CN105861639B - 一种快速鉴定食用向日葵杂交种sh361真实性和纯度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，通过在大量的SSR引物中筛选出SR‑57、SR‑123、SR‑830、SR‑1040和SR‑1164，并在上述引物下获得了适于以食用向日葵杂交种SH361及其亲本标准向日葵种子A436和R06‑1264‑1的基因组DNA为模板的PCR扩增反应的最优组合，对比通过凝胶电泳处理获得的食用向日葵杂交种SH361及其标准向日葵种子A436和R06‑1264‑1的电泳图谱，判定所述食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的鉴定，该方法方便、快捷，操作步骤简单，能够在短时间内对大量的待测食用向日葵杂交种SH361进行快速鉴定，测定结果准确。
Description
技术领域
本发明属于农业分子生物学领域，具体涉及一种快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法。
背景技术
向日葵(Helianthus annuus L.)为菊科(Composicae)向日葵属的双子叶植物。向日葵原产于北美洲西南部，是唯一一种起源和驯化于北美洲并在全球范围内大面积栽培的作物。向日葵分为油用型向日葵和食用型向日葵，染色体基数均为17，有二倍、四倍、六倍不同倍数水平，其中栽培种为二倍体，属虫媒异花授粉作物。向日葵属喜光性短日植物，全生育期有效积温≥1800～2600℃；耐旱耐盐碱，耐瘠薄，对土壤有极广的适应性，最适宜的土壤为壤土和沙壤土。因此，在我国北方干旱、降雨少、土壤盐碱化严重的地区，向日葵成为当地农民脱贫致富、增产增收的经济作物。随着向日葵育种技术的不断发展和杂交品种的广泛推广，向日葵杂交种的真实性与品种纯度鉴定已越来越成为新品种保护以及保护种植户利益的必要手段。
向日葵杂交种的真实性和纯度是衡量种子质量的重要指标，直接影响农作物的产量、品质和农民的利益。快速、准确、简便、经济地鉴定杂交向日葵种子真实性对育种和农业生产都具有重要意义。传统的向日葵杂交种的真实性与品种纯度鉴定采用形态鉴定法，依赖于品种表型差异，而形态性状的表现受环境影响较大，且形态鉴定法工作量大、鉴定周期长、成本高、受季节限制。
随着分子生物学技术的发展，分子标记技术越来越多的应用于农作物种子的真实性与品种纯度鉴定。分子标记鉴定技术是以DNA分子多态性为基础的一种遗传标记，能稳定遗传，可以反映生物的个体和群体特征。由于分子标记可以直接反映DNA水平上的差异，具有高度的专一性和特异性，用于鉴定种子纯度的分子标记主要的方法有RAPD、SSR和SCAR。其中SSR(simple sequence repeats)标记技术具有数量丰富、多态性高、共显性遗传、扩增稳定、易于检测等方面的优点，已在许多农作物遗传连锁图谱的构建、遗传多样性、标记和定位基因以及分子标记辅助方面的应用。SSR标记通常具有共显性的特点，F1杂交种具有双亲等位基因的互补带型。鉴于不育系和其同型保持系遗传背景基本一致，只在不育基因、保持基因等特征基因上存在差异，据此特征基因选择DNA分子标记进行分析，从而实现有效地区别和鉴定。SSR标记已成为现阶段用于鉴定种子纯度的常用方法,已广泛应用于玉米、水稻、大豆的新品种纯度鉴定。但是目前在食用向日葵杂交种使用SSR分子标记技术鉴定其真实性和纯度的报道鲜有，建立一套适于食用向日葵杂交种真实性和纯度鉴定的SSR分子标记技术具有重要意义，可以克服传统的田间小区种植鉴定所带来的不足。
SH361是北京三瑞农业科技有限公司2012年选育的食用向日葵晚熟杂交种，其亲本组合为A436×R06-1264-1，生育期为118天左右；幼苗生长整齐，长势强；叶片上挺，卵圆形，叶片数30片左右，叶色黄绿，叶片干净，株型紧凑；开花期一致，舌状花黄色；植株弯曲度较大、株高190-220厘米左右；抗倒伏能力强；单盘粒数1010粒，单盘粒重126.90克，粒长2.20厘米左右，宽0.88厘米，百粒重17.71克；籽粒色泽为黑色白边有细白色条纹,色泽鲜亮,有光泽,籽仁饱满，外观商品性好；口感香甜，出仁率51.31％。该品种抗霜霉病，中抗黄萎病；菌核病的发生率较低。该组合丰产性良好，最高亩产可达到320千克，适合各类田块种植，中高肥力的田块种植更能充分发挥品种潜力。为保证该优质品种的最大经济效益及其产业化的发展，需要一种权威的、高效准确的检测方法来鉴定所述食用向日葵杂交种SH361的真实性和品种纯度，加快杂交种的质量检测进程。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，所述方法方便、快捷，操作步骤简单，能够在短时间内对大量的待测食用向日葵杂交种SH361样品进行快速鉴定，且测定结果准确。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，包括如下步骤：
(1)分别取由待测食用向日葵杂交种SH361以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用常规的CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA；
(2)以步骤(1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计如下SR-57、SR-123、SR-830、SR-1040和SR-1164引物中的至少一种，分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增；
SR-57-F:5’-TTCCATTTCCACCATTTTGG-3’；
SR-57-R:5’-CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3’；
SR-123-F:5’-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3’；
SR-123-R:5’-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3’；
SR-830-F:5’-CAAGTGCATTAGGTGGTTCTAACA-3’；
SR-830-R:5’-GCCCTCTGACTGTTGTATGACTG-3’；
SR-1040-F:5’-CTGCTGATCGTTTCTTGGATAGA-3’；
SR-1040-R:5’-TGCTAATCCTTCTAATCAACTTCCAC-3’；
SR-1164-F:5’-TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3’；
SR-1164-R:5’-ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3’；
(3)分别将步骤(2)获得的各样本PCR扩增产物进行6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳处理，得到所述待测食用向日葵杂交种SH361以及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱；
(4)对比上述杂交种SH361以及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，若所述杂交种SH361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则判定所述待测食用向日葵杂交种SH361为真实；反之，为假。
所述待测食用向日葵杂交种SH361的品种纯度按照公式所述杂交种SH361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带的样本种子数/检测的样本种子总数×100％计算得到所述待测食用向日葵杂交种SH361的品种纯度。
优选的，所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，在所述步骤(2)中，所述引物选自引物SR-57、引物SR-123、引物SR-830、引物SR-1040和引物SR-1164中的任意两种。
所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，所述步骤(2)中，所述PCR反应体系包括：
DNA模板，30ng，1μL；
引物,0.2μM,1μL；
10×EasyTap Buffer for PAGE(扩增缓冲液，含Mg2+)，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
EasyTap DNA Polymerase for PAGE(Taq DNA聚合酶)，2.5units，0.5μL；
ddH2O，17μL。
所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min,获得的扩增产物4℃或-20℃保存，备用。
所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，所述步骤(3)中，所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g；
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L。
