CN102920688A - 4-羟基水杨酰苯胺在制备防治乙型肝炎的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了4-羟基水杨酰苯胺在制药领域中的新用途。该化合物是核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide reductase，RR）的抑制剂，通过抑制RR酶活性，阻断乙型肝炎病毒（HBV）复制所需dNTPs的合成，从而达到抑制HBV复制、治疗肝炎尤其是乙型肝炎的目的。可用于预防和治疗乙型肝炎，具有重要应用前景。

Description

4-羟基水杨酰苯胺在制备防治乙型肝炎的药物中的应用

（一）技术领域

本发明涉及4-羟基水杨酰苯胺在制备以核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide reductase，RR）为靶标的防治乙型肝炎的药物中的应用。 

（二）背景技术

慢性肝炎是威胁全球人类健康的严重传染性疾病之一。全世界约有20多亿人曾感染乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV），每年由于HBV感染而死亡的人数达100万。HBV感染不仅是引起慢性乙型肝炎、而且是引起原发性肝癌的重要生物学因素。中国、东南亚及非洲是HBV感染的高发区，原发性肝癌的发生率显著高于美洲中部和南部等HBV感染的低发区。慢性乙型肝炎现有的治疗主要有干扰素、核苷类药物、胸腺素，但这些药物长期应用会出现较严重的毒副作用或产生耐药，且价格昂贵。因此，寻找新型、有效的抗HBV药物是急需解决的问题。 

核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide reductase，RR）是细胞DNA合成限速酶。其功能是催化核糖核苷酸（NDPs）中核糖上C2位的羟基还原成氢，生成脱氧核糖核苷酸（dNDPs）。在细胞内，dNDPs经激酶作用生成三磷酸脱氧核苷（dNTPs），为DNA合成提供原料。RR酶由2个相同的大亚基（α2）和两个相同的小亚基（β2）组成四聚体（α2β2）。R1（在人RR又称为M1）代表α2部分，R2（在人RR又称为M2）代表β2部分，哺乳动物中还有另一RR小亚基p53R2（在人RR又称为M2B）。已经证明，RR高表达，或由此造成的细胞内dNTPs库混乱，与肿瘤发生 发展密切相关。而且，RR酶的高表达增加肿瘤治疗中的化疗抵抗。目前靶向针对RR酶治疗相关肿瘤已逐渐成为热点与重点。 

HBV基因组为双链、部分环状的DNA，由长链和短链组成。HBV侵入机体后，在肝细胞内进行复制，在其复制过程中病毒前基因组RNA逆转录成为DNA并复制子代病毒DNA。HBV DNA合成需要以dNTPs为底物。HBV通常在静止肝脏细胞中复制较快，但静止肝脏细胞中的dNTPs含量较低，正常情况下无法满足HBV的复制。最近研究表明，HBV之所以能够在静止肝脏细胞中复制，是因其HBx蛋白能够阻断R2抑制性调节因子x1（Rfx1）的作用，在静止肝细胞中选择性激活R2基因表达，从而激活RR酶活性而使细胞能够生成大量dNTPs，供HBV在静止肝细胞中的自身复制需要，引起肝炎。 

4-羟基水杨酰苯胺，其结构式为： 

该化合物的分子式为C₁₃H₁₁NO₃，白色粉末状，分子量为229.24，CAS编号为526-18-1。该化合物的通用名为柳胺酚片，目前用于肝胆病用药，作用机制与去氢胆酸相似，能增加肝血流量，改善肝功能，可使胆汁中水分显著增加。利胆作用较去氢胆酸强，能使Oddi括约肌松弛。此外尚有降低血胆固醇作用。 

（三）发明内容

本发明的目的在于提供4-羟基水杨酰苯胺的新用途，即4-羟基水杨 酰苯胺在制备以核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide reductase，RR）为靶标的防治乙型肝炎的药物中的应用。 

本发明采用的技术方案是： 

4-羟基水杨酰苯胺在制备以核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide reductase，RR）为靶标的防治乙型肝炎的药物中的应用。 

