CN105683818B - 具有偏振的样品照明的扫描显微镜 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测样品的方法，其中给该样品加载了照明光并且将来自样品的探测光引导至探测器，并且照明光被引导通过声光组件，利用该声光组件能够暂时中断给样品加载照明光。该方法的特征在于，利用具有第一线偏振方向的第一照明光束和第二照明光束照射该样品，该第二照明光束的线偏振方向持续地在第一线偏振方向和不同于第一线偏振方向的第二线偏振方向之间转换。第一线偏振方向的照明光沿着第一光路行进，并且第二线偏振方向的照明光沿着第二光路行进，并且声光组件将这些光路组合起来。

Description

具有偏振的样品照明的扫描显微镜
技术领域
本发明涉及一种用于检测样品的方法，其中，给该样品加载了照明光并且将来自样品的探测光引导至探测器，并且该照明光被引导通过声光组件，可以借助该声光组件暂时中断给样品加载照明光。
本发明还涉及一种用于实施这种方法的设备、尤其是扫描显微镜或共焦扫描显微镜，并且涉及一种用于检测样品的设备、尤其是扫描显微镜或共焦扫描显微镜，其中给该样品加载了照明光并且将来自样品的探测光引导至探测器，并且该照明光被引导通过声光组件，可以借助该声光组件暂时中断给样品加载照明光。
此外，本发明还涉及一种用于制造根据本发明的设备的模块。
背景技术
在显微镜中，尤其在扫描显微镜或者共焦扫描显微镜中，通常借助照明光束来照射样品，该照明光束是通过组合多个照明光束而产生的，以便观察从被照射的样品发出的反射光或荧光。
在扫描显微术中，例如，这种照明光束的焦点借助可控制的光束偏转装置(一般通过倾斜两个反射镜)在样本平面中移动；偏转轴通常相互垂直，以使得一个反射镜在X方向上偏转，另一个反射镜在Y方向上偏转。反射镜的倾斜例如借助检流计定位元件来实现。源自样本的光的功率水平根据扫描光束的位置来测量。这些定位元件通常配备有用于获知当前反射镜位置的传感器。
特别在共焦扫描显微术中，利用照明光束的焦点三维地扫描样本。共焦扫描显微镜通常包含光源、聚焦光学系统(光源的光通过聚焦光学系统聚焦在孔上，该孔被称为“激发针孔”)、分束器、用于光束控制的光束偏转装置、显微镜光学系统、探测针孔以及用于探测所探测的光或荧光的探测器。该照明光例如通过分束器耦合。
源自样本的荧光通过光束偏转装置返回至分束器，通过分束器，然后被聚焦到探测针孔上，探测器位于该探测针孔的后面。不直接源于焦点区域的探测光采取不同的光路并且不通过探测针孔，因此获得点信息项。可以通过样本的顺序扫描来生成三维图像。
相干拉曼显微镜(CRM)的领域在一段时间非常重要，并且应用在生物和药理学样品的成像研究以及营养科学领域。相干拉曼显微术相对于常规的拉曼显微术的优点尤其在于较高的成像速度。
相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)、相干斯托克斯拉曼散射(CSRS)、拉曼诱导克尔效应散射(RIKES)以及受激拉曼散射(SRS)表示各种CRM技术。其中，受激拉曼散射(SRS)具有特殊的优点，即可以完全阻拦非谐振的背景信号，并且能够实现较高的信噪比。
受激拉曼散射(SRS)技术的基础是，将具有不同波长的两个脉冲光场(具有在40-100MHz范围内的频率)通过共焦显微镜系统引导到待检测的样品上。在该情况下，适当的光束引导和聚焦确保了两个光场在空间和时间上在样品中重叠。
这两个光场中之一在样品中与其它光场相互作用之前，在频率Ω(典型地在kHz至MHz的范围内)处进行强度调制或频率调制或偏振调制。在经过该样品或在该样品处反射之后，探测到第二光场(其原本未经调制)，并且其具有频率Ω的调制振幅被测量。该调制振幅表示SRS信号。具有较高波长的光场可以是例如所谓的“斯托克斯”照明光束，而具有较低波长的光场可以被称为“泵浦”照明光束。
例如，可以调制斯托克斯照明光束，并且在样品相互作用之后探测泵浦照明光束。在这种情况下，产生的信号被称为“受激拉曼损失”(SRL)。在其它情况下，即当最初该泵浦照明光束被调制时，则在样品相互作用之后探测到斯托克斯照明光束，并且产生的信号被称为“受激拉曼增益”(SRG)。SRL和SRG都是流行的SRS方法；其中该信号的信息内容在这两个方法中几乎是相同的。在用于生成SRS图像的各种调制方法中，强度调制是最简单且最稳健的技术。
