CN105695388A - 一种生产含高硒蛋白红球藻的方法、检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种生产含高硒蛋白红球藻的方法、检测方法及其应用,本发明属于水生生物学与生物技术领域，为将无机硒转化为有机硒，本发明提供1.一种生产含高硒蛋白红球藻的方法，培养红球藻，在培养基内添加亚硒酸钠，通过红球藻将亚硒酸钠转化为硒蛋白。本发明的有益效果在于，能将无机硒转化为有机硒，而且制备过程简单易行。

Description

一种生产含高硒蛋白红球藻的方法、检测方法及其应用
技术领域
本发明属于水生生物学与生物技术领域，具体来讲涉及一种利用无机硒促进雨生红球藻富集硒蛋白的方法。
背景技术
硒是一种人体必需的微量营养元素，常以氧化态Se(Ⅱ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)形式存在，并为许多重要的细胞与生命活动提供支持。缺硒会导致一些重要的生理过程失调，从而导致心脏病、神经肌肉失调、癌症与炎症以及不育，硒同时也被认为与动物发育、免疫功能、抑制病毒等有密切关系，对人体健康有益的硒每日建议摄入量为50-200微克。中国大陆部分地区土壤含硒量低，使得居民无法补充足够的硒而影响健康，我国13个省市的营养调查表明，成人每日硒摄入量仅不到27微克，相对于过量的无机硒对生物体具有一定毒性，在我国补硒提倡采用安全性更高的有机硒强化剂。
有机硒主要包括硒蛋白、富硒酵母和硒化卡拉胶等，硒元素化学性质类似硫元素，因此许多含硫氨基酸能被硒替代而形成含硒氨基酸，如甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸。其中，硒代半胱氨酸(Sec)是一种具有重要生物活性的氨基酸，被称为“第21种氨基酸”，而硒蛋白是一种含有至少一个硒代半胱氨酸的蛋白质，在细胞内主要担任抗氧化酶的作用，因此，硒蛋白具有安全性高，易吸收且利用率高，是补充硒元素的最佳途径。
目前市场上主要的富硒产品中，富硒蔬菜对硒的吸收富集能力有限，且受土壤等环境因素影响，富硒酵母与植物相似，所富集的有机硒主要以硒代甲硫氨酸为主。傅瑞娟(2010)报道的实验表明：对组织中多种抗氧化酶的影响，硒代半胱氨酸的作用效果优于富硒酵母。因此，相对于普通的有机硒，含硒代半胱氨酸的硒蛋白作为硒强化剂对于提高机体抗氧化能力有更好的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有机硒的制备方法，将亚硒酸钠添加到雨生红球藻的培养体系中，使整个培养体系中亚硒酸钠的浓度控制在0.01-23.0mg/L的范围内。为实现这个目的，本发明采用的方法如下：
一种生产含高硒蛋白红球藻的方法，所述的方法包括如下步骤：
1.1将雨生红球藻在培养基中培养，培养温度为22±0.5℃，光强20μmolm-2s-1；雨生红球藻的生长分为接种阶段、营养生长阶段、细胞类型转化阶段和藻细胞虾青素累积阶段；
所述的培养基的组成如下：NaNO3：0.2g/L，K2HPO4：0.02g/L，MgSO4·7H2O：0.02g/L，土壤提取液：30mL/L，EDTA：0.004g/L,FeSO4·7H2O：0.0035g/L，ZnSO4·7H2O：5×10-6g/L，MnSO4·4H2O：1×10-5g/L，H3BO3：5×10-5g/L，CuSO4·5H2O：2.5×10-8g/L，Co(NO3)2·6H2O：5×10-6g/L，蛋白胨1g/L，pH为7-8.5。可添加亚硒酸钠使整个体系中亚硒酸钠的浓度控制在0.01-3mg/L，亦可不添加亚硒酸钠,制备培养基时添加适量的亚硒酸钠可以用于促进藻细胞的生长；