本申请人经实验研究发现，该化合物能有效抑制RR酶的活性，并且其能作为RR酶抑制剂，具有抑制肿瘤细胞生长的能力，可发展为肝炎和肿瘤的预防及治疗药物。 

具体的，所述4-羟基水杨酰苯胺用于制备抑制乙型肝炎病毒复制的药物。 

本发明化合物对RR酶的半数有效抑制浓度（IC₅₀）的测定结果见图1，对HepG2.2.15细胞的IC₁₀、IC₂₅及IC₅₀的测定见表2，对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg的影响的测定见表3，对HepG2.2.15细胞中HBV-DNA的影响见表4。该化合物可添加药物可接受的载体，制成常规的剂型如片剂、颗粒剂、针剂等。 

本发明的有益效果主要体现在： 

（1）本发明对已知药物4-羟基水杨酰苯胺发掘了新的医疗用途，开拓了多个新的应用领域。 

（2）本发明发现4-羟基水杨酰苯胺是RR酶的抑制剂。 

（3）与RR靶向抑制药物羟基脲（Hydroxyurea,HU）比较，4-羟基水杨酰苯胺的RR酶抑制活性高10倍以上。 

（4）4-羟基水杨酰苯胺的IC₁₀剂量对HepG2.2.15细胞表达HBsAg、以及HBV DNA复制具有明显抑制作用。4-羟基水杨酰苯胺抑制HBsAg 表达作用明显较高于HU和拉米夫定（Lamivudine，3-TC）；抑制HBV-DNA拷贝数明显高于HU、略低于3-TC。证明本发明的疗效显著，药理作用强。 

（5）HBV常发生变异而产生耐药性，已有3-TC耐药的报道。4-羟基水杨酰苯胺抑制HBV的机制与3-TC不同，可供临床治疗选择使用。 

（6）4-羟基水杨酰苯胺对多种肿瘤细胞具有较高的杀伤活性。 

（7）4-羟基水杨酰苯胺具有抑制HBV复制和肝癌细胞增殖的双重作用，因此与HU和3-TC比较，对肝癌的治疗和预防具有重要应用价值。 

（8）4-羟基水杨酰苯胺是保肝老药，安全性高，预示着其在肝炎和癌症领域有很好的药用前景。 

（四）附图说明

图1为RR酶活性抑制实验结果。纵坐标为RR酶相对活性，是指每种化合物处理组相对于溶剂对照组RR酶活性（100%）作图（n=3， 

）；羟基脲（HU）； 

图2为4-羟基水杨酰苯胺、羟基脲（HU）及拉米夫定（3-TC）对HepG2.2.15细胞的抑制曲线； 

图3为HBsAg标准品标准曲线。 

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此： 

实施例1：药物的重组RR酶抑制活性 

1、实验材料 

（1）主要试剂：羟基脲（Hydroxyurea，HU，Sigma），4-羟基水杨酰苯胺（上海泰坦化学有限公司）。 

（2）主要仪器：高效液相仪（日本岛津LC-10ATVP），液体闪烁计数仪（Backman LS6500）。 

2、实验方法 

（1）重组RR酶活性测定样品制备 

1)准备反应样品：大肠杆菌体外表达纯化的重组人RR酶大亚基M1（序列参见SEQ ID NO.1）和小亚基M2蛋白（序列参见SEQ ID NO.2）（蛋白用量为RR酶活性达到65~95%），加双蒸水调节体积为80μl，加入不同浓度的测试化合物10μl；混匀，室温孵育30~60min； 

2)每管加入反应缓冲液至体积100μl（终浓度：50mM HEPES，pH 7.2，6mM DTT，4mM magnesium acetate，2mM ATP，0.05mM CDP，100mM KCl，0.125μM[3H]CDP）；37℃孵育20~30min；沸水灭活10min； 

