CN105723194B - 显微镜以及用于显微镜的声光合束器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于显微镜、尤其是扫描显微镜的合束器，该合束器接收至少第一照明光束和第二照明光束，并且将所述照明光束组合成输出光束，其中该第一照明光束和第二照明光束具有相同的照明光波长，但具有不同的偏振、尤其是线偏振。该合束器被设计为声光合束器并且被构造和操作，以使得通过与至少一个机械波的相互作用，第一照明光束和第二照明光束被偏转，并由此被引导到共同的光轴上。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于显微镜、尤其是扫描显微镜的合束器，其接收至少第一照明光束和第二照明光束并且将它们组合成共线输出光束，其中该第一照明光束和第二照明光束具有相同的照明光波长，但具有不同的偏振、尤其是线偏振。
本发明还涉及一种具有这种声光合束器的显微镜，并且涉及这种声光合束器在照射样品时的应用。
背景技术
在显微镜中，尤其在扫描显微镜或者共焦扫描显微镜中，通常借助照明光束来照射样品，该照明光束是通过组合多个照明光束而产生的，以便观察从被照射的样品发出的反射光或荧光。
例如在扫描显微术中，这种照明光束的焦点可以借助可控制的光束偏转装置(一般通过倾斜两个反射镜)在样本平面中移动；偏转轴通常相互垂直，以使得一个反射镜在X方向上偏转，另一个反射镜在Y方向上偏转。反射镜的倾斜例如借助检流计定位元件来实现。源自样本的光的功率水平根据扫描光束的位置来测量。这些定位元件通常配备有用来获知当前反射镜位置的传感器。
特别在共焦扫描显微术中，利用照明光束的焦点三维地扫描样本。共焦扫描显微镜通常包含光源、聚焦光学系统(光源的光通过聚焦光学系统聚焦在孔上，该孔被称为“激发针孔”)、分束器、用于光束控制的光束偏转装置、显微镜光学系统、探测针孔以及用于探测所探测的光或荧光的探测器。该照明光例如通过分束器耦合。
源自样本的荧光通过光束偏转装置返回至分束器，通过分束器，然后被聚焦到探测针孔上，探测器位于该探测针孔的后面。不直接源于焦点区域的探测光采取不同的光路并且不通过探测针孔，因此获得点信息项，从而通过样本的顺序扫描得到三维图像。
为了组合具有不同波长的光束，在光学系统中通常使用二色性的分束器。DE 19633 185 A1例如公开了一种用于激光扫描显微镜的点光源以及一种用于将具有不同波长的至少两个激光器的光耦合至激光扫描显微镜中的方法。该点光源模块化地构成并且包含二色性的合束器，合束器将至少两个激光光源的光组合起来并且将其耦合至通向显微镜的光导纤维中。
以二色性的分束器为基础的布局的缺点是，其针对特定的波长被限定并且因此改变非常麻烦，即通过更换二色性的分束器。
EP 165 65 78 A1公开了一种用于共线地组合具有不同波长的光束的光学设备。该设备包含色散元件和成像光学系统，它们定义了分割平面，在该分割平面中，位置与每个光波长相关联。在分割平面中设置有微结构元件，它使来自不同方向的、在对应于其波长的位置上聚焦的光束经由成像光学系统引导至该色散元件，该色散元件共线地组合光束。然而，该设备在技术方面、特别地在校准方面非常复杂，并且不允许非常快的转换时间。
EP 215 85 13 A1公开了一种合束器，用于将至少两个光束组合成一个组合光束，尤其在优选显微镜的光学装置的光路中。该合束器的特征在于声光元件，在该声光元件中能够产生用来偏转或衍射光束的机械波，因此进入声光元件的第一光束和至少一个进入声光元件的第二光束作为组合的光束相互共线地离开该声光元件。该文献没有公开波长相同、但偏振不同的光束的组合。
从EP 0 473 071 B1也已知借助偏振分束器组合光束。然而，后果是，这种配置与具有二色性的分束器的设备一样使用不灵活，特别地涉及主要组件的更换。
发明内容
因此，本发明的目标是描述一种合束器，其允许波长相同、但偏振不同的照明光束的组合，并且能够简单且快速地适应变化的照明需求。
该目标通过一种合束器得以实现，其中，该合束器被实现为声光合束器并且被构造和操作，以使得通过与至少一个机械波相互作用，第一照明光束和第二照明光束被衍射，并因此指向共同的光轴。
根据本发明的合束器的优点尤其在于，声光合束器能够非常快速地在几微秒内转换。由此例如能够快速中断或再次释放照明光束。根据本发明的合束器的优点尤其还在于，能够快速地转换成其它波长或其它波长组合。
这种声光合束器的操作的方式基本上基于耦合的照明光束与一个机械波或多个机械波的相互作用。
声光组件通常由所谓的声光晶体构成，电子转换器(在文献中通常称为“换能器”)安装在该晶体上。该转换器通常包含压电材料以及位于其上方的一个电极和位于其下方的一个电极。利用无线电频率(其典型地位于30MHz和800MHz之间)对电极的电激活，使压电材料振动，因此能够产生声音波(即声波)，该声波在产生之后穿过该晶体。声波通常在经过光学相互作用区之后在晶体的相对侧上吸收或反射出去。
声光晶体由于以下事实而值得关注，即所产生的声波改变了晶体的光学特征，由此通过声音感应出一种光栅或者类似的光学活性结构，例如全息图。穿过该晶体的光经历光栅处的衍射。光在衍射方向上被相应地引导至不同的衍射级别。存在影响所有的入射光(几乎不考虑波长)的声光组件。仅通过示例，可以参考例如声光调制器(AOM)、声光偏转器(AOD)或移频器的组件。还存在例如选择性地根据辐射的无线电频率作用于单独的波长的组件(声光可调谐滤波器，AOTF)。声光元件通常由双折射晶体(例如氧化碲)构成；相应的元件的光学效果特别地由晶轴相对于光的入射方向及其偏振的位置来确定。