所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性的方法，所述步骤(3)中包括如下步骤：取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1x上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染料浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪，在波长为302nm紫外光激发下拍照。
所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性的方法，所述步骤(1)中，所述食用向日葵的基因组DNA的提取步骤具体包括：
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清600-800μL至2ml离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清400-600μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清300-400μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得。
所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性的方法，所述步骤(1)中还包括将提取得到的基因组DNA模板进行定量检测和/或质量检测的步骤；
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用。
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×Loading Buffer混合，并加入到含有体积比为万分之一的10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用。
本发明提供了一种由上述的方法在检测及鉴定食用向日葵杂交种真实性和品种纯度领域的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性的方法，通过对大量向日葵的SSR引物进行筛选研究，特定选择引物SR-57、SR-123、SR-830、SR-1040和SR-1164中的一个或多个做为引物，对提取的食用向日葵杂交种SH361及其亲本种植的向日葵的基因组DNA进行PCR扩增，然后经凝胶电泳获得食用向日葵杂交种SH361及其亲本的电泳图谱，用于所述食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的检测及鉴定，该检测方法方便、快捷，操作步骤简单，能够在短时间内对大量的待测食用向日葵杂交种SH361样品进行快速鉴定，测定结果准确、稳定可靠、检测费用低；
(2)本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，特定选择引物SR-57、SR-123、SR-830、SR-1040和SR-1164中的任意两种做为引物进行PCR扩增，使得对所述食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的检测及鉴定更加准确可靠；
(3)本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，通过优化PCR的反应体系对向日葵的基因组DNA进行PCR扩增，更加有助于快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法的优化，通过优化的PCR的扩增程序对食用向日葵的基因组DNA进行PCR扩增，能够快速准确的测定待测食用向日葵杂交种SH361的真实性和品种纯度；
(4)本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，通过优化食用向日葵基因组DNA的提取步骤，获得了纯度较高的DNA，更加有利于向日葵基因组DNA的PCR扩增，使得对食用向日葵杂交种SH361的鉴定结果更加准确；
(5)本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，通过改进变性聚丙烯酰胺凝胶显影步骤，步骤简单、安全，获得的电泳图谱清晰，便于对食用向日葵杂交种SH361的品种鉴定，检测结果准确。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例1的食用向日葵杂交种SH361以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱；
图2是本发明实施例2的食用向日葵杂交种SH361以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱；
图3是本发明实施例3的食用向日葵杂交种SH361以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱；
图4是本发明实施例4的食用向日葵杂交种SH361以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱；
图5是本发明实施例5的食用向日葵杂交种SH361以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱。
具体实施方式
本发明所使用的主要试剂如下：
RNase A生产厂家为北京全式金生物技术有限公司，型号为GE101；
GelSafe核酸染料生产厂家为北京原平皓生物技术有限公司，型号为EP106-01；
所使用的SSR引物生产厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司；
EasyTap Buffer for PAGE、dNTPs、EasyTap DNA Polymerase for PAGE和6×Loading Buffer生产厂家均为北京全式金生物技术有限公司、型号为AP112-02；
TEMED生产厂家为SIGMA，型号为T8133；
本发明所使用的主要设备如下：
高速冷冻离心机生产厂家为SIGMA、型号为3K15；
电泳仪生产厂家为北京市六一仪器厂，型号为DYY-8C；
水平电泳槽生产厂家为北京市六一仪器厂，型号为DYCP-31E；
凝胶成像系统生产厂家为北京赛智创业科技有限公司，型号为ChampGe15000。
实施例1
本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，包括如下步骤：
(1)分别取由待测食用向日葵杂交种SH361、以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA，具体步骤如下：
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清750μL至2mL离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清500μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清400μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一的10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)以步骤(1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计引物SR-57，分别对所述基因组DNA进行PCR扩增；
SR-57-F:5’-TTCCATTTCCACCATTTTGG-3’；
SR-57-R:5’-CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3’；
PCR反应体系如下：
DNA模板，30ng，1μL；
引物,0.2μM，1μL；
10×EasyTap Buffer for PAGE(扩增缓冲液，含Mg2+)，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
ddH2O，17μL；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，获得的扩增产物4℃保存，备用；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳包括如下步骤：
所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶成分包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L；
A)配制尿素6％变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis＝19:1)：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)收集食用向日葵杂交种SH361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1种植得到的标准向日葵按照上述步骤(1)-(3)所获得的电泳图谱，将所述待测向日葵杂交种SH361的图谱与其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的图谱进行比对，如图1所示，M为分子量标准，P1、P2为食用向日葵杂交种SH361的亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1，F1为食用向日葵杂交种SH361，从图中可以看到所述待测食用向日葵杂交种SH361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH361为真实的。
