JP2016534354A - 偏光式のサンプル照明部を備えた走査顕微鏡 - Google Patents

Abstract

本発明は、サンプルの検査方法であって、サンプルに照明光を印加して、このサンプルから出る検出光を検出器へ偏向し、照明光を音響光学素子を通して偏向し、この音響光学素子によってサンプルへの照明光の印加を一時的に中断可能にする方法に関する。本発明の方法は、サンプルを、第１の直線偏光方向を有する第１の照明光束と、第１の直線偏光方向とこれとは異なる第２の直線偏光方向との間で連続的に切り換えられる直線偏光方向を有する第２の照明光束とによって照明し、ここで、第１の直線偏光方向の照明光が第１の光路に沿って走行し、第２の直線偏光方向の照明光が第２の光路に沿って走行し、音響光学素子によって各光路を統合することを特徴とする。

Description

本発明は、サンプルの検査方法であって、サンプルに照明光を印加して、サンプルから出る検出光を検出器へ偏向し、照明光を音響光学素子を通して偏向し、この音響光学素子によってサンプルへの照明光の印加を一時的に中断可能にする方法に関する。

本発明はまた、上記方法を実行する装置、特に走査顕微鏡もしくは共焦点走査顕微鏡、及び、サンプルを検査する装置、特に走査顕微鏡もしくは共焦点走査顕微鏡であって、サンプルに照明光が印加されて、サンプルから出る検出光が検出器へ偏向され、照明光が音響光学素子を通して偏向され、この音響光学素子によってサンプルへの照明光の印加が一時的に中断可能となる装置に関する。

本発明はさらに、本発明の装置を製造するためのモジュールに関する。

顕微鏡、特に走査顕微鏡もしくは共焦点走査顕微鏡では、サンプルはしばしば複数の照明光束を統合して形成された１つの照明光束によって照明され、これにより、照明されたサンプルから放出された反射光もしくは蛍光が観察される。

例えば走査顕微鏡では、こうした照明光束の焦点が、制御可能なビーム偏向装置を用いて、一般に２つの鏡を傾動させることにより、対物面で運動される。ここで、各偏向軸線は大抵の場合相互に垂直であるので、一方の鏡がｘ方向へ、他方の鏡がｙ方向へ偏向される。鏡の傾動は例えばガルバノメータ調整素子を用いて行われる。対象物から到来する光の出力が、走査ビームの位置に依存して測定される。通常、当該調整素子には、その時点の鏡の位置を求めるセンサが備えられている。

特に共焦点走査顕微鏡では、対象物は１つの照明光束の焦点によって３次元で走査される。共焦点走査顕微鏡は、一般に、光源、光源の光をホールアパーチャ（いわゆる励起絞り）へフォーカシングするフォーカシング光学系、ビームスプリッタ、ビーム制御のためのビーム偏向装置、顕微鏡光学系、検出絞り、及び、検出光もしくは蛍光を検出する検出器を含む。照明光は例えばビームスプリッタを介して入力される。

対象物から到来する蛍光は、ビーム偏向装置を介してビームスプリッタへ戻り、これを通過した後に検出絞りへフォーカシングされ、この検出絞りの後方に検出器が存在している。焦点領域から直接に到来しない検出光は、他の光路を通っており、検出絞りを通過していないので、点情報を得ることができる。対象物の連続走査により、３次元画像を形成することができる。

コヒーレントラマン分光ＣＲＭ（coherent raman microscopy）の分野は、しばらく前から、生物学的サンプル及び薬学的サンプルの画像形成による検査や食品学の領域において大きな意義と有用性とを獲得している。従来のラマン分光に対するコヒーレントラマン分光の利点は、特に画像形成の速度が大きいということにある。

ＣＲＭ技術には種々のものがあり、コヒーレント反ストークスラマン散乱ＣＡＲＳ（coherent anti-stokes Raman Scattering）、コヒーレントストークスラマン散乱ＣＳＲＳ（coherent Stokes Raman scattering）、誘導ラマンＫｅｒｒ効果散乱Ｒｉｋｅｓ（Raman-induced Kerr-Effect scattering）及び励起ラマン散乱ＳＲＳ（stimulated Raman scattering）などが挙げられる。これらのなかで、励起式ラマン散乱ＳＲＳは、非共鳴の背景信号を完全に抑圧でき、高い信号対雑音比を達成できるという特別な利点を有する。

励起式ラマン散乱ＳＲＳの技術は、パルス制御された、それぞれ異なる波長の２つの光フィールド（４０ＭＨｚから１００ＭＨｚの領域の周波数を有する）を、共焦点走査顕微鏡装置を介して検査すべきサンプルへ導波することを基礎としている。この場合、適切なビームガイド及びフォーカシングによって、２つの光フィールドが空間的にも時間的にもサンプル内で重なることが保証される。

２つの光フィールドのうち一方は、サンプル内で他方の光フィールドの相互作用を受ける前に、典型的にはキロヘルツ領域からメガヘルツ領域の周波数Ωで、強度変調もしくは周波数変調もしくは偏光変調される。サンプルを通過した後又はサンプルで反射された後、最初変調されていなかった第２の光フィールドが検出され、その周波数Ωでの変調振幅が測定される。当該変調振幅がＳＲＳ信号となる。例えば、波長の高いほうの光フィールドがいわゆる“ストークス”照明光束とされ、波長の低いほうの光フィールドがいわゆる“ポンピング”照明光束と称される。

