CN103768076B - 一种治疗乙型肝炎的联合用药物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了4-羟基水杨酰苯胺与核苷类药物在制备治疗乙型肝炎的联合用药物中的应用，以及一种治疗乙型肝炎的联合用药物。本发明发现4-羟基水杨酰苯胺和核苷类药物联合用药对HBV复制的抑制作用非常明显，其联合指数CI<1，具有显著的协同效应。HBV常发生变异而产生耐药性，4-羟基水杨酰苯胺抑制HBV复制的药物靶标和作用机制与核苷类药物不同，可以联合使用，不仅有显著的协同作用，而且可以防止耐药性的出现。4-羟基水杨酰苯胺是保肝老药，安全性高，与核苷类药物尤其是拉米夫定联用将有良好的前景。

Description

一种治疗乙型肝炎的联合用药物

（一）技术领域

本发明涉及4-羟基水杨酰苯胺与核苷类药物在制备治疗乙型肝炎的联合用药物中的应用，以及一种治疗乙型肝炎的联合用药物。

（二）背景技术

慢性乙型肝炎是威胁全球人类健康的严重传染性疾病之一。全世界约有20多亿人曾感染乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV），每年由于HBV感染而死亡的人数达100万。HBV感染不仅是引起慢性乙型肝炎、而且是引起原发性肝癌的重要生物学因素。中国、东南亚及非洲是HBV感染的高发区，原发性肝癌的发生率显著高于美洲中部和南部等HBV感染的低发区。慢性乙型肝炎现有的治疗主要有干扰素、核苷类药物（如拉米夫定（Lamivudine）、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦、替诺福韦等）、以及胸腺素等。但这些药物长期应用会出现较严重的毒副作用或产生耐药，且价格昂贵。因此，寻找新型、有效的治疗乙型肝炎药物是急需解决的问题。将作用机制不同的药物进行合用以减毒增效并减少耐药性发生，是一个有效的解决方案。

拉米夫定（3TC）属于核苷类HBV逆转录酶抑制剂，1998年被美国食品与药品管理局批准作为乙型肝炎治疗药，1999年正式开始于中国大陆境内销售。但服用拉米夫定一年后大部分乙肝患者会产生耐药。拉米夫定结构式为：

核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotidereductase，RR）是细胞DNA合成限速酶。RR酶由2个相同的大亚基R1（α2,在人RR又称为M1）和两个相同的小亚基R2（β2,在人RR又称为M2）组成四聚体（α2β2）。哺乳动物中还有另一RR小亚基p53R2（在人RR又称为M2B）。RR酶的功能是催化核糖核苷酸（NDPs）中核糖上C2位的羟基还原成氢，生成脱氧核糖核苷酸（dNDPs）。在细胞内，dNDPs经激酶作用生成三磷酸脱氧核苷（dNTPs），为DNA合成提供原料。HBVDNA合成需要以dNTPs为底物。HBV通常在肝细胞中复制较快，但静止肝细胞中的dNTPs含量较低，正常情况下无法满足HBV的复制。最近研究（Hepatology2010,51(5),1538-46）表明，HBV之所以能够在静止肝脏细胞中复制，是因其HBx蛋白能够阻断R2抑制性调节因子x1（Rfx1）的作用，在静止肝细胞中选择性激活R2基因表达，从而激活RR酶活性而使细胞能够生成大量dNTPs，供HBV在静止肝细胞中的自身复制需要，引起乙型肝炎。因此，抑制RR酶的活性，将能起到抑制HBV复制作用。

4-羟基水杨酰苯胺（RC17），其结构式为：

4-羟基水杨酰苯胺目前用于胆囊炎、胆道炎、胆石症及胆道术后综合征等治疗，作用机制与去氢胆酸相似，能增加肝血流量，改善肝功能，可使胆汁中水分显著增加。利胆作用较去氢胆酸强，能使Oddi括约肌松弛。此外尚有降低血胆固醇作用。在发明人前期的研究中，发现了4-羟基水杨酰苯胺对RR酶的抑制作用。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种治疗乙型肝炎的联合用药物，与单独给药相比，其药效分别提高了数倍。