然而，利用SRS方法(其中这些光场中之一被强度调制)会出现的实际问题是，只能使用非常薄的样品。其原因是，在焦点体积中非常强的光场会影响样品的折射率。该效果被称为“克尔效应”。因此，前述光场之一的调制也引起了样品的折射率的调制，这引起了不同的次级效应(例如自相位调制)，并且会形成随时间变化的克尔透镜。
这会导致来自样品的、待探测的光场的发散的时间相关调制。如果采集光学器件的数值孔径小于聚焦光学器件(其使照明光聚焦)的数值孔径，则来自样品的探测光的随时间波动的部分不能由采集光学器件捕获。因此，探测器认为该探测光束的发散的调制是强度调制，它(实际上在相同的调制频率处)与实际想要探测的SRS信号重叠。这会引起干扰性的信号背景。
为了克服该效应，使用具有大数值孔径的采集光学器件。然而，这会严重限制可以在高分辨率的SRS成像中使用的样品厚度。为此必须使用厚度为几十微米的薄的样品片。这些现象的后果是样品制备时间长，并且会限制高分辨率的活细胞成像的成像方法的使用。
利用频率调制的SRS(FM-SRS)或利用偏振调制的SRS(PM-SRS)都不会出现这些缺点。然而，稳健的FM-SRS的实施在技术上非常复杂。
然而，即使利用偏振调制的SRS，也存在非常干扰性的实际问题，该技术借助(特别地，共焦)扫描显微镜无法实现，其中扫描显微镜的照明光借助一个或多个AOTF在光功率水平方面进行调节，或者它的照明借助一个或多个AOTF暂时地切断，因为这种扫描显微镜的AOTF仅作用于具有一个波长和特定偏振的照明光上，如例如从DE 198 29 981A1已知的那样。
发明内容
因此，本发明的目标是描述一种方法，其允许使用扫描显微镜实现相干拉曼显微术，借助它可以暂时中断照明和/或调节所述照明的光功率水平。
该目标通过一种方法得以实现，其特征在于，利用第一照明光束和第二照明光束照射样品，该第一照明光束具有第一线偏振方向，该第二照明光束的线偏振方向持续地在第一线偏振方向和不同于第一线偏振方向的第二线偏振方向之间转换，其中具有第一线偏振方向的照明光沿着第一光路行进，并且具有第二线偏振方向的照明光沿着第二光路行进，并且该声光组件将这些光路组合起来，以使得具有第一线偏振方向的照明光与具有第二线偏振方向的照明光共线组合地抵达共同的照明光束路径以用于照射样品。
本发明的另一目标是描述一种设备、尤其是扫描显微镜或共焦扫描显微镜，它既能暂时地中断所述照明和/或调节所述照明的光功率水平，也能允许在相干拉曼光谱法的基础上实施样品检测。
该另一目标通过一种设备、尤其是扫描显微镜或共焦扫描显微镜得以实现，其特征在于，该照明光包括具有第一线偏振方向的第一照明光束，并且包括第二照明光束，转换装置(尤其是声光的或电光的调制器)连续地在第一线偏振方向和与第一线偏振方向不同的第二线偏振方向之间转换该第二照明光束的线偏振方向，其中具有第一线偏振方向的照明光沿着第一光路行进，并且具有第二线偏振方向的照明光沿着第二光路行进，并且该声光组件将这些光路组合起来，以使得具有第一线偏振方向的照明光与具有第二线偏振方向的照明光共线组合地抵达共同的照明光束路径以用于照射样品。
本发明的另一目标是描述一种能力，其能够快速且有效地制造一种用于在相干拉曼光谱法的基础上实施样品检测的设备，其也允许照明的暂时中断，或者允许为此改装现有的设备。
该目标通过一种模块实现，其特征在于，该模块包括偏振分束器和声光组件，该偏振分束器定义了第一和第二光路的开始，该声光组件将第一和第二光路组合起来。
本发明的优点是，第一和/或第二照明光束可以例如快速地中断或再次释放。还可以有利地提供快速地转换成其它波长或其它波长组合的可能性。特别地，可以利用以下事实，声光组件通常可以在几微秒内转换。
根据本发明，还可以借助该声光组件来调节和/或控制第一照明光束和/或第二照明光束的光功率水平。
本发明的优点尤其在于，借助该声光组件能够暂时中断给该样品加载第一照明光束和/或第二照明光束。特别地，以这种方式能够有效地避免不必要的样品负荷，并因此例如避免样品的过早褪色。例如可以规定，只有照明光的探测发生或者在检测之前需要(例如用于预览图像)，该声光组件才特别地以自动控制的方式释放朝向样品的光路。
有利地可以规定，特别地，如果第一照明光束和/或第二照明光束照射处于待检测区域之外的样品区域，则通过该声光组件特别是自动地中断给该样品加载第一照明光束和/或第二照明光束。可选地或附加地，还可以规定，通过该声光组件特别是自动地在曲折型扫描的折回区域中和/或在(特别地，曲折型)扫描的返回路径上中断给该样品加载第一照明光束和/或第二照明光束。