尤其当例如在声光合束器中使用AOTF时，该机械波必须具有特定的频率，以使得针对具有期望的照明光波长和期望偏振的光恰好满足布拉格条件。在这些声光组件中，未满足布拉格条件的光不会被机械波偏转。
在根据本发明的合束器的特别简单的实施例中(它例如可以包含商业通用的AOTF)，声光合束器包括晶体，具有不同声频的第一和第二机械波同时地通过该晶体传播，其中该晶体和机械波的传播方向相对于彼此并且分别相对于入射到该晶体中的照明光束定向，以使得第一照明光束在第一机械波处被衍射，且第二照明光束在第二机械波处被衍射，并因此被引导到共同的光轴。
在该情况下特别有利的是，该组合的照明光束通过垂直于照明光束的传播方向定向的出射表面离开该晶体。在波长改变时或如果照明光束包括多个波长，照明光束的方向改变或空间分割不会发生。
然而，该实施例的缺点是，为了偏转波长相同、但偏振不同的两个照明光束，必须生成两个不同的机械波。由此，用于机械波的发生器(例如设置在晶体上的压电元件)必须同时加载两个不同的电磁HF波。结果，不利的是，双倍的热功率被引入到该晶体或这些晶体中，这最终会降低衍射效率，并且由于不可避免的温度波动，还会导致抵达样品和探测器的光的偏转方向和光功率水平出现波动。此外如果机械波的频率范围重叠，则可能出现“拍频”现象，这最终会使抵达样品和/或探测器的光的光功率水平出现周期性的波动。该问题特别地基于以下事实，即机械波本来不可能具有无限窄的(即单一的)声频，而总是必须存在中心频率附近的频率范围。
因此，在特别有利的实施方式中，不使用商业通用的AOTF。而是，声光合束器包括晶体，具有与第一和第二照明光束的波长相关联的声频的机械波通过该晶体传播，其中该晶体和机械波的传播方向相对于彼此并且分别相对于入射到该晶体中的照明光束定向，以使得第一照明光束和第二照明光束都在该机械波处被衍射，并因此引导到共同的光轴上。
在此可规定，特别地，第一照明光束被线性地偏振并且具有线偏振方向，其就晶体的双折射特性而言是寻常光的线偏振方向；和/或第二照明光束被线性地偏振并且具有线偏振方向，其就晶体的双折射特性而言是非寻常光的线偏振方向。还可以规定，特别地，第一照明光束的线偏振方向或第二照明光束的线偏振方向设置在由机械波的传播方向和探测光束的传播方向跨越的平面中。
这种声光合束器的具体构造、尤其是晶体相对于机械波的传播方向和照明光束的传播方向的定向、以及机械波和照明光束相对于彼此的定向、以及入射表面和出射表面相对于彼此以及相对于晶体的光轴的定向可以例如根据下面描述的迭代法进行设计；优选地，该方法不是基于真实的组件来实施(尽管这也是可行的)，而是以机算机模拟来代替，直到晶体形状、这些表面和晶格的的定向、机械波的传播方向的定向以及照明光束的传播方向的各个参数符合期望的需求。当在机算机模拟中以这种方式获得了所有相关的参数时，晶体随后可以在另一步骤中被制造。
在该情况下，例如，可以首先根据上述实施例继续进行，声光合束器包括商业通用的晶体，不同声频的第一和第二机械波实际上需要同时通过该晶体传播，以便将第一照明光束和第二照明光束引导到共同的光轴上。
相反的光路被考虑用于该迭代法；并且在相反的光路上，第一照明光束和第二照明光束通过(优选垂直定向的)出射表面共线地耦合到晶体中，但在该晶体中仅生成第一机械波。结果是，只有第一照明光束在机械波处被衍射，而第二光束未偏转地穿过该晶体，该第二光束具有相同的波长，但具有另一线偏振方向。
随后，该晶体优选地在由入射的共线照明光束和机械波的传播方向跨越的平面中旋转，并且因此也改变机械波的传播方向和晶轴之间的角度，直到具有两个线偏振部分的两个照明光束被该机械波偏转。
然而，旋转的结果通常是，该出射表面不再与入射的共线照明光束垂直。为此，在下一个迭代步骤中，在不旋转晶体的情况下改变晶体的形状，以使得该出射表面再次垂直于入射的共线照明光束。
然而，晶体形状的改变的结果通常是，具有照明光波长的两个线偏振部分可以不再各自借助机械波偏转。为此，之后再次旋转该晶体，直到再次满足该条件。随后重复已描述的其它迭代步骤。
执行足够数量的迭代循环，直到满足两个线偏振部分的同时偏转的条件以及共线光输出的条件。通常，该方法非常快速地收敛，以使得在少量迭代循环之后就达到了目标。
在特定实施例中，分别关注晶体的旋转，就反向行进的照明光的线偏振方向之一而言，被衍射至第一级次并具有照明光波长的所有光都共线地从晶体中输出。这种实施例的优点不仅在于具有不同线偏转的两个部分可以分别借助单一机械波被偏转，而且多色共线入射的照明光可以另外地经由第一衍射级次的光路(为此存在着上述的共线性)共线地衍射至照明光束路径。有利的是，对于该照明光来说，不需要针对空间分割的补偿，因为该照明光不存在空间分割。
利用这种实施例，例如可以规定，该晶体或第二晶体包括用于具有多个波长的主光的入射表面，以及用于引导到共同的光轴上的照明光束的出射表面，其中入射表面和出射表面相对于彼此定向，以使得该主光能够作为共线的照明光束耦合到晶体中，并且引导到共同的光轴上的照明光束作为共线的照明光束离开该晶体。
在有利的实施例中规定，至少一个另外的照明光束通过该晶体行进并且与第一和第二照明光束一起抵达共同的光轴，该另外的照明光束不具有该第一和第二照明光束的波长并且不在机械波处被衍射。这种实施例特别地可以连续地配置多个声光组件，这在下面进行详细描述。
例如可以规定，该另外的照明光束从第二晶体中发出，第二机械波在该第二晶体中传播，该第二机械波具有与另外的照明光束的波长相关联的声频，其中该另外的照明光束包含第三照明光束，其具有另外的照明光波长并且被第二机械波衍射；或者该另外的照明光束包含第三和第四照明光束，其具有另外的照明光波长，但具有不同的偏振、尤其是线偏振，这些照明光束被第二机械波衍射。为了实施后面提到的变形方案，该第二晶体应当优选地被构造以使得，如上面详细论述的一样，其使具有另外的波长的照明光偏转，而与其偏振无关。