本发明采用的技术方案是：

4-羟基水杨酰苯胺与核苷类药物在制备治疗乙型肝炎的联合用药物中的应用；所述核苷类药物为下列之一或其中两种以上的混合物：拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦、替诺福韦；所述4-羟基水杨酰苯胺与核苷类药物摩尔用量之比为10～80：1。

优选的，所述核苷类药物为拉米夫定，所述4-羟基水杨酰苯胺与拉米夫定摩尔用量之比为30～50：1，更优选为40：1。

本发明还涉及一种治疗乙型肝炎的联合用药物，由4-羟基水杨酰苯胺与核苷类药物的不同规格的单位制剂组成；所述核苷类药物为下列之一或其中两种以上的混合物：拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦、替诺福韦。该单位制剂为常规的剂型如片剂、颗粒剂、针剂等，由4-羟基水杨酰苯胺，或核苷类药物及其药学上可接受的载体分别制成，用于4-羟基水杨酰苯胺与核苷类药物的同时、分别或依次给药，此两种药物的联用，对抑制HBV有显著的协同效应。

优选的，所述4-羟基水杨酰苯胺与核苷类药物摩尔用量之比为10～80：1。

优选的，所述核苷类药物为拉米夫定，所述4-羟基水杨酰苯胺与拉米夫定摩尔用量之比为30～50：1，更优选为40：1。在本发明的一个实施例中，4-羟基水杨酰苯胺和拉米夫定合用对HBV复制的抑制作用非常明显，其联合指数CI<1，具有显著的协同效应。与单独用药相比，联合用药时RC17及3TC的药效分别提高5倍及8倍。

本发明的有益效果主要体现在：

（1）本发明发现4-羟基水杨酰苯胺和核苷类药物联合用药对HBV复制的抑制作用非常明显，其联合指数CI<1，具有显著的协同效应。

（2）HBV常发生变异而产生耐药性，4-羟基水杨酰苯胺抑制HBV复制的药物靶标和作用机制与核苷类药物不同，可以联合使用，不仅有显著的协同作用，而且可以防止耐药性的出现。

（3）拉米夫定使用一年后大部分乙肝患者会产生耐药，4-羟基水杨酰苯胺抑制HBV的机制与拉米夫定不同，可以联合使用，不仅有显著的协同作用，而且合用时RC17及3TC的药效分别提高5倍及8倍。

（4）4-羟基水杨酰苯胺是保肝老药，安全性高，与核苷类药物尤其是拉米夫定联用将有良好的前景。

（四）附图说明

图1为HBx质粒转染HBV阴性的永生化肝细胞和肝癌细胞系过表达后，应用Myc及RR抗体作免疫印迹试验检测结果。

图2为正常小鼠与HBV转基因小鼠肝组织RR酶活性比较。

图3为小鼠给药期间体重变化。

图4为小鼠肝组织切片苏木精-伊红染色法（HE）染色。A，阴性对照；B，3TC（100mg/kg）；C，RC17（400mg/kg）；D，RC17（800mg/kg）。图5为RC17与3TC给药不同时间对HBV转基因小鼠血清中HBVDNA抑制作用。

图6为RC17与3TC给药不同时间对HBV转基因小鼠血清中HBsAg抑制作用。

图7为RC17与3TC单独用药及联合用药的剂量-药效曲线。横坐标“0”表示空白对照；“1,2,3,4,5”对应RC17的浓度，分别为：1.6,3.2,6.4,12.8,25.6μM，分别对应3TC的浓度为0.04,0.08,0.16,0.32,0.64μM.；联合用药即为两种药物由小到大浓度对应联合。