实施例2
本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，包括如下步骤：
(1)分别取由待测食用向日葵杂交种SH361、以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA，具体步骤如下：
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清600μL至2mL离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清400μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清300μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一的10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)以步骤(1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计引物SR-123分别对各所述基因组进行PCR扩增；
SR-123-F:5’-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3’；
SR-123-R:5’-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3’；
PCR反应体系如下：
DNA模板，30ng，1μL；
引物,0.2μM，1μL；
10×EasyTap Buffer for PAGE(扩增缓冲液，含Mg2+)，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
ddH2O，17μL；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，获得的扩增产物4℃保存，备用；
(3)将步骤(2)获得的各样本PCR扩增产物进行6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳包括如下步骤：
所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶成分包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L；
A)配制尿素6％变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis＝19:1)：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)对比上述杂交种SH361以及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，如图2所示，M为分子量标准，P1、P2为食用向日葵杂交种SH361的亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1，F1为食用向日葵杂交种SH361，从图中可以看到所述待测食用向日葵杂交种SH361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH361为真实的。
实施例3
本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，包括如下步骤：
(1)分别取由待测食用向日葵杂交种SH361、以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA，具体步骤如下：
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清800μL至2mL离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清600μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清350μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一的10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)以步骤(1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计引物SR-830分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增；
SR-830-F:5’-CAAGTGCATTAGGTGGTTCTAACA-3’；
SR-830-R:5’-GCCCTCTGACTGTTGTATGACTG-3’；
PCR反应体系如下：
DNA模板，30ng，1μL；
引物,0.2μM，1μL；
10×EasyTap Buffer for PAGE(扩增缓冲液，含Mg2+)，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
ddH2O，17μL；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，获得的扩增产物4℃保存，备用；
(3)将步骤(2)获得的各样本PCR扩增产物进行6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH361以及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳包括如下步骤：
所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶成分包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L；
A)配制尿素6％变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis＝19:1)：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)对比上述杂交种SH361以及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，如图3所示，M为分子量标准，P1、P2为食用向日葵杂交种SH361的亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1，F1为食用向日葵杂交种SH361，从图中可以看到所述待测食用向日葵杂交种SH361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH361为真实的。
实施例4
本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，包括如下步骤：
(1)分别取由待测食用向日葵杂交种SH361、以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA，具体步骤如下：
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清700μL至2mL离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清500μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清400μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一的10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)以步骤(1)的所得的各所述基因组DNA为模板，设计引物SR-1040分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增；
SR-1040-F:5’-CTGCTGATCGTTTCTTGGATAGA-3’；
SR-1040-R:5’-TGCTAATCCTTCTAATCAACTTCCAC-3’；
PCR反应体系如下：
DNA模板，30ng，1μL；
引物,0.2μM，1μL；
10×EasyTap Buffer for PAGE(扩增缓冲液，含Mg2+)，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
ddH2O，17μL；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，获得的扩增产物4℃保存，备用；
(3)将步骤(2)获得的各样本PCR扩增产物进行6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳包括如下步骤：
