CN105801657B

CN105801657B - 从三七总皂苷中提纯人参皂苷Re与Rd的方法

Info

Publication number: CN105801657B
Application number: CN201410840992.9A
Authority: CN
Inventors: 郑志远; 李钊文; 黄宇声; 徐卓; 兰星
Original assignee: Guangxi Wuzhou Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Guangxi Wuzhou Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2018-04-10
Anticipated expiration: 2034-12-30
Also published as: CN105801657A

Abstract

本发明涉及一种从三七总皂苷中提纯人参皂苷Re与Rd的方法，该方法主要是通过弱酸性阳离子交换树脂结合氨基封尾的单分散聚合硅胶，把人参皂苷Re与Rd从三七总皂苷中高度分离纯化。

Description

从三七总皂苷中提纯人参皂苷Re与Rd的方法

技术领域

本发明涉及医药发明领域，具体涉及一种从三七总皂苷中提纯人参皂苷Re与Rd的方法。

背景技术

三七总皂苷来源于三七药材，主要成分包括三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1与人参皂苷Rd。常用于活血祛瘀，通脉活络，对高脂血症、高粘血症、对高血压的药理作用，同时具有抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化、抗血栓、抗心脑缺血等作用，临床主要以全成分制备成制剂为主，并无单一成分或其中组合制剂。

对心脑血管疾病具有预防与治疗作用。专利申请CN101116669，公开了人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh2与人参皂苷III几种组合物在预防放化疗后引起的白细胞降低的辅助用药。

专利申请CN 1305479 C，公开了人参皂苷Rg5、Rk1、Rg3、Rh2、Rg5等低极性人参皂苷组合物及其具抗癌活性的特征。

人参皂苷Re：抑制中枢神经，促进DNA，RNA合成。升高血浆皮质酮的作用，扩张血管。能减少乙酰胆碱引起的豚鼠离体子宫的收缩。对大鼠有减慢心率和双相性血压(先升后降)作用。对猫的行为和脑电图显示中等的抑制。有抗疲劳作用。

人参皂苷Rd能减少乙酰胆碱引起的豚鼠离体子宫的收缩。人参皂甙Rd对大鼠有减慢心率和双相性血压(先升后降)作用。人参皂甙Rd对猫的行为和脑电图显示中等的抑制。临床用于治疗急性缺血性脑卒中。[4]此外,人参皂甙Rd还有抗疲劳作用。

三七总皂苷纯化方法以层析纯化工艺为主，辅以氧化铝、活性炭等常用除杂手段，主要产物包括各类皂苷与皂苷元，纯度约为85％，并无针对其中各组分的提取、纯化方法。目前未见公开三七皂苷R1、人参皂苷Rb1纯化到95％以上的提取工艺。

离子交换树脂是带有官能团(有交换离子的活性基团)、具有网状结构、不溶性的高分子化合物。通常是球形颗粒物。离子交换树脂还可以根据其基体的种类分为苯乙烯系树脂和丙烯酸系树脂。树脂中化学活性基团的种类决定了树脂的主要性质和类别。首先区分为阳离子树脂和阴离子树脂两大类，它们可分别与溶液中的阳离子和阴离子进行离子交换。阳离子树脂又分为强酸性和弱酸性两类，阴离子树脂又分为强碱性和弱碱性两类(或再分出中强酸和中强碱性类)。

弱酸性阳离子树脂含弱酸性基团，如羧基－COOH，能在水中离解出H+而呈酸性。树脂离解后余下的负电基团，如R-COO－(R为碳氢基团)，能与溶液中的其他阳离子吸附结合，从而产生阳离子交换作用。这种树脂的酸性即离解性较弱，在低pH下难以离解和进行离子交换，只能在碱性、中性或微酸性溶液中(如pH5～14)起作用。这类树脂亦是用酸进行再生(比强酸性树脂较易再生)。

硅胶和聚合物为基质的填料是在色谱分离和分析领域必不可少的两种性能互为补充的色谱介质。硅胶基质机械强度大、柱效高、分辨率好，已广泛应用于有机化合物及中性分子的分析和大规模制备生产中；而聚合物基质填料则具有良好的化学稳定性及无与比拟的耐酸碱性，因此寿命长，可在线清洗适合生物分子的大规模纯化分离。研究证明，由于硅胶和聚合物色谱填料内在材料的差别，它们在对目标分子分离选择性方面具有极强的互补性，如一些用聚合物填料很难分离的物质，在硅胶填料上却能得到良好分离；相反地，一些在硅胶填料上很难分离的物质，而用聚合物填料能得到有效的分离。

单分散指物质的某一个参数具有均一性质。例如单分散体系通常是指分散相品种单一且粒度分布很窄(即粒径绝大部分相等)的分散体系，粒径分布呈正态分布，单分散小球指的是形状大小非常均匀的小球。

针对现有人参皂苷Re与人参皂苷Rd纯度不高的问题，发明人经过大量的研究，最终提出了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种从三七总皂苷中提纯人参皂苷Re与Rd的方法。

