CN105801480B - 一种从中华鲎尾中制备犬尿酸的方法 - Google Patents

一种从中华鲎尾中制备犬尿酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从中华鲎尾制备犬尿酸的方法，包括以下步骤：步骤一、中华鲎尾干粉的制备；步骤二、中华鲎尾粗体物的制备；步骤三、中华鲎尾粗体物的初步分离纯化；步骤五、组分A8的分离纯化；步骤六、组分A8‑24的分离纯化：取组分A8‑24适量加甲醇溶解后，过正相柱分离；取样品50mg用150mg硅胶粉拌样，5g硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，用石油醚与丙酮进行洗脱，收集石油醚：丙酮=1:10时的馏分，共60管，合并25管至40管，合并馏分后减压浓缩，蒸干溶剂后，制得犬尿酸。本发明首次从中华鲎尾中分离出了犬尿酸，犬尿酸作为中华鲎尾的活性成分，对于中华鲎尾的二次开发意义重大。

Description

一种从中华鲎尾中制备犬尿酸的方法
技术领域
本发明涉及活性药物的技术领域，尤其涉及一种从中华鲎尾中制备犬尿酸的方法。
背景技术
犬尿氨酸(kynurenine，Kyn)是人体必需氨基酸色氨酸(tryptophan，Trp)的代谢产物之一。人体摄入的Trp除用于合成蛋白质之外，主要在肝、肾、脑等组织器官进行代谢，生成多种具有生理作用的生物活性分子，如Kyn、5-羟色胺、喹啉酸等。Kyn及其代谢产物与多种神经精神疾病、肾功能衰竭、白内障、各种慢性恶性疾病等密切相关。因此，Kyn对相关疾病的诊断治疗、疗效监测及发病机制等研究具有重要参考价值。在现有技术中，尚未有报道犬尿酸存在于中华鲎尾中。
有鉴于此，本发明人研究和设计了一种从中华鲎尾中制备犬尿酸的方法，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从中华鲎尾中制备犬尿酸的方法，通过在中华鲎尾中加入抽提液逐步抽提后，并通过反相硅胶柱及正相硅胶柱的色谱分离，以最终制得犬尿酸。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：
一种从中华鲎尾中制备犬尿酸的方法，包括以下步骤：
步骤一、中华鲎尾干粉的制备：将中华鲎尾自然晾晒干燥，在常温下，用药用粉碎机粉碎，得到干粉，装于密封袋中，于干燥器中保存备用；
步骤二、中华鲎尾粗体物的制备：称取已经打粉的中华鲎尾5份，每份1000g，分别置于5个2L的三角瓶中，按料液比1:3:16分别加入乙酸、乙酸乙酯和甲醇，封口后置于摇床中，在40℃，150rpm条件下进行第一次提取48h，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入相应溶剂进行第二次提取，在同样的条件下提取24h，抽滤，收集滤液，待残渣中溶剂挥干后，再交换溶剂提取1次，进行第三次提取，在同样的条件下提取，合并滤液，45℃减压浓缩至圆底烧瓶中，回收溶剂，分别得有机提取物浸膏，合并提取物浸膏，得到中华鲎尾粗体物，4℃贮存备用；
步骤三、中华鲎尾粗体物的初步分离纯化：将中华鲎尾粗体物用甲醇溶解后过滤，40℃减压浓缩后，用硅胶粉干法拌样，上6cm×35cm反相硅胶柱，用100％水进行洗脱，洗脱体积为2L，每250ml收集一个组分，共得到8个馏分，45℃进行减压浓缩后除去溶剂后，合并得到组分A；
步骤四、组分A的分离纯化：组分A用适量甲醇溶解后，直接上Sephadex LH20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为8-9s/drop，使用自动收集器收集各馏分，每60min收集1管，共收集得到130管馏分；合并第123管至第130管的馏分，再进行减压浓缩，得到组分A8；
步骤五、组分A8的分离纯化：组分A8用适量甲醇溶解后，直接上Sephadex LH20正相硅胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，经若干次凝胶柱分离，最终收集得到40管馏分，合并24管至35管馏分得到样品，将该部分样品标记为组分A8-24；
步骤六、组分A8-24的分离纯化：取组分A8-24加适量甲醇溶解后，过正相柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，用石油醚与丙酮进行洗脱，收集石油醚：丙酮＝1:10时的馏分，共60管，合并25管至40管，合并馏分后减压浓缩，蒸干溶剂后，制得犬尿酸。
作为实施例的优选方式，所述步骤五中采用的正相硅胶进行分离的步骤：
a、硅胶粉活化：
取200～300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于110℃烘箱中活化2～3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用；
b、拌样：