特别地可以规定，至少一个机械波在该声光组件中传播，这些照明光束中的至少一个在该机械波处被衍射并因此被引导到照明光束路径中以用于照射样品。
此外，本发明的优点还尤其在于，甚至使用不具有大数值孔径的采集光学器件的情况下也可以进行样品的检测，因为前面描述的问题，特别是是探测光的发散的随时间的波动，利用根据本发明的方法不会出现。因此，以特别有利的方式，还可以检测具有明显大于如今能检测的样品厚度的厚度的样品。
在特别有利的实施例中，第一机械波在该声光组件中传播，该第一机械波的频率被选择，以使得第一照明光束在该机械波处被衍射并因此引导到照明光束路径以用于照射样品。可选地或附加地，可以规定，第二机械波在该声光组件中传播，该第二机械波的频率被选择，以使得如果第二照明光束具有第一线偏振方向，则该第二照明光束在该第二机械波处被衍射并因此引导到照明光束路径以用于照射样品。可选地或附加地，有利的是，第三机械波也可以在该声光组件中传播，该第三机械波的频率被选择，以使得如果第二照明光束具有第二线偏振方向，则该第二照明光束在该机械波处被衍射并因此引导到照明光束路径以用于照射样品。
特别地，可以有利地规定，该声光组件包括至少一个声光可调滤波器(AOTF)，这个机械波或这些机械波在AOTF中传播。
这种声光组件的操作的方式基本上基于耦合的照明光束与一个机械波或多个机械波的相互作用。声光组件通常由所谓的声光晶体构成，电子转换器(在文献中通常称为“换能器”)安装在该晶体上。该转换器优选地包括压电材料以及位于其上方的一个电极和位于其下方的一个电极。利用无线电频率(其典型地位于30MHz和800MHz之间的范围)对电极的电激活，使压电材料振动，因此能够产生声音波(即声波)，该声波在产生之后穿过该晶体。声波通常在经过光学相互作用区之后在晶体的相对侧上被吸收或反射出去。
声光晶体由于以下事实而值得关注，即所产生的声波改变了晶体的光学特征，通过声音感应出一种光栅或者类似的光学活性结构，例如全息图。穿过该晶体的光经历光栅处的衍射。光在衍射方向上被相应地引导至不同的衍射级别。存在影响所有的入射光(几乎不考虑波长)的声光组件。仅通过示例，可以参考例如声光调制器(AOM)、声光偏转器(AOD)和移频器的组件。还存在例如选择性地根据辐射的无线电频率作用于单独的波长的组件(声光可调谐滤波器，AOTF)。声光元件通常由双折射晶体(例如氧化碲)构成；相应的元件的光学效果特别地由晶轴相对于光的入射方向及其偏振的位置来确定。
尤其当例如在声光合束器中使用AOTF时，该机械波必须具有特定的频率，以使得针对具有期望的照明光波长和期望偏振的光恰好满足布拉格条件。利用这些声光组件，未满足布拉格条件的光不会被机械波偏转。
特别地可以规定，第一线偏振方向就晶体的双折射特性而言是寻常光的线偏振方向；和/或第二线偏振方向就晶体的双折射特性而言是非寻常光的线偏振方向；或者相反，可以规定(可选地或附加地)，第一线偏振方向或第二线偏振方向设置在由机械波的传播方向和入射光束的传播方向跨越的平面中。
在本发明的特定实施例中，首先产生主照明光束，其以共线组合的方式包含第一照明光束和/或第二照明光束。这种主要照明光束可以例如通过将第一照明光束与第二照明光束组合来产生，其中第二照明光束在组合之前穿过了在空间上与第一照明光束分离的光路，在该光路中设置有用于转换线偏振方向的元件，例如电光或声光调制器。
该主照明光束随后根据线偏振特别地利用偏振分束器在空间上分割，具有不同线偏振的部分相互分离地被引导至第一和第二光路中。该过程的优点在于，具有第一线偏振方向的照明光可以耦合到声光组件的第一输入端，而具有第二线偏振方向的照明光可以耦合到声光组件的第二输入端中，该第二输入端与第一输入端不同并且特别地在空间上是分离的。
特别地，具有不同线偏振的部分可以被耦合，以使得至少一个机械波分别作用在这些部分之一上，结果是这些部分通过衍射被偏转至共同的照明光束路径，其中这些部分以共线组合的方式在该照明光束路径中行进。
为了获取二维或三维的图像数据，可以规定，该样品的至少一个局部区域借助第一照明光束和第二照明光束扫描，和/或第一照明光束和第二照明光束的焦点共同地借助光束偏转装置在样品上移动或穿过该样品，并且在该情况下探测来自样品的探测光。共线组合的照明光束的共同偏转确保照明光束的焦点在空间上在样品中重叠。