例えば、ストークス照明光束を変調して、サンプルと相互作用した後のポンピング照明光束を検出することができる。このケースでは、生じる信号は、励起ラマン損失ＳＲＬ（stimulated raman loss）と称される。その他のケース、すなわち、ポンピング照明光束のほうを最初に変調するケースでは、ストークス照明光束がサンプルとの相互作用の後に検出され、生じる信号は励起ラマン利得ＳＲＧ（stimulated raman gain）と称される。ＳＲＬもＳＲＧも現行のＳＲＳプロセスで用いられており、どちらのプロセスの信号の情報内容もほぼ同一である。ＳＲＳ画像を形成するための種々の変調プロセスのなかでは、強度変調が最も簡単でかつローバスト性の高い技術である。

ただし、光フィールドの一方のみが強度変調されるＳＲＳプロセスには、きわめて薄いサンプルしか使用できないという実用上の問題がある。その原因は、焦点体積におけるきわめて強い光フィールドがサンプルの屈折率に影響するためである。こうした効果はＫｅｒｒ効果として知られている。したがって、上述した光フィールドが変調されると、その結果として、サンプルの屈折率も変調され、自己位相変調や時間変化するＫｅｒｒレンズの形成などの種々の副次効果が生じてしまう。

こうした副次効果は、サンプルから出る検出すべき光フィールドの発散角の時間変調を生じさせる。集光光学系の開口数が照明光をフォーカシングするフォーカシング光学系の開口数よりも小さい場合、サンプルから出た検出光の時間変動成分は集光光学系では捉えられない。そのため、検出光束の発散角の変調は検出器で強度変調と認識され、（変調周波数が同じであったとしても）本来検出すべきＳＲＳ信号に重畳されてしまう。この重畳は、障害となる背景信号を発生させる。

こうした効果を克服するために、開口数の大きな集光光学系が使用される。しかし、このようにすると、高分解能のＳＲＳ画像形成で使用可能なサンプル厚さが強く制限される。この場合、数十μｍマイクロメートル厚さの薄いサンプルプレートを製造しなければならない。このような現象の結果、長いサンプル準備時間が必要となり、高分解能のライブセルイメージングのための画像形成プロセスの使用に制限が生じる。

これらの欠点は、周波数変調ＳＲＳ（ＦＭ‐ＳＲＳ）や偏光変調ＳＲＳ（ＰＭ‐ＳＲＳ）には存在しない。しかし、ローバストなＦＭ‐ＳＲＳの実行は技術的にきわめて複雑である。

また、偏光変調ＳＲＳにおいても、走査顕微鏡、特に共焦点走査顕微鏡を用いて、顕微鏡の照明光の光出力を１つもしくは複数のＡＯＴＦによって調整するか又はその照明を１つもしくは複数のＡＯＴＦによって一時的に遮断する技術を利用できないという実用上きわめて厄介な問題が存在する。なぜなら、例えばＤＥ１９８２９９８１Ａ１から公知の走査顕微鏡のＡＯＴＦは、それぞれ１つずつの波長と定められた偏光状態とを有する照明光に対してしか作用しないからである。

したがって、本発明の課題は、照明の一時的中断及び／又は照明の光出力の調整の可能な走査顕微鏡によってコヒーレントラマン分光を実行することである。

この課題は、サンプルを、第１の直線偏光方向を有する第１の照明光束と、第１の直線偏光方向とこれとは異なる第２の直線偏光方向との間で連続的に切り換えられる直線偏光方向を有する第２の照明光束とによって照明し、第１の直線偏光方向の照明光を第１の光路に沿って走行させ、第２の直線偏光方向の照明光を第２の光路に沿って走行させ、音響光学素子によって２つの光路を統合し、これにより、第１の直線偏光方向の照明光と第２の直線偏光方向の照明光とを同一線に統合して、サンプル照明のための共通の照明光路に到達させることを特徴とする方法により解決される。

本発明の別の課題は、照明の一時的中断及び／又は照明の光出力の調整が可能であって、かつ、コヒーレントラマン分光に基づくサンプル検査を実行できる装置、特に走査顕微鏡もしくは共焦点走査顕微鏡を提供することである。

この課題は、照明光が、第１の直線偏光方向を有する第１の照明光束と、切換装置、特に音響光学変調器又は電気光学変調器によって第１の直線偏光方向とこれとは異なる第２の直線偏光方向との間で連続的に切り換えられる直線偏光方向を有する第２の照明光束とを含み、第１の直線偏光方向の照明光は第１の光路に沿って走行し、第２の直線偏光方向の照明光は第２の光路に沿って走行し、音響光学素子が２つの光路を統合し、これにより第１の直線偏光方向の照明光と第２の直線偏光方向の照明光とが同一線に統合されて、サンプル照明のための共通の照明光路に達することを特徴とする装置によって解決される。

本発明のさらなる課題は、照明の一時的中断が可能な、コヒーレントラマン分光に基づくサンプル検査を実行できる装置を迅速かつ効率的に製造できる手段、又は、既存の装置をこのようにレトロフィットできる手段を提供することである。

この課題は、第１の光路及び第２の光路の始点を定める偏光ビームスプリッタと、第１の光路及び第２の光路を統合する音響光学素子とを含むことを特徴とするモジュールによって解決される。

本発明は、第１の照明光束及び／又は第２の照明光束が例えば迅速に中断可能、又は、再イネーブル可能となるという利点を有する。また、他の波長又は他の波長組み合わせへ迅速に切り換える手段も有利に得られる。この場合、特に、音響光学素子が大抵の場合に数マイクロ秒以内で切り換え可能であるという事実が活用される。

