CN105963781A

CN105963781A - 涂层和涂覆方法

Info

Publication number: CN105963781A
Application number: CN201610390410.0A
Authority: CN
Inventors: L.甘; M.L.斯科特; S.C.贾尼
Original assignee: Smith and Nephew Richards Inc
Current assignee: Smith and Nephew Inc
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2016-09-28
Also published as: US8821911B2; EP2268327A2; US20110008407A1; US9839720B2; JP5788179B2; WO2009111307A2; WO2009111307A3; CN102014976A; EP2268327B1; EP2268327A4; AU2009222172B2; JP2017080527A; US20150056264A1; JP2015110019A; CA2716589A1; AU2009222172A1; CA2716589C; JP6400753B2; JP2011512959A

Abstract

本发明公开了用于医用植入物的涂层，其中所述涂层的至少一部分含有骨整合剂，并且该涂层的该相同和/或不同部分含有抗微生物金属试剂。

Description

涂层和涂覆方法

本申请是申请号为200980115900.8(国际申请号为PCT/US2009/035467)、申请日为2009年2月27日、发明名称为“涂层和涂覆方法”的中国专利申请的分案申请

技术领域

本发明一般涉及涂覆方法，更具体涉及用于矿化的身体部分的可植入假体的涂覆方法。

背景技术

本领域已知在人体和动物体内使用的医用植入物用于很多目的(短期和长期的目的)。与医用植入物相关的一种常见并发症是在植入部位的感染。植入物相关的感染通过很多不同的手段加以处理，所述手段包括在植入手术之前和之后，在复位时期(set periods)使用给予患者的预防性全身抗生素。然而，宿主部位(host site)的感染仍是常见的问题，最经常需要第二次手术来移除植入物。移除植入物的原因在于当出现感染时，植入物充当入侵细菌优选定居(colonize)的部位。当细菌菌群因此定居植入物时，它们极其耐受经由抗生药物经过全身方法(例如经口或静脉内)的递送而进行的根除。处理此类感染的唯一方法是用另一植入物系统代替以移除被定居植入物的翻修手术(revision surgery)。翻修手术与任何手术的所有并发症相关，所述并发症包括感染。另外，患者身体此刻不得不应对两种手术的发病率。翻修手术的其它不合需要的方面包括失血和血栓形成。翻修手术还与更大的植入失败风险有关，并且翻修手术的医学预后从不像初次手术那样好。翻修手术比初次手术更昂贵，并且患者需要额外的更长恢复时间来变得完全有功能，这可导致生产力损失。如前述中可见，由于植入部位感染而进行的翻修手术对于患者是主要的医疗问题，并且是治疗费用的主要消耗。减少或消除植入物相关的感染的技术将对患者的健康以及输送医疗护理(delivering medical care)产生重要的积极贡献。

医学领域众所周知，金属银及其化合物是良好的抗细菌剂。因此，银及其化合物常规用于治疗浅表皮肤感染。通常对新生儿的眼部给予银化合物以避免潜在的感染。银化合物相比传统抗生素药物的一个主要优势在于传染性细菌对银不形成抗性。抗药细菌是治疗感染领域中的主要关注原因。因此银化合物具有预防医用植入物中的细菌感染的潜力，而不存在发展抗性细菌菌株的风险。

过去已经进行了很多尝试，以将金属银和/或其化合物并入医用植入物的外表面中。在下文总结这些尝试及其局限性。

可以通过本领域已知的许多方法将银镀(涂覆)到医用植入物上，包括电镀、电沉积以及用有机聚合物载体涂抹。其它涂覆技术包括化学气相沉积(CVD)和物理蒸气沉积(PVD)。CVD和PVD技术非常昂贵且需要高度精密复杂、受控的制造工艺。所有这些涂覆技术在植入物中具有有限的应用，因为生物界面，即，植入物与宿主组织之间的界面对于涂覆的植入物相对于未经涂覆的植入物而言是完全不同的。这种限制可对医用植入物的成功具有深远的影响，通常将其生物界面设计用于与宿主组织整合(integration)。这种对植入物生物界面要具有抗微生物性能，同时具有组织整合性能的需求形成本发明的重要方面，这将在后文显示。

已经进行尝试以将银离子“注入”到医用植入物的表面上。该技术利用被撞击在植入物表面上的离子化银的高能束(高速)。这种技术称为“离子注入”。银离子注入仅影响非常薄的表面层(通常是纳米范围的厚度)，因此有限用于长期有效的抗传染药剂。所“注入”的银离子可能如此充分地并入医用植入物表面中，以致于极少的(银离子)会浸出进入周围组织中用于有效杀死细菌。类似的局限性存在于称为“离子束辅助沉积”(IBAD)的技术中。离子注入技术也非常昂贵而且需要精密复杂、受控的制造工艺。

先前讨论了通常将植入物的生物界面(实际上是与宿主组织接触的植入物表面)设计为与宿主组织整合。医用植入物中(尤其骨接触矫形外科、脊柱和牙科植入物)使用的常见表面工程技术是羟基磷灰石(HA)涂层。

使用多种不同的方法将羟基磷灰石(HA)涂层施用于医用植入物，所述方法包括等离子喷涂法、电沉积法、溶液沉淀法和溶胶-凝胶法。也进行了将银并入HA中的尝试。主要地，现有技术已经使用下述两种不同方法来提供掺杂银的涂层：

一种将银衍生物并入HA中的方法包括按序向植入物施加稳定的氧化银和HA粉末层的步骤。然而，这种方法不形成均匀的掺杂银的HA涂层。因此，覆盖不均匀，并且在植入后不能稳定地保持离子释放。即使在等离子喷涂之前使氧化银与HA粉末混合，该氧化物也不能与常规HA粉末进行化学反应以及结合而形成均匀配制物。

第二种方法是将具有羟基磷灰石涂层的植入物浸渍在硝酸银溶液中大约24小时，然后在空气或惰性环境中干燥该植入物。这种方法依赖于将银施加入已经涂覆有HA的植入物中。因此这种方法具有干扰现有HA涂层的物理和机械特性的可能性，从HA与基底医用植入物附着的观点看，这可能是不合需要的。另外，这种技术不能使足够的硝酸银深深浸入HA涂层中。医用植入物上的HA涂层的厚度可以为数微米至好几百微米。通过这种方法并入银需要硝酸银与HA涂层之间的离子交换反应。这种离子交换反应仅发生在外表面，在那里HA涂覆的植入物与硝酸银溶液接触。因此，尽管在表面处银被并入遍布HA基质，但是其未在HA涂层的整个厚度被并入HA基质中。因为银仅在HA涂层的表面以及表面区域附近被并入(并非遍及整个厚度)，所以银离子释放到宿主组织中可能是短效的；也就是说，银离子的释放将不会持续植入后数月避免感染所需的非常长的时期。此外，离子交换反应要求小心控制硝酸银溶液的pH。硝酸银溶液的理想pH可能不适合保存已经涂覆在植入物上的HA结构。在此类方法中，如果没有控制银盐溶液的pH，则附着于基底医用植入物的HA涂层在浸渍过程中可能受损(be compromised)。

前述讨论显示了将银及其化合物并入医用植入物的生物界面中的现有技术方法的局限性。对获得医用植入物的抗微生物涂层的商业可行的方法存在需要。具有抗微生物性能的理想医用植入物是这样的：该医用植入物的制造不背离目前实践的制造方法，例如等离子喷涂。

发明内容

在本发明的一个实施方式中，提供适用于医用植入物的涂层。此类植入物可具有有益效果，例如它们能够促进骨整合且/或同时减少或消除植入部位处的感染风险。

根据一些实施方式，提供用于医用植入物的涂层，其中所述涂层的至少一部分含有骨整合剂(osseointegration agent)，并且所述涂层的相同和/或不同部分含有抗微生物金属试剂(antimicrobial metal agent)。

根据本发明的一些实施方式，医用植入物具有与宿主生物环境接界(interfaces with)的涂层。此类涂层优选包含促进骨整合或骨传导性(osteoconductivity)的试剂，例如钙衍生物。如本文使用的术语“骨整合剂”指具有促进植入物与骨整合的能力的任何试剂。术语“骨传导性”指其中植入物能够支持新的成骨细胞与骨原细胞附着的情况，这提供了一种结构，新细胞可迁移通过该结构并且新血管可通过该结构形成。

应理解，如贯穿本说明书所用的术语“钙衍生物”用作可促进骨整合或骨传导性的试剂的代表性术语，并且常常称作羟基磷灰石(HA)，但是其可以是任何合适的衍生物，其实例是本领域技术人员充分意识到的。一个实例是HA，但是诸如磷酸钙、正磷酸钙、磷酸三钙、陶瓷生物玻璃(ceramicbioglass)之类的其它衍生物都能发挥本发明的功能，并且非限定性地并入本文。增强植入物整合入宿主组织中的其它形式的表面工程包括涂层磷灰石，例如磷酸钙、羟基磷灰石、β-磷酸三钙、羟基磷灰石与β-磷酸三钙的混合物、可再吸收性聚合物、生物玻璃、衍生的基于的磷酸盐化合物、正磷酸盐、磷酸一钙、磷酸八钙、磷酸二钙水合物(透钙磷石)、无水磷酸二钙(三斜磷钙石)、无水磷酸三钙、磷钙矿(whitlocktite)、磷酸四钙、无定形磷酸钙、氟磷灰石、氯磷灰石、非化学计量磷灰石(non-stoichiometricapatites)、碳酸盐磷灰石(carbonate apatites)、生物衍生的磷灰石、磷酸氢钙、磷灰石氢钙(calcium hydrogen apatite)、水不溶性陶瓷、磷酸盐、多磷酸盐、碳酸盐、硅酸盐、铝酸盐、硼酸盐、沸石、膨润土、高岭土及其组合。将这些表面工程技术非限制性地并入本文。

在一些实施方式中，钙衍生物是羟基磷灰石和/或β-磷酸三钙之一或组合。

根据本发明的一些实施方式，通过添加银来改善天然钙衍生物(例如HA)涂层的抗细菌功效。

银可以作为银取代的钙衍生物(如HA)和/或离散的金属银颗粒中的一种或多种存在。

优选地，抗微生物金属试剂作为离散颗粒在所述涂层的至少一部分中存在。抗微生物金属可以包含银、铜和/或锌中的一种或多种。离散颗粒(例如银颗粒)可优选遍及整个涂层厚度分布。

本发明人已经发现，优选将金属银而不是离散的银化合物(如氧化银)并入医用植入物中。

可以很多方式设计银的使用(或其它抗微生物金属种类，例如铜)。因为金属抗微生物剂要在宿主动物(包括人)组织中使用，因此其性能应发挥下述非限定性重要功能：

(a)抗微生物剂处理的医用植入物应抵抗细菌定居(bacterialcolonization)。在涂层中存在的银的化学形式可对其产生影响。例如，银可以作为化合物(如磷酸银、氧化银、硝酸银和其它化合物)存在于植入物表面上的涂层中。银也可以以金属银形式存在。另外，可以存在银化合物和/或金属银的混合物。随着抗微生物涂层在宿主组织环境中反应，确切的组成将影响植入物在植入时以及随时间抵抗微生物定居的能力。

(b)抗微生物剂处理的医用植入物应将抗微生物金属释放到宿主组织中以实现其抗微生物性能。可以作为银离子或作为金属银或者作为银的化合物(如磷酸银或氧化银)将抗微生物金属释放到宿主组织中。抗微生物剂释放的化学性质将取决于涂层的组成。应理解，可通过抗微生物涂层的组成来控制优选的释放类型(离子、金属或化合物)。

(c)银进入宿主环境中的释放动力学可以是爆发释放(弹丸(bolus))形式或长时期持续(释放)的形式或者爆发释放与持续释放的组合形式。可通过选择涂层中的银及其化合物的化学性质来设计释放动力学和释放持续时间，如上所讨论。

(d)以上讨论形式的银释放应处于被宿主活组织、器官和有机体充分耐受的剂量。该释放不应以可感觉的程度干扰植入物和涂层的其它生物学和机械功能。涂层和银的释放应是生物相容的，并且不应对宿主环境呈现细胞毒素攻击(cytotoxic challenge)。这可以通过如上所列举进行控制。

存在于抗微生物涂层中的银及其化合物的类型和浓度可通过多种方法来控制。可通过与硝酸银或本领域已知的其它银化合物的离子交换反应将银并入涂层微粒(如HA)中。在离子交换反应之后，可将过量的银化合物完全从HA粉末中冲洗出来，或者仅部分冲洗掉。因此，HA粉末可不含未反应的银化合物或者可保留所有未反应的过量银化合物，或者可保留部分量的未反应银。