在特别有利的实施例中，这些照明光束中的至少一个(即第一照明光束和/或第二照明光束)是脉冲式的。特别地，可以规定，第一照明光束和第二照明光束以相同的脉冲重复频率脉动。如果第一照明光脉冲和第二照明光脉冲应该在时间上在样品中重叠，则这是特别有必要的。
第一照明光束的脉冲重复频率和/或第二照明光束的脉冲重复频率优选地位于40MHz至100MHz的范围内，特别地为80MHz。
根据本发明的设备可以包括例如至少一个光源，其产生主照明光束，其包含第一照明光束和/或第二照明光束。该第一照明光束和/或该第二照明光束可以例如借助模式耦合的脉冲激光器产生。这种脉冲激光器可以跟随有用于影响波长(至少用于照明光束之一)的元件。第一照明光束和/或第二照明光束还可以来源于作为白光源的一部分的所谓的光子光纤或所谓的锥形光纤。
特别地为了确保样品中的脉冲在时间上的重叠，在特别有利的实施例中规定，具有第一线偏振方向的照明光沿着第一光路行进并且包括第一照明光脉冲串；具有第二线偏振方向的照明光沿着第二光路行进并且包括第二照明光脉冲串，其中第一照明光脉冲串相对于第二照明光脉冲串的相位被调节和/或控制，特别地为零。例如可以通过改变第一和/或第二光路的长度来调节或控制该相位。
例如，可以具有相位调节部件，用于调节第一照明光脉冲串相对于第二照明光脉冲串的相位。特别地，用于调节第一光路的长度的第一部件可以设置在第一光路中作为这种相位调节部件的一部分。可选地或附加地，至少一个用于调节第二光路的长度的第二部件还可以设置在第二光路中。
根据本发明的设备的特别有利的实施例包括控制回路，用于将相位控制为预定的或可预定的值。特别地可以规定，存在着用于控制相位的控制回路，其特别地相对于样品中的共同的焦点区域将相位控制为零。
在该方法的简单的实施例中，基于从来自样品的探测光中获得的探测信号，确定照明光脉冲是否实现了足够的时间重叠。可选地或附加地，也可借助合适的传感器、例如借助双光子吸收探测器来获知该时间重叠的程度。在此特别地可以规定，在共同的照明光束路径中传播的照明光的一部分在空间上被分割并且被引导至传感器。由此，可以寄生地(即甚至在样品检测期间)检查和监控照明光脉冲的时间重合。
传感器和相位调节部件都可以有利地成为上述控制回路的组成部分。还可以规定，特别地，电子控制系统是控制回路的组成部分，其接收来自传感器的信号并且将调节信号输出至相位调节部件。
特别地，为了借助相干拉曼光谱法来实施样品检测，和/或为了生成显微镜的样品的至少一部分的拉曼图像、尤其是SRS图像，例如该第一照明光束可以用作斯托克斯照明光束，第二照明光束可以用作泵浦照明光束。可选地，第二照明光束还可以用作斯托克斯照明光束，第一照明光束可以用作泵浦照明光束。
如果第二照明光束的线偏振以在10至30MHz的范围内、尤其在10MHz至20MHz的范围内、尤其是20MHz的频率被转换，则在该情况下可以实现特别可靠和准确的样品检测。特别地，有利的是，第二照明光束的线偏振以小于第一和/或第二照明光束的脉冲重复频率的频率被转换。
如已经提到的那样，该模块可以有利地以简单的方式(可选地在以后)制造出根据本发明的设备。该模块优选地被实现以使得它可以设置在显微镜、尤其是共焦扫描显微镜的光束路径中；该模块可以包括对准部件，用于相对于显微镜的其它组件来对准该模块。优选地，该模块的光学组件被预对准，以使得仅需要相对于显微镜的光束路径作为整体对准该模块。
在特定实施例中，该模块包括偏振分束器，该偏振分束器定义了第一和第二光路的开始。如之前已经描述的那样，主照明光束可以借助偏振分束器根据线偏振在空间上被分割，并且具有不同线偏振的部分可以相互分离地被引导至第一和第二光路中。还设置有声光组件，其再次将第一和第二光路组合起来，以使得照明光束及其部分可以在样品中在空间上重叠。
在特别有利的实施例中，该模块在第一光路中包含用于调节第一光路的长度的第一部件，和/或在第二光路中包含至少一个用于调节第二光路的长度的第二部件。借助这些部件中的至少一个，沿着第一光路传播的脉冲串的相位可以相对于沿着第二光路传播的脉冲串来调节。
该模块特别地还可以包括(特别地，电子)控制设备，用于控制在第一光路中传播的脉冲串相对于在第二光路中传播的脉冲串的相位。
该模块还可以有利地包括传感器、例如双光子吸收探测器，借助它获知沿着第一光路传播的第一照明光脉冲和沿着第二光路传播的第二照明光脉冲在时间上的重叠的程度。
附图说明
本发明的内容在附图中示意性地示出并且在以下参考附图进行描述，其中相同功能的元件设置有相同的附图标记。在附图中：