本発明によれば、さらに、音響光学素子によって第１の照明光束及び／又は第２の照明光束の光出力を調整及び／又は制御することができる。

本発明は、サンプルへの第１の照明光束及び／又は第２の照明光束の印加を音響光学素子によって一時的に中断できるという特別な利点を有する。このようにすれば、特に、サンプルへの不要な負荷、ひいては、サンプルの早期の変色を有効に回避できる。例えば、音響光学素子は、特には自動制御によって、照明光の検出が行われる場合のみ、又は、検査の前段階で例えばプレビュー画像のために必要となった場合にのみ、サンプルまでの光路をイネーブルするように構成可能である。

特に有利には、第１の照明光束及び／又は第２の照明光束がサンプルのうち検査すべき領域外に位置する領域を照明してしまう場合、サンプルへの第１の照明光束及び／又は第２の照明光束の印加が、音響光学素子によって、特には自動的に、中断される。これに代えてもしくはこれに加えて、サンプルへの第１の照明光束及び／又は第２の照明光束の印加が、音響光学素子によって、特には自動的に、メアンダ状走査の折り返し領域及び／又は走査、特にメアンダ状走査の戻り経路において中断されるように構成してもよい。

特に、音響光学素子において、少なくとも１つの照明光束の屈曲によってサンプル照明のための照明光路への偏向を生じさせる少なくとも１つの機械的な波が伝搬するように構成可能である。

本発明はさらに、大きな開口数を有さない集光光学系を用いてサンプルの検査を行えるという特別な利点を有する。なぜなら、冒頭に言及した問題、特に検出光の発散角の時間変動の問題が、本発明の手段では発生しないからである。したがって、特に有利には、これまで検査可能であったサンプルよりも格段に厚いサンプルを検査することができる。

特に有利な実施形態によれば、音響光学素子において、第１の照明光束の屈曲によってサンプル照明のための照明光路への偏向が生じるように選定された周波数を有する第１の機械的な波が伝搬する。これに代えてもしくはこれに加えて、第２の照明光束が第１の直線偏光方向を有する場合、この第２の照明光束の屈曲によってサンプル照明のための照明光路への偏向が生じるように選定された周波数を有する第２の機械的な波を伝搬させてもよい。さらに、これに代えてもしくはこれに加えて、有利には、第２の照明光束が第２の直線偏光方向を有する場合、この第２の照明光束の屈曲によってサンプル照明のための照明光路への偏向が生じるように選定された周波数を有する第３の機械的な波を伝搬させることもできる。

特に有利には、音響光学素子は少なくとも１つのＡＯＴＦ（音響光学チューナブルフィルタ）を含み、このＡＯＴＦ内を１つもしくは複数の機械的な波が伝搬する。

こうした音響光学素子の機能は、主として、入力される照明光束と１つもしくは複数の機械的な波との相互作用に基づく。音響光学素子はふつう、電気変換器（技術文献ではしばしばトランスデューサと称される）が取り付けられたいわゆる音響光学結晶から成っている。好ましくは、変換器は、圧電材料と、その上方及び下方に配置される電極とを含む。典型的には３０ＭＨｚから８００ＭＨｚの領域の無線周波数を電極に電気的に印加することによって圧電材料が発振し、これにより音響的な波すなわち音波が発生し、発生後に結晶を通過する。大抵の場合、当該音波は、反対側の結晶面の光学的な相互作用領域を通過した後に吸収されるか又は反射される。

音響光学結晶は発生音波が結晶の光学特性を変化させることを特徴としており、ここでは、音波によって一種の光学格子又はこれと同等の光活性構造体、例えばホログラムが誘導される。結晶を通して入射してくる光は光学格子の箇所で屈折する。したがって、光は種々の屈折次数で種々の屈折方向へ偏向される。なお、全ての入射光を、程度の差はあるにせよ波長から独立に制御する音響光学素子も存在する。その例として、ＡＯＭ，ＡＯＤ及び周波数シフタなどの素子を挙げておく。また、例えば入射する無線周波数に依存して選択的に個々の波長に作用する素子（ＡＯＴＦなど）も存在する。音響光学素子は、二酸化テルルなどの複屈折結晶から成ることが多く、特に光の入射方向及び偏光状態に対する結晶軸の位置によって各素子の光学的作用が定められる。

特に、音響光学ビーム結合器においてＡＯＴＦなどが用いられる場合、機械的な波は、所望の照明光波長及び所望の偏光状態の光について正確にブラッグ条件が満足されるように完全に定められた周波数を有さなければならない。ブラッグ条件が満足されていない光は、こうした音響光学素子において機械的な波によっては偏向されない。

特に、第１の直線偏光方向は結晶の複屈折特性に関する正規の光の直線偏光方向であってよく、及び／又は、第２の直線偏光方向は結晶の複屈折特性に関する非正規の光の直線偏光方向であってよく、又は、逆であってもよい。特には、これに代えてもしくはこれに加えて、第１の直線偏光方向もしくは第２の直線偏光方向が、機械的な波の伝搬方向と入射する照明光束の伝搬方向とによって定められる平面に配置される。

本発明の特に有利な実施形態では、まず、第１の照明光束及び／又は第２の照明光束を同一線に統合した１次照明光束が形成される。こうした１次照明光束は、例えば、第１の照明光束と、統合部の前方の、空間的に第１の照明光束から分離された光路を通過してくる第２の照明光束とを統合することにより形成される。分離された光路には、直線偏光方向を切り換える素子、例えば電気光学変換器もしくは音響光学変換器が配置される。