在一些实施方式中，离散的金属颗粒(例如金属银颗粒)存在于包含骨整合剂的涂层中，所述骨整合剂本身未被抗微生物金属试剂取代。任选地，金属颗粒分布在包含骨整合剂的涂层中，所述骨整合剂也已经被抗微生物金属试剂取代。优选地，金属试剂是银，且作为取代进入骨整合剂中的银(silver substituted into the osseointegration agent)存在于涂层中。

任选地，向医用植入物提供涂层的一种方法是通过称为“等离子喷涂”的技术。医用植入物上的等离子喷涂层的厚度通常可从约1微米起，并且通常在10微米或数十微米至数百微米的范围内。超过数千微米(1毫米或更大)的涂层厚度也是可能的。施加钙衍生物涂层到医用植入物上的其它方法包括溶胶-凝胶法、电沉积、溶液沉淀和仿生涂层(biomimetic coatings)。

根据本发明的一些实施方式，用骨整合剂(例如钙衍生物，如HA)的粉末对植入物进行等离子喷涂。优选地，在等离子喷涂之前，骨整合剂至少部分被抗微生物金属试剂(例如银)取代。

可以在常压(atmospheric)条件下或在还原(reducing)条件下或在真空中施加等离子喷涂层。另外，等离子喷涂设备可以处于受控的环境条件下。例如，所述环境可以含有氩气或其它惰性气体。或者所述环境可以含有活性气体。在其中操作等离子喷涂设备的环境可决定被并入HA涂层中的银(或其化合物)的类型。例如，在HA颗粒脱离等离子体(exit theplasma)并且在其被涂覆到植入物表面上之前，常压(未受控制的环境)HA涂覆可导致已经存在于HA颗粒中的银(及其化合物)通过离子交换反应而氧化。真空等离子喷涂可改善这种氧化反应。如果想要特定的银化合物，则可控制等离子喷涂设备的环境，以实现此类化合物的制备。例如，如果希望用氟化银作为HA涂层中的银化合物，则可以通过本领域已知的多种方法使环境富集氟。

在一个实施方式中，不需要后处理热处理(post-process heat treatment)来进一步使涂层巩固(consolidate)或使其与基底粘合(bond)。

如果要在本发明中使用等离子喷涂，则优选地，至少一层含有抗微生物剂(如银)的涂层的等离子喷涂在还原环境中进行。

因此，在本发明的一个实施方式中，提供用于医用植入物的等离子喷涂层，其中所述涂层的至少一部分含有骨整合剂，并且所述涂层的该相同和/或不同部分含有抗微生物剂。

优选地，骨整合剂是钙衍生物。

优选已经在还原条件下对含有抗微生物剂的涂层的至少一部分进行等离子喷涂，并且优选在真空中进行等离子喷涂。

不希望受到理论的束缚，据信，当粉末(如HA)含有未反应的银化合物时，这些化合物将在等离子体的高度还原环境(氢和惰性气体混合物)中离解成金属(元素)银。因此，如果在真空条件下进行等离子喷涂，则还原的金属银将作为离散的金属颗粒连同HA和含银的HA一起被涂覆到医用植入物上。另一方面，如果在常压条件下进行等离子喷涂处理，则在等离子体的还原气氛中形成的金属银将与氧气反应而形成氧化物。然后将这些氧化物连同HA和含银的HA一起涂覆到医用植入物上。从前述讨论中可以理解，可通过将涂层施加到医用植入物上的工艺来控制医用植入物上存在的银的类型。

在本发明的一些实施方式中，所述涂层的至少一部分含有抗微生物金属的离散颗粒。在一些实施方式中，所述抗微生物金属包括金属银、铜和/或锌中的一种或多种。

优选地，抗微生物金属包括金属银。在一些实施方式中，金属银颗粒是球形或不规则形状。此外，金属银颗粒的直径大小为约15nm至约10μm。

在本发明的一些实施方式中，银浓度足以具有抗细菌效果，例如具有约0.1至约10wt％的浓度。

在一些实施方式中，在含有钙衍生物的所述涂层的所述至少一部分中所含有的所述钙衍生物是银取代的，并且优选银取代的钙衍生物具有遍及涂层厚度均匀分布的银浓度。银取代的钙衍生物可含有约0.1至约10wt％的银，优选约0.5至约3.0wt％的银。

在一些实施方式中，含有抗微生物剂的所述涂层的至少一部分具有遍及该涂层的所述部分的整个厚度分布的抗微生物剂。

然后，在小心控制制造工艺的情况下，有可能产生等离子喷涂HA涂覆的医用植入物，该医用植入物在HA涂层中含有下述类型银中的任一种、或两种或更多种的组合；

(1)银可以从HA涂层的外表面直至固定深度存在，或者其可以存在于HA涂层的整个厚度。

(2)银可以是与HA完全反应并遍及HA涂层均匀分布的银化合物(例如磷酸银、氧化银)的形式。或者，银化合物可以离散地分布到HA涂层的基质中。

(3)银可以完全并入天然HA晶体结构中，作为银改性的HA，并遍及HA涂层均匀分布。

(4)银可以是在等离子体的还原气氛中形成的金属银的形式。这样的银作为离散的银颗粒分布在HA涂层的基质中。金属银可以从HA涂层的外表面直至固定深度存在，或者其可以存在于HA涂层的整个厚度。

在本发明的一些实施方式中，涂层厚度优选大于约1μm，优选约10μm至约200μm，最优选约30μm至约100μm。所述涂层优选充分附着于基底材料(例如Ti6Al4V、cp-Ti、CoCrMo、Ta和其它生物医学材料)并具有例如至少15Mpa的拉伸附着强度(tensile attachment strength)。

根据本发明的一些实施方式，天然钙衍生物(例如HA)涂层的骨整合未受到银添加的损害。

在本发明的一些实施方式中，涂层具有一种或多种骨传导、骨促进和/或抗微生物性能。

根据本发明的一些实施方式，从含银的钙衍生物(例如HA)粉末的均匀配制物形成涂层。在一些实施方式中，不需要将含银的钙衍生物粉末与其它含银粉末共混，以将银并入涂层中。例如在一个实施方式中，不需要将HA粉末与其它粉末(例如氧化银粉末)共混，以将银并入HA涂层中。

根据本发明的一些实施方式，骨整合剂(例如HA)粉末含有被吸附到表面上的至少部分过量的银反应物。

根据本发明的一些实施方式，HA粉末含有银取代物(silversubstitution)和过量的银反应物两者。

根据本发明的一些实施方式，用于取代进入骨整合剂(例如HA)粉末中的银反应物是一种或多种银盐，如硝酸银(AgNO₃)和/或氟化银(AgF)。或者，或另外，银反应物可以是一种或多种卤化银，如碘化银。

在本发明的一些实施方式中，除银之外，钙衍生物还被下述物质中的一种或多种取代：碳酸盐、氟化物、硅、镁、锶、钒、锂、铜和/或锌。

根据本发明的一些实施方式，通过首先将常规HA粉末在含硝酸银和/或含氟化银的水溶液或有机溶液中浸渍一段时间来形成含银的钙衍生物(例如HA)粉末。在一些实施方式中，水溶液或有机溶液可包含氟化银和硝酸银两者。

优选地，钙衍生物(例如HA)粉末在溶液中浸渍并搅拌合适的时间，以允许在HA粉末与Ag盐(一种或多种)溶液之间发生充分的离子交换反应。这样的时期可以为数小时(例如10小时)至一周，例如约一天至三天的时期。反应更优选为大约两天。对于最佳结果而言，避免使混合物过度暴露于光下可能是必要的。

可以在室温下浸渍骨整合剂(例如HA)粉末，然而，优选稍微更温热的温度，以便增加溶液进入HA中的溶解度。不应升高温度太多，以免分解该组合物。

在其中HA粉末与Ag盐于水溶液或有机溶液中反应的期间，维持所述溶液的适当pH水平通常也是重要的。通常应将pH保持在这样的水平，以使HA溶解达到最低，但同时减少硝酸银与OH反应并沉淀而形成氢氧化银，并最终变成氧化银的可能性。可将pH水平保持在6.5-8.5的范围内，但是其优选高于6.7，以防止HA溶解。更优选地，混合物的pH水平在6.8-7.2的范围内，但是其它水平也是可以接受的。

在离子交换反应之后，可放置混合物至风干，或可以用去离子蒸馏水(DDH₂O)冲洗和/或洗涤，然后使其风干。

在本发明的一些实施方式中，提供制备抗微生物涂层的方法，其中通过离子交换或溶胶-凝胶方法制备含银的钙衍生物粉末，并随后将其等离子喷涂到基底材料上。

在一些实施方式中，通过以下方式制备含银的钙衍生物粉末：

a.将钙衍生物粉末悬浮在银盐溶液中，持续足以将钙离子交换为银离子的时间和温度，和

b.将所述经过离子交换和洗涤的钙衍生物干燥。

在一些实施方式中，在步骤(a)与(b)之间进行洗涤所述离子交换的钙衍生物粉末的额外步骤。

在一些实施方式中，钙衍生物粉末与银盐溶液之间的离子交换反应在约20℃至95℃的温度下进行约24至168小时。在一些实施方式中，银盐溶液是浓度为10^-2-10^-4 M的硝酸银或氟化银，并且硝酸银与HA粉末的质量比在0.01-0.1的范围内。

此外，在一些实施方式中，通过下述的溶胶-凝胶法制备含银的钙衍生物粉末：

(a)将钙、银和/或磷前体的组合物混合，以获得均匀的溶胶-凝胶溶液；

(b)在20-95℃的温度下，将该溶胶-凝胶溶液老化，持续合适的时期；

(c)在高于室温的温度下将该溶胶-凝胶溶液干燥并煅烧，持续合适的时期；

(d)将经过煅烧的粉末处理成所需的粒度分布，用于随后的等离子喷涂处理。

在一些实施方式中，钙前体是硝酸钙。在一些实施方式中，银前体是硝酸银。在一些实施方式中，磷前体是磷酸二氢铵。在一些实施方式中，银前体的浓度范围是约0.1wt％至10wt％，优选0.5wt％至3.0wt％。

在某些实施方式中，将氟和碳酸盐前体与钙、银和磷前体混合，以获得均匀的溶胶-凝胶溶液。在一些实施方式中，氟前体是氟化铵。在一些实施方式中，碳酸盐前体是碳酸铵。在一些实施方式中，F和/或碳酸盐前体的浓度是约10^-2-10^-3M。

在某些实施方式中，将碳酸盐、氟化物、硅、镁、锶、钒、锂、铜或锌前体或者其组合与钙、银和磷前体混合，以获得均匀的溶胶-凝胶溶液。

其余的固体混合物包含其中含有银和/或氟化物的均匀的HA粉末配制物。该均匀的HA粉末配制物可以被碾碎(ground up)或可以不被碾碎，然后用于常规的等离子喷涂处理中，以便像一般的HA粉末一样涂覆生物医用植入物或医疗器械。本发明的浸渍和碾磨过程通常仅微不足道地增加HA粉末的平均粒度，并因此不干扰可取决于常规设备的后续等离子喷涂处理。

在一些实施方式中，在喷涂之前，含银的钙衍生物粉末配制物的大小分布与天然纯钙衍生物粉末基本相同。

使用前述风干方法而不冲洗的一种可能的优势在于，通过不进行冲洗，在水溶液/有机溶液蒸发后，除了均匀的HA/银粉末配制物之外，可能存在少量过量的硝酸银或氟化银。这可确保在等离子喷涂工艺过程中存在的极高温度之后，即使均匀HA粉末中的一些银蒸发，也有一些残留的(即，“额外的”)银存在于涂层中。可以利用不同的银盐浓度来调整最终的等离子喷涂层中的银含量和降解曲线(degradation profile)。

在本发明的一个实施方式中，提供治疗需要手术植入物的患者的方法，所述方法包括对所述患者进行手术，将包含权利要求1至20中任一项所述的涂层的医用植入物插入所述手术部位中，以及在手术后将所述植入物留在原位置，其中所述植入物降低了植入物部位处的术后感染的风险或消除植入物部位处的术后感染。