如已经论述的那样，还可以有利地规定，同时以多个方式应用前面提到的原理，其方式是：在至少一个晶体中为具有不同波长的照明光产生频率不同的多个机械波。
可以规定，例如，具有与额外的波长相关联的另一声频的至少一个额外的机械波同时在该晶体中或在第二晶体中传播，具有其他波长的至少一个额外的照明光束在该额外的机械波处被衍射，并因此被引导到共同的光轴上；和/或两个额外的照明光束(其具有其它波长和相互不同的偏振、尤其是线偏振)在该额外的机械波处被衍射，并因此被引导到共同的光轴上。
在特定实施例中，该声光合束器包括至少一个色散光学组件，其补偿(至少部分地)由该晶体或第二晶体产生的空间光谱分割。它例如可指照明光束的分割，该照明光束包含具有多个波长的光。然而，还可以规定，除了补偿照明光的分割以外，该色散光学组件还补偿探测光的空间光谱分割。
该色散光学组件可以被设置，以使得它还原已发生的空间光谱分割。然而，该补偿也可以被实现，以使得色散光学组件引起了空间光谱分割，其由该晶体或第二晶体还原。
特别有利地，根据本发明的声光合束器可以是显微镜、尤其是扫描显微镜或共焦扫描显微镜的光源的一部分。这种光源可以特别地包括多个主光源，它的照明光束通过声光合束器组合起来。
这些主光源中的至少一个还可以产生非偏振的主光、尤其是白光。这种光源可以包括例如偏振分束器，它接收非偏振的主光并且根据线偏振方向在空间上分割，因此产生的照明光束可以经由一个晶体或多个晶体的不同输入端暴露于该一个机械波的作用或多个机械波的作用。具有一个或多个波长的照明光可以由此以有针对性的且非常灵活切换的方式被选择并且共线地引导至照明光束路径以照射样品，而不会损失例如非偏振的主光的光强度(除了在耦合至光学组件和从光学组件脱耦时出现的常见损失以外)。特别地，原则上不需要完全省掉一个线偏振方向的光。
特别有利地，根据本发明的声光合束器可以是显微镜、尤其是扫描显微镜或共焦扫描显微镜的一部分。尤其在显微技术中样品同时或连续地用具有不同特征的照明光加载，如在以受激发射损耗(STED)显微术或以相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)显微术或以受激拉曼散射(SRS)显微术或以相干斯托克斯拉曼散射(CSRS)显微术或以拉曼诱导克尔效应散射(RIKES)显微术来照射样品时，可以非常有利地应用这种显微镜，因为还可以在照明光的偏振方面快速且灵活地调节照明参数，其中无需接受由于待执行的光束组合而引起的主光功率水平的巨大损失。
然而，在普通的荧光显微术的领域中，这种显微镜也是有利的。特别有利地，在此可以规定，声光合束器接收来自样品的探测光，并且从该探测光中移除具有该照明光波长和/或另外的照明光波长和/或其它照明光波长的部分。
这是因为，在荧光显微术中，照明光的在样品处反射的且在样品处散射的部分必须从探测光中移除，以便可以专门地探测荧光。在传统的显微镜中，构成所谓的“主分束器”的二色性滤光器用于该目的。
在特定实施例中，来自样品的探测光束通过与该晶体的机械波的相互作用，既使探测光束的具有照明光波长和第一线偏振方向的部分偏转，也使探测光的具有照明光波长和第二线偏振方向(其与第一线偏振方向垂直)的部分偏转，并因此从探测光束中移除。可选地或另外地，还可以规定，来自样品的探测光束通过与第二晶体的机械波的相互作用，既使探测光束的具有该另外的照明光波长和第一线偏振方向的部分偏转，也使探测光的具有该另外的照明光波长和第二线偏振方向(其与第一线偏振方向垂直)的部分偏转，并因此从探测光束中移除。
可选地或另外地，还可能的是，该晶体和机械波的传播方向相对于彼此并且分别相对于入射到该晶体中的探测光束定向，以使得声光合束器利用机械波既使探测光束的具有照明光波长和第一线偏振方向的部分偏转，也使探测光束的具有照明波长和第二线偏振方向(其与第一偏振方向垂直)的部分偏转，并因此将它们从探测光束中移除；和/或该第二晶体和第二机械波的传播方向相对于彼此并且分别相对于入射到该第二晶体中的探测光束定向，以使得声光合束器利用第二机械波既使探测光束的具有另外的照明波长和第一线偏振方向的部分偏转，也使探测光束的具有另外的照明波长和第二线偏振方向(其与第一线偏振方向垂直)的部分偏转，并因此将它们从探测光束中移除。
如已经参考晶体的连续配置类似地描述的，可以有利地规定，探测光束首先穿透该晶体并随后穿透第二晶体。
与声光合束器的特定实施例无关的是，但尤其在声光合束器中，机械波作用在具有一个照明光波长和两个线偏振方向的光部分上，可以有利地规定，合束器的光束引导组件被配置和实现，以使得探测光束的剩余部分共线地离开声光合束器。探测光束可以简单地被传送至探测器、例如多频带探测器。
如已经重复示出的那样，根据本发明的声光合束器或配备有这种合束器的光源可以用于照射样品，或以受激发射损耗(STED)显微术或以相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)显微术或以受激拉曼散射(SRS)显微术或以相干斯托克斯拉曼散射(CSRS)显微术或以拉曼诱导克尔效应散射(RIKES)显微术来照射样品。
附图说明
本发明的内容在附图中示意性地示出并且在以下参考附图进行描述，其中相同功能的元件设置有相同的附图标记。在附图中：
图1示意性地示出了根据本发明的显微镜的示例性实施例，其具有根据本发明的合束器和用作主分束器的另一声光合束器；
图2示出了根据本发明的声光合束器的示例性实施例；