ついで、１次照明光束は、直線偏光状態に依存して、特に偏光ビームスプリッタにより、空間的に分割され、それぞれ異なる直線偏光成分が相互に別個に第１の光路と第２の光路とへ偏向される。こうした手法は、第１の直線偏光方向の照明光が音響光学素子の第１の入力側へ入力可能となる一方、第２の直線偏光方向の照明光が音響光学素子の第１の入力側とは異なる第２の入力側、特には第１の入力側から空間的に分離された第２の入力側へ入力可能となるという利点を有する。

特に、それぞれ異なる直線偏光成分は、そのつど少なくとも１つの機械的な波がいずれかの成分に作用するように入力される。これにより、各成分は屈折によって共通の照明光路へ偏向され、そこで各成分が同一線に統合されて走行する。

２次元もしくは３次元の画像データを記録するために、サンプルの少なくとも一部の領域が第１の照明光束及び第２の照明光束によって走査され、及び／又は、第１の照明光束の焦点と第２の照明光束の焦点とがビーム偏向装置を用いて共通にサンプルの上方へ又はサンプルを通して移動され、サンプルから出る検出光が検出される。同一線に統合された照明光束を共通に偏向することにより、照明光束の焦点がサンプルにおいて空間的に重なることが保証される。

特に有利な実施形態では、少なくとも１つの照明光束、すなわち、第１の照明光束及び／又は第２の照明光束がパルス制御される。特に、第１の照明光束及び第２の照明光束が同じパルスシーケンス周波数でパルス制御されるように構成できる。この手段は特に、第１の照明光パルスと第２の照明光パルスとがサンプルにおいて時間的に重なるケースで必要となる。

好ましくは、第１の照明光束のパルスシーケンス周波数及び／又は第２の照明光束のパルスシーケンス周波数は、４０ＭＨｚから１００ＭＨｚの領域にあり、特には８０ＭＨｚである。

本発明の装置は、例えば、第１の照明光束及び／又は第２の照明光束を含む１次照明光束を形成する少なくとも１つの光源を有する。第１の照明光束及び／又は第２の照明光束は、例えばモード結合型パルスレーザによって形成できる。この種のパルスレーザの後方には、波長制御素子（少なくとも一方の照明光束の波長を制御する素子）を接続できる。また、第１の照明光束及び／又は第２の照明光束は、白色光源の一部であるいわゆるフォトニックファイバ又はいわゆるテーパードファイバに由来するものであってもよい。

特にサンプルでのパルスの時間的重なりを保証するために、本発明の特に有利な実施形態では、第１の光路に沿って走行する第１の直線偏光方向の照明光が第１の照明光パルス列を有し、第２の光路に沿って走行する第２の直線偏光方向の照明光が第２の照明光パルス列を有し、第２の照明光パルス列に対する第１の照明光パルス列の位相が特にはゼロへ調整及び／又は制御されるように構成される。当該位相は、例えば第１の光路及び／又は第２の光路の長さを変化させることによって調整又は制御される。

例えば、第２の照明光パルス列に対する第１の照明光パルス列の位相を調整する位相調整手段を設けることができる。特には、こうした位相調整手段の一部として、第１の光路に、第１の光路の長さを調整する第１の手段を配置できる。これに代えてもしくはこれに加えて、第２の光路に、第２の光路の長さを調整する少なくとも１つの第２の手段を配置してもよい。

特に有利な実施形態によれば、本発明の装置は、上記位相を設定された値もしくは設定可能な値へ制御する制御回路を有する。特に、位相（特にサンプルでの共通の焦点領域に対する位相）をゼロへ制御する制御回路（位相制御回路）を設けることもできる。

本発明の方法の簡単な構成として、サンプルから出た検出光から得られた検出信号に基づき、複数の照明光パルスの充分な時間的重なりが達成されているか否かを確認することができる。これに代えてもしくはこれに加えて、上記時間的重なりの尺度量を、適切なセンサ、例えば２光子吸収検出器によって求めることもできる。この場合、特に、共通の照明光路を伝搬する照明光の一部が空間的に分割され、センサへ案内される。このようにすれば、寄生的に、つまりサンプル検査中にも、複数の照明光パルスの時間的重なりを検査及び監視できる。

センサ及び位相調整手段の双方とも、有利には、上述した制御回路の構成要素であってよい。特には、センサからの信号を受信して調整信号を位相調整手段へ出力する制御電子回路が制御回路の一部であるように構成できる。

特に、コヒーレントラマン分光によるサンプル検査を実行するため、及び／又は、顕微鏡サンプルの少なくとも一部のラマン結像、特にＳＲＳ結像を形成するために、例えば、第１の照明光束をストークス照明光束として作用させ、第２の照明光束をポンピング照明光束として作用させることができる。これに代えて、第２の照明光束をストークス照明光束として作用させ、第１の照明光束をポンピング照明光束として作用させてもよい。

この場合、第２の照明光束の直線偏光状態を、１０ＭＨｚから３０ＭＨｚの領域の周波数、特に１０ＭＨｚから２０ＭＨｚの領域の周波数、特に２０ＭＨｚの周波数で切り換えると、特に確実かつ正確なサンプル検査が可能である。なお、第２の照明光束の直線偏光状態が第１の照明光束及び／又は第２の照明光束のパルスシーケンス周波数よりも小さい周波数で切り換えられると特に有利である。