如本文所用的术语“银”可包含基本纯的银、具有基于银的组分的组合物、具有基于银的组分的前体、银化合物或具有银的合金。根据前述讨论，可能的是，可以表面同时发挥抗微生物功能的方式将银和/或银化合物并入医用植入物的生物界面(如HA涂层)。

其它金属种类也已知具有类似的抗微生物效果。这些包括但不限于铜、锌、汞、铅和其它金属。这些金属种类具有宽范围的有效性，这取决于所递送的剂量。另外，这些金属种类中的一些可能对宿主组织具有毒性，这也取决于所用的剂量以及其中施用它们的组织部位。尽管本发明涉及作为优选的抗微生物金属种类的银，但是其不仅限于银。也可以使用不同金属种类的混合物。例如，可以使用变化量的银和铜化合物。

本发明适用的其它方面从下文提供的详述中将变得显而易见。应理解，详述和特定实例，在表示本发明的具体实施方式的同时，意图仅用于阐述的目的，而并非意图限定本发明的范围。

附图说明

被并入并形成本说明书的一部分的附图图解了本发明的实施方式并连同所撰写的说明书一起用于解释本发明的原理、特性和特征。在附图中：

图1是HA(a)、Ag-HA-L(b)、Ag-HA-M(c)和Ag-HA-H(d)-涂覆的Ti6Al4V圆盘(disc)的扫描电子显微镜照片。

图2是HA(左侧)和Ag-HA-H(右侧)-涂覆的Ti6Al4V圆盘的横截面视图的扫描电子显微镜照片。在遍及Ag-HA-H样品的涂层的不同位置测量银浓度，如通过“x”标记所示。

图3显示不同的涂覆试样(coupon)的拉伸粘合强度。

图4显示HA-涂覆的和Ag-HA-H-涂覆的样品(sample)的断面。

图5显示样品在PBS中的银释放曲线(release profile)。

图6a(HA)、6b(Ag-HA1)和6c(Ag-HA2)显示每种不同样品在低放大倍数下的二次电子图像，提供了每种样品类型的概观。

图7a(HA)、7b(Ag-HA1)和7c(Ag-HA2)显示图6样品的表面形态的较高放大倍数下的二次电子图像。

图8a(HA)、8b(Ag-HA1)和8c(Ag-HA2)显示在低放大倍数下不同样品的背散射电子图像，提供了每种样品类型的概观。

图9a(HA)、9b(Ag-HA1)和9c(Ag-HA2)显示来自图8中的每种样品的较高放大倍数下的背散射图像。

图10a(Ag-HA1)和10b(Ag-HA2)以及11a(Ag-HA1)和11b(Ag-HA2)显示对图8和9的样品的较高放大倍数检查。

图12是本发明样品的背散射EM。

图13a显示通过EDX微量分析获得的元素点图(dot-map)，而样品Ag-HA2的相应区域的背散射图像示于图13b中。

图14a(Ag-HA1)和14b(Ag-HA2)显示来自Ag-HA1样品和Ag-HA2样品的EDS光谱。

图15显示HA2样品上的离散的明亮颗粒的EDX谱(在图像中用″x″标记的点)。

图16a-c是远离离散的明亮颗粒的涂层区域的图像，所述区域也在HA2样品上通过EDXA进行评价。

图17显示三种样品HA、Ag-HA1和Ag-HA2的X-射线衍射图。

图18显示三种不同样品的拉伸粘合强度(tensile bonding strength)。

图19是本发明涂层的实施方式的示意图。

图20是含银的改性β-TCP和布比卡因的顶层PLGA涂层的低倍放大。

图21是含银的改性β-TCP和布比卡因的顶层PLGA涂层的高倍放大。

图22是本发明另一实施方式的示意图。

图23是PLGA涂层上的PLGA珠的顶视图的低倍放大。

图24是PLGA涂层上的PLGA珠的顶视图的高倍放大。

图25是PLGA涂层的高倍放大。

图26(a)和(b)是来自9-天拔出(9-day pulled out)植入物的SEM图像：来自Rabbit#1A的低Ag-改性的磷酸钙-涂覆的植入物。

图27(a)和(b)是来自9-天拔出植入物的SEM图像：来自Rabbit#1A的无磷酸钙-涂覆的植入物。

图28(a)和(b)是来自9-天拔出植入物的SEM图像：来自Rabbit#1B的高Ag-改性的磷酸钙-涂覆的植入物。

图29(a)和(b)是来自9-天拔出植入物的SEM图像：来自Rabbit#1B的无磷酸钙-涂覆的植入物。

图30是′低′S-CP，9天的背散射SEM。(样品4A右侧(sample 4Aright))。多孔涂层区域内的矿化组织(骨)(箭头)的小区域。虚线显示定点钻孔(site drilling)之后宿主骨的位置。

图31是′高′S-CP，9天的背散射SEM。(样品5B左侧(sample 5B left))。多孔涂层区域内的矿化组织(骨)(箭头)的小区域。虚线显示定点钻孔之后宿主骨的位置。

图32是′对照′(无CP)，9天的背散射SEM。(样品5B右侧)。多孔涂层区域内的矿化组织(骨)(箭头)的小区域。

图33是′低′S-CP，16天的背散射SEM。(样品9C右侧)。遍及整个多孔涂层深度的广泛的骨向内生长。虚线表示最初钻孔骨的边界。

图34是′高′S-CP，16天的背散射SEM。(样品8D右侧)。遍及整个多孔涂层深度的广泛的骨向内生长。虚线表示可能的最初钻孔骨的边界。

图35是′对照′(无CP)，16天的背散射SEM。(样品2C左侧)。遍及多孔涂层深度的骨向内生长；难以鉴定最初钻孔骨的边界。

图36(a)和(b)显示9-天烧结的多孔涂覆的Ti6Al4V′对照′植入物-(a)和(b)样品5B右侧-蓝绿色染色区域是骨(旧的以及新形成的)。由于切片厚度，一些骨未显示染色效应并且呈现灰色。在一些区域中在界面附近存在少量的纤维组织(箭头)。

图37(a)和(b)显示具有′低′S-CP覆盖层(over-layer)的9-天烧结的多孔涂覆的H6Al4V植入物-(a)样品8A左侧，(b)样品4A右侧-在(b)中，由于钻孔(以及可能由于一些骨枯萎(bone die-back))引起的最初骨丢失的程度通过截断的(骨)小梁是明显的。

图38(a)和(b)显示具有′高′S-CP覆盖层的9-天烧结的多孔涂覆的Ti6Al4V植入物-(a)&(b)样品8B左侧-高放大倍数及低放大倍数图像都显示由于定点制备(钻孔)以及可能由于随后的骨枯萎引起的骨丢失的程度((b)中的虚线)。然而，获得合适的压配合，这使得在界面区内的早期骨形成得以发生并且进入多孔涂层中(箭头)。

图39(a)和(b)显示16-天烧结的多孔涂覆T16Al4V植入物′对照′植入物-(a)&(b)样品2C左侧-遍及多孔涂层(蓝绿色染色区域)的广泛的新骨形成和向内生长。

图40(a)和(b)显示具有′低′S-CP覆盖层的16-天烧结的多孔涂覆Ti6Al4V植入物-(a)&(b)样品9C右侧-广泛的新骨形成和向内生长。[(a)中所见的包埋人工制品(空气泡)的样品]。

图41(a)和(b)显示具有′高′S-CP覆盖层的16-天烧结的多孔涂覆H6Al4V植入物-(a)&(b)样品8D右侧-沿着植入物长度的良好的骨向内生长。

图42和43显示微生物活性的声处理计数结果。

图44和45显示微生物活性的悬浮液计数(suspension counts)结果。

图46显示Ag/HA培养基中培养的MC3T3细胞在A450nm-A655nm处的平均吸光度。误差条代表数据的标准偏差。

具体实施方式

所述实施方式的下述描述在性质上仅仅是示例性的，并且决非有意限制本发明、其应用或用途。

通过首先将常规羟基磷灰石(HA)粉末(如商业可得的平均粒度为约45至约125微米的HA粉末)浸渍在含硝酸银和/或含氟化银的水溶液或有机溶液中一段时间来形成抗微生物HA粉末配制物。在一些实施方式中，水溶液或有机溶液可包含氟化银和硝酸银两者。在一些实施方式中，可以使用β-磷酸三钙，或者可以使HA与β-磷酸三钙结合。磷酸钙混合物包括约0.1wt％至约10wt％、约0.1wt％至约7wt％或约0.1wt％至约5wt％的银。在一个特定实施方式中，磷酸钙混合物包括约0.5wt％至约30wt％或约0.5wt％至约2wt％的银。

术语″wt％″或″重量百分比″指涂层或涂层内的层的重量百分比，并且其不包括植入物本身的重量。

在一些实施方式中，可将碳酸盐、氟化物、硅、镁、锶、钒、锂、铜和锌中的一种或多种添加至磷酸钙混合物中。

HA粉末在溶液中浸渍和搅拌约1天至约7天的时期。优选地，HA粉末在溶液中浸渍和搅拌约1天至3天的时期，以允许在HA粉末与Ag盐(一种或多种)溶液之间进行充分的离子交换反应。反应更优选为约2天。此外，对于最佳结果而言，使混合物避免过度暴露于光下可能是必要的。

可以在室温下浸渍HA粉末，但是优选稍微更温热的温度，以便增加溶液进入HA中的溶解度。不应升高温度太多，以免分解该组合物。在一些实施方式中，可以使用约20℃至约95℃的温度范围。在其它实施方式中，可以使用约60℃至约80℃的温度范围。

其余的固体混合物包含其中含银和/或氟化物的均匀的HA粉末配制物。该均匀的HA粉末配制物可以被碾碎，然后用于常规的等离子喷涂处理中，以便像一般的HA粉末一样涂覆生物医用植入物或医疗器械。本发明的浸渍过程通常仅微不足道地增加HA粉末的平均粒度，并因此不干扰可取决于常规设备的后续等离子喷涂处理。

在第一种方法中，将HA粉末与AgF溶液混合。浸渍并搅拌混合物1至3天。干燥混合物。可将所得配制物等离子喷涂到医用植入物上。作为实例，氟化银可以具有约1×10^-2至约1×10^-4M的浓度。作为实例，氟化银与HA粉末的质量比在约0.01至约0.1的范围内。在一个实施方式中，将混合物在空气中于约50℃至约95℃的温度下干燥约一天至约三天。在又一实施方式中，银溶液的浓度为1×10^-3至约1×10^-4M。

在第二种方法中，将HA粉末与AgNO₃溶液混合。浸渍并搅拌混合物1至3天。干燥混合物。可将所得配制物等离子喷涂到医用植入物上。作为实例，硝酸银可以具有约1×10^-2至约1×10^-4M的浓度。作为实例，硝酸银与HA粉末的质量比在约0.01至约0.1的范围内。在一个实施方式中，将混合物在空气中于约50℃至约95℃的温度下干燥约一天至约三天。

在第三种方法中，将HA粉末与AgF和AgNO₃溶液混合。浸渍并搅拌混合物1至3天。干燥混合物。可将所得配制物等离子喷涂到医用植入物上。

在第四种方法中，将HA粉末与AgF溶液混合。浸渍并搅拌混合物1至3天。冲洗混合物。然后干燥混合物。可将所得配制物等离子喷涂到医用植入物上。

在第五种方法中，将HA粉末与AgNO₃溶液混合。浸渍并搅拌混合物1至3天。冲洗混合物。然后干燥混合物。可将所得配制物等离子喷涂到医用植入物上。

在第六种方法中，将HA粉末与AgF和AgNO₃溶液混合。浸渍并搅拌混合物1至3天。冲洗混合物。然后干燥混合物。可将所得配制物等离子喷涂到医用植入物上。

在一些实施方式中，通过下述的溶胶-凝胶法制备含银的HA粉末：(a)将钙、银和/或磷前体混合，以得到均匀的溶胶-凝胶溶液；(b)在约20℃至约95℃的温度下老化该溶胶-凝胶溶液约7至约9天；(c)在约500至约800℃的高温下干燥并煅烧该溶胶-凝胶溶液约2至约4小时；和(d)碾磨并筛分上述煅烧粉末至所需的粒度分布，用于后续的等离子喷涂处理。在一些实施方式中，平均粒度是约45至约150微米。作为实例，钙前体可以是硝酸钙，银前体可以是硝酸银，而磷前体可以是磷酸二氢铵。银前体浓度可以在约0.1重量百分比至约10重量百分比、约0.1wt％至约7wt％或约0.1wt％至约5wt％的范围内，更优选为约0.5重量百分比至约3重量百分比，或约0.5wt％至约2wt％。