图1示意性地示出了实现为扫描显微镜的根据本发明的设备的示例性实施例；以及
图2示意性地示出了具有控制电路的根据本发明的设备的示例性实施例。
具体实施方式
图1示意性地示出了实现为扫描显微镜的根据本发明的设备的示例性实施例，该设备用于检测样品1。然而，为了更加清晰，仅示出了样品的照明，而没有示出来自该样品的探测光及其探测情况。
扫描显微镜包括第一光源2，其产生了具有第一线偏振方向的第一脉冲照明光束3。扫描显微镜还包括第二光源4，它产生了第二脉冲照明光束5，转换设备6(尤其是声光或电光调制器)在第一线偏振方向和与第一线偏振方向不同的第二线偏振方向之间连续地转换该第二脉冲照明光束5的线偏振方向。
该第二脉冲照明光束5在借助偏转镜7偏转之后，借助合束器8与第一脉冲照明光束3组合以产生主照明光束9。
该主照明光束9随后根据线偏振借助偏振分束器10在空间上分割，并且具有不同线偏振的部分13、14相互分离地被引导到第一光路11和第二光路12中。具有第一线偏振方向的第一部分13沿着第一光路11传播，而具有第二线偏振方向的第二部分14沿着第二光路12传播。
该扫描显微镜包括声光组件15，其将这些光路11、12组合起来，以使得具有第一线偏振方向的第一部分13与具有第二线偏振方向的第二部分14共线组合地抵达共同的照明光束路径16以用于照射样品1。物镜17和光束偏转装置18位于照明光束路径16中，该物镜17使照明光在样品1上或在样品1中聚焦，该光束偏转装置18将照明光的焦点引导到样品1上或穿过该样品1。
该声光组件15被实现为声光可调滤波器(AOTF)，并且包括光学晶体19，压电声波发生器20设置在光学晶体19上。该压电声波发生器20加载了三个不同的电子HF频率，并且产生了三个在其频率方面不同的机械波(即第一、第二和第三机械波)，它们同时通过晶体19传播；这未在附图中示出。
第一机械波的频率被选择，以使得第一脉冲照明光束3在该机械波处被衍射并因此被引导到照明光束路径以用于照射样品1。第二机械波的频率被选择，以使得如果第二脉冲照明光束5具有第一线偏振方向，则该光束在该机械波处被衍射并因此被引导到照明光束路径以用于照射样品1。第三机械波的频率被选择，以使得如果第二脉冲照明光束5具有第二线偏振方向，则该光束在该机械波处被衍射并因此被引导到照明光束路径以用于照射样品1。
除了仅用于光束引导的一些偏转镜7以外，在第一光路11中还设置有用于调节第一光路11的长度的第一部件21。用于调节第一光路11的长度的第一部件21包括成角度的第一双重镜22，它可位移地安装在(未示出的)位移台上。通过该成角度的第一双重镜22的位移，可以改变第一光路11的长度。除了仅用于光束引导的偏转镜7以外，在第二光路12中还设置有用于调节第二光路12的长度的第二部件23。用于调节第二光路12的长度的第二部件23包括成角度的第二双重镜24，它可位移地安装在(未示出的)位移台上。通过该成角度的第二双重镜24的位移，可以改变第二光路12的长度。
这些部件21、23是相位调节部件25的组成部分，该相位调节部件25用于调节沿第一光路11传播的第一部分13的第一照明光脉冲串相对于沿第二光路12传播的第二部分14的第二照明光脉冲串的相位。
图2示意性地示出了根据本发明的设备的示例性实施例，其具有控制电路，该控制电路用于控制沿第一光路11传播的第一部分13的第一照明光脉冲串相对于沿第二光路12传播的第二部分14的第二照明光脉冲串的相位。
该控制回路包括传感器26，它获取第一和第二照明光脉冲的时间重叠的程度，并且优选地实现为双光子吸收探测器。借助分束器28，由声光组件15组合的照明光的一部分被分割出来并且被输送至传感器26。该传感器将构成所测量相位的实际值的电子信号传送至电子控制系统27，其在考虑传感器信号的情况下将控制输出发送到相位调节部件25，以使得结果建立了期望相位、优选地零相位。
已参照特定实施例描述了本发明，在大多数情况下，对于相同或相同功能的组件使用相同的附图标记。然而，清楚无疑的是，可以在不背离下述权利要求的保护范围的情况下进行修改和变形。

Claims (45)

1.一种用于检测样品的方法，其中给所述样品加载了照明光并且将来自所述样品的探测光引导至探测器，并且所述照明光被引导通过声光组件，借助所述声光组件能够暂时中断给所述样品加载照明光，