上述したように、本発明の装置の製造乃至場合によりレトロフィットを簡単に行えるモジュールが提供されると有利である。当該モジュールは、好ましくは、顕微鏡、特に共焦点走査顕微鏡のビーム路に配置可能であって、自身を顕微鏡の他の要素に対して相対的にアライメントするアライメント手段を備えるように構成される。好ましくは、モジュールの各光学素子は予めアライメントされるので、当該モジュール全体を顕微鏡のビーム路に対して調整するだけでよい。

特別な構成として、モジュールは、第１の光路及び第２の光路の始点を定める偏光ビームスプリッタを有する。１次照明光束は、上述したように、偏光ビームスプリッタにより直線偏光状態に依存して空間的に分割され、それぞれ異なる直線偏光成分が相互に別個に第１の光路と第２の光路とへ偏向される。また、第１の光路と第２の光路とを再統合する音響光学素子を設けて、照明光束とその成分とのサンプルでの空間的重畳が可能となるようにしてもよい。

特に有利な実施形態では、モジュールは、第１の光路にこの第１の光路の長さを調整する第１の手段を含み、及び／又は、第２の光路にこの第２の光路の長さを調整する少なくとも１つの第２の手段を含む。少なくとも１つのこうした手段により、第２の光路に沿って伝搬するパルス列に対する、第１の光路に沿って伝搬するパルス列の位相を調整することができる。

なお、モジュールは、特には、第２の光路を伝搬するパルス列に対する、第１の光路を伝搬するパルス列の位相を制御する制御装置、特に電子制御装置を含むことができる。

モジュールは、有利には、第１の光路に沿って伝搬する第１の照明光パルスと第２の光路に沿って伝搬する第２の照明光パルスとの時間的重なりの尺度量を求めるセンサ、例えば２光子吸収検出器を含むことができる。

本発明の対象を概略的に図示し、図に即して以下に説明する。ここで、同様の機能を有する要素には同じ参照番号を付してある。

走査顕微鏡として構成された本発明の装置の一実施形態を概略的に示す図である。 制御回路を備えた本発明の装置の一実施形態を概略的に示す図である。

図１には、走査顕微鏡として構成された、本発明のサンプル１を検査する装置の一実施形態が概略的に示されている。ただし、わかりやすくするために、サンプルから出た検出光及びこれを検出する検出部は示さず、サンプル照明部のみを示してある。

走査顕微鏡は第１の光源２を有しており、この第１の光源２は、第１の直線偏光方向を有する第１の照明光束３をパルス制御によって形成する。走査顕微鏡はさらに第２の光源４を有しており、この第２の光源４は、切換装置６、特に音響光学変調器もしくは電気光学変調器によって第１の直線偏光方向とこれとは異なる第２の直線偏光方向との間で連続的に切り換えられる直線偏光方向を有する第２の照明光束５をパルス制御によって形成する。

第２の照明光束５は、偏向鏡７によって偏向された後、ビーム結合器８によって第１の照明光束３と統合され、１次照明光束９となる。

続いて１次照明光束９が直線偏光状態に依存して偏光ビームスプリッタ１０により空間的に分割され、それぞれ異なる直線偏光成分１３，１４が互いに別個に第１の光路１１と第２の光路１２とへ偏向される。第１の直線偏光方向の第１の成分１３は第１の光路１１に沿って伝搬し、第２の直線偏光方向の第２の成分１４は第２の光路１２に沿って伝搬する。

走査顕微鏡は、光路１１，１２を統合する音響光学素子１５を含んでおり、これにより、第１の直線偏光方向の第１の成分１３と第２の直線偏光方向の第２の成分１４とが同一線に統合されて、サンプル１を照明するための共通の照明光路１６へ達する。照明光路１６には、照明光をサンプル１上へ又はその内部へフォーカシングする対物レンズ１７と、照明光の焦点をサンプル１の上方へ又はサンプル１を通して案内するビーム偏向装置１８とが配置されている。

音響光学素子１５はＡＯＴＦ（音響光学チューナブルフィルタ）として構成されており、圧電音波発生器２０が配置された光学結晶１９を含む。圧電音波発生器２０にはそれぞれ異なる３つの電気的な高周波（ＨＦ周波）が印加され、それぞれ周波数の異なる３つの機械的な波、すなわち、光学結晶１９内を同時に伝搬する第１の機械的な波及び第２の機械的な波及び第３の機械的な波が形成される。ただしこのことは図示されていない。

第１の機械的な波の周波数は、第１の照明光束３の屈曲によってサンプル１を照明するための照明光路への偏向が生じるように選定されている。第２の機械的な波の周波数は、第２の照明光束５が第１の直線偏光方向を有する場合、第２の照明光束５の屈曲によってサンプル１を照明するための照明光路への偏向が生じるように選定されている。第３の機械的な波の周波数は、第２の照明光束５が第２の直線偏光方向を有する場合、第２の照明光束５の屈曲によってサンプル１を照明するための照明光路への偏向が生じるように選定されている。

ビームガイドのみに用いられる複数の偏向鏡７のほか、第１の光路１１には、第１の光路１１の長さを調整する第１の手段２１が配置されている。第１の光路１１の長さを調整する第１の手段２１は、所定の傾角を有する第１の二重鏡２２を含み、この第１の二重鏡２２は（図示されていない）移動テーブル上で移動可能に支承されている。第１の二重鏡２２を移動させることにより、第１の光路１１の長さを変化させることができる。第２の光路１２には、ビームガイドのみに用いられる偏向鏡７のほか、第２の光路１２の長さを調整する第２の手段２３が配置されている。第２の光路１２の長さを調整する第２の手段２３は、所定の傾角を有する第２の二重鏡２４を含み、この第２の二重鏡２４は（図示されていない）移動テーブル上で移動可能に支承されている。第２の二重鏡２４を移動させることにより、第２の光路１２の長さを変化させることができる。

