CN105926042A - 一种三维基因树生物芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三维基因树生物芯片，包括芯片基底、氧化锌纳米籽晶层、氧化锌纳米树干阵列、氧化锌纳米树枝结构、氧化锌纳米树叶结构和等离激元增强型结构，所述氧化锌纳米籽晶层均匀地分布于所述芯片基底上，所述氧化锌纳米树干阵列均布在所述氧化锌纳米籽晶层上，所述氧化锌纳米树枝结构设置于所述氧化锌纳米树干阵列上，所述氧化锌纳米树叶结构设置于所述氧化锌纳米树枝结构上，所述等离激元增强型结构设置于所述氧化锌纳米树叶结构上。本发明还公开了一种三维基因树生物芯片的制备方法。本发明的三维基因树生物芯片是具有比表面积大、标记聚集度高、产生的荧光信号强以及线性敏感度优异的新型生物芯片。

Description

一种三维基因树生物芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物芯片技术领域，尤其涉及一种三维基因树生物芯片及其制备方法。
背景技术
生物芯片这一名词最早是在二十世纪八十年代初提出的，它是生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微纳米加工和生物标记技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。
尤其是用于临床快速检测的基因芯片和蛋白芯片市场成长快速，目前保持着25％以上的年增长率。这两种芯片通过在不同孔位链接不同的DNA或抗体加荧光素，以实现对复杂生物系统(如含大量不同基因片段或未知的癌症蛋白)的特异性荧光标记与含量的探测。但这种传统的荧光染料存在着如下缺点：其浓度对于荧光亮度不敏感(线性敏感度差)，常常有20％的误差(在信号很亮时误差减小至10％以内)，而且不敏感度在含量较小(亮度弱)时更大，这就极大限制了测试精密度，不利于医生对病人病情的诊断、发展和治疗效果做出正确的判断。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本发明的一个目的在于提出一种亮度、检测率和敏感度都提升的三维基因树生物芯片及其制备方法。
根据本发明实施例的一种三维基因树生物芯片，包括芯片基底、氧化锌纳米籽晶层、氧化锌纳米树干阵列、氧化锌纳米树枝结构、氧化锌纳米树叶结构和等离激元增强型结构，所述氧化锌纳米籽晶层均匀地分布于所述芯片基底上，所述氧化锌纳米树干阵列均布在所述氧化锌纳米籽晶层上，所述氧化锌纳米树枝结构设置于所述氧化锌纳米树干阵列上，所述氧化锌纳米树叶结构设置于所述氧化锌纳米树枝结构上，所述等离激元增强型结构设置于所述氧化锌纳米树叶结构上。
根据本发明实施例的三维基因树生物芯片具有的详细的独立权利要求带来的优点。
另外，根据本发明上述实施例的三维基因树生物芯片还可以具有如下附加的技术特征：所述氧化锌纳米树叶结构上除了等离激元增强型结构外的面积上还设置有水相多聚赖氨酸层。
根据本发明实施例的一种三维基因树生物芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：液相合成氧化锌纳米晶颗粒，通过自由基链接的方式使其均匀、有控制分散地分布和固定在芯片基底上，以形成氧化锌纳米籽晶层，或在芯片基底上直接生长氧化锌纳米籽晶以形成氧化锌纳米籽晶层；
步骤二：利用溶剂热法在步骤一后的芯片基底上生长出分散有序的一维的氧化锌纳米树干阵列；
步骤三：采用溅射法或液相法在氧化锌纳米树干阵列上二次分散地布置氧化锌纳米籽晶层，然后利用液相法或CVD法在二次分散的氧化锌纳米籽晶层生长氧化锌纳米树枝结构和氧化锌纳米树叶结构；
步骤四：在液相中制备金或银纳米晶颗粒，利用自由基链接的方式使其有控制分散地分布在氧化锌纳米树叶结构上，再退火形成蠕虫状等离激元增强型结构，并修饰疏水基团；