所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶成分包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L；
A)配制尿素6％变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis＝19:1)：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)对比上述杂交种SH361以及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，如图4所示，M为分子量标准，P1、P2为食用向日葵杂交种SH361的亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1，F1为食用向日葵杂交种SH361，从图中可以看到所述待测食用向日葵杂交种SH361同时具有其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH361为真实的。
实施例5
本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，包括如下步骤：
(1)分别取由待测食用向日葵杂交种SH361、以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA，具体步骤如下：
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清650μL至2mL离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清550μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清300μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一的10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)以步骤(1)的所得的各所述基因组DNA为模板，设计引物SR-1164分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增；
SR-1164-F:5’-TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3’；
SR-1164-R:5’-ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3’；
PCR反应体系如下：
DNA模板，30ng，1μL；
引物,0.2μM，1μL；
10×EasyTap Buffer for PAGE(扩增缓冲液，含Mg2+)，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
ddH2O，17μL；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，获得的扩增产物4℃保存，备用；
(3)将步骤(2)获得的各样本PCR扩增产物进行6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳包括如下步骤：
所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶成分包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L；
A)配制尿素6％变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis＝19:1)：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)对比上述杂交种SH361以及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，如图5所示，M为分子量标准，P1、P2为食用向日葵杂交种SH361的亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1，F1为食用向日葵杂交种SH361，从图中可以看到所述待测食用向日葵杂交种SH361同时具有其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH361为真实的。
实施例6
本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，包括如下步骤：
(1)分别取由待测食用向日葵杂交种SH361、以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA，具体步骤如下：
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清750μL至2mL离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清500μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清400μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一的10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)以步骤(1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计引物SR-57和引物SR-1164分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增；
SR-57-F:5’-TTCCATTTCCACCATTTTGG-3’；
SR-57-R:5’-CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3’；
SR-1164-F:5’-TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3’；
SR-1164-R:5’-ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3’；
PCR反应体系如下：
DNA模板，30ng，1μL；
引物,0.2μM，1μL；
10×EasyTap Buffer for PAGE(扩增缓冲液，含Mg2+)，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
ddH2O，17μL；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，获得的扩增产物4℃保存，备用；
(3)将步骤(2)获得的各样本PCR扩增产物进行6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳包括如下步骤：
所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶成分包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L；
A)配制尿素6％变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis＝19:1)：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)对比上述杂交种SH361以及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，若所述待测食用向日葵杂交种SH361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH361为真实的。
实施例7
本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，包括如下步骤：
(1)分别取由待测食用向日葵杂交种SH361、以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA，具体步骤如下：
a)取所述食用向日葵真叶10mg(约1cm2)置于装有研磨珠(D＝0.6mm不锈钢珠)的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于液氮中待用；
b)取出步骤a)的离心管并加入1000μL预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65℃下水浴反应50min，每10min取出所述离心管上下颠倒混匀一次；
c)将步骤b)反应后的离心管放入4℃离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取上清750μL至2mL离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱和酚构成的混合液，震荡混匀，放入4℃离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清600μL至2mL离心管中，备用；
d)向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4℃离心机，12000rpm离心10min，吸取上清300μL至1.5mL离心管中，备用；