图3示出了根据本发明的声光合束器的第二示例性实施例；
图4示出了关于探测光的处理的根据本发明的声光合束器的第三示例性实施例；
图5示出了关于照明光的方向的第三示例性实施例；
图6示出了关于在STED显微术中的特殊应用的第三示例性实施例；以及
图7示出了根据本发明的声光合束器的第四示例性实施例。
具体实施方式
图1示出了实现为共焦扫描显微镜的显微镜，其装配有根据本发明的声光合束器11和用作主分束器的根据本发明的另一声光合束器13。
该显微镜包含多个光源1，它们的光被组合成一个共线照明光束2。具体说来，该显微镜包含二极管激光器3、(优选地二极管泵浦的)固态激光器4(DPSS激光器)、氦氖激光器5和氩离子激光器6，它们的发射光束借助二色性的分束器7组合起来。该组合的发射光束随后行进至声光可调谐滤波器(AOTF)8，它允许从组合的发射光束中选择具有特定波长的光并使其通过。为此，AOTF 8加载了高频源9的电磁高频波；用户能够通过经PC 10的输入限定通过的光应该具有哪个波长或哪些波长，并且高频源9的频率自动地由显微镜相应地调节。在AOTF 8的内部借助电磁高频波产生用于衍射期望光的机械波。
此外，该显微镜还具有声光合束器11，其一方面接收从AOTF 8传递的光，另一方面接收白光源12的光。
这种白光源12可以特别地包括专门的光学元件，例如显微结构的光学元件和/或锥形光纤和/或光子晶体光纤和/或光子晶体和/或光子带隙材料和/或引起非线性的类似的光学元件，它光谱地展宽入射的主光、尤其是脉冲激光器的光。这种光源可以得到具有几十nm、特别地几百nm的光谱宽度的主光。
该声光合束器11同样被加载由高频源9提供的电磁高频波。该声光合束器11包含声光元件，其中利用电磁高频波能够产生用来偏转或衍射光束的机械波，以使得由AOTF 8传递的光的相应期望部分和白光源12的光的相应期望部分作为组合的照明光束彼此共线地离开声光合束器11。该声光合束器11被构造和操作，以使得通过与至少一个机械波相互作用，由AOTF 8传递的光和白光源12的光被衍射并由此指向共同的光轴。
该显微镜还包含用作主分束器的另一声光合束器13，并且任务是将具有期望波长的照明光14或具有多个期望波长的照明光14引导至照明光束路径15，另一任务是，从来自被照射的样品16(其设置在样本台17上)的多色的且共线的探测光束18(虚线标出)中移除照明光15的在样品16处散射和/或反射的部分。
由另外的声光合束器13引导到照明光束路径15上的照明光14行进至光束偏转装置24，其包含第一电流计反射镜25和第二电流计反射镜26。主光2的其余部分不受该机械波或这些机械波的影响，并且抵达光束陷阱(未示出)。
在离开光束偏转装置24之后，照明光14行进至扫描透镜27，然后抵达镜筒透镜28，最后抵达物镜29，物镜29将照明光14聚焦到样品16上或样品16中。
光束偏转装置24优选地蜿蜒地在该样品16上或经由该样品16引导照明光14的焦点。电流计反射镜25负责X方向上的偏转，而第二电流计反射镜26负责Y方向上的偏转。
另外的声光合束器13加载了至少一个电磁高频波，以便产生至少一个具有一个频率的机械波。通过改变电磁高频波的频率，能够改变机械波的频率。例如可以借助压电声波发生器来产生机械波。
该另外的声光合束器13的晶体(在此附图中未示出，机械波在该晶体中传播)和机械波的传播方向关于来自样品16的探测光束18定向，以使得声光合束器13利用机械波偏转探测光束18的具有照明波长和第一线偏振方向的部分，以及探测光束18的具有照明波长和第二线偏振方向(其与第一偏振方向垂直)的部分，并因此将它们从探测光束18中移除。探测光束18的其余部分19共线地离开晶体，并且在经过声光陷波滤波器(AONF)20、成像光学系统21和探测针孔22之后抵达探测器23，其优选地实现为多波段探测器。该探测器23的电信号被传输到PC 10，以便进一步处理和评价。
该显微镜这样构成，不仅具有一个波长的光能够作为照明光14引导到照明光束路径15，而且不仅具有一个波长的光能够从来自样品16的探测光束18移除，而是多个机械波可以被同时使用以从探测光中移除具有多个不同波长(和两个线偏振方向)的照明光，和/或将具有多个不同波长(和两个线偏振方向)的照明光引导到照明光束路径中，但有利地，在另外的声光合束器13的晶体中针对每个照明光波长只产生单个机械波。
针对用户期望的每个照明光波长，另外的声光合束器13被加载由高频源9产生的单独的电磁高频波。为了实现完整性，提到的是，高频源9为AONF 20、声光合束器11、AOTF 8和另外的声光合束器13提供的不同的高频波通常具有不同的频率。然而，还可以将声光组件实现为使得可以针对至少两个声光组件使用具有相同频率的两个高频波。
图2示意性地示出了声光合束器76的示例性实施例。
该声光合束器76的前方设置有偏振分束器33，其接收具有多个波长的非偏振主光，尤其是(例如白光源的)非偏振宽带主光2。偏振分束器33在空间上将主光2分割成第一照明光束34和第二照明光束35，其中这些照明光束34、35的光具有相互垂直的线偏振方向。
该声光合束器76包含晶体30，该晶体30具有用于来自样品(在此未示出)的探测光束18(用虚线标出)的入射表面31，并且具有用于探测光束18的剩余部分19的出射表面32，该部分最终被引导至探测器(在此未示出)。用于剩余部分19的出射表面32同时是入射表面，用来将第一照明光束34和第二照明光束35耦合到晶体30中。