图8为Calcusyn分析RC17与3TC联合用药相互作用性质。图（A）为药物合用对病毒影响的联合指数（Fractionaleffectcombinationindex，Fa-CI），中间的红线代表效应数据，上下两条线之间为置信区间，置信区间内的这些点的CI>1时表示两种药物拮抗，而CI<1时代表两种药物具有协同作用。图（B）为药物等高线图，三个点分别代表抑制率达到50%、75%和90%时的浓度（EC₅₀、EC₇₅和EC₉₀），曲线代表两药物的相加效应线，如果三个点落在两药相加效应上，则药物相互作用性质为相加；如果位于相加效应曲线的上方，则代表药物相互作用的性质为拮抗作用，反之，位于相加效应先的下方，则代表药物相互作用性质为协同作用。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：药物对RR酶抑制活性

1、实验材料

（1）主要试剂：羟基脲（Hydroxyurea，HU，Sigma），4-羟基水杨酰苯胺（RC17,上海泰坦化学有限公司）。

（2）主要仪器：高效液相仪（日本岛津LC-10ATVP），液体闪烁计数仪（BackmanLS6500）。

2、实验方法

（1）细胞内RR酶活性测定样品制备

1)细胞培养：HepG2.2.15细胞培养于DMEM高糖培养基（添加10%胎牛血清的DMEM培养基，pH7.2），添加400μg/ml的G418，2mM谷氨酰胺，置于细胞培养箱中在37℃、5%CO₂环境下培养。待细胞生长到70%～80%时，用含有EDTA的胰酶消化传代。

2)药物处理：取HepG2.2.15细胞接种于10cmdish中培养，置CO₂孵箱37℃培养24h后，细胞贴壁且生长良好，吸除培养液，加入用培养基配好的含有RC17的浓度分别为400、600、900、1350μM的培养基,阳性对照组加入含有HU浓度为10mM的培养基，空白对照组加入相同浓度的DMSO。连续培养36h。

3)细胞蛋白提取：培养结束后用预冷的PBS洗涤三次，将细胞刮下，加入适量PBS吹打，4℃离心收集细胞。以1:1比例（与细胞沉淀相比）加入低盐匀浆液（100mMHepespH7.2，2mMDTT），用1mL注射器抽吸20次。以1：1比例加入高盐匀浆液（1MHepespH7.2，2mMDTT）,同时加入蛋白酶抑制剂用1ML注射器抽吸20次。16000g，4℃离心20-30min，取上清。取sephadexG25柱用50mMHepes溶液（pH7.2，2mMDTT）4℃、2000rpm离心4min，重复操作两次，预平衡柱子，将G25柱置于15ml离心管中，底部加2ml管子，加提取得到的上清，2000rpm、4℃离心3-5min，收集蛋白。

4)准备反应样品：将上述所得细胞蛋白180μg，每管加入反应缓冲液至体积100μl（终浓度：50mMHEPES，pH7.2，6mMDTT，4mMmagnesiumacetate，2mMATP，0.05mMCDP，100mMKCl，0.125μM[³H]CDP）；37℃孵育20～30min；加入5μl20mg/mLPDE，37℃孵育30min～60min；离心取上清。

5)以大肠杆菌体外表达纯化的重组人RR酶大亚基RRM1（序列参见SEQIDNO.1）和小亚基RRM2蛋白（序列参见SEQIDNO.2），加双蒸水调节体积为80μl，加入不同浓度的测试化合物10μl；混匀，之后步骤同上。

（2）HPLC测定：

1）色谱条件：流动相：磷酸二氢铵，pH3-5；流速：1ml/min。色谱柱：C18柱。

2）样品测定：上述上清进样20μL；收集分离样品50μL/管，加闪烁液，闪烁计数仪中测定样品的DPM和CPM。

（3）计算RR酶活性（%）=实验组产物dCDP的CPM/空白对照组的CPM×100%。

3、实验结果

以RR酶代表性抑制药物羟基脲（Hydroxyurea，HU）为阳性对照药物，测定化合物RC17对体外重组及细胞内RR酶活性的抑制作用，结果见表1，由表中数据可见，HU对重组RR酶活性的抑制作用呈剂量依赖性，与药物浓度呈正相关，计算其IC₅₀为96.55μM。RC17对重组RR酶活性抑制作用明显高于HU，并呈剂量依赖性，计算其IC₅₀为8.23μM，抑制活性约为HU10倍。HU对细胞内RR酶活性的抑制作用较弱，在10mM时仍然没有明显的抑制活性。而RC17对细胞内RR酶活性有较明显的抑制作用，其抑制IC₅₀为760μM。