步骤五：在氧化锌纳米树叶结构上除离激元增强型结构之外的面积处滴涂水相多聚赖氨酸，再低温退火使其均匀覆盖。
根据本发明的一个示例，所述步骤一包括步骤：配制1-10mmol/L的乙酸锌的乙醇溶液，采用匀胶旋涂法在芯片基底表面制备薄层，以150-300℃退火10-30min即可；
或包括步骤：分别配制1-10mmol/L六水合醋酸锌的甲醇溶液和5-20mmol/L的氢氧化钾的甲醇溶液，逐滴将1-3体积的氢氧化钾溶液加入到2-4体积的六水合醋酸锌溶液中，60-95℃反应1-3h，得到3-15nm左右尺度的氧化锌颗粒，将氧化锌纳米颗粒分散到乙醇中得到溶液，匀胶旋涂在芯片基底表面上；
或包括步骤：用磁控溅射法在氧化锌基因树上溅射纳米氧化锌颗粒，参数是：本底真空优于10-2Pa,工作气体为氩气，工作压强0.5-5Pa，溅射功率30-200W,厚度为5-15nm，150-350℃下快速热退火10-30min,形成分散的氧化锌籽晶，进而形成氧化锌纳米籽晶层。
根据本发明的一个示例，所述氧化锌纳米籽晶层也可以采用纳米金籽晶层，所述纳米金氧化锌纳米籽晶层的制备方法如下，方法一：用磁控溅射法在氧化锌基因树上溅射纳米金颗粒，参数是：本底真空优于10-2Pa,工作气体为氩气，工作压强0.5至5Pa，溅射功率30-120W，厚度为5-20纳米，200-350℃下快速热退火15min，形成分散的Au籽晶，充当生长ZnO的籽晶层，形成纳米金籽晶层；
方法二：室温下将0.2-2mL 1wt％的HAuCl4·3H2O加入20-200mL去离子水中磁力搅拌，30s-1.5min后加入0.1-1mL1％的柠檬酸钠溶液，再搅拌1-5min，加入0.2-2mL 0.075％的NaBH4(含1％柠檬酸钠)溶液，继续搅拌1-5min，得到金籽晶溶液，在4℃下保存备用后，在芯片基底生长形成纳米金籽晶层。
根据本发明的一个示例，所述步骤二包括以下步骤：配制反应的前驱水溶液，所述前驱水溶液包含0.01-0.1M六水合硝酸锌和0.01-0.1M六亚甲基四胺以及0.001-0.01M的聚乙烯亚胺，在60-95℃水浴条件下将带氧化锌纳米籽晶层的芯片基底竖直固定于溶液中，生长过程中加浓度为0-0.4M的氨水进行控制调节，生长时间2-6h。
根据本发明的一个示例，所述步骤三包括：
方法一，对步骤二后的芯片基底进行清洗，并300-500℃退火10-20min,在氧化锌纳米树干阵列重复生长氧化锌纳米籽晶层,配制反应的前驱水溶液，所述前驱水溶液包含0.01-0.1M六水合硝酸锌和0.01-0.1M六亚甲基四胺，在60-95℃水浴条件下将芯片基底竖直固定于溶液中，生长过程中加浓度为0-0.4M的氨水进行控制调节，生长时间2-6h；
方法二，在芯片基底上用磁控溅射生长5-15nm厚度的Au，200-350℃下快速热退火15-25min，形成分散的Au籽晶，充当ZnO树枝生长的籽晶层，形成有纳米金籽晶层的基因芯片，以份数比1:1的比例配制包含0.01-0.05M六水合硝酸锌和六亚甲基四胺的水溶液，在60-95℃水浴条件下将有纳米金籽晶层的基因芯片竖直固定于所述水溶液中，生长时间1-3h即可。
根据本发明的一个示例，所述步骤三还包括：
按照1：1：0.1～1：1：0.5比例配制含有六水合硝酸锌、六亚甲基四胺和柠檬酸钠的水溶液，将生长有氧化锌纳米树干阵列的芯片基底垂直固定于所述水溶液中，在60-90℃的环境中水浴生长5-10h，生长出氧化锌纳米树叶结构。
根据本发明的一个示例，所述步骤四还包括：室温下将0.1-1mL 1wt％的HAuCl4·3H2O加入50-200mL去离子水中磁力搅拌，1-3min后加入0.1-1mL1％的柠檬酸钠溶液，再搅拌1-3min，加入0.1-1mL 0.075％的NaBH4(含1％柠檬酸钠)溶液，继续搅拌1-5min，得到Au籽晶溶液，在4℃下保存备用；取100-400mL 0.01％的HAuCl4水溶液在微波炉中加热至沸腾，然后迅速加入0.2-0.8mL 1％的柠檬酸钠溶液和所述Au籽晶溶液，在微波炉中继续反应8min，停止加热，得到Au胶体溶液，在4℃下保存；用巯基丙酸(MPA)修饰芯片基底后备用，将该芯片基底竖直浸入以上所制备的Au溶胶溶液中，静置一夜后，在室温下风干，即可。