在该晶体30上设置有压电声波发生器36，其加载具有一个频率的电磁高频波或具有多个频率的多个电磁高频波，以分别产生一个机械波或多个不同的机械波。借助该机械波或多个机械波，既能从第一照明光束34，也能从第二照明光束35中使具有一个期望的照明光波长的光部分或具有多个期望的照明光波长的光部分通过衍射偏转，并因此共线地引导到照明光束路径15中，其中照明光波长中的一个(同时针对两个线偏振方向)分别与相应机械波的一个频率相关联(特别地为了满足相应的布拉格条件)。
该照明光14通过用于探测光束18的入射表面31离开晶体30，该入射表面31同时也是用于照明光14的出射表面。
同时借助该机械波或这些机械波，从探测光束18(虚线示出)中移除具有照明光14的一个波长或多个波长的光部分，晶体30和该机械波的传播方向关于来自样品16的探测光束18定向，以使得每个机械波既使探测光束18的具有照明波长和第一线偏振方向的部分偏转，也使探测光束18的具有照明波长和第二线偏振方向(其与第一偏振方向垂直)的部分偏转，并因此将它们从探测光束18中移除。探测光束18的剩余部分19通过出射表面32共线地离开该晶体。在该附图中，通过晶轴的标识[001]和[110]示意性地示出了晶体结构的方向。
第一照明光束34逆着寻常光的第一衍射级次的方向(相对于探测光的衍射部分)耦合到晶体30中，而第二照明光束35逆着非寻常光的第一衍射级次的方向(相对于探测光的衍射部分)耦合到晶体30中。由此可得到全部的主光2，以便借助声光设备将具有一个特定波长或多个特定波长的照明光14从该主光2引导到显微镜的照明光束路径并因此引导到样品上，其中对于每个波长来说只需要具有单一频率的单个机械波。
为了实现由晶体30输出的照明光束14的共线性，该晶体30的前面设置有色散光学组件37，它在空间上光谱地分割第一照明光束34和第二照明光束35，空间分割的程度(特别地通过角度和/或光路长度的选择)被限定以使得其不能再次由晶体30还原。
色散光学组件37包括用于第一照明光束34的耦合和脱耦窗口38。第一照明光束34首先通过该耦合和脱耦窗口38进入色散光学组件37中，并且在第一照明光束34在空间上光谱分割地通过耦合和脱耦窗口38再次离开色散光学组件37之前，该照明光束在经过该色散光学组件37之后由第一反射镜39反射，该第一反射镜39安装在与耦合和脱耦窗口38相对而置的表面上。
类似地，该色散光学组件37包括用于由偏转镜42偏转的第二照明光束35的另外的耦合和脱耦窗口40。第二照明光束35首先通过该另外的耦合和脱耦窗口40进入色散光学组件37中，并且在第二照明光束35在空间上光谱分割地通过该另外的耦合和脱耦窗口40再次离开色散光学组件37之前，该照明光束在经过该色散光学组件37之后由第二反射镜41反射，该第二反射镜41安装在与该另外的耦合和脱耦窗口40相对而置的表面上。
色散光学组件37还包括用于探测光束18的剩余部分19的相互平行的耦合表面43和脱耦表面44。探测光束18的剩余部分19正交地通过耦合表面43和平行的脱耦表面44，并因此不会经历光谱分割。
图3示出了根据本发明的声光合束器13的第二示例性实施例，其包括第一晶体45和第二晶体46。
该所示的声光合束器13通过第一输入端58接收未示出的光源的第一照明光束47。该第一照明光束47借助反射镜48朝向第一晶体45偏转，并且通过入射表面49进入该晶体中。
第一压电声波发生器57设置在第一晶体45上，该第一压电声波发生器57加载了高频源9的具有频率f1的电磁高频波，并且产生通过第一晶体45传播的、具有与频率f1相对应的声频的机械波(未示出)。
通过与机械波的相互作用，第一照明光束47被偏转到照明光束路径中以照射样品16，该第一照明光束47具有与该声频相关联的照明光波长。该偏转的照明光束47通过出射表面50离开第一晶体45，并且通过显微镜的扫描和光学结构51抵达待照射的样品16，该扫描和光学结构51特别地包含至少一个扫描装置和显微镜物镜。
声光合束器13包括第二晶体46。第二压电声波发生器53设置在第二晶体46上，该第二压电声波发生器53同样加载了高频源9的具有频率f1的电磁高频波，并且产生通过第二晶体46传播的、具有与频率f1相对应的声频的第二机械波(未示出)。
第二晶体接收通过合束器13的第二输入端59进入的第二照明光束77，它具有相同的波长，但具有与第一照明光束47的线偏振方向垂直的另一线偏振方向。第二照明光束77借助反射镜61朝向第二晶体46偏转，并且通过其入射表面54进入该晶体中。
通过与在第二晶体46中传播的第二机械波相互作用，第二照明光束77被偏转，并且引导到通过第一晶体45延伸的光路上。在第二照明光束77通过其出射表面52离开第二晶体46之后，它抵达第一晶体45。在第一晶体45中，第二照明光束77不被在第一晶体45中传播的第一机械波偏转。第一照明光束47在第一晶体45中被衍射至第二照明光束77的光路中。照明光束47、77作为共线组合的照明光束离开第一晶体45。
借助两个晶体45、46中的具有相同声频的声波，一方面第一照明光束47在第一晶体45中被偏转，另一方面第二照明光束77在第二晶体46中被偏转，而第一照明光束47通过未受其机械波影响的第一晶体，这一点通过以下方式实现，即晶体45、46是不同的并且在至少一个参数(例如晶体截面和/或晶体定向和/或机械波和光的传播方向)方面相互协调一致，即针对待偏转的各个照明光束47、77分别满足布拉格条件。
来自样品16的探测光束18在与共线组合的照明光束47、77相反的光路上回到第一晶体45，并且通过出射表面50进入该晶体。通过与第一晶体45的机械波相互作用，探测光中的第一部分55被偏转并因此从探测光束18中移除，该第一部分55具有照明光波长和第一线偏振方向。探测光束18的剩余部分通过入射表面49从第一晶体45中出射，并且随后抵达第二晶体46的出射表面52。
