CN105693546A

CN105693546A - 4-羟基水杨酰苯胺类化合物在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用

Info

Publication number: CN105693546A
Application number: CN201410707460.8A
Authority: CN
Inventors: 王贺瑶; 徐志建; 朱敬杰; 张勇; 蔡婷婷; 朱维良; 陈凯先
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2034-11-27
Also published as: CN105693546B

Abstract

本发明公开了4-羟基水杨酰苯胺类化合物在制备酪氨酸酶抑制剂中的用途，所述用途包括以下方面：(a)制备酪氨酸酶抑制剂或抑制酪氨酸酶的组合物；(b)制备抑制黑色素生成的组合物；(c)制备预防或治疗色素沉着性皮肤病的组合物。试验结果表明，4-羟基水杨酰苯胺能在细胞水平抑制B16细胞胞内酪氨酸酶的活性，进而能有效降低B16细胞合成黑色素的量，因此能够用于预防食物褐色变性、用于制备抗色素增加性皮肤病药物以及用于制备美白化妆品。

Description

4-羟基水杨酰苯胺类化合物在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用

技术领域

本发明属于医药和食品技术领域，具体地涉及4-羟基水杨酰苯胺(2-Hydroxy-N-(4-hydroxyphenyl)-benzamide)类化合物在制备酪氨酸酶抑制剂等方面的应用。

背景技术

酪氨酸酶(Tyrosinase)是由二价铜离子与酶蛋白结合的金属酶，是生物体合成黑色素的关键酶，可催化含酚基化合物(如酪氨酸、多巴等)氧化成多巴醌，经一系列中间反应后形成黑色素，而黑色素的合成、分布与哺乳动物皮肤、毛发的色素沉积直接相关，与果蔬褐变也有着重要的关系。

因此，通过筛选酪氨酸酶抑制剂，抑制酪氨酸酶的活性来控制黑色素的合成，已成为防止果蔬褐变，治疗色素沉着性皮肤病(包括原发性和继发性色素沉着性皮肤疾病，如黄褐斑、雀斑、炎症后色素沉着等)，以及美白化妆品研制的重要途径。

虽然目前已经开发了一些物质用作酪氨酸酶抑制剂或作为美白成分使用，但其长期安全性和酪氨酸酶抑制活性尚难以令人满意。因此，本领域迫切需要开发新的安全性高、抑制活性好的酪氨酸酶抑制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的安全性高、抑制活性好的酪氨酸酶抑制剂及其在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。

本发明的第一方面提供了一种具有式I结构的化合物或其盐的用途，

式中，

R₁和R₂各自独立地选自：H、OR₃和碱金属，其中R₃为取代或未取代的C₁-C₄烷基、取代或未取代的C₃-C₄环烷基，并且所述的“取代”指一个或多个H被选自下组的基团取代：卤素、C₁-C₃烷基、氨基、羟基；

所述化合物或其盐用于：(a)制备酪氨酸酶抑制剂或抑制酪氨酸酶的组合物；(b)制备抑制黑色素生成的组合物；和/或(c)制备预防或治疗色素沉着性皮肤病的组合物。

在另一优选例中，所述的盐为药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述的式I化合物为选自下组的4-羟基水杨酰苯胺化合物：

在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物、化妆品组合物、洗涤用品组合物、保健品组合物。

在另一优选例中，所述的式I化合物还用于制备抑制蔬菜和水果发生褐变的组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物为外用药物组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物含有如本发明第一方面所述的式I化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为透皮剂型。

在另一优选例中，所述药学上可接受的载体选自下组：透皮促进剂、软膏基质、乳化剂、稳定剂、或其组合。

在另一优选例中，所述药物组合物用于抑制黑色素生成，或用于制备抑制黑色素生成的药物。

在另一优选例中，所述药物组合物用于预防或治疗色素沉着性皮肤病、或用于制备预防或治疗色素沉着性皮肤病的药物。

在另一优选例中，所述色素沉着性皮肤病为所有原发性和继发性色素沉着性皮肤疾病。

在另一优选例中，所述化妆品含有如本发明第一方面所述的式I化合物或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述化妆品为美白化妆品。

在另一优选例中，所述化妆品还含有药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药学上可接受的载体选自下组：软膏基质、乳化剂、表面活性剂、稳定剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的化妆品为皮肤外用化妆品。