本发明所述从三七总皂苷中提纯人参皂苷Re与Rd的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取三七总皂苷加纯化水溶解，调PH值至5.0-6.0，过弱酸性阳离子交换树脂柱，以氨水洗脱，收集洗脱液，调PH至5.0-6.0，浓缩干燥；

2)取步骤1)所得干燥品加乙醇溶解，装载于以单分散聚合硅胶为填料的层析柱上，以70％-50％乙醇在恒温下作梯度洗脱，洗脱液用紫外检测器在线检测人参皂苷Re与Rd含量；

3)分段收集洗脱液，以紫外吸收度为依据，弃去无人参皂苷Re与人参皂苷Rd部分、及杂质峰面积高于5％部分，其余合并，所得收集液浓缩干燥，即得人参皂苷Re与Rd。

优选地，所述步骤2)单分散聚合硅胶为氨基封尾的单分散聚合硅胶。

优选地，所述步骤2)氨基封尾的单分散聚合硅胶柱，层析柱径高比为1:5-50。

优选地，所述步骤1)弱酸性阳离子交换树脂柱，层析柱径高比为1:5-20。

优选地，，所述步骤1)氨水洗脱，氨水浓度为3-10％。

优选地，所述步骤2)加乙醇溶解，乙醇浓度为60-80％。

优选地，所述步骤2)中乙醇恒温洗脱，温度为10-60℃。

优选地，所述步骤2)中紫外检测器在线检测，紫外吸收波长为200-210nm。

优选地，所述步骤1)中三七总皂苷，是指从三七中采用水提或醇提所得，其中含有三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb及人参皂苷Rd。

原料来源：

三七总皂苷：PANAX NOTOGINSENOSIDES，分子式C47H80O17，来源于三七提取的活性有效成份。【制剂】血塞通注射液、血栓通注射液、三七总甙片、三七总甙胶囊。【性状】本品为淡黄色无定形粉末，味苦，微甘。三七总皂苷是根据提取、分离技术从优质三七中提取有效的药用成分包括20多种皂苷活性物质、17种微量元素、蛋白、丰富的维生素、多糖等。【功能主治】活血祛瘀，通脉活络，具有抑制血小板聚集和增加心脑血流量的作用。

硅胶是一种高活性吸附材料，属非晶态物质，主要成分是二氧化硅，其化学分子式为mSiO₂·nH₂O。其本身没有毒性，化学性质稳定，不燃烧。不溶于水和任何溶剂，除强碱、氢氟酸外不与任何物质发生反应。主要用做干燥剂、防潮珠、除味剂和各种吸附剂，以及提纯煤油、吸附芳烃等，在三聚氰胺、苯酐、顺丁烯二酸酐、顺丁橡胶、丙烯腈等重要工业品生产中用作催化剂及催化剂载体。

在高纯硅胶基质上键合极性键合相氨基丙基Aminopropyl(-Si(CH2)3NH2)的极性吸附剂，同时具有氢键和阴离子交换两种作用机理，端基封尾。由于与氨基相连的丙基的作用，使得氨基呈现出弱极性，因此可用来从极性样品中分离非极性分化合物，但是强极性还是氨基的主要特性。

本发明通过弱酸性阳离子交换树脂结合氨基封尾的单分散聚合硅胶进行提纯的工艺方法，可将存在于三七药材中的两种单体成分人参皂苷Re与人参皂苷Rd的组合物高度分离纯化后获得，该组合物具缓解与治疗心绞痛及心率失调等症状的功效，对心血管疾病的治疗具有一定意义。

本发明提供的从三七总皂苷中提纯人参皂苷Re与Rd的方法具有以下优点：

在三七总皂苷纯化过程中，使用弱酸性阳离子交换树脂结合氨基封尾的单分散聚合硅胶吸附人参皂苷Re与人参皂苷Rd，可得到纯度85％以上的人参皂苷Re与Rd组合物。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的乙醇量的百分数是体积百分数，v/v表示溶液的体积比，BV为柱体积的倍数，如1BV为1倍柱体积。

实施例1：三七总皂苷的制备方法

取三七药材1000g，加入三七重量5倍的60％乙醇60℃加热回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.20，浓缩液脱脂后，所得浸膏过D101大孔吸附树脂吸附—洗脱，洗脱液经氧化铝、活性炭吸附脱色后浓缩、干燥，得三七总皂苷。

实施例2：三七总皂苷的制备方法

取三七粉碎成粗粉1000g，加80％乙醇8000ml提取7小时，收集提取液，过滤，取滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每1ml含0.5g生药的溶液，过大孔树脂柱及氧化铝吸附，用65％的乙醇洗脱，洗脱液浓缩、干燥，得三七总皂苷。