3)加入5μl 20mg/mL PDE，37℃孵育30min~60min；沸水灭活10min；16000rpm离心15min，取上清。 

（2）HPLC测定： 

1）色谱条件：流动相：磷酸二氢铵，pH3-5；流速：1mL/min。色谱柱：C18柱。 

2）样品测定：将上述上清进样20μL；收集HPLC分离样品50μL/管，每管加入4mL闪烁液。置于闪烁计数仪中测定样品的DPM和CPM。 

（3）计算RR酶活性（%）=实验组产物dCDP的CPM/空白对照组的CPM×100%。 

3、实验结果 

以RR酶代表性抑制药物羟基脲（Hydroxyurea，HU）为阳性对照药物，将体外表达纯化的RR大、小亚基蛋白重组成RR全酶，测定药物的RR靶向抑制作用，结果见图1。 

结果表明，HU对重组RR酶活性的抑制作用呈剂量依赖性，与药物浓度呈正相关，计算其IC₅₀为96.55μM（RR酶活性50%抑制时的药物浓度）。4-羟基水杨酰苯胺对重组RR酶活性抑制作用明显高于HU，并呈剂量依赖性，计算其IC₅₀为8.23μM，抑制活性约为HU 10倍。 

实施例2：药物实验剂量的确定 

1.实验材料 

（1）细胞株：HepG2.2.15细胞（稳定转染HBV基因，可以稳定进行HBV基因组复制和表达）（浙江大学传染病研究所惠赠）。 

（2）主要试剂：DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Gibco公司），羟基脲（Hydroxyurea,HU，Sigma），4-羟基水杨酰苯胺（上海泰坦化学有限公司），拉米夫定（Lamivudine，3-TC，日本东京仁成工业株式会社）；Cell Counting Kit-8试剂盒（CCK8，日本株式会社同仁化学研究所）。 

（3）主要仪器：二氧化碳培养箱（美国Thermo Forma公司），全自动酶标仪（Bio-TEK，Elx800）。 

2.实验方法 

（1）细胞培养： 

细胞培养于DMEM高糖培养基（添加10%胎牛血清的DMEM培养基，pH 7.2），添加400μg/ml的G418，2mmol/L谷氨酰胺，置于细胞培 养箱中在37℃、5%CO₂环境下培养。待细胞生长到70%~80%时，用含有EDTA的胰酶消化传代。 

（2）CCK8试剂盒测定各药物对HepG2.2.15细胞杀伤力： 

将4-羟基水杨酰苯胺用去除G418的DMEM培养基配制成125，175，250，350，500，700μM共6个浓度梯度，3-TC也同样配制成625，1250，2500，5000，10000，20000μM的浓度梯度，HU则配制成250，500，1000，2000，4000，8000，12000μM的浓度梯度。HepG2.2.15细胞浓度4×10⁴个/mL，加入96孔培养板100μL/孔，置CO₂孵箱37℃培养24h后，细胞贴壁且生长良好，吸除培养液，加入以上不同浓度不同药物的含药培养基100μL/孔，每个浓度3个复孔。连续培养72h，培养结束前2h，每孔加入CCK8试剂10μL，于CO₂孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪490nm检测各孔OD值。计算细胞存活率：细胞抑制率（%）=[1-(实验孔OD均值/对照孔OD均值)]×100%。拟合函数求出抑制细胞生长达50%时药物浓度（IC₅₀）。 

3.实验结果 

分别以RR抑制药物HU、抗HBV药物3-TC为阳性对照药物，应用MTT法（CCK8）测定药物的对HepG2.2.15的细胞毒性，计算各药物抑制HepG2.2.15细胞的IC₁₀、IC₂₅及IC₅₀（图2，表2）。 

为检测药物低细胞毒性剂量时对HBV的抑制作用，后续相关实验选用抑制细胞生长为10%及25%时的药物浓度即IC₁₀和IC₂₅两个剂量；同时阳性对照药3-TC及HU也设置IC₁₀和IC₂₅两个剂量，以保证不同药物作用的可比性。 