在另一优选例中，所述的皮肤包括以下部位的皮肤：面部、手部、足部。

在另一优选例中，所述洗涤用品组合物含有如权利要求1所述的式I化合物或其盐、洗涤用表面活性剂和洗涤用载体。

在另一优选例中，所述洗涤用品为抑制蔬菜和水果发生褐变的洗涤用品。

在另一优选例中，所述洗涤用载体选自下组：水、乳化剂、稳定剂或其组合。

在另一优选例中，所述保健品组合物含有如本发明第一方面所述的式I化合物或其药学上可接受的盐以及食品上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的保健品组合物为抑制黑色素生成的组合物。

在另一优选例中，所述的保健品组合物为片剂、胶囊、或口服液。

本发明的第二方面提供了一种抑制蔬菜和/或水果发生褐变的方法，所述方法包括步骤：

将所述蔬菜和/或水果与本发明式I化合物或其药学上可接受的盐进行接触，从而抑制所述蔬菜和/或水果发生褐变。

在另一优选例中，所述的接触在水中进行，并且所述式I化合物或其盐在水中的浓度为3μM～25μM。

本发明的第三方面提供了一种非治疗性的体外抑制酪氨酸酶活性的方法，所述方法包括步骤：在本发明式I化合物或其盐存在的情况下，培养细胞，从而抑制所述细胞中黑色素的生成和/或抑制所述细胞中的酪氨酸酶活性。

在另一优选例中，所述式I化合物或其盐在培养体系中的浓度为3μM～25μM。

在另一优选例中，所述的细胞选自下组：黑色素细胞、黑色素瘤细胞、人表皮细胞(包括来源于包皮、面部、乳房、腹部和大腿等部位的表皮细胞)及其分离得到的黑色素细胞、皮肤等价物(一种由黑色素细胞和角化细胞组成的重构三维皮肤等价物)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为4-羟基水杨酰苯胺对B16细胞胞内酪氨酸酶的活性影响的曲线图。

图2为4-羟基水杨酰苯胺对B16细胞黑色素分泌影响的柱状图。

图3为4-羟基水杨酰苯胺对B16细胞黑色素量影响的柱状图。

具体实施方式

本发明人经过长期广泛而深入的研究，通过对大量化合物进行筛选和测试，首次意外地发现，一种已知的保肝活性成分4-羟基水杨酰苯胺及其类似化合物(式I化合物)居然能够显著抑制B16细胞胞内酪氨酸酶活性，进而抑制B16细胞的黑色素生成及分泌。实验表明，在很低浓度下(处于安全浓度范围内)，本发明的式I化合物就具有明显的抑制胞内酪氨酸酶活性和美白效果，体现出极高的长期安全性。在此基础上完成了本发明。

活性成分

在本发明中，活性成分为式I化合物。一种代表性的化合物为4-羟基水杨酰苯胺。

4-羟基水杨酰苯胺的结构式为：

该化合物的分子式为C₁₃H₁₁NO₃，白色粉末状，分子量为229.24，CAS编号为526-18-1。该化合物的通用名为柳胺酚，目前用于肝胆病用药，作用机制与去氢胆酸相似，能增加肝血流量，改善肝功能，可使胆汁中水分显著增加。利胆作用较去氢胆酸强，能使Oddi括约肌松弛。此外尚有降低血胆固醇作用。

本发明的研究表明，4-羟基水杨酰苯胺是安全而非常有效的酪氨酸酶抑制剂，能够抑制B16细胞黑色素的分泌和合成。

B16细胞为小鼠黑色素瘤细胞，能够模拟人的细胞，在调控黑色素生成，防止果蔬褐变、防治色素沉着性皮肤病以及皮肤美白等研究中，是最为常用的细胞系之一。

4-羟基水杨酰苯胺类化合物，作为酪氨酸酶的抑制剂，可为防止果蔬褐变，治疗色素沉着性皮肤病(黄褐斑、雀斑、炎症后色素沉着等)药物的开发，以及美白化妆品研制提供多种途径。

用途

本发明提供了4-羟基水杨酰苯胺类化合物在用作酪氨酸酶抑制剂中的用途，可用于以下方面：(a)制备酪氨酸酶抑制剂或抑制酪氨酸酶的组合物；(b)制备抑制黑色素生成的组合物；和/或(c)制备预防或治疗色素沉着性皮肤病的组合物。

组合物

本发明的4-羟基水杨酰苯胺类化合物可用于(a)制备酪氨酸酶抑制剂或抑制酪氨酸酶的组合物；(b)制备抑制黑色素生成的组合物；和/或(c)制备预防或治疗色素沉着性皮肤病的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物、保健品组合物、化妆品组合物、洗涤用品组合物。