通过与在第二晶体46中传播的第二机械波的相互作用，探测光中的第二部分56被偏转并因此从探测光束18中移除，该第二部分56具有照明光波长和与第一线偏振方向垂直的第二线偏振方向。探测光束18的剩余部分通过入射表面54从第二晶体46出射，并且随后抵达探测器(未示出)。
利用在晶体45、46中具有相同声频的声波，探测光的第一部分55(其具有照明光波长和第一线偏振方向)以及探测光的第二部分56(其具有照明光波长和垂直于第一线偏振方向的第二线偏振方向)都可以被顺序地偏转，如同已参照照明光束47、77描述的一样，这一点通过以下方式实现，即晶体45、46是不同的且在至少一个参数(例如晶体截面和/或晶体定向和/或机械波和光的传播方向)方面相互协调一致，即针对待偏转的光分别满足布拉格条件。
晶体被实施和配置，以使得要输送至探测器的探测光作为共线的光束经由输出端60离开该声光合束器13。这一点特别地通过以下方式实现，即入射表面54和出射表面50相互平行地定向。
图4示出了根据本发明的声光合束器13的第三示例性实施例，其用作显微镜的主分束器，但为了更清楚，在此附图中只示出了来自样品16的探测光的走向，并且示出了从来自样品16的探测光中移除具有照明光波长λ1和λ2的部分。在图5中示出了照明光的走向。
该声光合束器13包括第一晶体62，第一压电声波发生器75设置在它上面，其加载了具有频率为f1和f2的两个电磁高频波，并且产生通过第一晶体62传播的、分别具有对应于频率f1和f2的声频的两个机械波(未示出)。
第一晶体62就其晶体结构而言，机械波的传播方向相对于彼此并且分别相对于入射到晶体中的探测光束18定向，以使得借助该机械波，探测光束18的具有照明波长λ1、λ2和第一线偏振方向的部分，以及探测光束的具有照明波长λ1、λ2和第二线偏振方向(其与第一线偏振方向垂直)的部分被偏转，并因此从探测光束18中移除。
该移除的部分在此附图中用oe和eo表示。在该示例性实施例中，第一线偏振方向就晶体62的双折射特性而言是寻常光的线偏振方向，而在该示例性实施例中，第二线偏振方向就晶体62的双折射特性而言是非寻常光的线偏振方向。通过标识“oe”和“eo”表达出，入射的探测光的线偏振方向通过与机械波的相互作用分别旋转90°(从寻常光至非寻常光，反之亦然)。
该声光合束器13还包括第二晶体63，其接收从第一晶体62输出的剩余探测光。该探测光在空间上既在其偏振方面也在其波长方面分割。然而，第二晶体63被配置，以使得从其输出的探测光束18共线地组合起来，该探测光束18被传送至(未示出的)探测器中。这通过以下方式实现，即第一晶体62的出射窗口64被配置为与第二晶体63的入射窗口65平行，并且另外地，第一晶体62的入射窗口66还被配置为与第二晶体63的出射窗口67平行。应当再次指出，为了清楚，术语“入射表面”和“出射表面”涉及照明光的走向，因此沿相反方向从照明光行进的探测光通过入射表面输出并且通过出射表面输入。
尽管存在着与第一晶体62的机械波的相互作用，第二晶体63一方面用来移除探测光中仍可能剩余的具有照明光波长为λ1和λ2的部分。此外，第二晶体63可以用于为待引导到样品上的照明光提供另外的输入端(这在此未详细示出)。
第二压电声波发生器68设置在第二晶体63上，该第二压电声波发生器68加载了具有频率f1'和f2'的两个电磁高频波，并且产生通过第二晶体63传播的、各自具有对应于频率f1'和f2'的声频的两个机械波(未示出)。
第二晶体63就其晶体结构而言，机械波的传播方向相对于彼此并且分别相对于入射到晶体中的探测光束定向，以使得借助该机械波，探测光束18的具有照明波长λ1、λ2和第一线偏振方向的部分，以及探测光束的具有照明波长λ1、λ2和第二线偏振方向(其与第一线偏振方向垂直)的部分被偏转，并因此从探测光束18中移除。
图5示出了，具有照明光波长λ1和λ2的照明光(它既具有第一线偏振方向，也具有与第一线偏振方向不同的第二线偏振方向)如何借助参照图3详细描述的声光合束器13共线地引导到用来照射样品16的照明光束路径。
在以下的说明书中，照明光只通过第一晶体62以及通过与在该晶体62中传播的机械波(未示出)的相互作用来描述。然而，可替换地或另外地，照明光也能够通过第二晶体63耦合，并且引导到用来照射样品16的照明光束路径。
照明光束的耦合在光路上进行，在该光路上探测光的具有照明光波长的部分从探测光束18移除，如图6所示。
由于第一晶体62的特殊的晶体截面，第一照明光束69作为共线的照明光束耦合，该第一照明光束69具有第一线偏振方向(在附图中用"o-pol"(o偏振)标出)以及具有两个照明光波长λ1和λ2的部分。通过与机械波的相互作用，将该光引导至用来照射样品16的照明光束路径。它通过显微镜的扫描和光学结构51抵达待照射的样品16，该结构特别地包含至少扫描装置和显微镜物镜。
此外，第二照明光束70以及第三照明光束71作为空间上分开的照明光束70、71耦合，第二照明光束70具有照明光波长为λ1的光和第二线偏振方向，第三照明光束71具有照明光波长为λ2的光和第二线偏振方向。这些照明光束70、71的光也通过与在第一晶体62中传播的机械波的相互作用抵达照明光束路径并且通过显微镜的扫描和光学结构51抵达样品16。
不具有照明光波长λ1或照明光波长λ2的光不会引导到照明光束路径，而是引导到光束陷阱(未示出)。
图6示出了关于在STED显微术中的特殊应用能力的第三示例性实施例；其中只示出了加载在样品上的照明光的走向，但为了更清晰，未示出探测光的走向。