第１の手段２１及び第２の手段２３は、第２の光路１２に沿って伝搬する第２の成分１４の第２の照明光パルス列に対する、第１の光路１１に沿って伝搬する第１の成分１３の第１の照明光パルス列の位相を調整する、位相調整手段２５の構成要素である。

図２には、制御回路を備えた本発明の装置の実施形態が概略的に示されている。ここでの制御回路は、第２の光路１２に沿って伝搬する第２の成分１４の第２の照明光パルス列に対する、第１の光路１１に沿って伝搬する第１の成分１３の第１の照明光パルス列の位相を制御する。

当該制御回路は、第１の照明光パルスと第２の照明光パルスとの時間的重なりの尺度量を求めるセンサ２６、好ましくは２光子吸収検出器として構成されるセンサ２６を含む。ビームスプリッタ２８により、音響光学素子１５によって統合された照明光からその一部が分割され、センサ２６へ供給される。当該センサは、測定された位相の実際値を表す電気信号を制御電子回路２７へ伝送し、この制御電子回路２７が、センサ信号を考慮して、結果として所望の位相、好ましくは位相ゼロが生じるように、調整値を位相調整手段２５へ出力する。

本発明を特定の実施形態に即して説明した。同一の要素もしくは同様の機能を有する要素には大抵の場合同じ参照番号を用いている。ただしもちろん、以下に挙げる特許請求の範囲の権利範囲を逸脱することなく、種々の変更乃至修正を行うことができる。

Claims (33)