根据样品的量50mg，向洁净的圆底烧瓶中加入硅胶粉150mg，用胶头滴管吸取样品液滴至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥干，使样品呈均匀粉末状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用；
c、装柱：
采用湿法装柱，称取5g硅胶粉用石油醚饱和后装柱；
d、上样：
采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表面，待样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液；
e、样品洗脱：
梯度洗脱：先用初始洗脱剂对样品进行洗脱，然后逐渐增加洗脱剂的极性，洗脱过程中用泵加压并用薄层层析TLC追踪，直至目标点被洗脱；
f、样品的收集与合并：
用小试管分步收集样品，将含有目标点的样品管按照出柱顺序合并为几个部分，减压浓缩后，继续进行薄层层析，根据样品的具体情况继续进行分离或者合并浓缩后4℃贮存备用。
作为实施例的优选方式，所述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于110℃烘箱中活化2～3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为0.8～1cm，两样点之间的距离不小于0.8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约1cm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪和其它显色剂进行显色。
作为实施例的优选方式，还包括犬尿酸的结构鉴定：将过正相硅胶柱后制得的犬尿酸装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MH核磁共振仪测定化合物的核磁谱，测定项目包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT 90、DEPT 135、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC；将样品用含5％甲酸的甲醇溶液溶解后测定质谱，质谱条件：电离源：电喷雾电离源；干燥气温度：200℃；干燥气压力：20psi；雾化气压力：50psi；雾化室温度50℃；针孔电压：5000V；屏蔽电压：600V；毛细管电压：80V。
本发明采用上述技术方案后，通过在中华鲎尾中加入抽提液逐步抽提，并通过反相硅胶柱及正相硅胶柱的色谱分离，最终制得犬尿酸，本发明从中华鲎尾中首次分离到了犬尿酸。
附图说明
图1是本发明HCT8的薄层层析结果；其中，展开剂氯仿：甲醇＝5:1，蓝色显色；1和2分别代表薄层层析时上样量为1倍浓度和2倍浓度；
图2是本发明HCT8的结构图；
图3是本发明化合物犬尿酸的1H-NMR的核磁谱；
图4是本发明化合物犬尿酸的13C-NMR核磁谱。
具体实施方式
本发明揭示了一种从中华鲎尾中制备犬尿酸的方法，包括以下步骤：
步骤一、中华鲎尾干粉的制备：将中华鲎尾自然晾晒干燥，在常温下，用药用粉碎机粉碎，得到干粉，装于密封袋中，于干燥器中保存备用；
步骤二、中华鲎尾粗体物的制备：称取已经打粉的中华鲎尾5份，每份1000g，分别置于5个2L的三角瓶中，按料液比1:3:16分别加入乙酸、乙酸乙酯和甲醇，封口后置于摇床中，40℃，150rpm下提取48h，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入相应溶剂(按料液比1:3:16分别加入乙酸、乙酸乙酯和甲醇)进行第二次提取，在同样的条件下(40℃，150rpm)提取24h，抽滤，收集滤液，待残渣中溶剂挥干后，再交换溶剂提取1次，进行第三次提取，提取条件同第一次提取，合并滤液，45℃减压浓缩至圆底烧瓶中，回收溶剂，分别得有机提取物浸膏，合并提取物浸膏，得到中华鲎尾粗体物，4℃贮存备用。
步骤三、中华鲎尾粗体物的初步分离纯化：将中华鲎尾粗体物用甲醇溶解后过滤，40℃减压浓缩后130g，硅胶粉干法拌样，上6cm×35cm反相硅胶柱，用100％水进行洗脱，洗脱体积为2L，每250ml收集一个组分，共得到8个馏分，45℃进行减压浓缩后除去溶剂后，合并得到组分A，称重830mg；
步骤四、组分A的分离纯化：组分A用适量甲醇溶解后，直接上170g填料的SephadexLH20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为8-9s/drop，使用自动收集器收集各馏分，每60min收集1管，共收集得到130管馏分；合并第123管至第130管的馏分，再进行减压浓缩，得到组分A8。
步骤五、组分A8的分离纯化：组分A8用适量甲醇溶解后，直接上Sephadex LH20正相硅胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，经若干次凝胶柱分离，最终收集得到40管馏分，合并24管至35管馏分得到106mg样品，将该部分标记组分A8-24；