共焦扫描显微镜的分辨能力还通过激励光束的焦点在样品中的强度分布和物理范围来确定。用于提高荧光应用的分辨能力的结构从WO 95/21393 A1得知。在此，激励光束的焦点体积的侧边缘区域借助具有另一波长的另一光束(所谓的“去激”光束)的(可选地，特殊成形的)焦点进行照射，以便在该处以受激的方式将由激励光束激发的样品区域带回基态。之后，仅探测到来自未被去激光束照射的区域的自发发射的光，以使得实现分辨率的整体改善。针对该方法建立了术语“受激发射损耗”(STED)。
在图6所示的示例性实施例中，声光分束器13用于将来自不同方向的各自具有波长λdep和不同线偏振的去激光束72、74，以及具有波长λexc的激励光引导到用来照射样品16的照明光束路径中。
第一晶体62的压电声波发生器75加载了频率为f1的高频波和频率为f2的高频波，并且产生通过第一晶体62传播的、声频分别对应于频率f1和f2的两个机械波(未示出)。
波长为λexc的激励光束73通过第一晶体62耦合。通过与机械波的相互作用，激励光束73被衍射并引导到用来照射样品16的照明光束路径，通过给压电声波发生器75加载频率为f2的高频波来产生该机械波。通过第一晶体62进行耦合是特别有利的，因为在样品16处反射的激励光在第一晶体62中可以利用在第一晶体62中传播的具有频率f2的机械波，以及利用在第二晶体63中传播的机械波从探测光中过滤出来。
具有非寻常线偏振方向的第一去激光束72同样通过第一晶体62耦合，并且通过与机械波的相互作用被衍射并引导到用来照射样品16的照明光束路径中，该机械波通过给压电声波发生器75加载频率为f1的高频波而产生。因此，第一去激光束72和激励光束73以共线组合的方式离开该晶体62。
第二晶体63的压电声波发生器68加载了频率为f1'的高频波，并且产生通过第二晶体63传播的、声频对应于频率f1'的机械波(未示出)。通过与该机械波的相互作用，波长为λdep的第二去激光束74被衍射并且随后未被在该处传播的机械波偏转地通过该第一晶体62行进至照明光束路径并且最后抵达样品16，该第二去激光束74相对于第二晶体63的双折射特性具有寻常线偏振方向。因为不满足布拉格条件，第二去激光束74未经历由于在第一晶体中传播的机械波而产生的偏转。因此，第二去激光束74、第一去激光束72和激励光束73以共线组合的方式离开晶体62，并且在经过显微镜的扫描和光学结构51之后抵达待照射的样品16，该结构特别地包含至少一个扫描装置和显微镜物镜。
用于改变去激光束72的照明光焦点的形状的元件(未示出)可以设置在例如第一去激光束72的光束路径中。该元件可以包括例如相位滤波器或渐进相位滤波器或分割相位滤波器或可转换的相位矩阵、尤其是LCD矩阵。特别地，可以规定，借助用于改变照明光焦点的形状的元件在样品16中产生了环状焦点(“面圈式焦点”)，它与激励光束73的焦点在X-Y平面(即在垂直于光轴的平面)中重叠，以便在X-Y方向上提高分辨率。环状焦点可以例如借助所谓的涡旋相位滤波器实现。
在第二去激光束74的光束路径中同样能够设置用来改变去激光束72的照明光焦点的形状的另一元件(未示出)。特别地，可以规定，借助该用来改变照明光焦点的形状的另一元件，产生了双重焦点，它与激励光束73的焦点在Z方向上、优选在激励光束73的焦点中心的上方和下方重叠，以便在Z方向上提高分辨率。
图6所示的合束器参照STED显微术中的特殊使用进行描述。然而，也可以所述的方式使用合束器来组合照明光束，以用于其它应用。
就此而言，图6所示的声光合束器是实现上述目的的通用解决方案的特殊实施例，其中该声光合束器包括第一晶体和第二晶体，第一机械波通过该第一晶体传播，第二机械波通过第二晶体传播，其中第一照明光束通过与第一机械波的相互作用被衍射并且引导到共同的光轴上，第二照明光束通过与第二机械波的相互作用被衍射并且引导到共同的光轴上，其中被衍射的第二照明光束在未与第一机械波进行相互作用的情况下穿过第一晶体，并且共线地、即在共同的光轴上与第一照明光束从第一晶体中输出。
在该示例性实施例中，还与其偏振无关地，从来自样品的探测光束中移除探测光的具有照明光的波长的部分。
然而，如前面详细描述的一样，在该示例性实施例中从来自样品的探测光束中移除具有激励光的波长λexc的部分。
图7示出了根据本发明的声光合束器76的第四示例性实施例。
声光合束器76的前方设置有偏振分束器33，其接收具有多个波长的非偏振主光，尤其是例如白光源的非偏振宽带主光2。偏振分束器33在空间上将主光2分割成第一照明光束34和第二照明光束35，其中这些照明光束34、35的光具有相互垂直的线偏振方向。
该声光合束器76包含晶体78，该晶体78具有入射表面79和出射表面80，该入射表面79用于两个照明光束34、35，组合的共线的照明光束通过该出射表面80离开晶体78。在该晶体78上设置有压电声波发生器81，它加载具有一个频率的电磁高频波或具有多个频率的多个电磁高频波，以便分别产生一个机械波或多个不同的机械波。借助该机械波或多个机械波，具有期望照明光波长的光部分或具有多个期望照明光波长的光部分既能从第一照明光束34，也能从第二照明光束35偏转，并因此作为共线组合的照明光束82被偏转到共同的照明光束路径，其中相应机械波的一个相应频率(特别地为了分别满足布拉格条件)同时针对两个线偏振方向与照明光波长中的一个相关联。
声光合束器76的特别之处在于，特别地由于晶体78的特殊构造和特殊定向，它只在空间上光谱地分割第二照明光束35，并且第一照明光束34的被偏转到照明光束路径中的部分不会经历空间分割。因此在第一照明光束34的光束路径中，不需要补偿元件，例如棱镜。因此，第一照明光束34的光束路径仅包含一些偏转镜83，以便将第一照明光束34从偏振分束器33引导至晶体78。除了偏转镜83以外，只在第二照明光束35的光束路径中设置有两个棱镜84，其在空间上光谱地分割第二照明光束35，以使得在再次经过晶体78时还原该分割。