根据本发明的一个示例，所述步骤五还包括：步骤四后的芯片基底在0.005-0.02mol/L的十二硫醇的乙醇溶液中常温浸泡0.5-2h，再用水稀释聚合赖氨酸至0.05-0.2mg/ml，涂抹在上述芯片基底上使其包覆在等离激元增强型结构之外的芯片基底上，然后在60-90℃的烘箱里快速烘干。
本发明的附加方面和优点：相对于传统的平面结构的生物芯片，本发明的三维基因树生物芯片是具有比表面积大、标记聚集度高、产生的荧光信号强以及线性敏感度优异的新型生物芯片。
附图说明
图1是本发明的实施例一和六的三维基因树生物芯片的制备方法的流程图；
图2是本发明的实施例二和五的三维基因树生物芯片的制备方法的流程图；
图3是本发明的实施例三的三维基因树生物芯片的制备方法的流程图；
图4是本发明的实施例四的三维基因树生物芯片的制备方法的流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的一种三维基因树生物芯片，包括芯片基底、氧化锌纳米籽晶层、氧化锌纳米树干阵列、氧化锌纳米树枝结构、氧化锌纳米树叶结构和等离激元增强型结构。
其中，氧化锌纳米籽晶层均匀地分布于芯片基底上，氧化锌纳米树干阵列均布在氧化锌纳米籽晶层上，氧化锌纳米树枝结构设置于氧化锌纳米树干阵列上，氧化锌纳米树叶结构设置于氧化锌纳米树枝结构上，等离激元增强型结构设置于氧化锌纳米树叶结构上。
其中，氧化锌纳米籽晶层可以替换成金纳米籽晶层。
针对本申请中出现的化学药品，解释有：六水合硝酸锌(>＝99.0％,AR，国药),六亚甲基四胺(>＝99.0％,AR，国药)，二水合柠檬酸三钠(>＝99.0％,AR，国药)，聚乙烯亚胺(>＝99.0％，AR，阿拉丁)，氨水(25-28％，AR，国药)，二水合乙酸锌(>＝99.0％,AR，国药)，无水乙醇(98％,AR，国药)，去离子水(自制18.25MΩ·cm)，金靶(4N)，聚-L-赖氨酸盐酸盐(wt 15,000-30,000，简称多聚赖氨酸，sigma)，氧化锌粉末(3N,AR,国药)，石墨粉(3N，国药)，甲醇(>＝99.5,AR,国药)，氢氧化钾(>＝85,AR，国药),二水合醋酸锌(>＝99.0,AR，国药)，正十二硫醇(>＝98,CP，国药)，氩气(3N)。
实施例一：
如图1所示，(1)分别配制10mmol/L六水合醋酸锌的甲醇溶液和20mmol/L的氢氧化钾的甲醇溶液，逐滴将1体积的氢氧化钾溶液加入到2体积的六水合醋酸锌溶液中，85℃反应3h,得到5nm左右尺度的氧化锌颗粒，将氧化锌纳米颗粒分散到乙醇中(摩尔浓度为10mM)，形成胶状体，匀胶旋涂在芯片基底上，形成氧化锌纳米籽晶层；
(2)配制包含0.025M六水合硝酸锌和0.025M六亚甲基四胺以及0.005M的聚乙烯亚胺的水溶液，将(1)后的芯片基底竖直固定于该水溶液中，在90℃水浴条件下反应时间3h，可以得到氧化锌纳米树干阵列，生长过程中添加0.2M的氨水调节溶液PH值来控制生长速度；
将上述芯片基底在350℃退火10min，再次匀胶制备氧化锌纳米籽晶层，配制包含0.02M六水合硝酸锌和0.02M六亚甲基四胺的水溶液，将上述芯片基底竖直固定于溶液中，在90℃水浴条件下反应2h，可以得到侧枝氧化锌纳米树干；
(3)配制含有0.01M六水合硝酸锌，0.01M六亚甲基四胺，0.001M柠檬酸钠的水溶液(浓度均可同时加倍)，将上述芯片基底垂直固定于溶液中，在90℃的环境中水浴生长6h，可以在氧化锌纳米树干阵列侧面生长出氧化锌纳米树叶；