在一些实施方式中，在施加磷酸钙涂层之前，可将底层(base layer)或底漆层(primer layer)施加于基底。底层可用来避免或减少基底与涂层之间的反应。或者，底层可以改进涂层-基底界面处的拉伸粘合强度。可利用真空等离子喷涂工艺施加底层。或者，可以利用常压等离子喷涂、离子溅射法(ion sputtering)、溶胶-凝胶浸涂法、溶液沉淀、仿生法(biomimetic method)或电沉积来施加底层。底层可以是多种化合物。作为实例，底层可以是金属涂层、陶瓷涂层或可生物降解的生物陶瓷涂层。尤其，底层可包括磷酸钙、生物玻璃、多磷酸钙、磷酸四钙(TTCP)、β-磷酸三钙(TCP)、β-焦磷酸钙(CPP)、β-偏磷酸钙(CMP)或基本纯的HA。在一个特定实施方式中，底层厚度为约1至约50微米，更优选为约10至约20微米。在一个具体实施方式中，底层和抗微生物涂层的总厚度为约30至约300微米，更优选为约50至约100微米。

在一些实施方式中，氟和碳酸盐前体可以与钙、银和磷前体混合，以得到均匀的溶胶-凝胶溶液。作为实例，氟前体可以是氟化铵，碳酸盐前体可以是碳酸铵。氟前体浓度可以在约10^-2至约10^-3M的范围内。碳酸盐前体浓度可以在约0.1至约10^-3M的范围内。

在一些实施方式中，使骨刺激材料与钙、银和磷前体混合，以得到均匀的溶胶-凝胶溶液。作为实例，盐、矿物质、金属、金属氧化物、碳酸盐、氟化物、硅、镁、锶、钒、锂、铜或锌前体或其组合可以与钙、银和磷前体混合，以得到均匀的溶胶-凝胶溶液。

本领域普通技术人员可容易意识到，溶液中的硝酸银和/或氟化银的确切的量或浓度可以变化。仅有小部分的硝酸银和/或氟化银可以被吸收进入HA粉末中，因此，可使溶液的浓度最优化，以减少硝酸银或氟化物浪费。或者，可将额外的氟化银和/或硝酸银添加至溶液中，以补偿在等离子喷涂期间银和/或氟的一些蒸发/汽化。

另外，锶和/或钒可以单独使用，或者与本发明的银和/或氟化物以及其它金属(如铜和锌)组合使用。

通过将少量的银和/或氟化物添加至常规的HA粉末中，本发明为生物医用植入物提供改进的抗微生物/抗感染/骨整合性能。此外，现有技术不能提供能够如本发明那样被等离子喷涂的均匀的HA粉末配制物。相比于单独非均匀施加的银和HA，在等离子喷涂之后，本发明的均匀的HA/银粉末配制物可提供均匀得多且受控的降解涂层。

尽管以上实例包括羟基磷灰石，但是本领域普通技术人员将理解，可以使用其它形式的磷酸钙。作为实例，磷灰石、非化学计量磷灰石、磷酸钙、正磷酸盐、磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸三钙、磷钙矿、磷酸四钙、无定形磷酸钙可以代替HA。

本发明还提供各种医用植入物，优选使用如本文所述的任意方法和技术进行涂覆。医用植入物的涂层可以包含一个或多个层，其中每一层可以包含与另一层相同或不同的组成。优选在还原环境(例如在真空中)中等离子喷涂每一层。

任选地，医用植入物具有包含很多层的涂层，并且其中抗微生物剂的浓度在至少两个涂层层中是不同的。

优选制造本发明的植入物，以增加成功整合到宿主环境中的机会，同时提供抗微生物环境以降低感染风险或预防感染。

因为参考相应的说明可以对上述示例性实施方式进行各种修改，而不背离本发明的范围，所以意图包含在前述描述以及示于附图中的所有内容应解释为阐述性的而非限制性的。因此，本发明的宽度和范围不应被任意上述示例性实施方式所限制，而应仅根据所附权利要求以及它们的等价物进行定义。

实施例

实施例1

方法

在去离子蒸馏水(DDH₂O)中制备三种不同浓度的硝酸银溶液，用于硝酸银溶液与HA粉末之间的离子交换反应。一些来自硝酸银溶液的Ag离子将取代来自HA结构的Ca离子，同时，一些银化合物将被物理吸附到HA表面上。HA粉末中的目标银含量分别是0.3wt％、1wt％和3wt％。硝酸银和HA粉末的质量列在表1中。

表1用于离子交换反应的硝酸银和HA粉末的质量

	AgNO₃	HA	DDH₂O	目标银wt％
					纯HA	-	250g	-	0
Ag-HA-L	1.25g	250g	750mL	0.3
					Ag-HA-M	4.0g	250g	1500mL	1.0
Ag-HA-H	12.0g	250g	3000mL	3.0

首先将硝酸银(BDH，Cat.#BDH0276-125G)溶解在容纳于3升玻璃烧杯中的DDH₂O中，然后按照表1将HA粉末(MEDICOATAG，粒度：-125μm+45μm)添加至所制备的硝酸银溶液中。将HA和硝酸银溶液在180RPM下于定轨摇床中在室温下搅拌3天，以允许发生均匀的离子交换反应。

在离子交换反应之后，使溶液置于烘箱中在80℃下干燥，以蒸发水。然后将干燥且改性的HA粉末手动使用研杵和研钵轻微研磨，以使干燥过程中形成的附聚物破碎。然后将磨碎的改性HA粉末通过100-325目筛(W.S.Tyler，Inc.，USA)筛分。丢弃任何大于150μm或小于45μm的HA粉末。在100-325目筛之间收集至少98％的HA粉末。

使用激光衍射粒度分析仪(Laser Diffraction Particle Size Analyzer)(型号LS13 320，Beckman Coulter，USA)进一步表征银改性的HA粉末。所有测量列在表2中。随着HA粉末中银含量的增加，平均粒度轻微增加。低和中等银HA粉末的粒度分布与对照的纯HA粉末相似。

表2纯HA和改性HA粉末的粒度和大小分布

	平均(μm)	D10(μm)	D25(μm)	D50(μm)	D75(μm)	D90(μm)
							纯HA	96.94±2.07	64.68	85.96	111.6	137.5	159.2
Ag-HA-L	96.66±1.85	63.08	83.13	108.4	134.1	156.0
							Ag-HA-M	99.28±1.71	64.06	83.80	109.0	135.0	157.4
Ag-HA-H	106.9±1.71	68.89	88.45	113.4	139.2	160.8

利用X-射线衍射(XRD)来表征粉末的结构、相组成和晶粒大小(预喷涂)。在H&M Analytical Services，Inc.(Allentown，NJ，USA)进行该分析。将涂覆样品置于标准样品支架上，并使用Cu辐射在40kV/30mA下送入Philips PW3020衍射计中。在10°至70°的范围内进行扫描，其中步长为0.02°，且每个样品的计数时间为8小时。使用与能量分散X-射线分析(JEOL JSM-6460LV，日本)结合的扫描电子显微镜检术来检查涂层的表面形态、Ca/P比率、银含量以及涂层厚度。

通过将粉末(预喷涂)完全溶解在10％硝酸溶液中进一步分析银改性粉末的组成。从硝酸溶液中取出等分试样，利用电感耦合等离子体(ICP)质谱进行银离子浓度分析。

然后在Medicoat(瑞士)将这些银改性HA粉末用于常规真空等离子喷涂工艺中，用于含银HA涂层。其上被喷涂粉末的所有基底由研磨-退火的(mill-annealed)Ti6Al4V合金制备。平面圆盘样品的直径为12.6mm，厚度为3.1mm。在等离子喷涂之前对这些试样进行喷砂处理并清洁。对于纯HA粉末和银改性HA粉末两者的所有喷涂参数都相同。具有Ф12.6mm孔的不锈钢板用于安装Ti6Al4V试样。在涂覆处理之后，所喷涂的涂层用异丙醇冲洗。

按用于粉末的相同方式，利用X-射线衍射(XRD)来表征涂层的结构、相组成和晶粒大小。

使用来自四组中每一组的三个1英寸直径的Ti6Al4V试样作为沉积HA涂层或掺杂Ag的HA涂层的基底，按与ASTM F1147中所述方式类似的方式评价涂层的拉伸附着强度。

每个试样的背面和测试桩(testing stub)的端部均用80-砂纸轻微打磨，以增强环氧附着强度。用丙酮清洁试样的背面(即，未涂覆的表面)，并使其风干2-3分钟。

在背表面上使用一层FM1000粘合剂以及在涂覆表面上使用一层FM1000粘合剂，使拉伸测试桩粘着至每个试样的相反表面。这通过以下方式来完成：将该结构装配在固化夹具(curing fixture)中，并在2.3lbf(10N)的静重载荷下，338°F(170℃)的温度下，将该夹具在对流传热炉中放置130分钟(或者，如果两个夹具同时放在炉中则为135分钟)，以热固化该胶。在从炉中移出夹具并使其冷却至室温之后，去除静重，并从夹具中取出该结构。

通过使每种结构在0.10in/min(2.5mm/min)的移位速度(displacementrate)下经历拉伸载荷直到破坏，来测试每种结构。记录每种结构的高峰载荷和破坏方式。通过用高峰载荷除以试样的横截面积来测定拉伸附着强度。测试之后，检查每个试样，以确保胶没有渗透入基底，胶渗透入基底表示无效的试验。

对每种条件使用一种样品，用于评价银从涂层的释放。将涂覆的圆盘样品于37℃，在2mL PBS(pH＝7.4)中浸渍24、72和168小时。在每个时间点，取出1mL溶液，并在电感耦合等离子体(ICP)银分析之前，在4℃冰箱贮存于eppendorf试管中，在Environmental Testing&Consulting，Inc.Memphis，TN进行所述电感耦合等离子体银分析。将15μL浓硝酸添加到试管中，以防止银从溶液中沉积。

结果

银改性的HA粉末的XRD和ICP结果列在下表3中。总Ag(XRD)是来自粉末XRD相组成分析的结果。XRD结果表明，银作为金属银、硝酸银(即，含银的初始银离子交换反应介质)或氧化银存在。应注意，XRD仅测定金属银或银化合物的晶相。其不检测已经被取代进入HA晶体中的银。ICP用于测定银改性HA粉末中的银的总量。ICP分析测量存在的所有银-作为在HA晶体中取代的(银)而存在的银以及与HA晶体分离的，作为离散化合物(例如硝酸银、氧化银和金属银)而存在的银。包含在HA晶体中的银的量可以通过从ICP结果减去XRD来测定。例如，对于1wt％Ag-HA粉末，XRD结果显示在银改性的HA粉末中存在0.45wt％的银；然而，同样粉末的ICP结果显示在该改性粉末中的总Ag含量是0.98wt％，这接近设计的总银浓度。因此，这表示约54％的银被取代进入HA结构中。如通过VPS处理之后的XRD所证实的，来自硝酸银离子交换溶液的过量银被转化为其它的Ag相。

表3

图1表示纯HA(a)、Ag-HA-L(b)、Ag-HA-M(c)和Ag-HA-H(d)-涂覆的Ti6Al4V圆盘样品的扫描电子显微镜照片，其显示涂层的表面外观。一般而言，所有涂层看上去是均匀的并且覆盖Ti6Al4V基底。在含银HA涂层与纯HA涂层之间没有明显的差异。HA和Ag-HA-H样品的横截面表明涂层的厚度是约80μm(图2)。在遍及Ag-HA-H样品的涂层的不同位置处测量银浓度，如通过″x″标记所示。

表4中定量能量分散X-射线分析(EDXA)显示涂层中的Ca/P比和Ag含量。每个样品使用至少10-15个随机选择的区域，以收集用于该定量分析的光谱。Ca/P比随着银含量的增加而减小，这表明Ag在HA晶格中的取代随着Ag在涂层中的增加而增加。此外，经鉴定，Ag穿过Ag-掺杂的涂层的厚度(图2；表5)。

掺杂的HA涂层的Ag含量高于通过ICP所测量的Ag含量(表3)，这可能是由于与EDXA分析相关的表面粗糙度后生现象(surface roughnessartifacts)。