在另一优选例中，所述化合物还用于制备抑制蔬菜和水果发生褐变的组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物为外用药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物为透皮剂型。

在另一优选例中，所述化妆品组合物含有如本发明第一方面所述的式I化合物或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述化妆品为美白化妆品。

在另一优选例中，所述化妆品还含有药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的化妆品为皮肤外用化妆品。

在另一优选例中，所述洗涤用品组合物含有如本发明第一方面所述的式I化合物或其盐、洗涤用表面活性剂和洗涤用载体。

在另一优选例中，所述保健品组合物为抑制黑色素生成的组合物。

在另一优选例中，所述保健品组合物为片剂、胶囊、或口服液。

方法

本发明提供了一种抑制蔬菜和/或水果发生褐变的方法，所述方法包括步骤：

本发明还提供了一种非治疗性的体外抑制酪氨酸酶活性的方法，所述方法包括步骤：

在本发明式I化合物或其盐存在的情况下，培养细胞，从而抑制所述细胞中黑色素的生成和/或抑制所述细胞中的酪氨酸酶活性。

本发明的主要优点包括：

1.本发明发掘了已知药物4-羟基水杨酰苯胺在化妆品、食品以及医疗方面的新用途，开拓了多个新的应用领域。

2.本发明首次发现4-羟基水杨酰苯胺是酪氨酸酶抑制剂。

3.与酪氨酸酶抑制剂曲酸比较，曲酸在不高于100μM的浓度下，对胞内酪氨酸酶未表现出显著性抑制活性，而4-羟基水杨酰苯胺在30.34μM附近即表现出半数抑制率。

4.4-羟基水杨酰苯胺在有效浓度范围内对细胞活力没有影响，安全有效。

5.4-羟基水杨酰苯胺是保肝老药，安全性高，预示着其在化妆品、食品以及医疗领域有很好的应用前景。

6.4-羟基水杨酰苯胺稳定性较高，在制备使用中不易变质，有助于其在食品、医疗领域，尤其是化妆品领域发挥作用。

7.4-羟基水杨酰苯胺具有对细胞内酪氨酸酶和黑色素生成的双重抑制活性，在化妆品、食品以及医疗领域中，将体现出优于现有的单一抑制活性的化妆品及药品的特点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料与仪器

1.主要试剂：4-羟基水杨酰苯胺(上海泰坦化学有限公司)，高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，左旋多巴(美国Sigma公司)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(美国Sigma公司)、曲酸(美国Sigma公司)、MTT(美国Amresco公司)。B16细胞为小鼠黑色素瘤细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

2.主要仪器：酶标仪MultiskanMK3(美国Thermo公司)、摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造公司)。

实施例14-羟基水杨酰苯胺化合物对B16细胞(C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞)活力的影响测试

1.1实验方法

采用MTT法：B16细胞接种于96孔板中，2×10³个/孔，100μL/孔，设置四复孔,调零孔(无细胞，仅含与实验孔等量的培养基)加入等体积的培养液(含10％胎牛血清FBS的高糖DMEM)。24h后加入不同浓度(3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM)的4-羟基水杨酰苯胺(培养液配制)，对照孔加入等浓度的DMSO(0.1％)溶液(培养液配制)。给药48小时后弃培养基，加入100μLMTT溶液(0.5mg/mL，DMEM配制)，4h后弃去上清液，加入100μLDMSO，振荡5min使结晶完全溶解，用酶标仪MultiskanMK3测492nm处吸光度(OD₄₉₂)。细胞存活率(％)计算公式如下：

细胞存活率(％)＝(C-B)×100/(A-B)

上式中A表示对照孔的OD₄₉₂，B表示调零孔的OD₄₉₂，C表示加药孔的OD₄₉₂。

1.2实验结果

结果如表1所示。

表14-羟基水杨酰苯胺对B16细胞的活力影响

浓度	细胞存活率％
		0	100±3.38
3.125μM	92.28±2.52
		6.25μM	88.9±8.16
12.5μM	92.22±3.26
		25μM	86.11±4.44
50μM	75.97±2.62
		100μM	65.96±1.73

1.3实验结论

从表1中可以看出，4-羟基水杨酰苯胺在大于等于50μM时对B16细胞有毒性(50μM时细胞存活率76％)，小于等于25μM时无毒性。

实施例24-羟基水杨酰苯胺化合物对B16细胞胞内酪氨酸酶活性的影响测试

2.1实验方法

B16细胞接种于96孔板，2×10³个/孔，用含10％胎牛血清FBS的高糖DMEM培养。24h后加入不同浓度(3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM)的4-羟基水杨酰苯胺溶液(含200μMIBMX的培养液配制)。72小时后弃培养基，加入100μL含底物左旋多巴2mM、TritonX-1000.2％的PBS溶液，37℃反应60min后用酶标仪MultiskanMK3测OD₄₉₂。