土壤提取液配置方法如下：在三角瓶中加入1/3体积天然腐殖土，应避免含有化肥及农药，也应避免含有过量黏土，加入去离子水至超过土壤表面5厘米，24小时间隔内高压蒸汽灭菌1小时两次，高速离心分离沉积物，轻轻倒出上清液至保存容器，121℃高压灭菌20分钟后保存于冰箱。1.2向所述的培养基添加亚硒酸钠，使培养体系中亚硒酸钠的终浓度(终浓度为体系内未转化的亚硒酸钠的浓度)为3mg/L-33mg/L，即培养基内的浓度达到3mg/L-33mg/L；添加的时机可以是接种阶段、营养生长阶段、细胞类型转化阶段和藻细胞虾青素累积阶段中的任何一个或几个阶段，优选的终浓度为13mg/L；申请人经研究发现，亚硒酸钠的添加量对雨生红球藻的生长有很大影响，当采用上述的培养基培养雨生红球藻，当终浓度为13mg/L时，无机硒转为有机硒的量最大。也可以在培养期间的任何一天多次添加亚硒酸钠，使得体系内未转化的亚硒酸钠浓度位于3mg/L-33mg/L。
1.3培养5-15天，每天上午下午各摇一次，一般来讲，根据生长曲线，14天时间为最佳；
1.4收集培养后的含高硒蛋白红球藻。
进一步的，步骤2中于培养的第一天向培养基中加入亚硒酸钠，申请人研究发现，在培养第一天加入亚硒酸钠，藻细胞富硒量最大，有机硒蛋白含量最高，随加硒时间延后，藻细胞中富集的有机硒蛋白和总硒含量逐渐降低。
一种检测雨生红球藻中有机硒的方法，所述的检测方法包括如下步骤：
a)离心收集培养后的雨生红球藻，60℃烘箱干燥24h，称取样品，分别加入ddH2O中，加热至近沸，保持8-12min，冷却后，转入容量瓶中定容，摇匀，干过滤，取滤液，加入环己烷萃取后，水相转入离心管，测定水相中无机硒含量；
b)再称取和上一步骤中同样重量的样品，放入消解罐内，再加入95％浓硝酸和20％过氧化氢溶液消解，将消解后的样品倒入烧杯内，保持近沸除去多余的硝酸，ddH2O定容后，测定总硒含量，其中95％浓硝酸和20％过氧化氢溶液，按3:1的比例混合；
c)计算：有机硒的含量＝总硒含量－无机硒含量。
本发明的有益效果在于，能将无机硒转化为有机硒，而且制备过程简单易行。
附图说明
图1是亚硒酸钠浓度与最大细胞密度之间的剂量反应关系；
图2是不同硒浓度处理后雨生红球藻的生长曲线；
图3是加入不同含量亚硒酸钠后藻细胞内有机硒与总硒的富集量；
图4是不同加硒时间处理下雨生红球藻有机硒及总硒的富集量；
图5是不同浓度亚硒酸钠处理的雨生红球藻硒蛋白硫氧还蛋白还原酶表达水平的测定结果；
图6是雨生红球藻经13mg/L亚硒酸钠处理组与对照组的TR1硒蛋白酶活性差异。
具体实施例
实施例1
a)将雨生红球藻在ESP培养基中培养，培养温度为22±0.5℃，光强20μmolm-2s-1；雨生红球藻的生长分为接种阶段、营养生长阶段、细胞类型转化阶段和藻细胞虾青素累积阶段；
培养基的组成如下：NaNO3：0.2g/L，K2HPO4：0.02g/L，MgSO4·7H2O：0.02g/L，土壤提取液：30mL/L，EDTA：0.004g/L,FeSO4·7H2O：0.0035g/L，ZnSO4·7H2O：5×10-6g/L，MnSO4·4H2O：1×10-5g/L，H3BO3：5×10-5g/L，CuSO4·5H2O：2.5×10-8g/L，Co(NO3)2·6H2O：5×10-6g/L，蛋白胨1g/L，pH为7-8.5；所述的培养基体积是1L，本申请实施例中涉及的培养基，其对应的培养基体积均为1L，可添加亚硒酸钠使整个体系中亚硒酸钠的浓度控制在0.01-3mg/L，亦可不添加亚硒酸钠。
土壤提取液配置方法如下：在三角瓶中加入1/3体积天然腐殖土，应避免含有化肥及农药，也应避免含有过量黏土，加入去离子水至超过土壤表面5厘米，24小时间隔内高压蒸汽灭菌1小时两次，高速离心分离沉积物，轻轻倒出上清液至保存容器，121℃高压灭菌20分钟后保存于冰箱。
b)选取4个培养基，于培养的第一天向4个培养基添加亚硒酸钠，使培养体系中亚硒酸钠的终浓度(终浓度为体系内未转化的亚硒酸钠的浓度)分别为3mg/L、13mg/L、23mg/L和33mg/L；即分别向4个体积为1L的培养基添加亚硒酸钠3mg、13mg、23mg和33mg；