表4利用EDAX的Ca/P比和银含量分析

	Ca/P	Ag(wt％)
			HA	1.72	0
HA-L	1.65	1.2
			HA-M	1.61	2.7
HA-H	1.54	6.3

表5通过EDXA测量的穿过涂层厚度的Ag浓度。该样品的位置和相应部位示于图2中。

	位置1	位置2	位置3	位置4
					平均Ag浓度(wt％)	7.4+/-0.73	9.3+/-1.07	7.6+/-0.56	8.4+/-0.88

XRD结果呈现在表6中。使用Rietveld精修(Rietveld refinement)进行定量分析。除了HA相之外，在所有涂覆样品中鉴定到Ca₃(PO₄)₂CaO(磷酸四钙，TTCP)杂质相。在对照的纯HA-涂覆样品中没有检测到Ag。掺杂的HA涂层中的Ag含量接近示于表1中的设计Ag含量。Ag的损失或蒸发在VPS处理期间是最小的。此外，Ag添加到HA涂层中不显著改变Ag-HA-L和Ag-HA-M-涂覆样品的相组成；然而，相比对照的纯HA-涂覆样品，高Ag掺杂的HA涂层(即Ag-HA-H)显示轻微增加的HA相和减少的TTCP相。

表6VPS-涂覆样品的相测定和组成

定量相分析：重量分数(wt％)

＊ND：未检测到

另外，利用Scherrer公式计算HA相和Ag相的点阵参数和晶粒大小。这些结果描述在表7中。使用半峰宽度(FWHM)数据连同Scherrer公式来测定平均HA和Ag晶粒大小。Scherrer公式通过下式给出：

t = \frac{0.9 λ}{β \cos θ}

其中λ是X-射线波长，β是FWHM，以及θ是布拉格衍射角。

表7涂覆样品的点阵参数和晶粒大小

值得注意的是，所有涂覆样品(包括掺杂Ag的HA涂层)与化学计量标准HA相比具有显著更高的c/a比(表7)。这表明HA和Ag-HA-涂覆样品是非化学计量的，这通过示于表4中的Ca/P比来证实。

利用Scherref公式，VPS涂层中的平均HA晶粒大小范围是40.8nm至57.0nm。涂层中的晶粒大小与Ag含量之间没有相关性。涂层中的平均Ag晶粒大小也处于纳米级，范围为37.6nm至56.4nm。在VPS处理之后，Ag或银化合物转化为纳米结晶金属Ag。在熔融或部分熔融的HA或Ag-HA粉末经历等离子体并迅速沉积到基底上之后，由快速冷却产生这种纳米结晶HA相和金属Ag相。因此，没有时间发生晶粒生长。

拉伸附着强度结果在图3中报告。Ag-HA-H-涂覆样品的拉伸附着强度在所有测试样品中是最低的，并且不满足ISO要求(其要求最小粘合强度为15Mpa)。小于或等于l wt％的Ag添加(即，Ag-HA-L和Ag-HA-M)不显著影响涂层的拉伸附着强度。在涂层内发生所有的破坏。在含银HA涂层与纯HA涂层(示于图4的纯HA和Ag-HA-H)之间不存在断面外观上的明显差异。

银在PBS中的释放曲线示于图5中。其显示，在37℃下，在早至24小时所有涂覆样品释放Ag到PBS中。所释放的Ag在PBS中的浓度随时间而逐渐增加，直至第7天。释放进入PBS中的Ag的量是Ag剂量依赖性的。Ag-HA-H-涂覆样品释放最高量的银进入PBS中，而Ag-HA-L-涂覆样品释放最低量的Ag。

实施例2

利用硝酸银溶液的羟基磷灰石粉末改性

在去离子蒸馏水(DDH₂O)中制备两种不同浓度的硝酸银溶液，用于硝酸银溶液与HA粉末之间的离子交换反应。理论上，一些来自硝酸银溶液的Ag离子将取代来自HA结构的Ca离子，同时，一些银离子将被物理吸附到HA表面上。HA粉末中的目标银含量分别是1wt％和2wt％。硝酸银和HA粉末的质量列在表8中。

表8用于离子交换反应的硝酸银和HA粉末的质量

首先将硝酸银(BDH，Cat.#BDH0276-125G)溶解在容纳在3升玻璃烧杯中的DDH₂O中，然后根据表8将HA粉末(MEDICOATAG，粒度：-130μm+45μm)添加至所制备的硝酸银溶液中。将HA和硝酸银溶液在180RPM下于定轨摇床中在室温下搅拌3天，以允许发生均匀的离子交换反应。

在离子交换反应之后，使溶液置于80℃的烘箱中干燥，以蒸发水。然后将干燥且改性的HA粉末利用自动化研杵和研钵(Retsch，MortarGrinder RM200，Newtown，PA)轻微研磨，以使在干燥过程中形成的附聚物破碎。然后将磨碎的改性HA粉末通过100-325目筛(W.S.Tyler，Inc.，USA)筛分。丢弃任何大于150μm或小于45μm的HA粉末。在100-325目筛之间收集至少98％的HA粉末。

使用激光衍射粒度分析仪(型号LS13 320，Beckman Coulter，USA)进一步表征银改性的HA粉末。所有测量列在表9中。随着HA粉末中银含量的增加，平均粒度轻微增加。低和中等银HA粉末的粒度分布与对照的纯HA粉末相似。

表9纯HA和改性HA粉末的粒度和大小分布

然后这些银改性的HA粉末在Medicoat(瑞士)用在常规的真空等离子喷涂处理中，用于含银HA涂层。

基底制备

所有基底由研磨-退火的Ti6Al4V合金制备。平面圆盘样品直径为12.6mm，厚度为3.1mm。在瑞士Aarau的S&N对这些试样将喷砂处理并清洁。

涂层沉积

在瑞士的Medicoat利用常规的真空等离子喷涂系统施加涂层。纯HA粉末和银改性的HA粉末两者的所有喷涂参数均相同。使用具有Ф12.6mm孔的不锈钢板来安装Ti6Al4V试样。在涂覆过程之后，用异丙醇洗涤如此喷涂的涂层。

涂层表征技术

场致发射扫描电子显微镜术

按照SOP/MS/131，使用装备有双背散射检测器(Dual BSD)和EDAXGenesis 4000能量分散X-射线微量分析(EDX)系统的FEI Nova NanoSEM200扫描电子显微镜(SEM)检查样品。通过自粘性富碳圆盘(self adhesivecarbon rich discs)将每个样品试样的所有三个样品安装在25mm直径的铝样品桩(pin stub)上。利用低真空条件(0.6-1.0托，水蒸气)，在使表面充电(surface charging)最小化以及使表面信息最大化(使电子束穿透最小化)的10KV的中等加速电压下，检查样品是未涂覆的(无溅射涂层)。

用于获得EDX数据的分析条件是10KV加速电压，斑大小5.5，其中最终孔径(final aperture)在位置3，并且在20％至39％检测系统死时间(接近最佳条件)，X-射线计数率为约1500-4000计数/秒。EDX微量分析在10KV加速电压下进行，因为这为该研究提供了从感兴趣的化学元素激发x-射线所需的最小电子束能量，同时尝试使通过材料表面的样品穿透最小化。用低真空检测器(LVD)获得高分辨率二次电子成像，用气体分析检测器(GAD)获得高分辨率背散射电子成像。以未压缩TIFF格式记录代表性区域的数字图像。利用Image Pro Plus软件来估计样品HA1-Ag/HA(TO035B)和HA2-Ag/HA(TO035C)中富含银的材料的大小，使用SEM图像比例尺(scale bar)来提供空间校准。

X-射线衍射

利用X-射线衍射(XRD)来表征结构和相组成。该分析在瑞士的瑞士联邦材料监测与研究实验室(Swiss Federal Laboratories for MaterialsTesting and Research)进行。利用铜x-射线源，在20°与60°之间以0.02°的步长测量XRD图形。在每一步测量信号3秒，并且以每秒钟计数(cps)给出强度。以下述顺序使用狭缝和过滤器：1mm、0.5mm、Ni过滤器和0.2mm。在所喷涂的涂层上而不是在刮自表面的粉末上测量XRD(如ISO13779-3中所述)。通过修改版本的ASTM F 2024-00和ISO 13779-3标准分析羟基磷灰石涂层的XRD图形。不适合直接应用这两种标准测试方法，因为银的存在使结果不明显。修改用于分析涂层的标准和方法的原因在结果部分进行讨论。参比材料是羟基磷灰石(HAref76/800/7h)、Al₂O₃(AlphaAesar 99.99％)和银板(99.95％)。

涂层对Ti6Al4V基底的拉伸附着强度

使用来自三个组中的每一组的五个直径为1英寸的Ti6Al4V试样作为沉积HA或掺杂Ag的HA涂层的基底，以与ASTM F1147中所述的方式相似的方式评价涂层的拉伸附着强度。

每个试样的背面和测试桩的端部均用80-砂纸轻微打磨，以增强环氧附着强度。用丙酮清洁试样的背面(即，未涂覆的表面)，并使其风干2-3分钟。

在背表面上使用一层FM1000粘合剂以及在涂覆表面上使用一层FM1000粘合剂，使拉伸测试桩粘着至每个试样的相反表面。这通过以下方式来完成：将该结构装配在固化夹具中，并在2.3lbf(10N)的静重载荷下，于338°F(170℃)的温度下，将该夹具在对流传热炉中放置130分钟(或者，如果两个夹具同时放在炉中则为135分钟)，以热固化该胶。在从炉中移出夹具并使其冷却至室温之后，去除静重，并从夹具中取出该结构。

通过使每种结构在0.10in/min(2.5mm/min)的移位速度下经历拉伸载荷直到破坏，来测试每种结构。记录每种结构的高峰载荷和破坏方式。通过用高峰载荷除以试样的横截面积来测定拉伸附着强度。测试之后，检查每个试样，以确保胶没有渗入基底，胶渗透入基底表示无效的试验。

结果和讨论

SEM/EDX

图6a至图6c显示在低放大倍数下每种不同样品的二次电子图像，提供了每种样品类型的概况。在每种样品类型的表面外观上没有看到定性差异。所述表面具有圆形的、无定形的混合形态，具有一些聚集的成角微粒(angular particulates)区域，这表明在涂覆过程中使用的粉末原料熔融不完全。这与使用熔体喷涂沉积工艺(如真空等离子沉积)来涂覆金属试样一致。

图7a至图7c显示每种样品的表面形态的较高放大倍数二次电子图像。在每种样品上可以看到混合形态，其中无定形状材料与一些细小的成角微粒都存在。在HA层的表面上存在显微裂纹(图7c中明显)。在所有样品上观察到相似的微粒材料，并且无论样品类型或放大倍数如何，其表面外观上没有明显的定性差异，尽管在二次检测器图像和背散射检测器图像中的背散射电子信号揭示在样品Ag-HA1和Ag-HA2中另外存在微米级和纳米级银颗粒。

图8a至图8c显示在低放大倍数下每种不同样品的背散射电子图像，提供了每种样品类型的概况。在含银样品上可以看到若干明亮斑点/颗粒。从较高平均原子序数(Z)构成的材料背散射更多的电子，这在背散射电子图像上产生明亮区域。图8b和8c中的较明亮区域和非常明亮区域对应于富含银的材料的位置(银化合物比钙HA具有更高的平均Z，钙HA在背散射电子图像中以较暗区域表示)。来自每种样品的较高放大倍数的背散射图像示于图9a至9c中，其揭示含银样品中富含银的材料的空间分布的精细细节。

如通过背散射电子所显现，HA对照样品的组成是均相的(图9a)。根据图9b和9c中的组成，含银的样品Ag-HA1和Ag-HA2显示是非均相的。可以看到富含银的材料的一系列不同大小，其中在样品Ag-HA2中存在更多富含银的材料。对于含银样品而言，富含银的材料的尺寸的图像分析估计为约15nm至10μm。较高放大倍数检查突出了基于银的微粒的不同形状(图10a和10b和图11a和11b)。当在高放大倍数下观察时，显示每种样品(如图9c中的橙色圆环，以及图12中清晰可见的)上的浅灰色区域是由很多分散在钙HA表面处或钙HA表面之下的纳米级银微粒组成。

图13a显示通过EDX微量分析获得的元素点图，而样品Ag-HA2的相应区域的背散射图像示于图13b中。该点图证实了对应于富含银的材料的示于掺杂银的样品的背散射图像中的明亮特征和浅灰色特征(EDX图的蓝色区域)的证明。