其中，利用第一照明光束和第二照明光束照射所述样品，所述第一照明光束具有第一线偏振方向，所述第二照明光束的线偏振方向持续地在第一线偏振方向和不同于所述第一线偏振方向的第二线偏振方向之间转换，具有所述第一线偏振方向的照明光沿着第一光路行进，并且具有所述第二线偏振方向的照明光沿着第二光路行进，并且所述声光组件将所述第一光路和所述第二光路组合起来，以使得具有所述第一线偏振方向的照明光与具有所述第二线偏振方向的照明光共线组合地抵达共同的照明光束路径以用于照射所述样品，
其中，所述声光组件包括一个声光可调滤波器，一个机械波或多个机械波在所述声光可调滤波器中传播，所述照明光束中的至少一个在所述一个机械波或多个机械波处被衍射并因此被引导到所述照明光束路径以用于照射所述样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
a.第一机械波在所述声光组件中传播，所述第一机械波的频率被选择，以使得所述第一照明光束在所述第一机械波处被衍射并因此被引导到所述照明光束路径以用于照射所述样品；或
b.第二机械波在所述声光组件中传播，所述第二机械波的频率被选择，以使得如果所述第二照明光束具有所述第一线偏振方向，则所述第二照明光束在所述第二机械波处被衍射并因此被引导到所述照明光束路径以用于照射所述样品；或
c.第三机械波在所述声光组件中传播，所述第三机械波的频率被选择，以使得如果所述第二照明光束具有所述第二线偏振方向，则所述第二照明光束在所述第三机械波处被衍射并因此被引导到所述照明光束路径以用于照射所述样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，主照明光束以共线组合的方式包含所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一，并且根据线偏振在空间上被分割，具有不同线偏振的部分相互分离地被引导至所述第一光路和第二光路。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一照明光束和所述第二照明光束的焦点借助光束偏转装置在所述样品上移动或穿过所述样品，并且在该情况下探测来自所述样品的探测光。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，利用所述声光组件暂时中断给样品加载所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，
如果所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一照射处于待检测区域之外的样品区域，则利用所述声光组件中断给样品加载所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一；或
利用所述声光组件在曲折型扫描的折回区域中或在返回路径上中断给样品加载所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，借助所述声光组件来调节或控制所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一的光功率水平。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一是脉冲式的；或
所述第一照明光束的脉冲重复频率或所述第二照明光束的脉冲重复频率位于40 MHz至100 MHz的范围内。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第一照明光束和所述第二照明光束以相同的脉冲重复频率脉动。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第一照明光束的脉冲重复频率或所述第二照明光束的脉冲重复频率为80 MHz。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，具有所述第一线偏振方向的照明光沿着所述第一光路行进并且包括第一照明光脉冲串；具有所述第二线偏振方向的照明光沿着所述第二光路行进并且包括第二照明光脉冲串，