c)培养14天，每天上午下午各摇一次，雨生红球藻达到生长平台期；
d)收集培养后的含高硒蛋白红球藻。
实施例2
采用实施例1中的前3个步骤，经14天培养后，研究最佳的亚硒酸钠的添加量，申请人通过测定半最大效应浓度(EC50)后发现，亚硒酸钠对雨生红球藻的半最大效应浓度是23.32mg/L，其95％置信区间在[19.27,28.23]mg/L，如图1所示；
对雨生红球藻细胞计数并绘制生长曲线，结果如图2所示：在亚硒酸钠浓度为3mg/L时，藻的细胞数目基本上与不加硒对照组的数目一致，藻细胞浓度最高可达4.37×105cells/L，这表明在低浓度情况下，亚硒酸钠对雨生红球藻的生长基本上没有影响，而当亚硒酸钠浓度提高到13mg/L时，雨生红球藻细胞数目出现下降，细胞生长受到抑制，而且随着硒浓度的增加，抑制效果增强，当亚硒酸钠浓度增加到33mg/L时，藻细胞最大浓度降至2.3×105个细胞/L，可以得出，当培养体系中亚硒酸钠的终浓度为13mg/L时，可以在获取较多的有机硒、最终又得到较多的雨生红球藻细胞两者之间取得最佳的平衡。
实施例3
离心收集不同浓度的亚硒酸钠处理的藻细胞样品，60℃烘箱干燥24h，称取0.005g样品，分别加入10mLddH2O中，使用可控温电热炉进行加热至近沸，保持10min；冷却后，转入10mL容量瓶中定容。摇匀，干过滤，取滤液7mL，加入10mL环己烷萃取，水相转入15mL离心管，使用ICP-MS测定无机硒含量。
再称取0.005±0.001g，放入消解罐内，再加入6mL95％的浓硝酸和2mL20％的过氧化氢溶液(比例为3:1)，按照程序在微波消解仪中进行消解，将消解后的样品倒入烧杯内，保持近沸除去多余的浓硝酸，ddH2O定容到10mL，使用ICP-MS测定总硒含量，有机硒的含量＝总硒含量－无机硒含量。
结果如图3所示，在培养体系中亚硒酸钠的终浓度低于13mg/L时，藻内有机硒及总硒的富集量均随着硒浓度的增加而增加；当培养体系中亚硒酸钠的终浓度高于13mg/L时，藻内富集有机硒和总硒的量开始下降，因此，当培养体系中亚硒酸钠的终浓度为13mg/L时，藻细胞中的硒组分含量达到420μg/g，效果最佳。
实施例4
采用与实施例1相同的培养基与培养条件静止培养雨生红球藻，不同加硒时间处理如下：
A.在培养的第一天向第一组雨生红球藻中加入亚硒酸钠使其在培养基中浓度达到13mg/L；
B.在培养的第三天向第二组雨生红球藻中加入亚硒酸钠使其在培养基中浓度达到13mg/L；
C.在培养的第七天向第三组雨生红球藻中加入亚硒酸钠使其在培养基中浓度达到13mg/L；
D.在培养的第九天向第四组雨生红球藻中加入亚硒酸钠使其在培养基中浓度达到13mg/L。
结果如图4所示，在培养第一天加入亚硒酸钠，藻细胞富硒量最大，有机硒蛋白含量最高，随加硒时间延后，藻细胞中富集的有机硒蛋白和总硒含量逐渐降低。
实施例5
利用荧光定量PCR技术分析雨生红球藻硒蛋白TR1基因表达水平，对处于指数生长期的藻细胞(密度约为每毫升3×105个细胞)用3个浓度梯度的亚硒酸钠处理后进行分析，mRNA水平表达差异结果如图5所示：处理组各组均有不同程度的显著上调，其中，相比其它浓度，经3mg/L亚硒酸钠处理的藻细胞TR1的转录水平在第6小时达到最高峰。而未加硒的对照组无显著差异。
通过硫氧还蛋白还原酶检测试剂盒K763(Biovision，美国)可以检测藻细胞硒蛋白TR1的酶活性，雨生红球藻经13mg/L亚硒酸钠处理后检测不同时间内硒酶的活性，其结果如图6所示：加硒后第三小时TR活性有显著上升，到第六小时达峰值，其活性接近初始活性的两倍，之后到第十二小时衰减到1.5倍，其后TR活性与初始值无显著差异，但仍比初始值与对照组高。相比加硒的实验组，对照组在各时间段TR活性并无显著差异，由此可见培养基中添加无机硒可以显著提高硒蛋白的产量。