已参照特定实施例描述了本发明，其中对于相同或相同功能的组件通常使用相同的附图标记。然而，清楚无疑的是，还可以在不背离下述权利要求的保护范围的情况下进行修改和变形。
Claims (20)
1.一种用于显微镜的声光合束器，其接收至少第一照明光束和第二照明光束并且将它们组合成共线的输出光束，所述第一照明光束和所述第二照明光束具有相同的照明光波长，但具有不同的偏振，
其中，所述声光合束器被构建和操作以使得通过与至少一个机械波的相互作用，所述第一照明光束和所述第二照明光束被衍射并因此被引导到共同的光轴上，以及
其中，所述声光合束器包括第一晶体和第二晶体，第一机械波通过所述第一晶体传播，第二机械波通过所述第二晶体传播，其中所述第一照明光束通过与所述第一机械波的相互作用被衍射并且被引导到共同的光轴，所述第二照明光束通过与所述第二机械波的相互作用被衍射并且被引导到共同的光轴，被衍射的第二照明光束未被所述第一机械波衍射地通过所述第一晶体。
2.根据权利要求1所述的声光合束器，其中，至少一个另外的照明光束通过所述第一晶体行进并且与所述第一和第二照明光束一起抵达共同的光轴，所述另外的照明光束不具有所述第一和第二照明光束的波长并且不在所述机械波处被衍射。
3.根据权利要求2所述的声光合束器，其中，所述另外的照明光束从第二晶体中发出，所述第二机械波在所述第二晶体中传播，所述第二机械波具有与所述另外的照明光束的波长相关联的声频，
a.所述另外的照明光束包含第三照明光束，其具有另外的照明光波长并且被所述第二机械波衍射；或者
b.所述另外的照明光束包含第三和第四照明光束，其具有另外的照明光波长，但具有不同的偏振，这些照明光束被所述第二机械波衍射。
4.根据权利要求1所述的声光合束器，其中，所述显微镜是扫描显微镜。
5.一种用于显微镜的光源，其具有多个主光源和根据权利要求1至4中任一项所述的声光合束器，该声光合束器将所述多个主光源的照明光束组合起来。
6.根据权利要求5所述的光源，其中，所述显微镜是扫描显微镜。
7.根据权利要求6所述的光源，其中，所述显微镜是共焦扫描显微镜。
8.一种具有根据权利要求1至4中任一项所述的声光合束器的显微镜。
9.根据权利要求8所述的显微镜，其中，所述声光合束器用作主分束器，其将照明光引导到照明光束路径以照射样品，并且将来自样品的探测光引导到具有探测器的探测光束路径。
10.根据权利要求8所述的显微镜，其中，所述显微镜是扫描显微镜。
11.根据权利要求10所述的显微镜，其中，所述显微镜是共焦扫描显微镜。
12.一种具有根据权利要求3所述的声光合束器的显微镜。
13.根据权利要求12所述的显微镜，其中，所述声光合束器接收来自样品的探测光，并且从所述探测光中移除具有所述第一照明光束和所述第二照明光束的照明光波长或所述另外的照明光波长的部分。
14.根据权利要求12所述的显微镜，其中，
a.来自样品的探测光束通过与所述第一晶体的机械波的相互作用，既使所述探测光束的具有照明光波长和第一线偏振方向的部分偏转，也使所述探测光的具有照明光波长和与所述第一线偏振方向垂直的第二线偏振方向的部分偏转，并因此从所述探测光束中移除；或
b.来自样品的探测光束通过与所述第二晶体的机械波的相互作用，既使所述探测光束的具有该另外的照明光波长和第一线偏振方向的部分偏转，也使所述探测光的具有该另外的照明光波长和与所述第一线偏振方向垂直的第二线偏振方向的部分偏转，并因此从所述探测光束中移除；或
c.所述第一晶体和所述机械波的传播方向相对于彼此并且分别相对于入射到所述第一晶体中的探测光束定向，以使得所述声光合束器利用所述机械波偏转所述探测光束的具有照明光波长和第一线偏振方向的部分，以及所述探测光束的具有照明光波长和与所述第一线偏振方向垂直的第二线偏振方向的部分，并因此将它们从所述探测光束中移除；或
d.所述第二晶体和所述第二机械波的传播方向相对于彼此并且分别相对于入射到所述第二晶体中的探测光束定向，以使得所述声光合束器利用所述第二机械波偏转所述探测光束的具有另外的照明光波长和第一线偏振方向的部分，以及所述探测光束的具有另外的照明光波长和与所述第一线偏振方向垂直的第二线偏振方向的部分，并因此将它们从所述探测光束中移除。
15.根据权利要求14所述的显微镜，其中，所述探测光束首先通过所述第一晶体，随后通过所述第二晶体。
16.根据权利要求14或15所述的显微镜，其中，所述合束器的光束引导组件被配置和实现，以使得所述探测光束的剩余部分共线地离开所述声光合束器。
17.根据权利要求12所述的显微镜，其中，所述显微镜是扫描显微镜。
18.根据权利要求17所述的显微镜，其中，所述显微镜是共焦扫描显微镜。
19.根据权利要求1至4中任一项所述的声光合束器或者根据权利要求5至7中任一项所述的光源以受激发射损耗(STED)显微术或以相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)显微术或以受激拉曼散射(SRS)显微术或以相干斯托克斯拉曼散射(CSRS)显微术或以拉曼诱导克尔效应散射(RIKES)显微术照射样品时的应用。
20.根据权利要求8至18中任一项所述的显微镜的用于以受激发射损耗(STED)显微术或以相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)显微术或以受激拉曼散射(SRS)显微术或以相干斯托克斯拉曼散射(CSRS)显微术或以拉曼诱导克尔效应散射(RIKES)显微术来检测样品的应用。
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