步骤六、组分A8-24的分离纯化：取组分A8-24适量加甲醇溶解后，过正相柱分离；取样品50mg用150mg硅胶粉拌样，5g硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，用石油醚与丙酮进行洗脱，收集石油醚：丙酮＝1:10时的馏分，共60管，合并25管至40管，合并馏分后减压浓缩，蒸干溶剂后，制得犬尿酸。
作为实施例的优选方式，所述步骤五中采用的正相硅胶进行分离的步骤如下：
a、硅胶粉活化：
取200～300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于110℃烘箱中活化2～3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用；
b、拌样：
根据样品的量50mg，向洁净的圆底烧瓶中加入硅胶粉150mg，用胶头滴管吸取样品液滴至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥干，使样品呈均匀粉末状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用；
c、装柱：
采用湿法装柱，称取5g硅胶粉用石油醚饱和后装柱；
d、上样：
采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表面，待样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液；
e、样品洗脱：
梯度洗脱：先用初始洗脱剂对样品进行洗脱，然后逐渐增加洗脱剂的极性，洗脱过程中用泵加压并用薄层层析TLC追踪，直至目标点被洗脱；
f、样品的收集与合并：
用小试管分步收集样品，将含有目标点的样品管按照出柱顺序合并为几个部分，减压浓缩后，继续进行薄层层析，根据样品的具体情况继续进行分离或者合并浓缩后4℃贮存备用。
作为实施例的优选方式，所述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于110℃烘箱中活化2～3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为0.8～1cm，两样点之间的距离不小于0.8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约1cm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪和其它显色剂进行显色。本发明HCT8的薄层层析结果如图1所示，其中，图中1和2分别代表薄层层析时上样量为1倍浓度和2倍浓度；展开剂氯仿：甲醇＝5:1，Rf值为0.67，通过紫外分析仪检测显示化合物呈蓝色。
作为实施例的优选方式，还包括犬尿酸的结构鉴定：将过正相硅胶柱后制得的犬尿酸装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代甲醇，使用400MH核磁共振仪测定化合物的核磁谱，测定项目包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT 90、DEPT 135、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC；将样品用含5％甲酸的甲醇溶液溶解后测定质谱，质谱条件：电离源：电喷雾电离源；干燥气温度：200℃；干燥气压力：20psi；雾化气压力：50psi；雾化室温度50℃；针孔电压：5000V；屏蔽电压：600V；毛细管电压：80V。犬尿酸的核磁谱数据如表1所示。
表1化合物HCT8的核磁谱数据
进行质谱测定后可知化合物HCT8的ESI-MS:m/z＝187[M-2]+，综合HCT8的核磁谱数据及质谱数据并与文献进行比对，推测化合物犬尿酸(分子式C10H7NO3，分子量为189.171)，其结构如图2所示。化合物犬尿酸的1H-NMR、13C-NMR核磁谱如图3及图4所示。
中华鲎尾具有重要的药用价值，清热解毒，活血祛瘀，治跌打损伤、创伤出血、烫伤、疮疖，肺结核咯血等。因此，对中华鲎尾进行各方面的研究具有重要的意义和应用价值。本研究中主要通过结合凝胶柱层析和硅胶柱层析对中华鲎尾中的活性成分进行分离，并首次分离出了犬尿酸，犬尿酸作为中华鲎尾的活性成分，对于中华鲎尾的二次开发意义重大。
本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种从中华鲎尾中制备犬尿酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、中华鲎尾干粉的制备：将中华鲎尾自然晾晒干燥，在常温下，用药用粉碎机粉碎，得到干粉，装于密封袋中，于干燥器中保存备用；