2.2实验结果

表2对胞内酪氨酸酶的抑制活性

化合物	IC₅₀(μM)
		曲酸	>100
4-羟基水杨酰苯胺	30.34±5.30

结果如表2和图1所示，曲酸在不高于100μM的浓度下，对胞内酪氨酸酶未表现出显著性抑制活性，而4-羟基水杨酰苯胺在30.34μM附近即表现出半数抑制率。

2.3实验结论

从图1中可以看出，在无毒性的浓度范围内，4-羟基水杨酰苯胺对胞内酪氨酸酶的抑制活性优于曲酸。

实施例34-羟基水杨酰苯胺化合物对B16细胞黑色素生成的影响测试

3.1实验方法

B16细胞接种于24孔板，2×10⁴个/孔，1mL/孔，用含10％胎牛血清FBS的高糖DMEM培养。24h后加入含3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，200μM)的培养基1mL/孔，同时加入不同浓度(终浓度3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM)的4-羟基水杨酰苯胺溶液，使用曲酸作为阳性对照。作用72h后，吸取100μL培养基，用酶标仪MultiskanMK3测OD₄₉₂，测定分泌的黑色素含量；吸弃培养基，PBS洗两次，每孔加入100μLNaOH(1M)溶液，70℃水浴20min，吸取溶液至96孔板中，用酶标仪MultiskanMK3测OD₄₉₂，测定胞内黑色素含量。

3.2实验结果

结果如图2、图3、表3和表4所示，对照组(4-羟基水杨酰苯胺浓度为0)的黑色素生成量为100％，*表示与对照组相比p<0.05，**表示与对照组相比p<0.01。

表3对B16细胞黑色素分泌的影响对比

^ans:不显著

表4对B16细胞胞内黑色素量的影响对比

^ans:不显著

3.3实验结论

从图2中可以看出，与对照组相比，4-羟基水杨酰苯胺在不低于12.5μM的浓度下，显著降低B16细胞分泌黑色素的量，结合表格数据可以看出，4-羟基水杨酰苯胺在有效浓度范围内对细胞活力没有影响。

从图3中可以看出，与对照组相比，4-羟基水杨酰苯胺在不低于25μM的浓度下，显著降低B16细胞胞内黑色素的量，结合表格数据可以看出，4-羟基水杨酰苯胺在有效浓度范围内对细胞活力没有影响。

综上所述，4-羟基水杨酰苯胺类化合物能在细胞水平抑制B16细胞胞内酪氨酸酶的活性，进而能有效降低B16细胞分泌黑色素的量，因此4-羟基水杨酰苯胺能够用于预防食物褐色变性、用于制备抗色素增加性皮肤病药物以及用于制备美白化妆品。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种式I化合物或其盐的用途，

式中，

其特征在于，用于(a)制备酪氨酸酶抑制剂或抑制酪氨酸酶的组合物；(b)制备抑制黑色素生成的组合物；和/或(c)制备预防或治疗色素沉着性皮肤病的组合物。

2.一种外用的药物组合物，所述组合物含有如权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于抑制黑色素生成，或用于制备抑制黑色素生成的药物。

4.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于预防或治疗色素沉着性皮肤病、或用于制备预防或治疗色素沉着性皮肤病的药物。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述色素沉着性皮肤病为所有原发性和继发性色素沉着性皮肤疾病。

6.一种化妆品组合物，其特征在于，所述组合物含有如权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐。

7.一种洗涤用品组合物，其特征在于，所述组合物含有如权利要求1所述的式I化合物或其盐、洗涤用表面活性剂和洗涤用载体。

8.一种保健品组合物，其特征在于，所述组合物含有如权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐以及食品上可接受的载体。

9.一种抑制蔬菜和/或水果发生褐变的方法，其特征在于，包括步骤：

将所述蔬菜和/或水果与式I化合物或其药学上可接受的盐进行接触，从而抑制所述蔬菜和/或水果发生褐变。

10.一种非治疗性的体外抑制酪氨酸酶活性的方法，其特征在于，包括步骤：

在式I化合物或其盐存在的情况下，培养细胞，从而抑制所述细胞中黑色素的生成和/或抑制所述细胞中的酪氨酸酶活性。