(4)室温下将1mL 1wt％的HAuCl4·3H2O加入100mL去离子水中磁力搅拌，1min后加入1mL1％的柠檬酸钠溶液，再搅拌1min，加入1mL 0.075％的NaBH4(含1％柠檬酸钠)溶液，继续搅拌5min，得到Au籽晶溶液，在4℃下保存备用；将200mL 0.01％的HAuCl4水溶液在微波炉中加热至沸腾，然后迅速加入0.8mL 1％的柠檬酸钠溶液和一定量的Au籽晶溶液，在微波炉中继续反应8min，停止加热，得到Au胶体溶液，在4℃下保存；将巯基丙酸(MPA)修饰后的芯片基底竖直浸入以上所制备的Au溶胶中(Au浓度为1mM)，静置一夜在室温下风干，即实现Au纳米颗粒在基因树上的静电自组装；再将芯片基底置于氮气氛下退火(350℃，15min)即在基因树上得到等离激元增强型结构；
(5)把获得的样品在0.01mol/L的十二硫醇的乙醇溶液中常温浸泡1h使等离激元增强型结构上链接疏水基团；用水溶液稀释聚合赖氨酸至0.1mg/ml，涂抹在样品上使其包覆在等离激元增强型结构之外的基因树上，然后在80℃的烘箱里快速烘干。
实施例二：
如图2所示，(1)分别配制10mmol/L六水合醋酸锌的甲醇溶液和20mmol/L的氢氧化钾的甲醇溶液，逐滴将1体积的氢氧化钾溶液加入到2体积的六水合醋酸锌溶液中，85℃反应3h，得到5nm左右尺度的氧化锌颗粒，将氧化锌纳米颗粒分散到乙醇中(摩尔浓度为10mM)，形成胶状体，匀胶旋涂在芯片基底上，形成氧化锌纳米籽晶层；
(2)配制包含0.025M六水合硝酸锌和六亚甲基四胺以及0.005M的聚乙烯亚胺的水溶液，将(1)后的芯片基底竖直固定于该水溶液中，在90℃水浴条件下反应时间3h，可以得到氧化锌纳米树干阵列，生长过程中添加0.2M的氨水调节溶液PH值来控制生长速度；
(3)将上述芯片基底在350℃退火10min，再次匀胶制备氧化锌纳米籽晶层，配制包含0.02M六水合硝酸锌和0.02M六亚甲基四胺的水溶液，将上述芯片基底竖直固定于溶液中，在90℃水浴条件下反应6h，可以得到侧枝氧化锌纳米树叶；
(4)室温下将1mL 1wt％的HAuCl4·3H2O加入100mL去离子水中磁力搅拌，1min后加入1mL1％的柠檬酸钠溶液，再搅拌1min，加入1mL 0.075％的NaBH4(含1％柠檬酸钠)溶液，继续搅拌5min，得到Au籽晶溶液，在4℃下保存备用；200mL 0.01％的HAuCl4水溶液在微波炉中加热至沸腾，然后迅速加入0.8mL1％的柠檬酸钠溶液和一定量的Au籽晶溶液，在微波炉中继续反应8min，停止加热，得到Au胶体溶液，在4℃下保存；将巯基丙酸(MPA)修饰的上述芯片基底竖直浸入以上所制备的Au溶胶中(Au浓度为0.5-2.0mM)，静置一夜在室温下风干，即实现Au纳米颗粒在基因树上的静电自组装，再将上述芯片基底置于氮气氛下退火(350℃，15min)即在基因树上得到等离激元增强型结构。
(5)把获得的样品在0.01mol/L的十二硫醇的乙醇溶液中常温浸泡1h使等离激元增强型结构上链接疏水基团，以避免聚合赖氨酸包覆其上；用水溶液稀释聚合赖氨酸至0.1mg/ml，涂抹在样品上使其包覆在等离激元增强型结构之外的基因树上。然后在80℃的烘箱里快速烘干。
实施例三：
如图3所示，(1)分别配制10mmol/L六水合醋酸锌的甲醇溶液和20mmol/L的氢氧化钾的甲醇溶液，逐滴将1体积的氢氧化钾溶液加入到2体积的六水合醋酸锌溶液中，85℃反应3h，得到5nm左右尺度的氧化锌颗粒，将氧化锌纳米颗粒分散到乙醇中(摩尔浓度为10mM)，形成胶状体，匀胶旋涂在芯片基底上，形成氧化锌纳米籽晶层；
(2)配制包含0.025M六水合硝酸锌和六亚甲基四胺的水溶液，将(1)后的芯片基底竖直固定于该水溶液中，在90℃水浴条件下反应时间3h，可以得到氧化锌纳米树干阵列，生长过程中添加0.2M的氨水调节溶液PH值来控制生长速度；