图14a-b显示来自Ag-HA1样品和Ag-HA2样品的EDS光谱。箭头指示银的峰能量。其显示Ag-HA2在涂层中具有更高的Ag含量。

图15显示HA2样品上的离散的明亮颗粒的EDX光谱(图像中用″x″标记的斑点)。这些区域中的银浓度比没有离散的明亮颗粒的区域中的银浓度高得多，如在下面的图像中所示。这些明亮区域和所伴随的EDXA光谱证实了先前经由XRD分析所发现的金属颗粒的存在。

HA2样品上远离离散的明亮颗粒的涂层区域也经由EDXA进行评价，如在图16a-c中所示。这些缺乏明亮离散颗粒的区域也显示银的存在，尽管银以低得多的浓度存在。这证实了在HA基质内存在银取代，如先前通过XRD和ICP分析所示。

X-射线衍射

定性分析

图17中给出三种样品的XRD图形。样品HA显示羟基磷灰石的所有预期峰。Ag-HA1和Ag-HA2样品显示相同的HA峰，但是增加了在38.15°处的峰(在图17中，箭头指示峰)，其与金属银一致。在31.1°处观察到宽峰。该峰可能归因于非晶相或α-磷酸三钙(α-TCP)或β-磷酸三钙(β-TCP)。38.15°处的峰是来自银(Ag)的衍射，插图显示该峰的放大图像。

3.3.2结晶度分析

通过ASTM F 2024-00和ISO 13779-3标准来测量结晶度。两种方法的结果呈现在表10中。ASTM F 2024-00测量相比于外标(α-Al₂O₃)的38.5°与59°之间的峰的相对强度。这些峰未被羟基磷灰石中发现的普通杂质卷积(convoluted)，但是这些峰的相对强度比主要峰低，因此该方法较不灵敏。ISO 13779-3标准测量10个最强峰相比于100％羟基磷灰石参考的相对强度。这些测量在′所喷涂的(as sprayed)′样品上进行，而不是在刮自表面的粉末(如在ISO 13779-3中所规定)上进行。

3.3.3银分析

通过相比于纯银样品的相对强度来测量两种样品Ag-HA1和Ag-HA2的银含量。表10中给出银含量的结果。Ag-HA1样品的银含量为2.0±0.5％，Ag-HA2样品的银含量为2.5±0.5％。

表10.结晶度、β-TCP和银含量

3.5涂层对Ti6Al4V基底的拉伸附着强度

图18中报告拉伸附着强度结果。在所有测试样品中，Ag-HA1-涂覆样品的拉伸附着强度是最低的，但是即使该组的最低值仍满足ISO要求(其要求最小粘合强度为15Mpa)。在涂层内发生所有的破坏。在含银HA涂层与纯HA涂层之间的断面外观上没有明显差异。

实施例3用于生物医疗应用的梯度涂层

图19显示通过下述方法制备的本发明实施方式的实例(植入物基底(1510)[例如Ti6Al4V]，其具有含VPS HA(1512)和VPS AgHA(1514)的梯度涂层，顶层PLGA涂层含有β-TCP、Ag和布比卡因(1516))：

1.HA/Ag-HA涂层制备：利用离子交换反应对Ag-HA粉末(45-125μm)进行改性。涂层工艺参数与在我们的医用植入物制造工厂制备的标准真空等离子喷涂HA涂层相同。先后施加VPS HA涂层和VPS Ag-HA涂层。所涂覆的样品准备用于PLGA涂层。

2.银改性的β-TCP粉末制备：

1).将0.5gβ-TCP粉末(D₅₀约3μm)和145.8mg硝酸银溶解在55mL去离子蒸馏水中并在60℃搅拌1小时。

2).在60℃下使水蒸发过夜。

3).然后碾磨干燥粉末。或者，也可以将银改性的β-TCP冻干，以除去水，且所述碾磨步骤不是必要的。

4).然后将银改性的粉末随后在400℃下烧结2小时。

3.PLGA溶液制备：

1).将0.75g PLGA粒料(pellet)(85∶15)溶解在15mL二氯甲烷中并搅拌过夜。

2).将0.25g银改性的β-TCP和100mg布比卡因粉末溶解在PLGA溶液中并搅拌过夜。

4.PLGA涂层施加：将VPS HA/VPS Ag-HA涂覆的Ti6Al4V基底浸入PLGA溶液中并垂直取出，然后在空气中干燥过夜。

结果：顶部PLGA层的表面形态示于图20和21中。从EDXA光谱获得的定量分析示于表11中。

表11.顶部PLGA涂层的EDXA结果

元素	Wt％
		CK	65.23
OK	26.17
		PK	3.09
AgL	1.04
		CaK	4.48

实施例4

图22显示本发明的另一实施方式(植入物基底(1810)[例如Ti6Al4V]，其具有含VPS HA(1812)和VPS AgHA(1814)的梯度涂层，并且一层PLGA涂层含有β-TCP、Ag和布比卡因(1816)，以及PLGA珠层含有β-TCP、Ag和布比卡因(1818))。

这是证明Ag和布比卡因的量和释放持续时间可以通过在PLGA涂层的顶表面上添加PLGA珠而增加总的涂覆表面积来控制的实例。已知布比卡因在身体环境中具有迅速的释放曲线。为了具有连续的延长释放，将布比卡因并入PLGA珠中以减慢其在身体环境中的降解速率。

方法

1.PLGA珠制备：

1)以与实施例3相同的方式制备银改性的β-TCP粉末。

2)将0.25g银改性的β-TCP和100mg布比卡因粉末溶解在PLGA溶液中(0.75g PLGA在15mL二氯甲烷中)并搅拌过夜。

3)将5g十二烷基硫酸钠(SDS)溶解在500mL去离子蒸馏水中。

4)将含银的改性β-TCP和布比卡因的PLGA溶液在剧烈搅拌下逐滴添加至SDS溶液中。在1％SDS中搅拌24小时后，洗涤并收集从水-油-水双重乳化形成的珠。

5)将所收集的PLGA珠施加到也含银的改性β-TCP和布比卡因的顶部PLGA涂层上。

6)在70℃下使PLGA珠与PLGA涂层一起烧结12小时。

结果：表面形态示于图23、24和25中。利用EDXA分析表面组成，结果示于表12中。

表12：顶部PLGA涂层的EDXA结果

元素	Wt％
		CK	63.76
OK	26.16
		PK	3.53
AgL	1.54
		CaK	5.01

实施例5释放曲线

分别通过ICP分析和紫外光谱法来证实Ag、Ca和布比卡因从制备的涂层中的释放。

将涂覆样品在37℃下浸在3mL PBS中24和48小时。在每个时间点，用分光光度计(Nanodrop，Thermo)在265nm处测量布比卡因的释放。通过将适量的药物溶解在PBS中制备布比卡因标准品。PBS用作空白。布比卡因浓度示于表13中。

表13：在24小时和48小时，PBS中的布比卡因浓度

	布比卡因浓度(ppm)
		24小时	126
48小时	141

在24小时和48小时，PBS中的Ag、Ca和P浓度示于表14中。

表14：在24小时和48小时，PBS中的银和钙浓度(ppm)

	Ag	Ca
			24小时	0.393	1.58
48小时	0.392	1.35

降解研究证实涂层能够释放用于镇痛效应的布比卡因、用于抗微生物效应的Ag离子以及用于骨传导效应(osteoconductive effect)的Ca。

实施例6合成及表征方法的实例

合成

1).VPS梯度涂层：Ti6Al4V基底+纯VPS HA层+3％VPS AgHA层

2).将PLGA(85∶15)粒料溶解在二氯甲烷中并搅拌过夜

3).在硝酸银溶液中浸渍并搅拌β-TCP 2小时，以使离子交换反应发生

3).将布比卡因添加至上述TCP+硝酸银溶液中

4).将布比卡因+TCP+硝酸银溶液干燥过夜

5).将布比卡因+TCP+硝酸银的干燥粉末添加至溶解的PLGA溶液中，并搅拌过夜

6).使用上述含有布比卡因+TCP+硝酸银的PLGA溶液浸涂VPS梯度涂层

表征

1).SEM顶视图和横截面

2).EDAX-顶层和横截面的元素组成(Ca、P、Ag)

3).XRD-顶层的相组成(主要检测布比卡因)

4).XRD的另选方案：将顶层溶解在PBS中(3天)，随后分光镜分析布比卡因

实施例7合成及表征方法的其它实例

合成

1).溶胶-凝胶浸涂方法来制备Ag分级涂层，即Ti6Al4V基底+纯Ca-P层+2％Ag-Ca-P层

2).在氯仿中溶解PLGA(85∶15)粒料

3).添加镇痛药(例如非处方泰诺(over counter Tylenol))和Ag-CaP(2wt％Ag)粉末至PLGA中

4).使用所制备的PLGA聚合物溶液浸涂所述溶胶-凝胶Ag-Ca-P样品。

表征

1).在PBS和SBF中降解之前和之后的SEM顶视图

2).ToF-SIMS，以获得深度信息

3).XRD-相组成

4).在SBF中的体外生物活性评价(3天)

5).在PBS中溶解(24h、48h、72h)，以测量Ag浓度。

实施例8具有改性抗微生物磷酸钙涂层的多孔表面植入物的骨整合。

这里报告了用或者不用溶胶-凝胶形成的Ag改性的磷酸钙薄膜覆盖层(约1微米厚)制备的Ti6Al4V合金多孔表面植入物的机械拔出测试的结果。简要概括而言，该研究使用了4组兔，每组10只，所述兔具有横向植入其股骨内侧髁(medial femoral condyles)(与松质骨接界的多孔区域)中的多孔表面植入物(得自Innova-Sybron Dental Products的牙科植入物)。植入物定位和植入方法类似于在Tache等(2004)，Int J Oral MaxillofacImplants，19：19-29；Gan等(2004)，部分II：Short-term in vivo studies，Biomaterials.25：5313-5321；Simmons等(1999)，J Biomed Mater Res.，47：127-138中描述的那些，所有参考文献通过引用并入本文。′测试′植入物(每只动物在右腿或左腿具有一个-随机安置)用覆盖(overlaying)在Ti合金植入物的烧结多孔表面上的Ag-改性的磷酸钙涂层来制备。多孔表面区域由大约三层Ti6Al4V合金粉末(粒度为44至150微米)组成，所述Ti6Al4V合金粉末被烧结以便形成约300微米厚的多孔层，其孔隙度为35体积百分比(大约)，平均孔径大小在75至100微米范围内。互连的开孔结构适合通过不受抑制的骨向内生长来实现植入物固定。值得注意的是，该颗粒和孔径大小稍微小于常规用于矫形植入物的颗粒和孔径大小，但是已证实其是可接受的，并且实际上，其优选用于出现尺寸限制的牙科植入物应用。

溶胶-凝胶形成的磷酸钙覆盖层先前已经进行了研究(但是没有Ag+改性)，并且观察到其以未改性的形式促进更快速的骨向内生长(即，增强骨整合)。基于这些早期研究，由Smith&Nephew提出并开发了Ag-改性的磷酸钙涂层作为抗微生物和骨传导涂层，其将增加骨向内生长进入多孔表面植入物，并且降低早期植入后时期(early post-implantation period)期间，在植入物部位处感染的可能性。该增加的抗感染性在决定性的早期植入后治愈期期间是合意的，因为导致局部感染和炎性反应的微生物进入将抑制骨向内生长并可能导致植入失败。因此，在该早期期间降低细菌感染的可能性在改进设计为通过骨向内生长固定的矫形植入物的可靠性方面将具有可观的益处。

材料&方法

调查两种不同的含Ag+的磷酸钙配制物。在本报告中这些被称为′低′和′高′Ag水平。(在下面呈现的结果中，LC＝低Ag+(0.9wt％)磷酸钙，HC＝高Ag+(2.5wt％)磷酸钙涂层)。对动物研究进行设计，以致将LC植入物放置在20只兔的股骨髁中，其中′对照′植入物(即，无磷酸钙(NC)溶胶-凝胶涂层)在另一股骨中，类似地相对于′对照′植入物将HC植入物放置在其余20只兔中。在植入物放置之后，将来自每个组的十只兔供养(maintain)9天，然后使其安乐死，而另外十只兔在处死之前被供养16天。这提供了植入9天后的10个LC植入物，用于10个NC 9-天植入物进行对比；以及16天的类似数量的LC植入物，用于与NC植入物进行对比。类似地，在9天和16天植入物停留期后研究了两组HC植入物，每组10个，并与NC植入物进行比较。