e)向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1mL质量浓度为75％的乙醇，摇晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4℃离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干沉淀；
f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30μL的无菌ddH2O溶解DNA，再加入1μL的RNase A，37℃水浴30min，在4℃或-20℃条件下保存溶液，即得；
将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2μL用ddH2O稀释400倍，用紫外分光光度仪测定OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值；若所述比值在范围1.7-1.9内，则DNA纯且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
所述质量检测步骤具体包括：取5μL样品DNA与等体积6×LoadingBuffer混合，并加入到含有体积比为万分之一的10000×GelSafe核酸染液的0.7％琼脂糖凝胶上样孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则表明DNA已降解不可用；
(2)以步骤(1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计如下引物SR-57、SR-123、SR-830、SR-1040和SR-1164引物，对各所述基因组DNA进行PCR扩增；
SR-57-F:5’-TTCCATTTCCACCATTTTGG-3’；
SR-57-R:5’-CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3’；
SR-123-F:5’-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3’；
SR-123-R:5’-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3’；
SR-830-F:5’-CAAGTGCATTAGGTGGTTCTAACA-3’；
SR-830-R:5’-GCCCTCTGACTGTTGTATGACTG-3’；
SR-1040-F:5’-CTGCTGATCGTTTCTTGGATAGA-3’；
SR-1040-R:5’-TGCTAATCCTTCTAATCAACTTCCAC-3’；
SR-1164-F:5’-TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3’；
SR-1164-R:5’-ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3’；
PCR反应体系如下：
DNA模板，30ng，1μL；
引物,0.2μM，1μL；
10×EasyTap Buffer for PAGE(扩增缓冲液，含Mg2+)，2mM，2.5μL；
dNTPs，2.5mM，2μL；
Taq DNA聚合酶，2.5units，0.5μL；
ddH2O，17μL；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环退火温度下降0.5℃，直至54℃，94℃变性30s，54退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最终72℃延伸20min，获得的扩增产物4℃保存，备用；
(3)将步骤(2)获得的各样本PCR扩增产物进行6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到所述食用向日葵杂交种SH361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳包括如下步骤：
所述6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶成分包括：
尿素(Urea)，420g；
5×TBE，100mL；
丙烯酰胺，57g
N、N’-亚甲基双丙烯酰胺，3g；
ddH2O定容至1L；
A)配制尿素6％变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis＝19:1)：按照上述凝胶电泳体系取Urea、5×TBE、丙烯酰胺、N、N’-亚甲基双丙烯酰胺和ddH2O混合均匀制成胶混合液，待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室温保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓度为10％的APS(催化剂)和TEMED(加速剂)(取胶混合液30mL，10％APS 180μL，TEMED 80μL)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子(注意不要将梳齿拔断)，并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1×TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下预电泳1h，使凝胶预热；
B)取步骤(2)获得的PCR扩增产物加入10μL的1×上样缓冲液(二甲苯菁0.025g，溴酚蓝0.025g，0.5M/L EDTA(PH＝8.0)2ml，去离子甲酰胺98ml)中混合均匀，95℃变性5min，4℃冷却，每上样孔加入上述混合液5μL，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳1h，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，取出胶板，用ddH2O冲洗干净后，经3×GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光激发下并拍照。
(4)对比上述杂交种SH361以及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，若所述待测食用向日葵杂交种SH361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH361为真实的。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (1)
1.一种引物在快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和品种纯度领域的应用，其特征在于，所述引物如下：
SR-57-F:5’-TTCCATTTCCACCATTTTGG-3’；
SR-57-R:5’-CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3’。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN201510033343.2A CN105861639B (zh) | 2015-01-22 | 2015-01-22 | 一种快速鉴定食用向日葵杂交种sh361真实性和纯度的方法 |
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Non-Patent Citations (4)
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| （蒙）农种生许字（2015）第0004号;内蒙古自治区农牧业厅;《主要农作物种子生产许可证》;20150929;1 * |
| Marker Development, Genome Mapping, and Cloning of Candidate Disease Resistance Genes in Sunflower, Helianthus annuus L;MA Gedil;《https://ir.library.oregonstate.edu/concern/graduate_thesis_or_dissertations/h702qb25t》;20120907;18 * |
| Simple sequence repeat map of the sunflower genome;Tang S et al;《Theor Appl Genet.》;20080806;1124-1136 * |
| Simple sequence repeat marker development and mapping in cultivated sunflower, Helianthus annuus L;Ju-Kyung Yu;《https://ir.library.oregonstate.edu/concern/graduate_thesis_or_dissertations/d504rp76k》;20120814;22 * |
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