表1:4-羟基水杨酰苯胺（RC17）对RR酶抑制活性

实施例2：HBV激活细胞内RR的表达及提高肝脏组织RR酶活性

1.实验材料

（1）主要试剂：细胞转染试剂Lipofectamine2000（Invitrogen#11668）、Opti-IReduced-SerumMedium(1X)(Invitrogen#31985070)。

（2）质粒：Myc-HBx质粒由浙江大学刘伟教授赠与。对照为pcDNA3.1-c-Myc空载。

（3）动物：健康Balb/c小鼠，体重18～22g，雌性，由浙江大学实验动物中心提供。HBV转基因Balb/c小鼠，体重18～22g，雌性，由解放军458医院全军肝病研究中心（广州广东）提供。实验小鼠随机分组，全价颗粒饲料喂养，自由饮水，室温18～22℃，实验室相对湿度：55～70%。

（4）细胞株：正常人肝细胞株（HL-7702），人肝癌细胞株（HepG2）均购买于美国模式菌种收藏所(ATCC)，本实验室传代保存。

（5）主要仪器：高效液相仪（日本岛津LC-10ATVP），液体闪烁计数仪（BackmanLS6500），InfraredImagingSystem（美国LI-COR公司）。

2.实验方法

（1）细胞培养

HL-7702及HepG2细胞分别培养于1640培养基及DMEM高糖培养基（添加10%胎牛血清的DMEM培养基，pH7.2），添加2mM谷氨酰胺，置于细胞培养箱中在37℃、5%CO₂环境下培养。待细胞生长到70%～80%时，用含有EDTA的胰酶消化传代。

（2）细胞转染

转染前一天，接种HL-7702及HepG2细胞于60mm板上，5mL的培养基。密度以转染时细胞能覆盖率达80%为佳，置于细胞培养箱中培养24h。转染时，利用细胞培养基（无血清、无蛋白、无抗生素）稀释溶解于TE缓冲液（pH7-8）的4μg质粒，最终的体积为150μL；稀释10μLlipo2000至260μL。室温孵育5min。两者混合，室温孵育25min。将转染复合物转入60mm的培养板中。培养4-6h后换液，加入新鲜的培养基。培养48h后，收集细胞，检测转染细胞的表达。

（3）SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹

配制SDS聚丙烯酰胺凝胶，15μg蛋白与同体积的2×电泳加样缓冲液混合，沸水浴中加热5min，使蛋白变性；加样，垂直电泳，直至溴酚蓝到达胶的底端；电泳结束后，取出凝胶，制作转膜三明治，转膜2h；转膜结束后，立春红染色观察转膜效果，封闭液中温和振荡2h；将膜放在含一抗的封闭液中，4℃温和振荡过夜；回收一抗后，在TBS-T中振荡洗膜3次；将膜放在IRDye800或者IRDye680标记的二抗中，室温振荡2h；用TBS-T洗膜3次，使用InfraredImagingSystem进行检测。

（4）小鼠肝脏组织酶活性测定：取正常Balb/c小鼠及HBV转基因小鼠，颈椎脱臼处死后，立即分离肝脏。取适量肝组织用研钵研碎后加入适量50mMHepespH7.2缓冲液用匀浆器匀浆，所得样品4℃离心30min，取上清蛋白加入硫酸链霉素，在层析冷柜中上下翻滚沉淀，使核酸沉淀彻底，离心去沉淀，留上清。取上清蛋白加入饱和硫酸铵，在层析冷柜沉淀30min，16000g，4℃，20～30min，沉淀重溶于50mMHepes透析过夜，蛋白-70℃冻存。