(3)在芯片基底上用磁控溅射生长5nm厚度的Au，300℃下快速热退火15min,形成分散的Au籽晶，充当氧化锌纳米籽晶层；配制含有0.01M六水合硝酸锌，0.01M六亚甲基四胺，0.001M柠檬酸钠的水溶液(浓度均可同时加倍，下同)，将上述芯片基底垂直固定于溶液中，在90℃的环境中水浴生长6h，可以在纳米树干侧面生长出氧化锌纳米树叶结构；
(4)首先制备6nm大小的Au籽晶溶液:室温下将1mL 1wt％的HAuCl4·3H2O加入100mL去离子水中磁力搅拌，1min后加入1mL1％的柠檬酸钠溶液，再搅拌1min，加入1mL 0.075％的NaBH4(含1％柠檬酸钠)溶液，继续搅拌5min，得到Au籽晶溶液，在4℃下保存备用；200mL 0.01％的HAuCl4水溶液在微波炉中加热至沸腾，然后迅速加入0.8mL 1％的柠檬酸钠溶液和一定量的Au籽晶溶液，在微波炉中继续反应8min，停止加热，得到Au胶体溶液，在4℃下保存；将巯基丙酸(MPA)修饰的芯片基底竖直浸入以上所制备的Au溶胶中(Au浓度为0.5-2.0mM)，静置一夜在室温下风干，即实现Au纳米颗粒在基因树芯片上的静电自组装。再将芯片置于氮气氛下退火(350℃，15min)即在基因树上得到等离激元增强型结构；
(5)把获得的样品在0.01mol/L的十二硫醇的乙醇溶液中常温浸泡1h使等离激元增强型结构上链接疏水基团，以避免聚合赖氨酸包覆其上；用水溶液稀释聚合赖氨酸至0.1mg/ml，涂抹在样品上使其包覆在等离激元增强型结构之外的基因树上。然后在90℃的烘箱里快速烘干。
实施例四
如图4所示，(1)分别配制10mmol/L六水合醋酸锌的甲醇溶液和20mmol/L的氢氧化钾的甲醇溶液，逐滴将1体积的氢氧化钾溶液加入到2体积的六水合醋酸锌溶液中，85℃反应3h，得到5nm左右尺度的氧化锌颗粒，将氧化锌颗粒分散到乙醇中(摩尔浓度为10mM)，形成胶状体，匀胶旋涂在芯片基底上，形成氧化锌纳米籽晶层；
(2)配制包含0.025M六水合硝酸锌和0.025M六亚甲基四胺以及0.005M的聚乙烯亚胺的水溶液，(1)后的芯片基底竖直固定于该水溶液中，在90℃水浴条件下反应时间3h，可以得到氧化锌纳米树干阵列，生长过程中添加0.2M的氨水调节溶液PH值来控制生长速度；
在基底上用磁控溅射生长5nm厚度的Au，300℃下快速热退火15min,形成分散的Au籽晶，充当氧化锌纳米籽晶层；配制包含0.02M六水合硝酸锌和0.02M六亚甲基四胺的水溶液，将上述芯片基底垂直固定于溶液中，在90℃的环境中水浴生长2h，可以在纳米树干侧面生长出氧化锌纳米树枝结构；
(3)配制含有0.01M六水合硝酸锌，0.01M六亚甲基四胺，0.001M柠檬酸钠的水溶液，将芯片基底垂直固定于溶液中，在90℃的环境中水浴生长6h，可以在纳米主干上生长出氧化锌纳米树叶。
(4)室温下将1mL 1wt％的HAuCl4·3H2O加入100mL去离子水中磁力搅拌，1min后加入1mL1％的柠檬酸钠溶液，再搅拌1min，加入1mL 0.075％的NaBH4(含1％柠檬酸钠)溶液，继续搅拌5min，得到Au籽晶溶液，在4℃下保存备用。200mL 0.01％的HAuCl4水溶液在微波炉中加热至沸腾，然后迅速加入0.8mL1％的柠檬酸钠溶液和一定量的Au籽晶溶液，在微波炉中继续反应8min，停止加热，得到Au胶体溶液，在4℃下保存。将巯基丙酸(MPA)修饰的基因树芯片竖直浸入以上所制备的Au溶胶中(Au浓度为1mM)，静置一夜在室温下风干，即实现Au纳米颗粒在基因树上的静电自组装。再将芯片置于氮气氛下退火(350℃，15min)即在基因树上得到等离激元增强型结构。
(5)把获得的样品在0.01mol/L的十二硫醇的乙醇溶液中常温浸泡1h使等离激元增强型结构上链接疏水基团，以避免聚合赖氨酸包覆其上；用水溶液稀释聚合赖氨酸至0.1mg/ml，涂抹在样品上使其包覆在等离激元增强型结构之外的基因树上。然后在90℃的烘箱里快速烘干。