实施例3：三七总皂苷的制备方法

取三七，制成20目粗粉，用乙醇提取2次，每次加10倍70％的乙醇，每次提取3小时，合并提取液，滤过，取滤液回收乙醇至无醇味，过8倍三七重量的大孔吸附树脂柱吸附，收集洗脱液，吸附脱色，回收溶剂，浓缩，低温干燥，得三七总皂苷。

实施例4：

1)取三七总皂苷按1％比例加纯化水溶解，用2％枸橼酸钠调节PH值至6.0，过径高比为1:10的弱酸性阳离子交换树脂，以3倍柱体积5％氨水洗脱，收集洗脱液，调PH至6.0，浓缩干燥；

2)取步骤1)所得干燥品加70％乙醇溶解，装载于以氨基封尾的单分散聚合硅胶为填料的层析柱，径高比为1:10，以70％-50％乙醇在40℃下梯度洗脱，洗脱液用紫外检测器在线检测人参皂苷Re与Rd含量，检测波长为203nm；

3)分段收集洗脱液，以紫外吸收度为依据，弃去无人参皂苷Re与人参皂苷Rd部分、及杂质峰面积高于5％部分(紫外检测数据见表1)，合并其中5-14段，置60℃真空浓缩干燥，即得人参皂苷Re与人参皂苷Rd。

结果检测：人参皂苷Re与人参皂苷Rd组合物比例为0.2:1，纯度约为89％。

实施例5：

1)取三七总皂苷按0.5％比例加纯化水溶解，用1.5％枸橼酸钠调节PH值至5.0，过径高比为1:5的弱酸性阳离子交换树脂，以3倍柱体积3％氨水洗脱，收集洗脱液，调PH至6.0，浓缩干燥；

2)取步骤1)所得干燥品加60％乙醇溶解，装载于以氨基封尾的单分散聚合硅胶为填料的层析柱，径高比为1:5，以70％-50％乙醇在10℃下梯度洗脱，洗脱液用紫外检测器在线检测人参皂苷Re与Rd含量，检测波长为200nm；

3)分段收集洗脱液，以紫外吸收度为依据，弃去无人参皂苷Re与人参皂苷Rd部分、及杂质峰面积高于5％部分，其余合并，置60℃真空浓缩干燥，即得人参皂苷Re与人参皂苷Rd。

结果检测：人参皂苷Re与人参皂苷Rd组合物比例为0.2:1，纯度约为87％。

实施例6：

1)取三七总皂苷按2％比例加纯化水溶解，用3％枸橼酸钠调节PH值至6.0，过径高比为1:20的弱酸性阳离子交换树脂，以3倍柱体积10％氨水洗脱，收集洗脱液，调PH至6.0，浓缩干燥；

2)取步骤1)所得干燥品加80％乙醇溶解，装载于以氨基封尾的单分散聚合硅胶为填料的层析柱，径高比为1:50，以70％-50％乙醇在60℃下梯度洗脱，洗脱液用紫外检测器在线检测人参皂苷Re与Rd含量，检测波长为210nm；

结果检测：人参皂苷Re与人参皂苷Rd组合物比例为0.2:1，纯度约为86％。

实验例1：分段采集HPLC测定数据，含量检测数据见表1。

表1：实施例4操作过程紫外检测结果

表1结果显示：三七总皂苷经弱酸性阳离子交换树脂结合氨基封尾的单分散聚合硅胶进行提纯，其洗脱液中人参皂苷Re与人参皂苷Rd出峰浓度高的时段，与杂质高峰段有明显偏差，因此可以利用本发明技术方案纯化分离人参皂苷Re与人参皂苷Rd。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.从三七总皂苷中提纯人参皂苷Re与Rd的方法，其特征在于包括以下步骤：1）取三七总皂苷加纯化水溶解，调PH值至5.0-6.0，过弱酸性阳离子交换树脂柱，以氨水洗脱，收集洗脱液，调PH至5.0-6.0，浓缩干燥；2）取步骤1）所得干燥品加乙醇溶解，装载于以单分散聚合硅胶为填料的层析柱上，以70%-50%乙醇在恒温下作梯度洗脱，洗脱液用紫外检测器在线检测人参皂苷Re与Rd含量；3）分段收集洗脱液，以紫外吸收度为依据，弃去无人参皂苷Re与人参皂苷Rd部分、及杂质峰面积高于5%部分，其余合并，所得收集液浓缩干燥，即得人参皂苷Re与Rd；

所述步骤2）单分散聚合硅胶为氨基封尾的单分散聚合硅胶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）氨基封尾的单分散聚合硅胶柱，层析柱径高比为1:5-50。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）弱酸性阳离子交换树脂柱，层析柱径高比为1:5-20。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）氨水洗脱，氨水浓度为3-10%。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）加乙醇溶解，乙醇浓度为60-80%。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中乙醇恒温洗脱，温度为10-60℃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中紫外检测器在线检测，紫外吸收波长为200-210nm。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中三七总皂苷，是指从三七中采用水提或醇提所得，其中含有三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb及人参皂苷Rd。