1. サンプルの検査方法であって、
   サンプルに照明光を印加して、該サンプルから出る検出光を検出器へ偏向し、
   前記照明光を、音響光学素子を通して偏向し、該音響光学素子によって前記サンプルへの前記照明光の印加を一時的に中断可能にする、方法において、
   前記サンプルを、第１の直線偏光方向を有する第１の照明光束と、前記第１の直線偏光方向と該第１の直線偏光方向とは異なる第２の直線偏光方向との間で連続的に切り換えられる直線偏光方向を有する第２の照明光束と、によって照明し、
   前記第１の直線偏光方向の照明光を第１の光路に沿って走行させ、
   前記第２の直線偏光方向の照明光を第２の光路に沿って走行させ、
   前記音響光学素子によって前記第１の光路と前記第２の光路とを統合し、これにより、前記第１の直線偏光方向の照明光と前記第２の直線偏光方向の照明光とを同一線に統合して、サンプル照明のための共通の照明光路へ到達させる、
   ことを特徴とする方法。
2. 前記音響光学素子において、少なくとも１つの前記照明光束の屈曲によってサンプル照明のための前記照明光路への偏向を生じさせる、少なくとも１つの機械的な波を伝搬させる、
   請求項１記載の方法。
3. 前記音響光学素子において、
   ａ．前記第１の照明光束の屈曲によってサンプル照明のための前記照明光路への偏向が生じるように選定された周波数を有する第１の機械的な波を伝搬させ、及び／又は、
   ｂ．前記第２の照明光束が前記第１の直線偏光方向を有する場合、前記第２の照明光束の屈曲によってサンプル照明のための前記照明光路への偏向が生じるように選定された周波数を有する第２の機械的な波を伝搬させ、及び／又は、
   ｃ．前記第２の照明光束が前記第２の直線偏光方向を有する場合、前記第２の照明光束の屈曲によってサンプル照明のための前記照明光路への偏向が生じるように選定された周波数を有する第３の機械的な波を伝搬させる、
   請求項１又は２記載の方法。
4. 前記音響光学素子は少なくとも１つのＡＯＴＦ（音響光学チューナブルフィルタ）を含み、該ＡＯＴＦ内を１つもしくは複数の機械的な波が伝搬する、
   請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
5. 前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束を同一線に統合したものを含む１次照明光束を、直線偏光状態に依存して、特に偏光ビームスプリッタにより、空間的に分割し、
   それぞれ異なる直線偏光成分を相互に別個に前記第１の光路と前記第２の光路とへ偏向する、
   請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
6. ａ．前記サンプルの少なくとも一部の領域を前記第１の照明光束及び前記第２の照明光束によって走査し、及び／又は、
   ｂ．前記第１の照明光束及び前記第２の照明光束の焦点を、ビーム偏向装置を用いて、前記サンプルの上方へ又は前記サンプルを通して移動させ、前記サンプルから出る検出光を検出する、
   請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
7. ａ．前記サンプルへの前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束の印加を、前記音響光学素子によって一時的に中断する、及び／又は、
   ｂ．前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束がサンプルのうち検査すべき領域外に位置する領域を照明してしまう場合、前記サンプルへの前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束の印加を、前記音響光学素子によって、特には自動的に、中断する、又は、
   ｃ．前記サンプルへの前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束の印加を、前記音響光学素子によって、特には自動的に、メアンダ状走査の折り返し領域及び／又は戻り経路において中断する、
   請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
8. 前記音響光学素子によって、前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束の光出力を調整及び／又は制御する、
   請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
9. ａ．前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束をパルス制御する、及び／又は、
   ｂ．前記第１の照明光束及び前記第２の照明光束を同じパルスシーケンス周波数でパルス制御する、及び／又は、
   ｃ．前記第１の照明光束のパルスシーケンス周波数及び／又は前記第２の照明光束のパルスシーケンス周波数は、４０ＭＨｚから１００ＭＨｚの領域にあり、特には８０ＭＨｚである、
   請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
10. 前記第１の光路に沿って走行する前記第１の直線偏光方向の照明光は、第１の照明光パルス列を有し、前記第２の光路に沿って走行する前記第２の直線偏光方向の照明光は、第２の照明光パルス列を有し、
    ａ．前記第２の照明光パルス列に対する前記第１の照明光パルス列の位相を調整及び／又は制御する、又は、
    ｂ．前記第２の照明光パルス列に対する前記第１の照明光パルス列の位相をゼロへ調整及び／又は制御する、
    請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
11. ａ．前記第１の光路の長さ及び／又は前記第２の光路の長さを変化させることにより、前記位相を調整もしくは制御する、及び／又は、
    ｂ．前記第１の光路に、前記第１の光路の長さを調整する第１の手段を配置し、及び／又は、前記第２の光路に、前記第２の光路の長さを調整する少なくとも１つの第２の手段を配置し、前記第１の手段及び／又は前記第２の手段は、位相を制御する制御回路の一部である、
    請求項１０記載の方法。
12. ａ．前記位相を、統合された照明光の少なくとも一部を特に寄生的に受信するセンサによって、特に２光子吸収検出器によって、検出する、及び／又は、
    ｂ．前記位相を、位相を制御する制御回路の一部であるセンサによって検出する、
    請求項１０又は１１記載の方法。
13. ａ．前記第２の照明光束の直線偏光状態を、１０ＭＨｚから３０ＭＨｚの領域の周波数、特に１０ＭＨｚから２０ＭＨｚの領域の周波数、特に２０ＭＨｚの周波数で切り換える、及び／又は、
    ｂ．前記第２の照明光束の直線偏光状態を、前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束のパルスシーケンス周波数よりも小さい周波数で切り換える、
    請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
14. ａ．コヒーレントラマン分光によるサンプル検査を行うため、及び／又は、顕微鏡サンプルの少なくとも一部のラマン結像、特にＳＲＳ結像を形成するために、前記第１の照明光束をストークス照明光束として用い、前記第２の照明光束をポンピング照明光束として用いる、又は、
    ｂ．コヒーレントラマン分光によるサンプル検査を行うため、及び／又は、顕微鏡サンプルの少なくとも一部のラマン結像、特にＳＲＳ結像を形成するために、前記第２の照明光束をストークス照明光束として用い、前記第１の照明光束をポンピング照明光束として用いる、
    請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。
15. 請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法を実行する装置、特に走査顕微鏡。
16. サンプルを検査する装置、特に走査顕微鏡又は共焦点走査顕微鏡であって、
    サンプルに照明光が印加されて、該サンプルから出る検出光が検出器へ偏向され、
    前記照明光が音響光学素子を通して偏向され、該音響光学素子によって前記サンプルへの前記照明光の印加が一時的に中断可能となる、装置において、