将动物处死之后，通过机械拔出测试(如在上面讨论的先前报告的研究中)以及一些植入物-组织样品的组织学检查和评价，来评价就导致稳固植入物固定的有效骨向内生长而言的植入物性能。另外，通过在扫描电子显微镜中二次电子成像检查一些拔出的植入物，以表征植入物-组织界面区以及鉴定可能存在的任何骨状组织特征或纤维组织特征。机械拔出测试的优点在于该测试提供完整界面上的信息，而不是提供通过显微镜检查所观察到的选择区域上的信息。在动物安乐死之后，将用于机械测试的所有样本贮存在盐溶液中，并且在处死2小时内解剖股骨髁区域并进行测试。

对如上所述每组10个样品中的8个进行机械测试，将其余的两个样品用于组织学样品制备。拔出测试涉及将骨-植入物样品安装在确保植入物适当对准的定制的夹具中，并在移位控制(displacement control)下以1mm/min的速度施加拔出力。多孔表面植入物的逐渐变细(tapered)的形状以及仔细的样品对准确保了作用在骨-植入物接合处的可能有助于所测量的拔出力和界面刚度(surface stiffness)的摩擦力得以避免。最大拔出力和载荷-移位曲线的最大切线斜率用于测定抗拔出性和界面区(surfacezone)刚度。

将兔处死之后收集如上所述的每组10个样品中两个，并将其固定在10％缓冲福尔马林中，并进行处理以包埋在甲基丙烯酸甲酯中。使用金刚石扁平刀片切开所得的块，以制备沿着植入物的长轴在其正中平面厚度为大约200微米的切片。然后将这些样品安置在载玻片上并仔细研磨和抛光，以提供厚度约30至40微米的非脱钙切片。将′薄′切片用0.3％甲苯胺蓝和2％硼酸钠的1∶1混合物在50℃下染色15分钟，然后在0.3％亮绿(在2％乙酸中)中于室温下染色3分钟。通过光学显微镜术检查切片并如下所述记录外观。

针对不同的植入物对，对于磷酸钙涂覆的′测试′植入物对未涂覆的′对照′植入物，进行最大拔出力和已测界面区刚度值的统计分析(方差分析，其中植入物设计作为一种变量参数)。因此，将9-天LC植入物与放置在对侧兔股骨髁中的相应的9-天NC植入物进行比较，将9-天HC植入物与相应的9-天NC植入物进行比较，以及以相同方式将16-天成对植入物进行比较。另外，将9-天NC植入物与16-天NC植入物进行比较，以及将9-天HC植入物和16-天HC植入物进行类似比较。

结果&讨论

来自目前研究的机械测试结果呈现在表15中。

表15机械拔出测试概述

＊显著差异(p＝0.048)

#各对之间的显著差异(p＜0.01)

统计检验表明，对于所有的样品对而言，′测试′和′对照′植入物之间在最大拔出力和界面刚度方面都没有显著差异(显著差异对应于p＜0.05)。然而，对于LC和HC植入物两者而言，相比于9-天样品，16-天植入物的拔出力具有非常显著的增加(p＜0.01)。从9天到16天界面区刚度也显示增加，尽管该增加是显著的(p＝0.048)，但是该差异并非几乎与针对抗拔出性所观察到的一样大。这种有趣的结果表明，界面区发展了更强的对裂纹扩展和破裂的抵抗性，因为从9天到16天形成更广泛的组织和骨向内生长(即，形成′更强韧的′界面区)。从9-天到16-天植入期的增加与先前所报告的该兔股骨髁植入模型一致。

有趣地，Ag+-改性的磷酸钙覆盖层导致16-天植入期之后的界面刚度值尽管平均高于9-天植入物的值，但是并非显著不同。对于所烧结的非磷酸钙涂覆的以及Ag+-改性的磷酸钙涂层(低和高Ag+)而言，这种对9天的植入物移出的抵抗性表明，对于涂覆植入物，已经发生组织(骨)向内生长。

拔出植入物的SEM检查

通过二次电子发射扫描显微镜术检查已经进行机械测试的一些9-天植入物。

图26到29显示八张所收集的图像。图26a&b显示从9-天植入兔#1A得到的磷酸钙-涂覆的较低Ag+植入物(CL-9)的图像。尽管该植入物表现出较低的界面刚度和拔出力，但是对于展示矿化组织特性的区域，二次电子图像显示了广泛的组织附着和向内生长。图27a&b是从同一动物的另一个膝部拔出的未经涂覆的′对照′植入物(NCL-9)的图像。相比于来自对侧肢体的涂覆植入物(CL)，该植入物表现出更高的刚度和拔出力，并且显示了9天植入时期中预期的广泛组织附着和矿化组织向内生长。图28a&b和29a&b是所得到的含较高Ag+的磷酸钙涂覆植入物(图28a&b)的图像和相应的未涂覆的′对照′植入物的图像(图29a&b)的图像；(兔#1B，即，分别含有植入物CH-9和NCH-9)。

非机械测试植入物的BS-SEM检查

使用BS-SEM来收集组织-植入物界面区的图像，其中在经检查的切片上进行定量图像分析。对于定量评估(Quantimet图像分析程序)，选择来自植入物基底，沿着其多孔涂覆区域长度的约220微米宽的包层(envelope)(即，接近沿着植入物长度的多孔涂层末端但是不包括更外周区域的包层宽度；植入物端部也被排除)。利用Quantimet图像分析软件分析该区域。测定孔内的百分比骨面积(即，％[骨面积/孔面积])。该程序也允许测定多孔涂层的百分比孔隙率，其标称设计为35至40体积百分比。

图30至35显示所有样品类型的典型BS-SEM图像。对于具有CP覆盖层的植入物以及′对照′植入物，BS-SEM图像清楚显示在两个时期的矿化组织(骨)向内生长(浅灰色区域)。可利用孔隙内的骨百分比的定量图像分析的结果呈现在表16中。对于所分析的切片，将植入物长度分成四个部分进行分析，从而允许较高放大倍数图像用于分析。然后对四个测量进行平均，以给出每个植入物的百分比骨向内生长(和百分比孔隙率)。来自所有切片的数据包括在表16中，并且显示沿着植入物长度所观察到的变化。鉴于其中放置植入物的松质骨的结构，这并不令人惊讶。测定每种植入物的平均偏差和标准偏差。进行单因素方差分析，测定每只兔的对侧肢体中的植入物之间是否存在统计差异。统计学显著被认为在p＜0.05。通过Quantimet成像软件容易区分不同的区域(骨，Ti合金颗粒和未填充孔，或者至少未用骨填充)，这使得能够客观测定在可利用孔内的百分比骨填充。仅进行动物内比较(即每只动物的左腿和右腿)。这样提供7套用于比较，包括所有不同的条件(在9天和16天的低S-CP、高S-CP、对照)，其中每一种条件评估两只动物，一个除外。遗憾的是，一个丢失的植入物(兔2C)不能包括在内。

表16BS-SEM检查的定量图像分析的概括

尽管少量的样品被分析，但是定量图像分析的确提出一些令人感兴趣的额外发现。

9天数据表明，在两只兔(8A和8B)中，相比于其各自的‘对照′植入物(无CP覆盖层)，S-CP-改性的植入物(8A，低S-CP，以及8B，高S-CP)的％骨向内生长显著更高。被分析的另外两只9天兔没有显示显著的差异。

在16天，CP-改性的植入物与‘对照′植入物之间在骨向内生长方面不存在显著差异。

如前，这些发现表明，S-CP-覆盖层不抑制骨向内生长。事实上，BS-SEM图像和定量图像分析显示，添加S-CP覆盖层可促进更快速率的骨向内生长。

定量图像分析也用于证实植入物的百分比孔隙率。如使用Quantimet软件所测定的，所分析的17个切片的百分比孔隙率等于43.1±2.7％。

兔植入物的组织学评估

所检查的切片从16个组织-植入物块制备并在研究中使用，所述16个组织-植入物块收获自选自40只兔的8只兔。在这些用于组织学切片制备的16个样品中，植入物不存在于一个块中。推测该植入物(样品2C，16-天′低′Ag+)在放置后还未发生骨整合，但是从植入部位发生迁移。对其余64个植入物进行机械测试(拔出测试)，以测定植入物-骨界面区的剪切强度和界面刚度，如上所讨论。

在已经进行高或低处理的植入物与对照(未经处理的)之间没有明显的差异。在所有动物中，随着时间的骨向内生长的成熟是相同的。对于已经进行处理的植入物没有观察到反应，并且在周围的骨中没有明显的细胞死亡。图36至41显示每种条件的代表性显微镜照片，其显示所有植入物的骨向内生长的区域。该发现与上面报告的机械拔出测试结果一致。

概括&结论

1.拔出测试结果和拔出的植入物的SEM图像证实，对于具有Ag+-改性的磷酸钙溶胶-凝胶形成的涂层覆盖层的多孔表面植入物而言，到9天出现导致稳固的植入物固定的组织向内生长。

2.拔出试验表明，较低或较高添加Ag+的改性涂层表现相似。

3.如所预期的，用于移出植入物的拔出力随着植入时期的加长而增加，相比于9-天的样品，记录到16-天的植入样品具有显著更高的拔出力。然而，9天和16天植入样品的界面区刚度值没有显著差异，尽管16天植入物的平均值更高。

4.虽然来自本研究的改性磷酸钙涂覆的植入物的记录拔出力与先前研究(Tache等)中所报告的那些没有显著差异，但是观察到显著更高的界面区刚度值。该更高的界面刚度可能归因于在先前研究中所使用的植入物更长(9mm对7mm长度)。

5.向沉积在多孔涂覆Ti-6Al-4V植入物上的溶胶-凝胶磷酸钙膜添加Ag+不抑制骨的向内生长。进行测试的两种浓度的银看上去给出相似的结果。

实施例9-HA-Ag涂层的抗微生物活性

方法

评价来自实施例2的涂层的抗微生物活性。另外，还阴性对照(未经涂覆的Ti6Al4V基底)和阳性对照(Acticoat 7(Smith and Nephew)，已知具有抗微生物性能的含纳米结晶银的创伤敷料)进行评价。

样品培养方法

通过收获过夜的斜面培养物来制备含有约10⁴cfu/ml的试验有机体的悬浮液。以基于ASTM标准E2149-01(用于在动态接触条件下测定固定的抗微生物剂的抗微生物活性的标准测试方法)的方法测试试验试样。

将样品置于带低蒸发盖的24孔无菌组织培养板平底中，对于所测试的每个时间点，每个样品类型制备四个。另外，建立Acticoat 7的阳性对照样品和阴性培养物对照(每个时间点每个(对照)3个重复)。每个样品接种2ml试验有机体悬浮液，各平板用石蜡膜密封，以使培养物的蒸发最小化。使样品于37℃在150rpm搅拌下孵育有关的时期，在24、48和72小时进行声处理计数(sonicated counts)。声处理计数不适合于阳性和阴性方法对照样品。0时间样品未进行声处理计数，因为在没有时间发生定居(colonisation)的情况下，它们不会产生任何有关信息。

对于显示远离表面所表现的任何活性的另外的支持信息，在0、24、48和72小时从试验接种物进行计数，以计算悬浮液中的计数的对数减少。在所有时间点，进行3个重复取样，因为这是所有时间限制所允许的。

声处理计数

洗涤剂溶液中的声处理是从金属表面移除所附着的细胞以评估其数目的公认方法。本文中，其用来测定是否在具有含银HA涂层和非含银HA对照的样品上观察到不同的细菌生长水平。

在PBS中洗涤试样，然后抽吸掉(aspirate off)过量的(试样)，重复该过程另外5次，总共进行6次洗涤。将试样置于15ml Falcon试管中的9ml STS(0.85％盐&1％吐温20&0.4％巯基乙酸钠)中，并利用聚苯乙烯浮子在声处理水浴中漂浮。然后将样品在60Hz下声处理10分钟。

在最大回收稀释剂(Maximum Recovery Diluent，MRD)中将所得声波处理物(sonicate)稀释至10^-5，所有稀释在双份Aerobic Count Petrifilm(3M)上铺开(plated out)。然后在使用petrifilm读数仪计数之前，在32℃下孵育所得膜至少48小时。

声处理计数结果

图42和43示出了声处理计数的结果。相比于eMRSA 15(流行性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌15(epidemic MRSA 15)，英国医院分离物)，观察到在对抗表皮葡萄球菌(S.epidermidis)具有更大的表面计数降低，尽管在72小时时间点观察到反向生长(grow back)至等于最初的接种和同等的对照的水平。