（5）组织酶活性测定：酶活性测定方法同实施例1中细胞酶活性测定方法。

3.实验结果

在HBV阴性的永生化肝细胞系HL7702和肝癌细胞系HepG2，转染HBx质粒过表达，能上调RRM2和RRM1亚基表达水平（图1）；而且HBV转基因小鼠的肝组织RR酶活性比正常小鼠明显增高（图2）。表明HBV（无RR基因）在体外和体内肝细胞中能激活RR表达和酶活性，以保证病毒自身大量复制所需DNA合成原料。

实施例3:RC17体内抗HBV活性实验

1.实验材料

（1）主要试剂：4-羟基水杨酰苯胺（RC17，上海泰坦化学有限公司），拉米夫定（3TC，葛兰素史克），FQ-PCR试剂盒（罗氏Roche），HBsAg检测ELISA试剂盒（上海研吉生物科技有限公司）。

（2）主要仪器：全自动酶标仪（Bio-TEK，Elx800），FQ实时荧光定量PCR仪（ABI，7500real-timePCR）

（3）动物：雌性HBV转基因小鼠，由解放军458医院全军肝病研究中心（广州广东）提供。该小鼠是由Balb/c小鼠胚胎显微注射1.3copy的HBVDNA（ayw亚型）研制而成。在该转基因小鼠的血清中能够检测到高水平的HBsAg及HBVDNA。本实验采用9-10周龄的成年小鼠。

2.实验方法

转基因小鼠随机分为4组，分别为空白组、3TC阳性对照组、RC17低剂量组和RC17高剂量组，每组5只。药物用0.5%的羧甲基纤维素钠混悬给药。空白组给予10ml/kg的0.5%的羧甲基纤维素钠。阳性对照组给予100mg/kg的拉米夫定（3TC），实验药物组分别给予400、800mg/kg的RC17。空白对照及药物组通过灌胃方式连续给药28d，每天一次。在给药7d、14d、21d5h后断尾取血0.2ml分离血清，在最后一次28d给药5h后将小鼠摘眼球取血，分离所得的血清用于检测HBsAg及HBV-DNA。HBsAg按照Elisa说明书进行检测，HBVDNA采用荧光定量PCR技术检测。小鼠处死后，尽快分离肝脏，并将肝脏的左下叶用福尔马林固定，其余肝脏放入冻存管置于液氮中速冻。福尔马林固定的小鼠肝脏用石蜡包埋并常规HE染色，并通过免疫组化检测肝脏中的HBsAg表达水平。

3.统计学分析

实验数据用SPSS13.0软件处理，结果以表示，多个样本均数的比较采用单因素方差（One-wayANOVA）分析，P<0.05为统计学差异显著。

4.实验结果

（1）小鼠给药期间体重变化

小鼠给药过程中每周称取体重，以时间为横坐标，每组小鼠的平均体重为纵坐标作图，如图3所示，不同组别的小鼠在给药期间没有伤亡，并且体重没有明显变化，说明药物没有造成严重的不良反应。

（2）小鼠肝脏HE染色

小鼠处死后将肝脏迅速分离，并剪取左下叶用福尔马林固定，石蜡固定后切片做常规HE染色，结果见图4。由于外源基因在鼠胚胎发育期即开始复制表达，引起小鼠免疫系统对其产区的耐受，导致了HBV转基因小鼠没有免疫反应。故在小鼠肝脏切片的HE染色中并无发现严重的病理变化。

（3）小鼠血清中HBVDNA水平变化。

HBV转基因小鼠灌胃给药不同时间后，采集血液并分离血清，血清中的HBV拷贝水平用Q-PCR检测（图5），在给药7d后3TC与RC17的均没有产生明显的抑制HBVDNA拷贝的作用，而在第14d时3TC及RC17高剂量组（800mg/kg/d）与空白组相比均能产生明显的抑制作用（*P<0.05）。在第28d时，RC17的高低剂量均能够产生明显的抑制作用（*P<0.05）。

