据组被认为具有非线性。因此应对该试剂进行临床标准的线性与非线性检验。
4.2临床标准的线性与非线性检验
临床标准的线性检验中使用了两个统计量,ADL(偏离直线平均差异average deviation from linearity)与PctBnd(百分区界percent bound),PctBnd取5%。如ADL小于所要求的临界判断值,则可认为数据组具有临床可接受的线性,所拟合出的最适非线性多项式无临床意义。
计算ADL值,计算公式为:
其中,p(x)为最优拟合二阶或三阶方程的拟合值,a+bx为拟合一阶方程的拟合值,L为样本数,为总平均浓度(全部测量数据的平均值)。
测量数据的精密度可直接影响多项式回归分析的结果,为提高统计功效,需对数据组进行精密度检验。用最优拟合方程的回归标准误(σ)与总平均浓度()的百分比代表不精密度。
计算最优拟合方程的回归标准误(σ),计算公式为:
跟据以下公式进行判断:
其中,yi为各个测量值,p(xi)为最优拟合方程的拟合值,n为样本数乘以重复次数(L x R),d为最优拟合方程的阶数,为总平均浓度,L为样本数,R为重复测量的次数,C为常数。
根据以上公式分别对表4~5中的结果进行统计分析,结果如表7所示:
表7 线性检验及不精密度分析结果表
试剂二阶与三阶回归方程的不精密度分别为0.3%、1.1%,二阶与三阶回归方程的 分别为11.3%、11.1%,均满足判断式,说明数据的精密度好可作线性评价。一般设定ADL小于5%为临床允许误差,试剂二阶与三阶回归方程的ADL分别为1.6%、1.1%,可认为该数据组具有临床可接受的线性。
综上所述,本试剂盒样本浓度在0.02mg/L~200mg/L的范围内具有临床可接受的线性。
实施例5
使用优化后的检测体系检测梯度稀释的C反应蛋白抗原作为标准曲线,然后检测收集的21例临床样本,通过标准曲线换算浓度值后与临床背景值进行相关性评价,结果如表8所示:
表8 临床样本检测结果
通过相关性评价,两者相关性方程为y=1.0217x+0.0452,相关系数r为0.9860,说明二者有较好的相关性。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (9)
1.一种全程C反应蛋白测定试剂盒,其特征在于:包括如下组分:
M试剂,含有0.5~1mg/mL的包被了第一抗体的磁性微粒、0.5~1%酪蛋白和0.5~1%牛血清白蛋白,溶剂为pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液,其中第一抗体的包被量为5~15μg/mg磁性微粒;
R1试剂,浓度为10~20mM的HCl溶液;
R2试剂,含有包被了第二抗体的吖啶酯、0.5~1%酪蛋白和0.5~1%牛血清白蛋白,溶剂为pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液,其中第二抗体的包被量为5~15μg/mL吖啶酯;
碱性预处理液,浓度为20~50mM的NaOH溶液;
预激发液和激发液;
上述第一抗体和第二抗体均为能与C反应蛋白特异性反应的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的一种全程C反应蛋白测定试剂盒,其特征在于:所述R1试剂为浓度10mM的HCl溶液。
3.如权利要求1所述的一种全程C反应蛋白测定试剂盒,其特征在于:所述碱性预处理液为浓度20mM的NaOH溶液。
4.如权利要求1所述的一种全程C反应蛋白测定试剂盒,其特征在于:所述M试剂的制备方法为:将所述第一抗体与磁性微粒混合于pH=5.0~6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液中,于25℃~37℃包被1~3h,在加入pH=8.0~9.0的0.1%~0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液终止1~3h,将其中包被后的磁性微粒分离后分散于pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液中,再加入酪蛋白和牛血清白蛋白,即得M试剂。
5.如权利要求1所述的一种全程C反应蛋白测定试剂盒,其特征在于:所述包被了抗体的吖啶酯的制备方法为:将所述第二抗体与吖啶酯混合于pH=8.0~9.0的磷酸盐缓冲液中,于25℃~37℃包被1~3h,在加入pH=8.0~9.0的含0.1%~0.5%牛血清白蛋白的Tris缓冲液终止1~3h,得母液,将该母液用pH=7.0~8.0的磷酸盐缓冲液稀释至1:100~500,即得R2试剂。
6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的一种全程C反应蛋白测定试剂盒,其特征在于:所述预激发液为1%(w/v)过氧化氢溶液。
7.如权利要求6所述的一种全程C反应蛋白测定试剂盒,其特征在于:所述激发液为1mol/L氢氧化钠溶液。
8.一种应用权利要求1至7中任一权利要求所述的全程C反应蛋白测定试剂盒进行检测的方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)用100~120μL碱性预处理液处理20~30μL样本;
(2)按1:2~3:5~7的体积比在反应孔中依次加入预处理后的样本、M试剂和R1试剂,孵育15~20min;
(3)步骤(2)的孵育结束后,用含0.05~0.08%的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤,再加入20~25μLR2试剂,孵育10~15min;
(4)步骤(3)的孵育结束后,用含0.05~0.08%的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤,加入预激发液100~200μL,进行预激发;
(5)去除预激发液,加入激发液100~200μL,进行激发和检测。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中M试剂和R1试剂的加样间隔为0~4min。
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