实施例五：
如图2所示，利用籽晶层制备方法一在载玻片上制备分散的氧化锌纳米颗粒籽晶。具体为：配制8mmol/L的乙酸锌的乙醇溶液，采用匀胶旋涂法制备薄层，以350℃退火30min即可，形成带有氧化锌纳米籽晶层的芯片基底；
配制包含0.025M六水合硝酸锌和六亚甲基四胺以及0.005M的聚乙烯亚胺的水溶液，芯片基底竖直固定于该水溶液中，在90℃水浴条件下反应时间3h，可以得到氧化锌纳米树干阵列，生长过程中添加0.2M的氨水调节溶液PH值来控制生长速度；
在芯片基底上用磁控溅射生长5nm厚度的Au，300℃下快速热退火15min，形成分散的Au籽晶，充当氧化锌纳米籽晶层。配制包含0.02M六水合硝酸锌和六亚甲基四胺(1：1)的水溶液，将芯片基底竖直固定于溶液中。反应液在90℃水浴条件下反应，生长时间2h可以得到侧向氧化锌纳米树枝。
配制含有0.01M六水合硝酸锌，0.01M六亚甲基四胺，0.001M柠檬酸钠的水溶液，将芯片基底垂直固定于溶液中，在90℃的环境中水浴生长6h，可以在纳米主干上生长出氧化锌纳米树叶。
室温下将1mL 1wt％的HAuCl4·3H2O加入100mL去离子水中磁力搅拌，1min后加入1mL1％的柠檬酸钠溶液，再搅拌1min，加入1mL 0.075％的NaBH4(含1％柠檬酸钠)溶液，继续搅拌5min，得到Au籽晶溶液，在4℃下保存备用。200mL 0.01％的HAuCl4水溶液在微波炉中加热至沸腾，然后迅速加入0.8mL 1％的柠檬酸钠溶液和一定量的Au籽晶溶液，在微波炉中继续反应8min，停止加热，得到Au胶体溶液，在4℃下保存。将巯基丙酸(MPA)修饰的基因树芯片竖直浸入以上所制备的Au溶胶中(Au浓度为1mM)，静置一夜在室温下风干，即实现Au纳米颗粒在基因树上的静电自组装。再将芯片置于氮气氛下退火(350℃，15min)即在基因树上得到等离激元增强型结构。
把获得的样品在0.01mol/L的十二硫醇的乙醇溶液中常温浸泡1h使等离激元增强型结构上链接疏水基团，以避免聚合赖氨酸包覆其上；用水溶液稀释聚合赖氨酸至0.1mg/ml，涂抹在样品上使其包覆在等离激元增强型结构之外的基因树上。然后在90℃的烘箱里快速烘干。
实施例六：
如图1所示，(1)利用籽晶层制备方法一在载玻片上制备分散的氧化锌纳米颗粒籽晶。具体为：配制8mmol/L的乙酸锌的乙醇溶液，采用匀胶旋涂法制备薄层，以350℃退火30min即可，形成带有氧化锌纳米籽晶层的芯片基底；
(2)配制包含0.025M六水合硝酸锌和六亚甲基四胺以及0.005M的聚乙烯亚胺的水溶液，芯片基底竖直固定于该水溶液中，在90℃水浴条件下反应时间3h，可以得到氧化锌纳米树干阵列，生长过程中添加0.2M的氨水调节溶液PH值来控制生长速度；
将长有氧化锌的基底350℃退火10min,匀胶制备氧化锌纳米籽晶层，配制包含0.02M六水合硝酸锌和六亚甲基四胺的水溶液，将芯片基底固定于溶液中。反应液在90℃水浴条件下反应，生长时间2h可以得到侧枝氧化锌纳米树干。
(3)将芯片基底350℃退火10min。配制含有0.01M六水合硝酸锌，0.01M六亚甲基四胺，0.001M柠檬酸钠的水溶液，将芯片基底垂直固定于溶液中，在90℃的环境中水浴生长6h，可以在纳米树干侧面生长出氧化锌纳米树叶。
(4)室温下将1mL 1wt％的HAuCl4·3H2O加入100mL去离子水中磁力搅拌，1min后加入1mL1％的柠檬酸钠溶液，再搅拌1min，加入1mL 0.075％的NaBH4(含1％柠檬酸钠)溶液，继续搅拌5min，得到Au籽晶溶液，在4℃下保存备用。200mL 0.01％的HAuCl4水溶液在微波炉中加热至沸腾，然后迅速加入0.8mL1％的柠檬酸钠溶液和一定量的Au籽晶溶液，在微波炉中继续反应8min，停止加热，得到Au胶体溶液，在4℃下保存。将巯基丙酸(MPA)修饰的基因树芯片竖直浸入以上所制备的Au溶胶中(Au浓度为1mM)，静置一夜在室温下风干，即实现Au纳米颗粒在基因树上的静电自组装。再将芯片置于氮气氛下退火(350℃，5-15min)即在基因树上得到等离激元增强型结构。