调节或控制所述第一照明光脉冲串相对于所述第二照明光脉冲串的相位。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述第一照明光脉冲串相对于所述第二照明光脉冲串的相位被调节或控制为零。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，通过改变所述第一和第二光路中至少之一来调节或控制所述相位。
14.根据权利要求11或12所述的方法，其中，在所述第一光路中设置用于调节所述第一光路的长度的第一部件；或在所述第二光路中设置至少一个用于调节所述第二光路的长度的第二部件，所述第一部件或所述第二部件是用于控制所述相位的控制回路的一部分。
15.根据权利要求11或12所述的方法，其中，借助传感器来感测所述相位，该传感器接收组合的照明光的至少一部分。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述传感器是双光子吸收探测器。
17.根据权利要求11或12所述的方法，其中，借助传感器来感测所述相位，该传感器是用于控制所述相位的控制回路的一部分。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二照明光束的线偏振以在10至30 MHz的范围内的频率来转换。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第二照明光束的线偏振以在10 MHz至20MHz的范围内的频率来转换。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第二照明光束的线偏振以20 MHz的频率来转换。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二照明光束的线偏振以小于所述第一和第二照明光束中至少之一的脉冲重复频率的频率来转换。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，
a.所述第一照明光束用作斯托克斯照明光束并且所述第二照明光束用作泵浦照明光束，以通过相干拉曼光谱法来实施样品检测，或生成显微镜的样品的至少一部分的拉曼图像或SRS图像；或者
b.所述第二照明光束用作斯托克斯照明光束并且所述第一照明光束用作泵浦照明光束，以通过相干拉曼光谱法来实施样品检测，或生成显微镜的样品的至少一部分的拉曼图像或SRS图像。
23.一种用于实施根据权利要求1至22中任一项所述的方法的扫描显微镜。
24.一种用于检测样品的扫描显微镜，其中给所述样品加载了照明光并且将来自样品的探测光引导至探测器，并且所述照明光被引导通过声光组件，借助所述声光组件能够暂时中断给样品加载照明光，其中，所述照明光包括具有第一线偏振方向的第一照明光束，并且包括第二照明光束，该第二照明光束的线偏振方向通过声光或电光调制器连续地在第一线偏振方向和不同于所述第一线偏振方向的第二线偏振方向之间转换，具有所述第一线偏振方向的照明光沿着第一光路行进，并且具有所述第二线偏振方向的照明光沿着第二光路行进，并且所述声光组件将这些光路组合起来，以使得具有所述第一线偏振方向的照明光与具有所述第二线偏振方向的照明光共线组合地抵达共同的照明光束路径以用于照射样品，
其中，所述声光组件包括一个声光可调滤波器，一个机械波或多个机械波在所述声光可调滤波器中传播，所述照明光束中的至少一个在所述一个机械波或多个机械波处被衍射并因此被引导到所述照明光束路径以用于照射所述样品。
25.根据权利要求24所述的扫描显微镜，其中，所述扫描显微镜是共焦扫描显微镜。
26.根据权利要求24所述的扫描显微镜，其中，
a.第一机械波在所述声光组件中传播，所述第一机械波的频率被选择，以使得所述第一照明光束在所述第一机械波处被衍射并因此被引导到照明光束路径以用于照射样品；或
b.第二机械波在所述声光组件中传播，所述第二机械波的频率被选择，以使得如果所述第二照明光束具有所述第一线偏振方向，则所述第二照明光束在所述第二机械波处被衍射并因此被引导到照明光束路径以用于照射样品；或
c.第三机械波在所述声光组件中传播，所述第三机械波的频率被选择，以使得如果所述第二照明光束具有第二线偏振方向，则所述第二照明光束在所述第三机械波处被衍射并因此被引导到照明光束路径以用于照射样品。
27.根据权利要求24所述的扫描显微镜，其中，存在至少一个主光源，其产生包含所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一的主照明光束；以及偏振分束器根据线偏振在空间上分割所述主照明光束，并且将具有不同线偏振的部分相互分离地引导到所述第一和第二光路。