步骤二、称取已经打粉的中华鲎尾5份，每份1000g，分别置于5个2L的三角瓶中，按料液比1:3:16分别加入乙酸、乙酸乙酯和甲醇，封口后置于摇床中，在40℃，150rpm条件下进行第一次提取48h，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入相应溶剂进行第二次提取，在同样的条件下提取24h，抽滤，收集滤液，待残渣中溶剂挥干后，再交换溶剂提取1次，进行第三次提取，在同样的条件下提取，合并滤液，45℃减压浓缩至圆底烧瓶中，回收溶剂，分别得有机提取物浸膏，合并提取物浸膏，得到中华鲎尾粗提 物，4℃贮存备用；
步骤三、中华鲎尾粗提 物的初步分离纯化：将中华鲎尾粗提 物用甲醇溶解后过滤，40℃减压浓缩后，用硅胶粉干法拌样，上6cm×35cm反相硅胶柱，用100%水进行洗脱，洗脱体积为2L，每250ml收集一个组分，共得到8个馏分，45℃进行减压浓缩后除去溶剂后，合并得到组分A；
步骤四、组分A的分离纯化：组分A用适量甲醇溶解后，直接上Sephadex LH20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为8-9s/drop，使用自动收集器收集各馏分，每60min收集1管，共收集得到130管馏分；合并第123管至第130管的馏分，再进行减压浓缩，得到组分A8；
步骤五、组分A8的分离纯化：组分A8用适量甲醇溶解后，直接上Sephadex LH20正相硅胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，经若干次凝胶柱分离，最终收集得到40管馏分，合并24管至35管馏分得到样品，将该部分样品标记为组分A8-24；
步骤六、组分A8-24的分离纯化：取组分A8-24 加适量甲醇溶解后，过正相柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，用石油醚与丙酮进行洗脱，收集石油醚：丙酮=1:10时的馏分，共60管，合并25管至40管，合并馏分后减压浓缩，蒸干溶剂后，制得犬尿酸。
2.如权利要求1所述的一种从中华鲎尾中制备犬尿酸的方法，其特征在于：所述步骤五中采用的正相硅胶进行分离的步骤：
a、硅胶粉活化：
取200~300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于110℃
烘箱中活化2~3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用；
b、拌样：
根据样品的量50mg，向洁净的圆底烧瓶中加入硅胶粉150mg，用胶头滴管吸取样品液滴至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥干，使样品呈均匀粉末状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用；
c、装柱：
采用湿法装柱，称取5g硅胶粉用石油醚饱和后装柱；
d、上样：
采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表面，待样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液；
e、样品洗脱：
梯度洗脱：先用初始洗脱剂对样品进行洗脱，然后逐渐增加洗脱剂的极性，洗脱过程中用泵加压并用薄层层析TLC追踪，直至目标点被洗脱；
f、样品的收集与合并：
用小试管分步收集样品，将含有目标点的样品管按照出柱顺序合并为几个部分，减压浓缩后，继续进行薄层层析，根据样品的具体情况继续进行分离或者合并浓缩后4℃贮存备用。
3.如权利要求2所述的一种从中华鲎尾中制备犬尿酸的方法，其特征在于：所述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于110℃烘箱中活化2~3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为0.8~1cm，两样点之间的距离不小于0.8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约1cm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪和其它显色剂进行显色。
4.如权利要求1所述的一种从中华鲎尾中制备犬尿酸的方法，其特征在于：还包括犬尿酸的结构鉴定：将过正相硅胶柱后制得的犬尿酸装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MH核磁共振仪测定化合物的核磁谱，测定项目包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT 90、DEPT 135、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC；将样品用含5%甲酸的甲醇溶液溶解后测定质谱，质谱条件：电离源：电喷雾电离源；干燥气温度：200℃；干燥气压力：20psi；雾化气压力：50psi；雾化室温度50℃；针孔电压：5000V；屏蔽电压：600V；毛细管电压：80V。
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