(5)把获得的样品在0.01mol/L的十二硫醇的乙醇溶液中常温浸泡1h使等离激元增强型结构上链接疏水基团，以避免聚合赖氨酸包覆其上；用水溶液稀释聚合赖氨酸至0.1mg/ml，涂抹在样品上使其包覆在等离激元增强型结构之外的基因树上。然后在90℃的烘箱里快速烘干。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种三维基因树生物芯片，其特征在于，包括芯片基底、氧化锌纳米籽晶层、氧化锌纳米树干阵列、氧化锌纳米树枝结构、氧化锌纳米树叶结构和等离激元增强型结构，所述氧化锌纳米籽晶层均匀地分布于所述芯片基底上，所述氧化锌纳米树干阵列均布在所述氧化锌纳米籽晶层上，所述氧化锌纳米树枝结构设置于所述氧化锌纳米树干阵列上，所述氧化锌纳米树叶结构设置于所述氧化锌纳米树枝结构上，所述等离激元增强型结构设置于所述氧化锌纳米树叶结构上。
2.根据权利要求1所述的一种三维基因树生物芯片，其特征在于，所述氧化锌纳米树叶结构上除了等离激元增强型结构外的面积上还设置有水相多聚赖氨酸层。
3.一种三维基因树生物芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：液相合成氧化锌纳米晶颗粒，通过自由基链接的方式使其均匀、有控制分散地分布和固定在芯片基底上，以形成氧化锌纳米籽晶层，或在芯片基底上直接生长氧化锌纳米籽晶以形成氧化锌纳米籽晶层；
步骤二：利用溶剂热法在步骤一后的芯片基底上生长出分散有序的一维的氧化锌纳米树干阵列；
步骤三：采用溅射法或液相法在氧化锌纳米树干阵列上二次分散地布置氧化锌纳米籽晶层，然后利用液相法或CVD法在二次分散的氧化锌纳米籽晶层生长氧化锌纳米树枝结构和氧化锌纳米树叶结构；
步骤四：在液相中制备金或银纳米晶颗粒，利用自由基链接的方式使其有控制分散地分布在氧化锌纳米树叶结构上，再退火形成蠕虫状等离激元增强型结构，并修饰疏水基团；
步骤五：在氧化锌纳米树叶结构上除离激元增强型结构之外的面积处滴涂水相多聚赖氨酸，再低温退火使其均匀覆盖。
4.根据权利要求3所述的一种三维基因树生物芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤一包括步骤：配制1-10mmol/L的乙酸锌的乙醇溶液，采用匀胶旋涂法在芯片基底表面制备薄层，以150-300℃退火10-30min即可；
或包括步骤：分别配制1-10mmol/L六水合醋酸锌的甲醇溶液和5-20mmol/L的氢氧化钾的甲醇溶液，逐滴将1-3体积的氢氧化钾溶液加入到2-4体积的六水合醋酸锌溶液中，60-95℃反应1-3h，得到3-15nm左右尺度的氧化锌颗粒，将氧化锌纳米颗粒分散到乙醇中得到溶液，匀胶旋涂在芯片基底表面上；
或包括步骤：用磁控溅射法在氧化锌基因树上溅射纳米氧化锌颗粒，参数是：本底真空优于10-2Pa,工作气体为氩气，工作压强0.5-5Pa，溅射功率30-200W,厚度为5-15nm，150-350℃下快速热退火10-30min,形成分散的氧化锌籽晶，进而形成氧化锌纳米籽晶层。
5.根据权利要求3所述的一种三维基因树生物芯片的制备方法，其特征在于，所述氧化锌纳米籽晶层也可以采用纳米金籽晶层，所述纳米金氧化锌纳米籽晶层的制备方法如下：
方法一：用磁控溅射法在氧化锌基因树上溅射纳米金颗粒，参数是：本底真空优于10-2Pa,工作气体为氩气，工作压强0.5至5Pa，溅射功率30-120W，厚度为5-20纳米，200-350℃下快速热退火15min，形成分散的Au籽晶，充当生长ZnO的籽晶层，形成纳米金籽晶层；