（4）小鼠血清HBsAg水平变化

HBV转基因小鼠灌胃给药不同时间后，采集血液并分离血清，血清中的HBsAg水平用Elisa定量试剂盒检测，由结果（图6）可以看出，在给药21d及28d后，RC17高剂量组及3TC对血清中HBsAg均有比较明显的抑制作用（P<0.5）。

实施例4：4-羟基水杨酰苯胺和拉米夫定合用对HepG2.2.15细胞上清HBVDNA抑制作用

1.实验材料

（1）主要试剂：4-羟基水杨酰苯胺（RC17，上海泰坦化学有限公司），拉米夫定（3TC，葛兰素史克）。FQ-PCR试剂盒（罗氏Roche，批号：12995100）

（2）主要仪器：FQ实时荧光定量PCR仪（ABI，7500real-timePCR）

（3）细胞株：HepG2.2.15细胞（稳定转染HBV基因，可以稳定进行HBV基因组复制和表达）（浙江大学传染病研究所惠赠）。

2.实验方法

（1）药物处理：细胞接种于24孔板中培养24h后，将RC17及3TC按照图7图注浓度分别单独或者联合用药处理，隔天换含有相应药物浓度的培养基，连续培养8d后，取上清Q-PCR检测HBVDNA。

（2）HBV-DNA提取及检测

按照DNA提取试剂盒说明，提取同上分别经各药物处理的HepG2.2.15培养细胞样品的DNA，测定OD值，计算用于FQ-PCR的模板体积，使各样本中总DNA量相同。PCR扩增引物为：P1:5-ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT-3；P2:5-CAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA-3，按以下条件进行扩增：50℃2min、92℃10min处理后，再做95℃15s和60℃1min40个循环。

3.实验结果

拉米夫定（3TC）是目前临床抑制抗HBV病毒治疗乙型肝炎的常用药物之一，但是抗病毒治疗时间长达数年，长时间单用3TC容易使病毒突变而导致耐药性，而且会会出现较严重毒副作用和不良反应。但有研究表明，如果不同作用机制的药物合用，能够明显的改进慢性病毒疾病的治疗，使作用更加明显，从而阻止或减慢由于突变引起的耐药性的出现，有效减缓病毒变异发展，从而有效延长病人对药物的敏感性。因此我们选择将RC17与3TC两种通过不同机制抑制HBV复制的药物联合用药，用Calcusyn分析两种药物联合用药效应，其结果见图8。

由图7可见，RC17与3TC两者联合用药的药效曲线明显低于两者单独用药，分别计算其抑制HBV-DNA的IC₅₀可得，联合用药时，RC17与3TC的浓度分别为2.4和0.06μM时抑制率即可达到50%，与两者单独用药的IC₅₀（RC17IC₅₀=12.8μM，3TCIC₅₀=0.57μM）相比有很大提高，提示其联合用药具有减毒增效的作用。而图8中，联合指数CI<1及ED₅₀，ED₇₅，ED₉₀三个点均在相加线的下方均表明RC17与3TC具有显著的协同效应。和单独使用相比，合用时RC17及3TC的药效分别提高5倍及8倍。

Claims (4)

1.4-羟基水杨酰苯胺与核苷类药物在制备治疗乙型肝炎的联合用药物中的应用；所述核苷类药物为下列之一或其中两种以上的混合物：拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦、替诺福韦；所述4-羟基水杨酰苯胺与核苷类药物摩尔用量之比为10～80：1。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述核苷类药物为拉米夫定，所述4-羟基水杨酰苯胺与拉米夫定摩尔用量之比为30～50：1。

3.一种治疗乙型肝炎的联合用药物，由4-羟基水杨酰苯胺与核苷类药物的不同规格的单位制剂组成；所述核苷类药物为下列之一或其中两种以上的混合物：拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦、替诺福韦，所述4-羟基水杨酰苯胺与核苷类药物摩尔用量之比为10～80：1。

4.如权利要求3所述的药物，其特征在于所述核苷类药物为拉米夫定，所述4-羟基水杨酰苯胺与拉米夫定摩尔用量之比为30～50：1。