来自悬浮液的计数

在适当的时期之后，从所有样品的重复1至3取样1ml接种物，并添加至9ml STS中。然后将该1ml(接种物)重复两次铺板(plated)，对于阴性对照，将1ml在MRD中连续稀释，在0时间稀释至10^-4，在24小时稀释至10^-5，然后稀释至10^-6，对于涂覆样品和阳性对照，在所有时间点，将1ml在MRD中稀释至10^-5。

对于未经涂覆样品和培养物对照，在0和24小时，分别来自从10^-2以及10^-3向下的稀释在双份Aerobic Count Petrifilm(3M)上铺开。对于涂覆样品，将所有稀释重复两次在Aerobic Count Petrifilm(3M)上铺板。在计数之前将所得板在32℃下孵育至少48小时。

悬浮液计数结果

图44和45示出了悬浮液计数的结果。来自悬浮液的计数可用来计算从零时间的计数的降低，并因此用来计算对数降低。对抗eMRSA 15，较低剂量的银显示出极小的杀死，但是的确使悬浮液中的数目保持静态。较高的银剂量的确杀死至检测限并维持其中的数目。两种剂量的银HA最初杀死表皮葡萄球菌直至低水平，但是在72小时出现有机体反向生长(growback)至与最初的有机体相当的水平。

实施例10-VPS Ag/HA样品的细胞毒性试验

评价来自实施例2的涂层的细胞毒性。另外，还对未经涂覆的Ti6Al4V试样(已知为无细胞毒性的阴性对照)进行评价。

方法

材料

未经涂覆的Ti6Al4V试样

VPS-羟基磷灰石(HA)试样-批次TO035A

含低剂量银(1％)的VPS-HA(HA1)-批次TO035B

含中等剂量银(2％)的VPS-HA(HA2)-批次TO035C

聚氯乙烯圆盘-批次TO024-90-02-01

高密度聚乙烯圆盘-批次TO024-90-02-02

Eaglesα-极限必需培养基(α-Minimum Essential Medium Eagles)(α-MEM)+10％胎牛血清-#9696、#9662、#9707

胰蛋白酶-EDTA-批号058K2373

锥虫蓝-Sigma T8154批号088k2379和批号047k2349

Vectashield封固剂，用于利用DAPI的荧光-Vector H-1200批号UO403

WST-1试剂-Roche 11644807001批号14473200

条件培养基的制备

利用ISO10993指南，计算所有试验样品和对照样品的表面积与体积之比，以测定每个样品所需的培养基体积，以制备样品的液体提取物(称为条件培养基)。对于HA、HA1、HA2和钛试样，所需的培养基体积是1.23ml/试样，将四个试样置于6-孔板的孔(n＝4)中，总体积为4.92ml。PVC和HDPE圆盘所需的培养基体积是1.33ml/圆盘，将四个圆盘置于6-孔板的孔(n＝4)中，总体积为5.32ml。这些组在6-孔板中的布置是随机的，以帮助降低板布置的影响。沿着这些板的边，6-孔板具有所添加的5.32ml培养基/孔，其充当组织培养塑料器具组(TCP)，因为该组仅用作试验对照并且因此无需包括在随机取样中。与试验材料一起孵育的培养基是α-MEM；这五个板在37℃，5％CO₂下孵育7天。

细胞接种

按照SOP/CB/006，使MC3T3-E1细胞传代进行计数。要求以5x10⁴/cm²接种细胞。以该密度在2x 96-孔板上接种168个孔，细胞现在是P13。在37℃，5％CO₂下培养细胞48小时。

条件培养基的施用

从96-孔板中去除培养基并用100μl适当的条件培养基替换，n＝6/样品组/处理/对照组。在37℃，5％CO₂下孵育2x 96-孔板24小时。

WST-1试验

使用WST-1试剂来量化暴露于条件培养基的细胞的代谢活性。将10μlWST-1试剂/孔添加至每一个96-孔板中。将板在37℃，5％CO₂下孵育1小时，摇动1分钟，然后在Multiskan读板仪(资产编号00005247)上分别在450nm和650nm的试验波长和参考波长处读数。对于每个孔，从试验波长减去参考波长，并计算和绘制每组的平均值，以表示细胞的代谢活性(见图46)。

结果和讨论

支原体试验

按照SOP/CB/069进行用DAPI染色的支原体试验。在该试验中使用的细胞被认为是支原体阴性的。

WST-1试验

在该试验中，相比于阳性细胞毒性对照组PVC和阴性对照组HDPE，HA1和HA2组刺激MC3T3-E1细胞的增加的代谢活性。然而，暴露于单独HA的细胞的代谢活性高于两种含Ag组中的任一组。暴露于Ti6Al4V组的细胞的代谢活性低于所有含HA组和阴性对照HDPE的细胞代谢活性。然而，Ti6Al4V的确刺激细胞的矿化至阳性对照水平的两倍的水平。使用TCP组作为细胞对照组，并且该组中的细胞以与阴性对照HDPE相似的水平代谢。注意，钛组中的细胞的代谢活性低于两个阴性对照的细胞代谢活性，但是存在来自该数据集的大的数据展开，如通过误差条所示。

结论

1％和2％银处的VPS Ag/HA样品将MC3T3-E1细胞的代谢活性增加至高于阳性和阴性对照的代谢活性水平的水平。然而，来自这些组的细胞的代谢活性低于单独HA组中的细胞。

技术人员将认识到，本发明的宽度和范围不应被任意上述示例性实施方式所限制，而是应当仅根据所附的权利要求及其等价物来定义。

Claims

1.用于医用植入物的涂层，其中所述涂层的至少一部分含有骨整合剂，并且所述涂层的该相同和/或不同部分含有抗微生物金属试剂。

2.权利要求1所述的涂层，其中所述抗微生物金属试剂作为离散颗粒存在于所述涂层的至少一部分中。

3.权利要求1或2所述的涂层，其中所述抗微生物金属包括银、铜和/或锌中的一种或多种。

4.权利要求2或3所述的涂层，其中所述离散颗粒是金属银或银化合物颗粒。

5.任一项前述权利要求所述的涂层，其中所述金属试剂作为离散金属银颗粒存在于所述涂层中。

6.权利要求4或5所述的涂层，其中所述金属银颗粒是球形或不规则形状。

7.权利要求6所述的涂层，其中所述金属银颗粒的直径大小为约15nm至约10μm。

8.任一项前述权利要求所述的涂层，其中所述金属试剂是银，并作为取代进入所述骨整合剂中的银存在于所述涂层中。

9.权利要求8所述的涂层，其中银取代的骨整合剂具有遍及所述涂层厚度均匀分布的银浓度。

10.权利要求9所述的涂层，其中所述银取代的骨整合剂含有按重量计约0.1％至约10％的银，优选按重量计约0.5％至约3.0％的银。

11.任一项前述权利要求所述的涂层，其中所述涂层是等离子喷涂层。

12.权利要求11所述的涂层，其中在还原条件下对含有抗微生物金属试剂的所述涂层的至少一部分进行等离子喷涂。

13.权利要求12所述的涂层，其中在真空中进行等离子喷涂。

14.任一项前述权利要求所述的涂层，其中所述抗微生物金属试剂的浓度足以具有抗细菌效果。

15.权利要求14所述的涂层，其中所述金属试剂的浓度是约0.1wt％至约10wt％。

16.任一项前述权利要求所述的涂层，其中所述骨整合剂是钙衍生物。

17.权利要求16所述的涂层，其中所述钙衍生物是羟基磷灰石和/或β-磷酸三钙中的一种或组合。

18.任一项前述权利要求所述的涂层，其中含有抗微生物剂的所述涂层的至少一部分具有遍及所述涂层的该部分的整个厚度分布的抗微生物剂。

19.任一项前述权利要求所述的涂层，其中所述涂层厚度大于约1μm，优选为约10μm至约200μm，更优选为约30μm至约100μm。

20.任一项前述权利要求所述的涂层，其中所述涂层对金属基底的拉伸附着强度大于或等于15Mpa。

21.任一项前述权利要求所述的涂层，其中所述涂层具有一种或多种骨传导、骨促进和/或抗微生物性能。

22.任一项前述权利要求所述的涂层，其中所述骨整合剂被以下物质中的一种或多种取代：碳酸盐、氟化物、硅、镁、锶、钒、锂、铜和/或锌。

23.医用植入物，其包含至少一个表面，其中所述至少一个表面至少部分被如任一项前述权利要求中所述的涂层涂覆。

24.制备抗微生物涂层的方法，其中通过离子交换法或溶胶-凝胶法制备含银的钙衍生物粉末，并且随后将其等离子喷涂到基底材料上。

25.权利要求24所述的方法，其中通过以下方法制备所述含银的钙衍生物粉末：

b.将所述经过离子交换并洗涤的钙衍生物干燥。

26.权利要求25所述的方法，其中在步骤(a)与(b)之间进行洗涤所述经过离子交换的钙衍生物粉末的额外步骤。

27.权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述钙衍生物是磷酸钙。

28.权利要求27所述的方法，其中所述磷酸钙是羟基磷灰石和/或β-磷酸三钙中的一种或组合。

29.权利要求25至28中任一项所述的方法，其中所述钙衍生物粉末与银盐溶液之间的离子交换反应在约20℃至95℃的温度下发生约24至168小时。

30.权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述银盐溶液是浓度为10^-2-10^-4M的硝酸银或氟化银，并且硝酸银与HA粉末的质量比在0.01-0.1的范围内。

31.权利要求26至30中任一项所述的方法，其中所述含银的钙衍生物粉末还被以下物质中的一种或多种取代：碳酸盐、氟化物、硅、镁、锶、钒、锂、铜和锌。

32.权利要求24所述的方法，其中通过以下的溶胶-凝胶法制备所述含银的钙衍生物粉末：

(a)混合钙、银和/或磷前体的组合，以获得均匀的溶胶-凝胶溶液；

(b)在20-95℃的温度下将所述溶胶-凝胶溶液老化，持续合适的时期；

(c)在高于室温的温度下干燥并煅烧所述溶胶-凝胶溶液，持续合适的时期；

33.权利要求32所述的方法，其中所述钙前体是硝酸钙。

34.权利要求32或33所述的方法，其中所述银前体是硝酸银。

35.权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述磷前体是磷酸二氢铵。

36.权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述Ag前体的浓度范围是约0.1wt％至10wt％，优选为0.5wt％至3.0wt％。

37.权利要求32至36中任一项所述的方法，其中将氟和碳酸盐前体与钙、银和磷前体混合，以获得均匀的溶胶-凝胶溶液。

38.权利要求37所述的方法，其中所述氟前体是氟化铵。

39.权利要求37或38所述的方法，其中所述碳酸盐前体是碳酸铵。

40.权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述F和/或碳酸盐前体的浓度为约10^-2-10^-3M。

41.权利要求32至40中任一项所述的方法，其中将碳酸盐、氟化物、硅、镁、锶、钒、锂、铜或锌前体或其组合与钙、银和磷前体混合，以获得均匀的溶胶-凝胶溶液。

42.权利要求24所述的方法，其中在喷涂之前含银的钙衍生物粉末配制物的大小分布基本等于天然的纯钙衍生物粉末。

43.制备抗微生物涂层的方法，其包括将含银的钙衍生物粉末等离子喷涂到基底上。

44.权利要求43所述的方法，其中在还原环境中进行所述等离子喷涂。

45.权利要求43或44所述的方法，其中等离子喷涂步骤导致形成金属银颗粒。

46.权利要求45所述的方法，其中所述银金属颗粒遍及所述涂层的厚度分布。

47.权利要求43至46中任一项所述的方法，其中不需要后处理热处理来进一步巩固所述涂层或使所述涂层与基底粘合。

48.权利要求43至47中任一项所述的方法，其中所述涂层形成自含银的钙衍生物粉末的均匀配制物。

49.权利要求48所述的方法，其中不需要将所述含银的钙衍生物粉末与其它含银粉末共混，以将银并入所述涂层中。

50.权利要求43至49中任一项所述的方法，其中所述钙衍生物粉末含有被吸附到所述粉末的表面上的至少部分过量的银反应物。

51.治疗需要外科植入物的患者的方法，所述方法包括对所述患者进行手术，将包含权利要求1至20中任一项所述的涂层的医用植入物插入所述手术部位中，以及手术之后将所述植入物留在原位，其中所述植入物降低在植入物部位的术后感染的风险或者消除在植入物部位的术后感染。