28.根据权利要求24所述的扫描显微镜，其中，光束偏转装置使所述第一照明光束和所述第二照明光束的焦点在所述样品上移动或穿过所述样品，并且在该情况下探测来自所述样品的探测光。
29.根据权利要求24所述的扫描显微镜，其中，
a.如果样品不被加载照明光，则所述声光组件中断所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一；或
b.如果所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一照射位于待检测的区域之外的样品区域，则所述声光组件中断所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一；或
c.所述声光组件在曲折型扫描的折回区域中或在返回路径上中断给样品加载所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的扫描显微镜，其中，利用所述声光组件调节或控制所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一的光功率水平。
31.根据权利要求24至29中任一项所述的扫描显微镜，其中，
所述第一照明光束和所述第二照明光束中至少之一是脉冲式的；或
所述第一照明光束的脉冲重复频率或所述第二照明光束的脉冲重复频率位于40 MHz至100 MHz的范围内。
32.根据权利要求31所述的扫描显微镜，其中，所述第一照明光束和所述第二照明光束以相同的脉冲重复频率脉动。
33.根据权利要求31所述的扫描显微镜，其中，所述第一照明光束的脉冲重复频率或所述第二照明光束的脉冲重复频率为80 MHz。
34.根据权利要求24至29中任一项所述的扫描显微镜，其中，具有所述第一线偏振方向的照明光沿着所述第一光路行进并且包括第一照明光脉冲串；具有所述第二线偏振方向的照明光沿着所述第二光路行进并且包括第二照明光脉冲串，
利用相位调节部件来调节或控制所述第一照明光脉冲串相对于所述第二照明光脉冲串的相位。
35.根据权利要求34所述的扫描显微镜，其中，所述第一照明光脉冲串相对于所述第二照明光脉冲串的相位被调节或控制为零。
36.根据权利要求34所述的扫描显微镜，其中，作为所述相位调节部件的一部分，在所述第一光路中设置有用于调节所述第一光路的长度的第一部件，或在所述第二光路中设置有至少一个用于调节所述第二光路的长度的第二部件。
37.根据权利要求34所述的扫描显微镜，其中，存在用于将所述相位控制成预定值的控制回路。
38.根据权利要求34所述的扫描显微镜，其中，存在用于控制所述相位的控制回路，其将所述相位控制为零。
39.根据权利要求37所述的扫描显微镜，其中，
a.传感器是控制回路的组成部分，其接收组合的照明光的至少一部分；和
b.所述相位调节部件是所述控制回路的组成部分；和
c.电子控制系统是所述控制回路的组成部分，其接收来自所述传感器的信号并且将调节信号输出至所述相位调节部件。
40.根据权利要求39所述的扫描显微镜，其中，所述传感器是双光子吸收探测器。
41.根据权利要求24至29中任一项所述的扫描显微镜，其中，所述第二照明光束的线偏振以在10至30 MHz的范围内的频率来转换。
42.根据权利要求41所述的扫描显微镜，其中，所述第二照明光束的线偏振以在10 MHz至20 MHz的范围内的频率来转换。
43.根据权利要求41所述的扫描显微镜，其中，所述第二照明光束的线偏振以20 MHz的频率来转换。
44.根据权利要求24至29中任一项所述的扫描显微镜，其中，所述第二照明光束的线偏振以小于所述第一和第二照明光束中至少之一的脉冲重复频率的频率来转换。
45.根据权利要求24至29中任一项所述的扫描显微镜，其中，
a.所述第一照明光束用作斯托克斯照明光束并且所述第二照明光束用作泵浦照明光束，以通过相干拉曼光谱法来实施样品检测，或产生显微镜的样品的至少一部分的拉曼图像；或者
b.所述第二照明光束用作斯托克斯照明光束并且所述第一照明光束用作泵浦照明光束，以通过相干拉曼光谱法来实施样品检测，或产生显微镜的样品的至少一部分的拉曼图像。
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