    前記照明光は、第１の直線偏光方向を有する第１の照明光束と、切換装置、特に音響光学変調器又は電気光学変調器によって前記第１の直線偏光方向と該第１の直線偏光方向とは異なる第２の直線偏光方向との間で連続的に切り換えられる直線偏光方向を有する第２の照明光束と、を含み、
    前記第１の直線偏光方向の照明光は、第１の光路に沿って走行し、
    前記第２の直線偏光方向の照明光は、第２の光路に沿って走行し、
    前記音響光学素子が各光路を統合し、これにより、前記第１の直線偏光方向の照明光と前記第２の直線偏光方向の照明光とが同一線に統合されて、サンプル照明のための共通の照明光路に達する、
    ことを特徴とする装置。
17. 前記音響光学素子において、少なくとも１つの前記照明光束の屈曲によってサンプル照明のための前記照明光路への偏向を生じさせる少なくとも１つの機械的な波が伝搬する、
    請求項１６記載の装置。
18. 前記音響光学素子において、
    ａ．前記第１の照明光束の屈曲によってサンプル照明のための前記照明光路への偏向が生じるように選定された周波数を有する第１の機械的な波が伝搬し、及び／又は、
    ｂ．前記第２の照明光束が前記第１の直線偏光方向を有する場合、該第２の照明光束の屈曲によってサンプル照明のための前記照明光路への偏向が生じるように選定された周波数を有する第２の機械的な波が伝搬し、及び／又は、
    ｃ．前記第２の照明光束が前記第２の直線偏光方向を有する場合、該第２の照明光束の屈曲によってサンプル照明のための前記照明光路への偏向が生じるように選定された周波数を有する第３の機械的な波が伝搬する、
    請求項１６又は１７記載の装置。
19. 前記音響光学素子は少なくとも１つのＡＯＴＦ（音響光学チューナブルフィルタ）を含み、該ＡＯＴＦ内を１つもしくは複数の機械的な波が伝搬する、
    請求項１６から１８までのいずれか１項記載の装置。
20. 前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束を含む１次照明光束を形成する少なくとも１つの光源が設けられており、
    偏光ビームスプリッタにより、前記１次照明光束が直線偏光状態に依存して空間的に分割され、それぞれ異なる直線偏光成分が相互に別個に前記第１の光路と前記第２の光路とへ偏向される、
    請求項１６から１９までのいずれか１項記載の装置。
21. ａ．前記サンプルを走査するために前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束を偏向するビーム偏向装置が設けられている、及び／又は、
    ｂ．ビーム偏向装置によって、前記第１の照明光束及び前記第２の照明光束の焦点を、前記サンプルの上方へ又は前記サンプルを通して移動させ、前記サンプルから出る検出光を検出する、
    請求項１６から２０までのいずれか１項記載の装置。
22. ａ．サンプルに照明光が印加されない場合、前記音響光学素子によって、前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束が、特には自動的に、中断される、及び／又は、
    ｂ．前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束が、サンプルのうち検査すべき領域外、特には予め定められた領域外に位置する領域を照明してしまう場合、前記音響光学素子によって、前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束が、特には自動的に、中断される、及び／又は、
    ｃ．前記音響光学素子によって、前記サンプルへの前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束の印加が、特には自動的に、メアンダ状走査の折り返し領域及び／又は戻り経路において中断される、
    請求項１６から２１までのいずれか１項記載の装置。
23. 前記音響光学素子によって、前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束の光出力が調整可能及び／又は制御可能となる、
    請求項１６から２２までのいずれか１項記載の装置。
24. ａ．前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束がパルス制御される、及び／又は、
    ｂ．前記第１の照明光束及び前記第２の照明光束が同じパルスシーケンス周波数でパルス制御される、及び／又は、
    ｃ．前記第１の照明光束のパルスシーケンス周波数及び／又は前記第２の照明光束のパルスシーケンス周波数が４０ＭＨｚから１００ＭＨｚの領域にあり、特には８０ＭＨｚである、
    請求項１６から２３までのいずれか１項記載の装置。
25. 前記第１の光路に沿って走行する前記第１の直線偏光方向の照明光は、第１の照明光パルス列を有し、前記第２の光路に沿って走行する前記第２の直線偏光方向の照明光は、第２の照明光パルス列を有し、
    ａ．前記第２の照明光パルス列に対する前記第１の照明光パルス列の位相が位相調整手段によって調整可能及び／又は制御可能である、又は、
    ｂ．前記第２の照明光パルス列に対する前記第１の照明光パルス列の位相がゼロへ調整可能及び／又は制御可能である、
    請求項１６から２４までのいずれか１項記載の装置。
26. 前記位相調整手段の一部として、前記第１の光路に該第１の光路の長さを調整する第１の手段が配置されており、及び／又は、前記第２の光路に該第２の光路の長さを調整する少なくとも１つの第２の手段が配置されている、
    請求項２５記載の装置。
27. ａ．前記位相を設定された値もしくは設定可能な値へ制御する制御回路が設けられている、及び／又は、
    ｂ．前記位相をゼロへ制御する制御回路が設けられている、
    請求項２５又は２６記載の装置。
28. ａ．統合された照明光の少なくとも一部を特に寄生的に受信するセンサ、特に２光子吸収検出器が、前記制御回路の構成要素である、及び／又は、
    ｂ．位相調整手段が前記制御回路の構成要素である、及び／又は、
    ｃ．センサからの信号を受信して調整信号を位相調整手段へ出力する制御電子回路が前記制御回路の構成要素である、
    請求項２７記載の装置。
29. ａ．前記第２の照明光束の直線偏光状態が、１０ＭＨｚから３０ＭＨｚの領域の周波数、特に１０ＭＨｚから２０ＭＨｚの領域の周波数、特に２０ＭＨｚの周波数で切り換えられる、及び／又は、
    ｂ．前記第２の照明光束の直線偏光状態が、前記第１の照明光束及び／又は前記第２の照明光束のパルスシーケンス周波数よりも小さい周波数で切り換えられる、
    請求項１６から２８までのいずれか１項記載の装置。
30. ａ．コヒーレントラマン分光によるサンプル検査を行うため、及び／又は、顕微鏡サンプルの少なくとも一部のラマン結像を形成するために、前記第１の照明光束がストークス照明光束として作用し、前記第２の照明光束がポンピング照明光束として作用する、又は、
    ｂ．コヒーレントラマン分光によるサンプル検査を行うため、及び／又は、顕微鏡サンプルの少なくとも一部のラマン結像を形成するために、前記第２の照明光束がストークス照明光束として作用し、前記第１の照明光束がポンピング照明光束として作用する、
    請求項１６から２９までのいずれか１項記載の装置。
31. 請求項１６から３０までのいずれか１項記載の装置を製造するためのモジュールにおいて、
    該モジュールは、第１の光路及び第２の光路の始点を定める偏光ビームスプリッタと、前記第１の光路及び前記第２の光路を統合する音響光学素子と、を含む、
    ことを特徴とするモジュール。
32. ａ．前記第１の光路に該第１の光路の長さを調整する第１の手段が配置されており、及び／又は、前記第２の光路に該第２の光路の長さを調整する少なくとも１つの第２の手段が配置されている、及び／又は、
    ｂ．前記第２の光路を伝搬するパルス列に対する、前記第１の光路を伝搬するパルス列の位相を制御する制御装置が設けられている、
    請求項３１記載のモジュール。
33. 前記モジュールは、前記第１の光路に沿って伝搬する第１の照明光パルスと前記第２の光路に沿って伝搬する第２の照明光パルスとの時間的重なりの尺度量を求めるセンサ、特に２光子吸収検出器を含む、
    請求項３１又は３２記載のモジュール。

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