方法二：室温下将0.2-2mL 1wt％的HAuCl4·3H2O加入20-200mL去离子水中磁力搅拌，30s-1.5min后加入0.1-1mL1％的柠檬酸钠溶液，再搅拌1-5min，加入0.2-2mL 0.075％的NaBH4(含1％柠檬酸钠)溶液，继续搅拌1-5min，得到金籽晶溶液，在4℃下保存备用后，在芯片基底生长形成纳米金籽晶层。
6.根据权利要求3所述的一种三维基因树生物芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤二包括以下步骤：配制反应的前驱水溶液，所述前驱水溶液包含0.01-0.1M六水合硝酸锌和0.01-0.1M六亚甲基四胺以及0.001-0.01M的聚乙烯亚胺，在60-95℃水浴条件下将带氧化锌纳米籽晶层的芯片基底竖直固定于溶液中，生长过程中加浓度为0-0.4M的氨水进行控制调节，生长时间2-6h。
7.根据权利要求3所述的一种三维基因树生物芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤三包括：
方法一，对步骤二后的芯片基底进行清洗，并300-500℃退火10-20min,在氧化锌纳米树干阵列重复生长氧化锌纳米籽晶层,配制反应的前驱水溶液，所述前驱水溶液包含0.01-0.1M六水合硝酸锌和0.01-0.1M六亚甲基四胺，在60-95℃水浴条件下将芯片基底竖直固定于溶液中，生长过程中加浓度为0-0.4M的氨水进行控制调节，生长时间2-6h；
方法二，在芯片基底上用磁控溅射生长5-15nm厚度的Au，200-350℃下快速热退火15-25min，形成分散的Au籽晶，充当ZnO树枝生长的籽晶层，形成有纳米金籽晶层的基因芯片，以份数比1:1的比例配制包含0.01-0.05M六水合硝酸锌和六亚甲基四胺的水溶液，在60-95℃水浴条件下将有纳米金籽晶层的基因芯片竖直固定于所述水溶液中，生长时间1-3h即可。
8.根据权利要求3所述的一种三维基因树生物芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤三还包括：
按照1：1：0.1～1：1：0.5比例配制含有六水合硝酸锌、六亚甲基四胺和柠檬酸钠的水溶液，将生长有氧化锌纳米树干阵列的芯片基底垂直固定于所述水溶液中，在60-90℃的环境中水浴生长5-10h，生长出氧化锌纳米树叶结构。
9.根据权利要求3所述的一种三维基因树生物芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤四还包括：室温下将0.1-1mL 1wt％的HAuCl4·3H2O加入50-200mL去离子水中磁力搅拌，1-3min后加入0.1-1mL1％的柠檬酸钠溶液，再搅拌1-3min，加入0.1-1mL 0.075％的NaBH4(含1％柠檬酸钠)溶液，继续搅拌1-5min，得到Au籽晶溶液，在4℃下保存备用；取100-400mL 0.01％的HAuCl4水溶液在微波炉中加热至沸腾，然后迅速加入0.2-0.8mL 1％的柠檬酸钠溶液和所述Au籽晶溶液，在微波炉中继续反应8min，停止加热，得到Au胶体溶液，在4℃下保存；用巯基丙酸(MPA)修饰芯片基底后备用，将该芯片基底竖直浸入以上所制备的Au溶胶溶液中，静置一夜后，在室温下风干，即可。
10.根据权利要求3所述的一种三维基因树生物芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤五还包括：步骤四后的芯片基底在0.005-0.02mol/L的十二硫醇的乙醇溶液中常温浸泡0.5-2h，再用水稀释聚合赖氨酸至0.05-0.2mg/ml，涂抹在上述芯片基底上使其包覆在等离激元增强型结构之外的芯片基底上，然后在60-90℃的烘箱里快速烘干。
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