表2：实验药物对HepG2.2.15的细胞毒性作用 

实施例3：药物对HepG2.2.15细胞培养上清HBsAg表达水平抑制作用 

1.实验材料 

（1）主要试剂：HBsAg检测ELISA试剂盒（上海研吉生物科技有限公司）。 

（2）主要仪器：全自动酶标仪（Bio-TEK，Elx800）。 

2.实验方法 

将HepG2.2.15细胞（5×10⁴个/mL）置CO₂孵箱中培养24h后，细胞贴壁且生长良好，除去培养液，根据细胞毒性试验结果，分别加入含有不同浓度药物的去除G418的细胞培养液，每个浓度设置3个重复，并设去除G418的完全培养基的细胞为正常对照，5%CO₂、37℃下培养。分别在连续培养48h，72h，96h后吸取各样本上清液置于1.5mL灭菌离心管中，1000rcf离心10min取上清，-20℃保存；同时收集各样品细胞，-70℃保存。 

采用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测。以试剂盒HBsAg标准品的浓度为横坐标、相应的OD值为纵坐标制作标准曲线。将各样本OD值读数代入标准曲线，计算出各样本中HBsAg含量及抑制率。药物对HBsAg抗原的抑制百分率（%）=（1- 样品抗原含量/空白抗原含量）×100%。 

3.统计学分析 

实验数据用SPSS 13.0软件处理，结果以 

表示，多个样本均数的比较采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，P<0.05为统计学差异显著。 

4.实验结果 

分别以RR抑制药物HU、抗HBV药物3-TC为阳性对照药物，应用ELISA方法检测4-羟基水杨酰苯胺对HepG2.2.15细胞上清液HBsAg表达水平的影响。以HBsAg标准品制作标准曲线（见图3）。各受试药物取IC₁₀和IC₂₅两个浓度，各样品的ELISA检测OD值代入标准曲线方程计算结果，见表3。 

表3：各受试物对HepG2.2.15细胞上清中HBsAg表达量的影响（n=3， 

） 

与对照相比,^*P<0.05,^△P<0.01 

结果可见，4-羟基水杨酰苯胺对HepG2.2.15细胞表达和分泌HBsAg有明显抑制作用，并与药物浓度及作用时间呈明显正相关，与细胞对照组比具有显著性差异（P<0.01）。4-羟基水杨酰苯胺IC₁₀剂量在加药后96h 时对HBsAg抑制率可达66.78%，而3-TC IC₁₀剂量在加药后96h时对HBsAg抑制率仅为27.73%。为保证上述结果不是因为细胞数量的差异而产生，以同样细胞毒性剂量3-TC及HU（IC₁₀和IC₂₅两个浓度）为对照，均表明4-羟基水杨酰苯胺对于HepG2.2.15细胞表达和分泌HBsAg的抑制作用大于3-TC及HU。此结果证明，4-羟基水杨酰苯胺在抑制HBsAg合成和分泌作用方面具有独特优势。 

实施例4：药物对HepG2.2.15细胞中HBV-DNA复制的抑制作用 

1.实验材料 

（1）主要试剂：FQ-PCR试剂盒（罗氏Roche，批号：12995100） 

（2）主要仪器：FQ实时荧光定量PCR仪（ABI，7500real-time PCR） 

2.实验方法 

按照DNA提取试剂盒说明，提取同上分别经各药物处理的HepG2.2.15培养细胞样品的DNA，测定OD值，计算用于FQ-PCR的模板体积，使各样本中总DNA量相同。PCR扩增引物为：P1:5-ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT-3；P2:5-CAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA-3，按以下条件进行扩增：50℃2min、92℃10min处理后，再做95℃15s和60℃1min 40个循环。 

3.统计学分析 

实验数据用SPSS 13.0软件处理，结果以 

表示，多个样本均数的比较采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，P<0.05为统计学差异显著。 

4.实验结果 

与空白对照组比较，4-羟基水杨酰苯胺IC₁₀剂量在加药96h后对HBV DNA拷贝数具有明显抑制作用（P<0.01）（表4）。其作用高于HU，略低于3-TC。 

表4:各受试物对HepG2.2.15细胞中HBV-DNA的影响（n=3， 

） 

与对照相比,^*P<0.05,^△P<0.01。 

Claims (2)

1.4-羟基水杨酰苯胺在制备以核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotidereductase，RR）为靶标的防治乙型肝炎的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述4-羟基水杨酰苯胺用于制备抑制乙型肝炎病毒复制的药物。

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