实施例5
实施例1中得到的含高硒蛋白红球藻，通过过滤或者离心的方法采收，清水冲洗后烘干，得到藻粉，根据制作食品的需要粉碎，加入到面包、面条或者奶粉、咖啡中，混合均匀，按照常规方法制备各种食品，得到富硒食品。
实施例6
实施例1中得到的含高硒蛋白红球藻，通过过滤或者离心的方法采收，清水冲洗后烘干，得到藻粉，根据制作保健品的需要纳米粉碎，粉碎后的藻粉加入纤维素等片剂辅料(藻粉：辅料＝1:3)，制成片剂或者胶囊，制备得到高硒蛋白红球藻保健品。
实施例7
实施例1中得到的含高硒蛋白红球藻，通过过滤或者离心的方法采收，清水冲洗后烘干，得到藻粉，利用高压液相色谱、氢化物原子荧光谱法检测虾青素和硒蛋白的含量，藻粉直接用于药品制备或与其他组分混合后制备药品，或将藻粉中的硒蛋白、虾青素等有效成分提取出来，用于制备含高硒蛋白红球藻的药品，如抗癌药物、抗病毒药物。

Claims (9)

1.一种生产含高硒蛋白红球藻的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
1.1将雨生红球藻在培养基中培养，培养温度为22±0.5℃，光强20μmolm-2s-1；所述的培养基组成如下：NaNO3：0.2g/L，K2HPO4：0.02g/L，MgSO4·7H2O：0.02g/L，土壤提取液：30mL/L，EDTA：0.004g/L,FeSO4·7H2O：0.0035g/L，ZnSO4·7H2O：5×10-6g/L，MnSO4·4H2O：1×10-5g/L，H3BO3：5×10-5g/L，CuSO4·5H2O：2.5×10-8g/L，Co(NO3)2·6H2O：5×10-6g/L，蛋白胨1g/L，亚硒酸钠：0-3mg/L，pH为7-8.5；
1.2诱导红球藻产生高硒蛋白，其方法是向培养体系添加亚硒酸钠，使培养体系中亚硒酸钠的终浓度为3mg/L-33mg/L；
1.3培养5-15天，每天上午下午各摇一次；
1.4收集培养后的含高硒蛋白红球藻。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.2中亚硒酸钠的终浓度为13mg/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.2中于培养的第一天向培养基中加入亚硒酸钠。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.2中于培养期间向培养基内添加一次以上的亚硒酸钠。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.3中培养的时间为14天。
6.一种在红球藻中检测有机硒的方法，其特征在于，所述的检测方法包括如下步骤：
6.1离心收集培养后的雨生红球藻，60℃烘箱干燥24h，称取样品，分别加入ddH2O中，加热至近沸，保持8-12min，冷却后，转入容量瓶中定容，摇匀，干过滤，取滤液，加入环己烷萃取后，水相转入离心管，测定水相中无机硒含量；
6.2再称取和上一步骤中同样重量的样品，放入消解罐内，再加入95％浓硝酸和20％过氧化氢溶液消解，将消解后的样品倒入烧杯内，保持近沸除去多余的硝酸，ddH2O定容后，测定总硒含量，其中95％浓硝酸和20％过氧化氢溶液，按3:1的比例混合；
6.3计算：有机硒的含量＝总硒含量－无机硒含量。
7.如权利要求1-5任一权利要求所述的含高硒蛋白红球藻在制备食品中的应用。
8.如权利要求1-5任一权利要求所述的含高硒蛋白红球藻在制备保健品中的应用。
9.如权利要求1-5任一权利要求所述的含高硒蛋白红球藻在制备药品中的应用。
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